Summary
כאן מתוארות שיטות לא פולשניות ללוקליזציה של חלבוני קרום פוטורצפטור ולהערכת ניוון הרשתית בעין המורכבת דרוזופילה באמצעות פלואורסצנציה eGFP.
Abstract
סחר בחלבון ממברנה מווסת את השילוב וההסרה של קולטנים ותעלות יונים בקרום הפלזמה. תהליך זה חשוב ביסודו לתפקוד התא ולשלמות התאים של תאי העצב. תאי דרוזופילה פוטורצפטורים הפכו למודל לחקר סחר בחלבון ממברנה. מלבד רודופסין, אשר עם ההארה מופנם מממברנת הפוטורצפטור ומתפרק, תעלת היונים דמוית פוטנציאל הקולטן הארעי (TRPL) בדרוזופילה מציגה טרנסלוקציה תלוית אור בין קרום הפוטורצפטור הרבדומרלי (שם הוא ממוקם בחושך) לבין גוף התא הפוטורצפטור (שאליו הוא מועבר עם ההארה). ניתן לחקור את ההובלה התוך-תאית הזו של TRPL בצורה פשוטה ולא פולשנית על ידי ביטוי TRPL המתויג על ידי eGFP בתאים פוטורצפטורים. לאחר מכן ניתן לראות את הפלואורסצנציה eGFP בפסאודו-פופיל העמוק או על ידי מיקרוסקופיה של טבילת מים. שיטות אלה מאפשרות זיהוי של פלואורסצנציה בעין שלמה ולכן הן שימושיות לבדיקות בתפוקה גבוהה ולמסכים גנטיים עבור מוטציות דרוזופילה הפגומות בטרנסלוקציה של TRPL. כאן, הכנת זבובים, הטכניקות המיקרוסקופיות, כמו גם שיטות כימות המשמשות לחקר טרנסלוקציה המופעלת על ידי אור זה של TRPL מוסברים בפירוט. שיטות אלה יכולות להיות מיושמות גם עבור מחקרי סחר בבני אדם על חלבונים אחרים של Drosophila photoreceptor, למשל, רודופסין. בנוסף, על ידי שימוש בחלבונים rhabdomeral המתויגים על ידי eGFP, ניתן להשתמש בשיטות אלה כדי להעריך את התנוונותם של תאים פוטורצפטורים.
Introduction
על ידי אספקה והסרה של חלבונים אל קרום הפלזמה וממנו, סחר בחלבון ממברנה בתאי עצב שולט בציוד קרום הפלזמה באמצעות קולטנים כמו גם תעלות יונים, וכתוצאה מכך מווסת את תפקוד העצבים. לרגולציה שגויה או פגמים בסחר בחלבונים יש בדרך כלל השפעות מזיקות על התאים וגורמות לניוון עצבי. בבני אדם, זה עלול לגרום למחלות נוירודגנרטיביות כגון מחלת אלצהיימר ופרקינסון או רטיניטיס פיגמנטוזה1. פוטורצפטורים בעין המורכבת של Drosophila melanogaster הפכו למערכת מודל in vivo לחקר סחר בחלבון ממברנה2. זה לא רק בגלל הרבגוניות הגנטית של Drosophila המאפשרת מסכים גנטיים יעילים, אלא גם משום שכל המרכיבים החיוניים של קרום הפוטורצפטור סופג האור מאופיינים בפירוט רב וטכניקות מיקרוסקופיות יעילות זמינות שניתן ליישם על עין הזבוב. טכניקות אלה הן המוקד של מאמר זה.
בתאי דרוזופילה פוטורצפטורים, קרום הפלזמה האפית יוצר ערימה צפופה של מיקרוווילי לאורך צד אחד של התא, המכונה rhabdomere. הרבדומרים של תאי הפוטורצפטור R1-6 מסודרים בתבנית טרפזית אופיינית בעוד שתאי הפוטורצפטור R7 ו-R8 יוצרים רבדומר יחיד במרכז הטרפז3. יש צורך בסחר בחלבוני ממברנה לצורך תחלופה מוסדרת של חלבוני ממברנה רבדומרליים כגון רודופסין וה-TRP המופעל באור (פוטנציאל קולטן חולף) ותעלות יונים TRPL (דמויות TRP) כדי להבטיח את הכמות הנכונה של חלבוני פוטו-טרנסדוקציה אלה ברבדומר. חלבוני קרום פוטורצפטור מסונתזים ברשתית האנדופלסמית ומועברים דרך מנגנון גולג'י לרבדומר. לאחר הפעלת רודופסין על ידי אור, מולקולת רודופסין יכולה להיות מושתקת על ידי ספיגה של פוטון שני או להיות מוסרת מהרבדומר על ידי אנדוציטוזה בתיווך קלתרין. רודופסין אנדוציטוסי מתפרק בליזוזום או ממוחזר בחזרה לרבדומר 4,5. תעלת היונים TRPL מופנמת גם לאחר הפעלת מפל הפוטו-טרנסדוקציה ועוברת טרנסלוקציה תלוית אור בין הרבדומאר (שם הוא ממוקם כאשר זבובים מוחזקים בחושך) לבין תא אחסון מועשר ב-ER בגוף התא (שאליו הוא מועבר תוך מספר שעות עם ההארה)6,7,8,9,10 . בניגוד לרודופסין אנדוציטוסיטוס, רק כמויות קטנות של TRPL מתפרקות דרך המסלול האנדוליזוזומלי, והרוב מאוחסן במקום זאת תוך-תאי וממוחזר בחזרה לרהבדומר עם הסתגלות כהה6. לפיכך, TRPL יכול לשמש לניתוח סחר המופעל על ידי אור של חלבוני ממברנת פלזמה. תאים פוטורצפטורים של דרוזופילה משמשים גם לחקר ניוון עצבי. ניוון תאי פוטורצפטור נקבע לעתים קרובות על ידי הערכת המבנה של rhabdomeres, אשר מתפרקים כתוצאה מתהליכים ניווניים5.
על מנת לחקור את הלוקליזציה התת-תאית של TRPL ורודופסין בתאי פוטורצפטור או בניוון תאי פוטורצפטור, יושמו כאן שתי שיטות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות הנבדלות זו מזו ביחס למהירות הניתוח ולרזולוציה. שיטה מהירה מאוד, לא פולשנית, שיכולה לשמש למסכים גנטיים אך עם רזולוציה מרחבית מוגבלת היא זיהוי של פלואורסצנציה בפסאודו-פופיל עמוק (DPP). ה- DPP הוא תופעה אופטית של עיניים מורכבות פרוקי רגליים שמקורן הגיאומטרי הוסבר בפירוט על ידי פרנצ'סקיני וקירשפלד בשנת 197111. בקיצור, בכמה מישורים אופטיים מתחת לכיסוי הרשתית ניתן לראות תמונות-על של rhabdomeres מאומטידיה סמוכה. במישור מוקד דרך מרכז עקמומיות העין, הקרנות על-גביות אלה יוצרות תמונה המזכירה את הפריסה הטרפזית של הרבדומרים באומטידיום יחיד רק בסדרי גודל גדולים יותר. תופעה זו יכולה גם להיות נצפית ללא תלות בביטוי אקסוגני של חלבונים פלואורסצנטיים (למשל TRPL::eGFP8), אשר בכל זאת הופכים את ה-DPP לקל יותר לזיהוי (איור 1A-A'')12. שיטה לא פולשנית שנייה היא מיקרוסקופיית טבילה במים המסתמכת על הדמיה של חלבונים המתויגים באופן פלואורסצנטי לאחר נטרול אופטי של המנגנון הדיופטרי של העיניים באמצעות מים (איור 1B-C'')12. באמצעות שיטת טבילת המים, ניתן להעריך באופן כמותי את הכמות היחסית של TRPL::eGFP ברבדומרים או בגוף התא עבור תאים פוטורצפטורים בודדים. יתר על כן, ניתן להשתמש בחלבונים שאינם מתויגים בפלואורסצנציה כדי להעריך את שלמות הרבדומרל ולקבוע את מהלך הזמן של התנוונות פוטנציאלית באופן כמותי, כפי שמתואר כאן.
בעוד שהקלטות של ה-DPP הן ללא ספק הקלות והמהירות ביותר מבין השיטות הללו לביצוע, הרזולוציה המרחבית של הנתונים שהן מייצרות מוגבלת. בנוסף, ישנן סיבות רבות מדוע DPP עשוי להיות נעדר, אשר אינם בהכרח ניתן להבחין על ידי הדמיית DPP עצמה. מכיוון שה- DPP מייצג סיכום של מספר אומטידיה, מידע על תאים בודדים הולך לאיבוד. לפיכך, הדמיית DPP ברזולוציה נמוכה משרתת תפקיד חשוב בסינון מספר רב של זבובים, אך בדרך כלל יש לעקוב אחריה הקלטות ברזולוציה גבוהה יותר בדרך של מיקרוסקופיה של טבילה במים. מיקרוגרפים של טבילה במים מאפשרים פרשנויות על תאים בודדים, פגמים התפתחותיים, מורפולוגיה של העיניים, אי-סלוקליזציה של חלבונים או ניוון רשתית, כמו גם כימות של השפעות אלה. פרוטוקול זה מתאר את שתי הטכניקות הללו בפירוט.
איור 1: סקירה כללית של וריאציות מיקרוסקופיה עבור עין הדרוזופילה המוצגות בפרוטוקול זה. ייצוגים סכמטיים ומיקרוגרפים למופת של הדמיית פסאודו-פופיל עמוק (DPP) פלואורסצנטית (A-A''), מיקרוסקופיית טבילת מים קטלנית (B-B'') של רבדומרים פלואורסצנטיים, ו-(C-C'') מיקרוסקופיית טיפת מים לא קטלנית של רהבדומרים פלואורסצנטיים. סרגל קנה מידה (A''): 100 מיקרומטר. סרגלי קנה מידה (B''-C''): 10 מיקרומטר. הנתון שונה מהפניה13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. שיקולים כלליים
- השתמש במניות Drosophila המבטאות חלבון פלואורסצנטי הממוקם באופן קבוע במיקום רבדומרלי לניתוח מורפולוגי (לדוגמה, TRP::eGFP, eGFP::NINAC) וטרנסלוקציה של חלבונים לניתוחים בנוגע לסחר בחלבונים (לדוגמה, TRPL::eGFP, Arr2::eGFP).
- קבעו מראש תנאי חשיפה לאור של זבובים נבחרים לצורך הגישה הניסיונית.
- להתאמה כהה, שמור את הזבובים בקופסאות חשוכות לתקופה הרצויה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. להארה של עד 16 שעות בניסויי טרנסלוקציה (לדוגמה, TRPL::eGFP המבטאת זבובים), יש לשמור על זבובים מתחת לצינור פלואורסצנטי בטמפרטורת החדר.
- בניסויים המעריכים ניוון פוטורצפטורים (לדוגמה, TRP::eGFP המבטא זבובים), שמור את הזבובים מתחת לצינור פלואורסצנטי בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס במחזור חושך של אור של 12 שעות / 12 שעות להארה ארוכת טווח של עד 28 ימים עם אור לבן.
- להארת זבובים באור צבעוני, השתמשו בקופסאות פלסטיק שקופות בצבעים שונים יחד עם צינור הפלורסנט.
- אם נעשה שימוש במלאי זבובים עם עיניים פיגמנטיות, בעלי חיים מזדקנים דווקא לניתוח השוואתי, שכן פיגמנטציה של העין עשויה לגדול באופן משמעותי עם הגיל.
הערה: לצורך פרשנות נתונים, חשוב לציין שקיימת הטיית אות עקב אפקט הגל האופטי של המבנה הרבדומרלי. בהתאם לכך, האות הפלואורסצנטי מהרבדומר תמיד יוגבר במידה מסוימת בהדמיית DPP ובמיקרוסקופיית טבילת מים ביחס לאותות המתקבלים מגוף התא. זה נצפה באופן הבולט ביותר בעיניים פיגמנטיות, שבהן פלואורסצנציה מחוץ לרבדומרים נספגת על ידי פיגמנטים אלה ויש לה חשיבות מיוחדת כאשר יש לזהות חלבוני היתוך תוך-תאיים. לפיכך, לגבי שלבים קריטיים, מחקר זה מתייחס בנפרד לזבובים לבנים ואדומים עיניים. - לגבי מיקרוסקופיה של טבילה במים, מתוארות שתי וריאציות. וריאציה קטלנית מהירה יותר, כמו גם וריאציה לא קטלנית המאפשרת התאוששות למחקרים הבאים.
2. הדמיית DPP
- הכינו את חלל העבודה עם הציוד והריאגנטים הדרושים, כפי שמוצג באיור 2. להרדים זבובים (בני 1-3 ימים) של גנוטיפ המבטא חלבון פלואורסצנטי בתאי פוטורצפטור עם CO2 על משטח זבובים. בחר בעלי חיים להדמיה תחת מיקרוסקופ סטריאו עם מקור אור קונבנציונלי והגדלה נמוכה (למשל, פי 10).
איור 2: סביבת עבודה להדמיית DPP. החומרים הדרושים הם (A) מכשיר הרדמה CO2 , (B) מיקרוסקופ סטריאו עם מנורת UV ומערכת מסנן פלואורסצנטי, (C) מקור אור, (D) מצלמה המותקנת על מיקרוסקופ עם (E) תוכנה, (F) מברשת צבע, (G) קרטון שחור, ו-(H) בקבוקון זבוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- לצורך הדמיית DPP, השאירו את הזבובים שנבחרו מורדמים והניחו את אחד מהם במרכז מטרת המיקרוסקופ על צדו, כך שעין שמאל או ימין תפנה למטרה באופן רדיאלי מדויק (איור 3A).
הערה: מאחר שהמתווה האומטידיאלי של תאי הפוטורצפטור מציג סימטריית מראה בקו האמצע הגבי-בנטרלי, עדיף לראות את ה-DPP מעט מעל או מתחת לקו המשווה של העין (איור 3B).
איור 3: מיקום הזבוב מתחת לסטריאומיקרוסקופ להדמיית DPP. (A) איור של הזבוב על צדו כאשר עין אחת פונה אל מטרת המיקרוסקופ באופן רדיאלי. (B) יש לסובב את ראש הזבוב מעט למעלה או למטה כך שהמטרה תתמקד בנקודה מעט מעל או מתחת לקו המשווה של העין כפי שמציינים החצים האדומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- הגדל את ההגדלה כך שתתאים לכל העין (למשל, פי 100) ומרכז את האומטידיה המרכזית של העין. הפחיתו את עומק השדה של המיקרוסקופ, למשל, על ידי התאמת הסרעפת בעלת הקשתית הכפולה לסביבה רדודה (איור 4A-B').
- כבו את מקור האור הקונבנציונלי והדליקו את מנורת ה-UV של המיקרוסקופ בעוצמה מרבית ובחרו את סט המסנן הפלואורסצנטי של המיקרוסקופ בהתאם לחלבון הפלואורסצנציה המבוטא בעיניים (איור 4C-E). הגדר את נתיב האור לעבר המצלמה המותקנת במיקרוסקופ.
- השתמש בתכונת ההדמיה החיה בתוך התוכנה כדי להתאים את בהירות התמונה להגדרה שמזהה רק אותות ספציפיים מהעין על-ידי התאמת זמן החשיפה וערך העלייה (לדוגמה, 80 אלפיות השנייה ו-12x, בהתאמה). התאימו מחדש את המיקרוסקופ להתמקד "לתוך" העין (מתחת לקרנית) כדי ליצור את התמונה העל-גבית של ה-DPP (איור 4C-E').
איור 4: איור של הדמיית DPP ו-DPP פלואורסצנטית. תמונות מופתיות של עיני דרוזופילה תחת תאורה קונבנציונלית ו-UV עם סט מסנן GFP, שצולמו עם מישורי מוקד משתנים המאוירים בחתכים סכמטיים דרך העין. (A) מיקרוגרף נרשם עם הגדרות בהירות של מקור אור קונבנציונלי, זמן חשיפה של 30 אלפיות השנייה, רווח של פי 1, עומק שדה עמוק ומישור מוקד ליד פני השטח של הקרנית כפי שמודגם ב-(A'). (B) מיקרוגרף נרשם עם הגדרות בהירות של מקור אור קונבנציונלי, זמן חשיפה של 30 אלפיות השנייה, רווח של פי 1, עומק שדה רדוד ומישור מוקד כ-180 מיקרומטר מתחת לפני השטח של הקרנית כפי שמתואר ב-(B'). DPP ציין. (ג-ה) מיקרוגרף נרשם עם הגדרות בעוצמה גבוהה של מקור אור UV וערכת מסנני GFP, זמן חשיפה של 80 אלפיות השנייה, רווח של פי 12, עומק שדה רדוד ומישור המוקד (C') ליד, (D') מעט מתחת, או (E') כ-180 מיקרומטר מתחת לפני השטח של הקרנית. DPP פלואורסצנטי מסומן בחץ מעוקל. סרגל קנה מידה 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- צלם תמונה של ה-DPP הפלואורסצנטי. החליפו את המיקרוסקופ בחזרה לאור הנראה ואת נתיב האור בחזרה לכיוון עיניהם. שחזרו את החיה המצולמת בבקבוקון זבובים להמשך הליכים על פי פנוטיפ ה-DPP שלה (למשל, צלבים). המשך עם החיה הבאה בשלב 2.2.
3. מיקרוסקופיית טבילה במים
- הכנת זבובים
- הכינו את חלל העבודה עם הציוד והריאגנטים הדרושים, כפי שמוצג באיור 5. מעבירים זבובים עם תנאי גיל ותאורה קבועים מראש לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל מקורר מראש ומרדימים על ידי דגירה שלהם על קרח למשך 15 עד 30 דקות.
הערה: נשאו עמכם זבובים בני יום אחד, המותאמים לחושך, כהפניה. באופן כללי, זבובים המותאמים לכהה צריכים להיות מועברים לארגז קרח עם מכסה בחושך. זבובים המותאמים לאור יכולים להיות מועברים לקרח באור החדר.
- הכינו את חלל העבודה עם הציוד והריאגנטים הדרושים, כפי שמוצג באיור 5. מעבירים זבובים עם תנאי גיל ותאורה קבועים מראש לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל מקורר מראש ומרדימים על ידי דגירה שלהם על קרח למשך 15 עד 30 דקות.
איור 5: סביבת עבודה של מיקרוסקופיית טבילה במים. החומרים הדרושים הם: (A) צינור צנטריפוגה 15 מ"ל, (B) פתיתי קרח, (C) מים מזוקקים צוננים, (D) סטריאומיקרוסקופ, (E) צלחת פטרי, (F) פלסטלינה, (G) החלקת אובייקט, (H) סיכות חרקים או קצות פיפטה ואזמל, (I) מיקרוסקופ פלואורסצנציה עם (J) תוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- בחר את ההכנה המתאימה מבין השתיים המתוארות להלן (3.1.3 וריאציה קטלנית או 3.1.7 וריאציה לא קטלנית) ובכל פעם שנעשית הבחנה בין עיניים פיגמנטיות ללא פיגמנטיות, בצע את השלבים המתאימים.
- הכן זבובים לווריאציה הקטלנית כדלקמן.
- הדביקו חתיכת פלסטלינה על שקופית אובייקט וחתיכה נוספת למרכז צלחת פטרי (למשל, 94 מ"מ Ø) ושמרו על הפרדה ביניהם לעת עתה. מלאו את צלחת הפטרי במים מזוקקים מקוררים בקרח ובכמה פתיתי קרח (איור 6A).
- שים זבוב אחד מורדם קרח מתחת לסטריאומיקרוסקופ על גבי שקופית האובייקט המצופה פלסטלינה. סובבו את הזבוב על גבו וחדרו סיכת חרקים דרך מרכז בית החזה (איור 6B). קבעו את הסיכה בצורה אופקית על החלקת האובייקט המצופה פלסטלינה וכיוונו את העין השמאלית או הימנית של הזבוב כלפי מעלה (איור 6C).
- קבעו בזהירות את מגלשת האובייקט, כאשר הצד נטול הפלסטלינה שלה פונה כלפי מטה, בצלחת פטרי ומונעת סיבוב של הזבוב. ודאו שעין הזבוב מכוסה במים (איור 6D). השתמשו במחט הכנה כדי להסיר בזהירות את בועות האוויר שאולי נוצרו סביב העין, והמשיכו מיד לרכישת התמונה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
הערה: עיכוב משמעותי ברכישת התמונה גורם להתעוררות מחדש ולתנועות של הזבוב, מה שעלול להוביל לתמונות מטושטשות.
איור 6: הכנה למיקרוסקופיה קטלנית של טבילת מים. איור של (A) החלקת עצם מצופה פלסטלינה וצלחת פטרי, (B) הצמדת זבוב דרך בית החזה על קרקע פלסטלינה, (C) כיוון זבוב על שקופית האובייקט המצופה פלסטלינה, ו-(D) מערך ניסויי סופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- הכינו זבובים לווריאציה הלא קטלנית באופן הבא.
- מעבירים זבוב אחד מורדם בקרח לתוך קצה פיפטה של 200 μL ודוחפים את הזבוב לכיוון הקצה בזהירות עם אוויר דחוס.
- חותכים את קצה הפיפטה ממש מול הראש באמצעות אזמל. באמצעות פינצטה, דחפו בזהירות את הזבוב כמה מילימטרים הרחק מהקצה. חותכים שוב את קצה הפיפטה ודוחפים את הזבוב בחזרה לכיוון הקצה עם אוויר דחוס, כך שרק ראש הזבוב בולט מקצה הפיפטה.
- הדביקו חתיכת פלסטלינה על החלקת עצם ולחצו לתוכה את קצה הפיפטה כך שעין שמאל או ימין של הזבוב תפנה כלפי מעלה (איור 7A). ממש לפני רכישת התמונה, השתמשו בפיפטה של מעבדה כדי להדביק טיפה גדולה של מים צוננים לחלק התחתון של מטרת טבילת מים (איור 7B). המשך באופן מיידי לרכישת תמונה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
הערה: עיכוב משמעותי ברכישת התמונה גורם להתעוררות מחדש ולתנועות של הזבוב, מה שעלול להוביל לתמונות מטושטשות.
איור 7: הכנה למיקרוסקופיית טיפת מים לא קטלנית. איור של (A) זבוב מורדם קר קבוע בתוך קצה פיפטה של 200 μL המותקן על מגלשת עצם מצופה פלסטלינה ו-(B) יישום של טיפת מים צוננים בצד התחתון של מטרת טבילת המים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- רכישת תמונה
- הניחו בזהירות את צלחת הפטרי (שלב 3.1.3) או את החלקת האובייקט (שלב 3.1.7) עם הזבוב המוכן על במת המיקרוסקופ ובחרו מטרת טבילת מים.
- הנמיכו את מטרת טבילת המים באופן ידני עד שהם נוגעים בפני המים (שלב 3.1.3) או שהעין של הזבוב נוגעת בטיפה (שלב 3.1.7) (איור 8A,B).
- הפעילו את מנורת ה-UV של המיקרוסקופ ובחרו את ערכת הסינון המתאימה. השתמשו בעיניות כדי למקם את הזבוב מתחת למטרה ולמקד את המיקרוסקופ על פני השטח של העין.
- החלף את נתיב האור לכיוון מצלמת המיקרוסקופ וצור תמונה חיה בתוכנה המתאימה. התאימו מחדש את המיקוד למצלמה והעריכו את כיוון העין, בהתחשב בכך שהעין צריכה להתמודד עם מטרת המיקרוסקופ באופן רדיאלי כפי שמודגם בפירוט רב יותר באיור 8C-E.
איור 8: מיקום הזבוב מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי לצורך הדמיית טבילה במים. הגדרה וכיוון סופי לרכישת תמונה באמצעות (A) פרוטוקולי הכנת זבובים קטלניים או (B) לא קטלניים. (C) המחשה של כיוון זבוב להשגת התוצאות הטובות ביותר של תמונות מיקרוסקופיית טבילה במים. הנקודה האידיאלית להתמקד בעין אינה המרכז המדויק ביחס לצירים הקדמיים/אחוריים והגחוניים/הגחוניים, אלא מעט מעל קו המשווה של העין, כפי שמעיד החץ האדום. (D) דוגמה לתמונת טבילה במים לעין במיקום מושלם. כל שלושת צירי הסימטריה של הריצוף האומטידיאלי המשושה מופיעים כקווים ישרים והכמות המרבית של אומטידיה יכולה להיות בפוקוס בו זמנית. (E) דוגמה לתמונת טבילה במים של עין הממוקמת בצורה לא נכונה. התמונה מכילה צירים מעוקלים ועומק שדה רדוד. סרגל קנה מידה: 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- השתמש ב- LUT המתאים (טבלת חיפוש למעלה) בתוך תוכנת ההדמיה כדי לזהות גלישת יתר (מסומנת כפיקסלים אדומים).
- במקרה של זבובים ללא פיגמנט, התאם את זמן החשיפה כך שהפיקסלים הבהירים ביותר יהיו ממש מתחת לגבול הרוויה עבור כל תמונה.
- במקרה של זבובים פיגמנטיים והשונות הקטלנית, התאימו את זמן החשיפה כך שכל הפיקסלים הבהירים ביותר יהיו מעט מתחת לגבול הרוויה בחמישה זבובים בני יום אחד לפחות, המותאמים לכהים. החל את זמן החשיפה הממוצע המחושב על כל תנאי הניסוי האחרים (גנוטיפים, תנאי תאורה, נקודות זמן וכו ').
- במקרה של זבובים פיגמנטיים (למשל, אדומי עיניים) והשונות הלא קטלנית, התאימו את זמן החשיפה כך שכל הפיקסלים הבהירים ביותר יהיו ממש מתחת לגבול הרוויה עבור כל זבוב בן יום אחד, מותאם לכהה בנפרד. החל את זמן החשיפה הזה על כל תנאי הניסוי האחרים (תנאי תאורה, נקודות זמן וכו') של זבוב זה.
- הקלט תמונה ושמור אותה כקובץ גולמי כדי לאחסן בארכיון את כל המטא-נתונים המתאימים של ההקלטה. ייצא את התמונה בתבנית .tif עבור הכימות הבא.
הערה: במקרה של הווריאציה הלא קטלנית, האירו את הזבובים במשך 5 דקות באור אדום (למשל, 630 ננומטר) מיד לאחר רכישת התמונה, אם הם מיועדים לשמש לניסויים נוספים. אור אדום משבית את מפל הפוטו-טרנסדוקציה שהופעל בצורה מוגזמת על-ידי אור אינטנסיבי בגלים קצרים במהלך רכישת התמונה.
- ניתוח נתונים וכימות של פלואורסצנציה eGFP יחסית ברבדומרים של מיקרוגרפים של טבילת מים
- הורד, התקן והפעל את התוכנה ImageJ/Fiji.
- התאם את הגדרות ImageJ על ידי לחיצה על נתח > הגדר מדידות... וסמן רק את התיבה עבור 'ערך אפור ממוצע'. ייבוא תמונה .tif על-ידי לחיצה על קובץ > פתח... או על ידי גרירה ושחרור. בחר אזור מייצג של התמונה שנמצא במוקד והגדל אותה ל- 200%-300% על-ידי הקשה חוזרת ונשנית על Ctrl ו - + יחד .
- בחר בכלי הסגלגל ותוך כדי לחיצה על מקש Shift צור בחירה מעגלית בתמונה הקטנה משמעותית מרבדומר פלואורסצנטי אחד. לפני שחרור לחצן העכבר, חפש את הגודל המדויק המוצג מתחת לסרגל הכלים בחלון הראשי של ImageJ. השתמש באותו גודל של בחירה מעגלית עבור כל הניתוחים.
הערה: הגודל המדויק של הבחירה המעגלית בפיקסלים או במיקרונים תלוי בהגדרה הספציפית. השתמש בעיגול בערך 1/3 או 1/4 מהקוטר הרבדומרלי של זבובי בקרה בני יום אחד, המותאמים לכהה. - הזז את הבחירה העגולה על-ידי לחיצה על העכבר לתוכו וגרירה או על-ידי לחיצה על מקשי החצים במקלדת.
- כדי למדוד את עוצמות הפלואורסצנציה בתוך הבחירה המעגלית, הזז את המעגל ל- rhabdomere הראשון (r1) ולחץ על נתח > מדוד או השתמש בקיצור המקשים Ctrl + M. חלון תוצאה המפרט את הערך האפור שנמדד יופיע.
- המשך עם מדידות של r2-r6 כמדידות חוזרות ומדידת אות הרקע (b). במקרה של זבובים ללא פיגמנט, בצע מדידות נוספות של אזורי גוף התא המתאימים (c1-c6) (איור 9).
איור 9: כימות של פלואורסצנציה רבדומרלית יחסית למחקרי טרנסלוקציה. המחשה לגבי כימות פלואורסצנציית eGFP יחסית ברבדומרים על ידי מדידת עוצמת הפלואורסצנטיות של rhabdomere (r), גוף התא (c) והרקע (b) של שלושה אומטידיה מייצגת (עיגולים לבנים) שונים בתמונת מיקרוסקופיית טבילה אחת במים; סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אומטידיום מוגדל מוצג מימין; סרגל קנה מידה: 2 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- חזור על שלבים 3.3.5 ו- 3.3.6 עבור שני אומטידיה נוספים, וכתוצאה מכך שלושה שכפולים טכניים. סמן את האומטידיה המנותחת באמצעות הכלי עיפרון ושמור תמונה זו לתיעוד.
- בחר והעתק את הערכים האפורים שנמדדו מחלון התוצאה והדבק אותם בתוכנת גיליון אלקטרוני לצורך חישובים נוספים. מיין את הערכים של עוצמת הפלואורסצנציה לפי מקורם לקטגוריות rhabdomere (r), גוף התא (c) והרקע (b). חשב את העוצמה הממוצעת מכל קטגוריה (Ir, Ic, Ib).
- חשב את הכמות היחסית של eGFP הקיימת ברבדומר (R), באמצעות הנוסחה הבאה (1) עבור ללא פיגמנט ונוסחה (2) עבור עיניים פיגמנטיות:
(1)
(2) - המשך עם התמונה הבאה בשלב 3.3.3. מומלץ להשתמש בתמונות של לפחות חמישה פרטים מכל קבוצת ניסוי כשכפולים ביולוגיים כדי לקבל מדידה אמינה.
(1)
(2)- ניתוח נתונים וכימות של מורפולוגיה של העין על ידי פלואורסצנציה eGFP במיקרוגרפים של טבילה במים
- הורד, התקן והפעל את תוכנת ImageJ/Fiji. ייבא תמונה .tif על-ידי לחיצה על קובץ > פתח... או על-ידי גרירה ושחרור. בחר שלוש אומטידיה סמוכות באזור מייצג של התמונה שנמצאת במוקד.
- הערך את 18 הרבדומרים של הברירה בנפרד על פי עוצמת ה- eGFP שלהם, חדות הקצוות והניגודיות ביחס לאות הרקע שמסביב כדי ליצור מדד ניוון. ניקוד של rhabdomeres גלויים בבירור עם ערך של 2, rhabdomeres גלויים חלשים עם ערך של 1, rhabdomeres נעדרים עם ערך של 0 (איור 10).
הערה: דרך כימות זו מביאה לציון של 36 לעיניים שלמות לחלוטין ולציון של 0 לעיניים מנוונות לחלוטין. מומלץ לקבוע את הציון של 36 עד 100% על מדד הניוון.
איור 10: כימות באמצעות הערכת rhabdomere למחקרי ניוון. המחשה לגבי כימות מורפולוגיה של העין על ידי ניקוד הרבדומרים של שלושה אומטידיה מייצגים שונים (עיגולים לבנים) בתמונת מיקרוסקופיית טבילה אחת במים עם ערכים של 2 (גלוי בבירור; עיגול כחול), 1 (נראה חלש; עיגול כתום), או 0 (נעדר; עיגול אדום). סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אומטידיום מוגדל מוצג מימין; סרגל קנה מידה: 2 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
- פתח את התמונה הבאה והמשך עם שלב 3.4.2. מומלץ להשתמש בתמונות של לפחות שמונה פרטים מכל קבוצת ניסוי כשכפולים ביולוגיים כדי לקבל מדידה אמינה.
הערה: מכיוון ששיטת כימות זו פחות אובייקטיבית מהשיטה לכימות טרנסלוקציה על ידי עוצמת פלואורסצנציה, המספר המומלץ של שכפולים גבוה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נוצרו זבובי דרוזופילה מהונדסים המבטאים חלבון היתוך TRPL::eGFP בשליטת מקדם רודופסין 1. בזבובים אלה, TRPL::eGFP מתבטא בתאי פוטורצפטור R1-6 של העין המורכבת ומציג לוקליזציה תלוית תאורה. כאשר זבובים נשמרים בחושך, TRPL::eGFP משולב ברבדומרים החיצוניים. לאחר ההארה במשך מספר שעות, TRPL מבצע טרנסלוקציה לתוך גוף התא, שם הוא מאוחסן בתא מועשר ב-ER. 8,10 כאשר TRPL::eGFP ממוקם ברבדומרים, ניתן לראות את הפלואורסצנציה שלו ב- DPP. עם זאת, פלואורסצנציה רבדומרלית נעלמת באור כתוצאה מהטרנסלוקציה של TRPL::eGFP (איור 11A,B). זה שימש לביצוע בדיקה גנטית למוטנטים פגומים בהפנמה של TRPL::eGFP (איור 11C,D)14,15. כדי לאפשר בידוד של מוטציות קטלניות שעלולות להיות הומוזיגוטיות, מסך זה בוצע באמצעות מערכת Flp/FRT של שמרים ליצירת שיבוטי תאים סומטיים ברקמת העין המתפתחת (כלומר, עיני פסיפס). מלבד הפשטות של בדיקת ה-DPP, יתרונות גדולים נוספים של שיטת זיהוי פלואורסצנציה זו הם התפוקה הגבוהה שלה, כמו גם האופי הלא פולשני שלה המאפשר זיהוי מוטציות בזבובים חיים ולהשתמש בזבובים אלה ליצירת מלאי זבובים מוטנטיים יציבים.
איור 11: תוצאות מייצגות מבדיקה גנטית על פגמים בטרנסלוקציה של TRPL. זבובים זכרים עברו מוטגניזציה עם אתיל מתנסולפונט (EMS) והוצלבו לנקבות המבטאות TRPL::eGFP בתאי פוטורצפטור R1-6. דור ה-F1 שנוצר כתוצאה מכך עם עיני פסיפס מוטנטיות הומוזיגוטיות מסוג Flp/FRT נבדק לאיתור פגמים בטרנסלוקציה של TRPL על ידי הדמיה של פסאודו-פופילים עמוקים פלואורסצנטיים (DPP) לאחר תקופה של הסתגלות כהה (עמודה שמאלית) כמו גם הסתגלות לאור (עמודה ימנית). (א,ב) זבובים ללא מוטציה נישאו יחד כבקרה לטרנסלוקציה רגילה של TRPL המושרה על ידי אור. ה- DPP הלא פלואורסצנטי מסומן על ידי חץ. (ג,ד) תוצאה מופתית של מוטנטים מבודדים הפגומים בטרנסלוקציה של TRPL המופעלת על ידי אור. סרגל קנה מידה: 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
מוטנטים פגומים (ttd) של טרנסלוקציה TRPL שבודדו מהבדיקה הגנטית הזו זוהו מאוחר יותר והפגמים שלהם אופיינו ביתר פירוט בעזרת הדמיית טבילת מים. מיקרוסקופיית טבילה במים יושמה כדי להעריך את הלוקליזציה של חלבונים ברבדומרים ובגופי התאים או כדי לעקוב אחר פגמים במבנה הרבדומרלי עקב ניוון פוטורצפטורים באופן כמותי כפי שמתואר בפרוטוקול. איור 12A,B ממחיש את הכימות של כמות ה-TRPL::eGFP הנמצאת ברבדומרים של זבובים עם עיני פסיפס מוטנטיות שאינן מוטנטיות ולולהttd12 בחושך, באור ולאחר הסתגלות שנייה לחושך. בזבובי שליטה (שאינם מוטנטיים), TRPL::eGFP מתחלף מתוך ה-rhabdomeres לתוך גוף התא לאחר 16 שעות של תאורה וכתוצאה מכך יורדת ה-TRPL::eGFP של rhabdomeral לכ-45% בהשוואה למצב המותאם לכהה. הדגירה הכהה השנייה מעלה שוב את הפלואורסצנציה הרבדומרלית ל-95% מהערך ההתחלתי. המוטציה lolattd12 בודדה על ידי בדיקת DPP עקב פגם הטרנסלוקציה TRPL שלה. בהתאם לכך, נראה כי תבנית הפלואורסצנציה TRPL::eGFP בתמונות טבילה במים של רבדומרים אינה משתנה באופן דרסטי לאחר 16 שעות של תאורה והתאמת חושך לאחר מכן במשך 24 שעות. עם זאת, התמונות חושפות גם כי מוטנטים של lolattd12 פגומים מבחינה התפתחותית, מה שמעיד על היעדר מזדמן של תאים פוטורצפטורים כפי שתואר קודם לכן עבור מוטנטים אחרים של לולה 16. פגמים מורפולוגיים אלה גורמים לחוסר יכולת למדוד אות רקע תקף, ומונעים כימות נכון באמצעות נוסחה (1). לעומת זאת, vps35MH20 הוא מוטציה המציגה פגם טרנסלוקציה TRPL מבלי להשפיע על המורפולוגיה האומטידיאלית בדרך זו10. במוטציה זו, שיטת הכימות המתוארת כאן יכולה לזהות פגם מיחזור מובהק ביותר מבחינה סטטיסטית (איור 12C,D).
איור 12: תוצאות מייצגות של פגם בתעתיק TRPL בזבובים המוטנטיים של לולה ו-vps35 ובמגבלות של שיטת הכימות. (A) TRPL::eGFP-המבטאים זבובים שאינם מוטנטיים ולולהttd12 בעלי עיני פסיפס מוטנטיות דוגרו בחושך במשך 3 ימים, מוארים באור כתום במשך 16 שעות, והותאמו לחושך במשך 24 שעות בפעם השנייה. תמונות של רהבדומרים פלואורסצנטיים צולמו בדרך של מיקרוסקופיה של טבילת מים כדי לתעד את ה-TRPL התת-תאי::eGFP לוקליזציה כמתואר בשלב 3.2.6. (B) כימות של פלואורסצנציה רבדומרלית של בעלי חיים מוטנטיים שאינם מוטנטיים (אפורים) ולולהttd12 מוטנטיים (ירוקים) כמתואר בשלב 3.3.9 באמצעות נוסחה (1). סרגלי השגיאה מייצגים את ה-SEM. (C) TRPL::eGFP-המבטאים זבובים שאינם מוטנטיים ו-vps35MH20 בעלי עיני פסיפס מוטנטיות דוגרו בחושך במשך 3 ימים, הוארו באור כתום במשך 16 שעות, והותאמו לחושך במשך 24 שעות בפעם השנייה. תמונות של רהבדומרים פלואורסצנטיים צולמו בדרך של מיקרוסקופיה של טבילת מים כדי לתעד את ה-TRPL התת-תאי::eGFP לוקליזציה כמתואר בשלב 3.2.6. (D) כימות של פלואורסצנציה רבדומרלית של בעלי חיים שאינם מוטנטיים (אפורים) ו-vps35MH20 (אדומים) כמתואר בשלב 3.3.9 באמצעות נוסחה (1). פסי שגיאה מייצגים את SEM. המובהקות הסטטיסטית חושבה כהשוואות מרובות עם תיקון Bonferroni לאחר ANOVA (ns, לא משמעותי; *, p ≤ 0.05; ***, p ≤ 0.001). סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. לוחות C ו- D שונו מהפניה10. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
כפי שכבר הוזכר בפרוטוקול, פיגמנטציה של העין משפיעה באופן משמעותי על תמונת טבילת המים המתקבלת. זבובים בעלי עיניים לבנות מאפשרים זיהוי של אותות פלואורסצנטיים הן מהרבדומר והן מגוף התא, ובכך מאפשרים קביעה מדויקת למדי של יחס ההתפלגות TRPL::eGFP. לעומת זאת, בזבובים אדומי עיניים TRPL::eGFP האות ניתן לזיהוי רק ברבדומרים אך לא בגופי התאים (איור 13A). הסיבה לכך היא שמולקולות פיגמנט בולעות את האור הנפלט מ-TRPL::eGFP. אף על פי כן, על ידי שימוש בנוסחה (2) לעיניים פיגמנטיות, הכימות חושף יפה את התנהגות הטרנסלוקציה TRPL::eGFP בזבובים לבנים כמו גם אדומי עיניים. בהתאם לכך, הערכים המקבילים של פלואורסצנציית הרבדומרים יורדים מ-100% במצב המותאם לחושך ל-25% ו-5% לאחר ההארה ועולים שוב ל-80% ו-90% כתוצאה מדגירה כהה שנייה (איור 13B).
איור 13: תוצאות מייצגות של TRPL::eGFP פלואורסצנציה בזבובים לבנים ואדומים עיניים. (A) TRPL::eGFP-המבטאים זבובים לבנים ואדומים-עיניים דוגרו בחושך במשך יום אחד, הוארו באור כתום במשך 16 שעות, והותאמו למשך 24 שעות בפעם השנייה. תמונות של רבדומרים פלואורסצנטיים צולמו בדרך של מיקרוסקופיית טיפת מים לא קטלנית כדי לתעד TRPL תת-תאי::eGFP לוקליזציה כמתואר בשלבים 3.2.6 (זבובים לבנים עיניים) ו-3.2.8 (זבובים אדומי עיניים). (B) כימות של פלואורסצנציה רבדומרלית בזבובים לבנים עיניים (אפורים) ואדומים עיניים (אדומים). זבובים בעלי עיניים לבנות כומתו באמצעות נוסחה (1) וזבובים אדומי עיניים, תוך שימוש בנוסחה (2), כמתואר בשלב 3.3.9. סרגלי שגיאות מייצגים את SEM. סרגל קנה מידה: 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
להערכת ניוון פוטורצפטורים, ניתן לקבוע מדד ניוון המבוסס על הפלואורסצנציה של TRP::eGFP ברבדומרים (ראו פרוטוקול). שיטת כימות זו מומחשת באיור 10. בתוצאות הייצוגיות כאן, זבובים שאינם מוטנטיים ו-sdhAttd11 בעלי עיני פסיפס מוטנטיות הוחזקו במחזור חשוך של 12 שעות / 12 שעות במשך שבועיים, והשלמות של rhabdomeres נחקרה כל 2-4 ימים על ידי התבוננות ב-TRP::eGFP באמצעות מיקרוסקופיה של טבילת מים (איור 14A). העקומה המתקבלת מראה ירידה במדד הניוון בזבובי הבקרה אך לא בזבובי הבקרה (איור 14B).
איור 14: תוצאות מייצגות של התנוונות רשתית הנגרמת על-ידי אור בזבובים מוטנטיים מסוג sdhA . (A) TRP::eGFP-המבטאים זבובים שאינם מוטנטיים ו-sdhAttd11 בעלי עיני פסיפס מוטנטיות דוגרו במשך 14 יום במחזור חושך של אור של 12 שעות / 12 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס. תמונות של רבדומרים פלואורסצנטיים צולמו באמצעות מיקרוסקופיה של טבילה במים במרווחי זמן קבועים כדי לתעד את בריאות הרשתית. (B) כימות של פלואורסצנציה רבדומרלית מסוג פראי (אפור) ו-sdhAttd11 מוטציה (כתומה) זבובים כמתואר בשלב 3.4. סרגלי שגיאות מייצגים את SEM. סרגל קנה מידה: 10 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הישימות של חלבונים פלואורסצנטיים ופשטות ההקרנה על ידי הדמיית DPP ומיקרוסקופיה של טבילת מים ברשתית הוכחו כמוצלחות על ידי קבוצות רבות12. אסטרטגיות דומות לאלה שהוצגו כאן שימשו במספר בדיקות גנטיות כדי לזהות פגמים ברמות ביטוי רודופסין, הומאוסטזיס, ארגון רשתית או שלמות תאית בעזרת Rh1::eGFP 17,18,19,20,21. כפי שהוסבר לעיל, ניתן להשתמש בהעתקת חלבוני היתוך כמו TRPL::eGFP כדי לזהות אם תהליכי סחר בחלבונים מהרבדומר ואליו נפגעים, למשל, במסכי מוטגנזה. מצד שני, ניתן להשתמש בחלבוני היתוך רבדומרליים באופן קבוע כמו TRP::eGFP כדי לחקור את המורפולוגיה של הרבדומרים. DPP ומיקרוסקופיה של טבילה במים נחשבים לשיטות מצוינות לניתוחים ומסכים בתפוקה גבוהה במודל של עין דרוזופילה. עם זאת, מומלץ לבצע בסופו של דבר ניתוחים היסטוכימיים (אימונוניים) של אומטידיה מבודדת או רקמת רשתית בחתך קריו כדי לאשש את התוצאות המתקבלות על ידי DPP או מיקרוסקופיה של טבילת מים. בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ברזולוציה גבוהה, טכניקות אלה מאפשרות פרשנויות לקראת לוקליזציות תת-תאיות מדויקות. להלן, מוצעות מספר הנחיות כיצד לפתור את תהליכי ההדמיה של DPP ומיקרוסקופיית טבילת מים ברשתית החשובה במיוחד לניתוחים כמותיים נכונים.
לגבי ה-DPP, אם הסופרפוזיציה של הפלואורסצנציה מטושטשת או לא ברורה, ייתכן שההגדרות אינן נכונות. אפשרות אחת היא שהעין אינה פונה למטרה במדויק באופן רדיאלי או שהמיקוד מוגדר לאזורים ההיקפיים של העין. מאחר שהמתווה האומטידיאלי של תאי הפוטורצפטור מציג סימטריית מראה בקו האמצע הגבי-ונטרלי, ניתן לראות תבנית יוצאת דופן ב-DPP, אם האותות מזוהים משתי ההמיספרות של העין. איכות ה-DPP מסתמכת במידה רבה גם על עומק שדה רדוד כדי ליצור חתך אופטי דרך העין המורכבת. אם פני השטח של משטח ה-flypad מציגים פלואורסצנציה אוטומטית, ניתן להניח את הזבוב על פיסת קרטון שחורה שחורה שאינה פלואורסצנטית על גבי משטח הטיסה. חוסר יכולת להקליט DPP עשוי להיות קשור למגוון סיבות בסיסיות, כולל מיקום זבוב לא אופטימלי, רמות ביטוי נמוכות של החלבון הפלואורסצנטי, ארכיטקטורת רשתית לא מאורגנת או תהליכים ניווניים. בעת הדמיית ה-DPP, יש לציין גם כי פלואורסצנציה ציטופלסמית בזבובים לבנים עשויים לפזר את גבולות האות מהרבדומרים, ורמות הביטוי של חלבון עשויות להשתנות באופן משמעותי בין פרטים ולהשפיע על איכות ה-DPP שנוצר. לכן, במקרה של הדמיית DPP פלואורסצנטית, זה יתרון להשתמש זבובים עם עיניים פיגמנטיות. בשל ספיגת אותות פלואורסצנטיים מגופי התאים, ה-DPP שנוצר עשוי להיראות חד יותר מאשר בזבובים בעלי עיניים לבנות.
כדי למנוע תמונות מטושטשות במיקרוסקופיה של טבילת המים, יש לבצע את רכישת התמונה במהירות לאחר הכנת הזבוב כדי למנוע התעוררות מחדש ותנועות של הזבוב. עבור תמונות באיכות גבוהה, האותות הפלואורסצנטיים הבהירים ביותר מהעין צריכים להגיע כמעט לרוויה בכל התמונות אם משתמשים בזבובים בעלי עיניים לבנות. ניתן להשיג זאת על ידי התאמת זמן החשיפה במהלך ההדמיה. מאחר שפיגמנטציה מעכבת זיהוי של פלואורסצנציית eGFP ציטוזולית, הגישה המתוארת עבור זבובים בעלי עיניים לבנות להתאים את זמן החשיפה תגרום תמיד לאותות פלואורסצנטיים רבדומרליים חזקים בעיניים פיגמנטיות, ותעוות את הפרשנות והכימות שלאחר מכן. בנוסף, על ידי שימוש בעיניים פיגמנטיות, הלבנת תמונות עקב חשיפה חזקה לאור כחול עלולה להוביל לאותות חלשים יותר ובכך לפרשנות שגויה של נתונים. בהתאם להקשר (כלומר, קטלני או לא קטלני), שני הליכים חלופיים מוצגים בפרוטוקול לעיניים פיגמנטיות. באופן כללי, יש להעדיף את השונות הלא קטלנית בעיניים פיגמנטיות, שכן ניתן למדוד את אותו זבוב שוב ושוב, והערכת זמן חשיפה ספציפי עבור כל זבוב בנפרד מביאה לכימות מדויק יותר ויכולת שכפול גבוהה יותר מאשר קביעת זמן חשיפה ממוצע שנוצר מדגימה. עם זאת, השונות הלא קטלנית דורשת גם טיפול רב יותר בטיפול בבעלי חיים כדי להבטיח את הישרדותם במהלך מדידות חוזרות ונשנות. ניתן להשיג זאת על ידי שימוש רק באוויר בלחץ נמוך כדי להעביר זבובים לתוך קצה הפיפטה ושימוש זהיר בפינצטה כדי לשחרר את הזבוב מקצה הפיפטה לאחר ההדמיה. מכיוון שהזבובים אינם שקועים במים מצוננים בקרח במהלך ההליך, קיים סיכון מוגבר להתעוררות מחדש. כתוצאה מהמדידות החוזרות ונשנות מדגימות בודדות, כל סדרת המדידות תקפה רק אם הזבוב נשאר ללא פגע מתחילתו ועד סופו. כתוצאה מכך, השונות הלא קטלנית היא מאוד עתירת עבודה וגוזלת זמן. הווריאציה הקטלנית, לעומת זאת, מאפשרת תפוקה גבוהה יותר מכיוון שניתן להצמיד מספר זבובים ברצף על אותה סיכת חרקים ולרשום אותם ברצף בסיבוב אחד של רכישת תמונה. עם זאת, זבובים מרובים על אותה סיכה דורשים גם הדמיה מהירה עוד יותר כדי למנוע התעוררות מחדש ותנועות. החיסרון האחרון של השונות הקטלנית הוא כמובן חוסר היכולת לשחזר את בעלי החיים לאחר ההדמיה עבור יישומים מאוחרים יותר (למשל, צלבים, מדידות חוזרות).
בנוגע לכימות הטרנסלוקציה, פרוטוקול זה מציג נוסחה (1), המתייחסת לאותות פלואורסצנטיים מהרבדומר כמו גם מגוף התא, ובכך יוצרת הערכה טובה מאוד להתפלגות היחסית של החלבון הטרנסלוקציה בתוך התא (איור 12D). בשל היעדר מדידות פלואורסצנטיות מגוף התא במקרה של עיניים פיגמנטיות, מוצעת פורמולה (2), שעובדת היטב עבור בעיה זו שנתקלים בה לעתים קרובות (איור 13B). מלבד פיגמנטציה של העין, ישנן נסיבות נוספות המונעות את הכימות עם כל אחת מהנוסחאות הללו. אחד המקרים האלה מוצג באיור 12A,B בצורה של המוטציה lolattd12. במוטציה זו, באופן ספציפי, היעדרו של תא פוטורצפטור R7 משפיע באופן משמעותי על המורפולוגיה האומטידיאלית ובכך על היכולת לרכוש מדידות עוצמה סבירות של פלואורסצנציית רקע מאזור זה. אם נעשה שימוש באותה שיטה של כימות טרנסלוקציה למרות בעיות אלה, התוצאות מציגות שונות גבוהה, קשות להשוואה עם פקדים, ועלולות להתפרש באופן שגוי. הדוגמה של המוטציה lolattd12 ממחישה אפוא את גבולותיה של שיטת כימות זו, המסתמכת באופן בלתי נמנע על מורפולוגיה דמוית "סוג פראי" למדידות עוצמה נכונות. במקרים נדירים שבהם יש לכמת פגמים בטרנסלוקציה של חלבונים באומטידיה פגומה מבחינה מורפולוגית, הפרוטוקול המוצג כאן נכשל ויש להתאים אותו בהתאם. זה כולל שינויים מתאימים בנוסחה כדי לא לכלול מדידות שלא ניתן להשיג באופן סביר או לכלול מדידות נוספות של אזורים מייצגים אחרים.
במקרה של כימות של תהליכים ניווניים, ספי עוצמת פלואורסצנטיות התבררו כאינדיקטור לא טוב, שכן יש יותר מדי שונות בתוך ובין rhabdomeres. שונות זו נמדדת בממוצע על פני כל 18 הרבדומרים שנמדדו בשיטה לכימות טרנסלוקציה. עם זאת, בשל ההערכה האינדיבידואלית של כל רבדומר בהערכת הניוון, לא ניתן לחשב את השונות בעוצמות הפלואורסצנטיות. יתר על כן, אינטנסיביות היא רק אחד המאפיינים שיש לקחת בחשבון. היבטים חשובים אחרים הם ניגודיות וחדות הקצוות. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מציג שיטת כימות המבוססת על סיווג המורפולוגיה של rhabdomeres על פי הפלואורסצנטיות שלהם לפי העין. זה בהכרח סובייקטיבי במידה מסוימת. אף על פי כן, בהינתן ניסיון מספיק, פרוטוקול זה הוכיח את עצמו כשיטה שימושית, מהירה וניתנת לשחזור של כימות לניוון (איור 14) ופורסם מספר פעמים22,10. כמו בכל ההערכות הסובייקטיביות, תמיד רצוי לבצע אותן בהקשר עיוור. פרוטוקולים מקבוצות אחרות משתמשים בדרך כלל רק בשתי קטגוריות כדי לכמת את ניוון הרשתית בדרוזופילה (נוכחות או היעדרות של rhabdomeres), אשר עשוי להיות פחות סובייקטיבי, אבל גם פחות מדויק. בנוסף, לדרך כימות זו עדיין יש בעיה של הגדרת נקודת חיתוך בין שתי הקטגוריות, שעשויה להיות קשה באותה מידה להגדרה אובייקטיבית.
לגבי שינויים ויישומים מתקדמים של השיטות שהוצגו כאן, ניתן גם להעריך את הכמות היחסית של שני חלבוני היתוך פלואורסצנטיים בו זמנית על ידי הדמיה של צבע כפול. לדוגמה, על ידי שימוש ב- TRPL::HcRed וב- TRP::eGFP, TRPL::HcRed translocation הוערך בהתחשב בשלמות הרבדומרלית באותו זבוב23. הדמיית צבע כפול משמשת גם בשיטת עגבניות/GFP-FLP/FRT, למשל, כדי לזהות גורמים הגורמים לאפופטוזיס24. וריאציה זו מאפשרת לדמיין את התנוונותם של תאי פוטורצפטור באמצעות ninaC::eGFP בשיבוטי תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי על ידי ninaC::tdTomato. יישום נוסף של מיקרוסקופיית טבילה במים הוא ניטור של תחלופת פוספוינוסיטיד בפוטורצפטורים. לשם כך, נעשה שימוש בתחומים קושרי פוספונינוסיטיד המתויגים באופן פלואורסצנטי כגון תחום ההומולוגיה הפלקסטרין (PH) מ- PLCδ1. בדיקות פלואורסצנטיות אלה מאפשרות מעקב אחר השפלת הפוספוינוסיטיד לאורך זמן על ידי זיהוי הירידה של פלואורסצנציה רבדומרלית הנגרמת על ידי דיפוזיה של הגשושית מהרבדומר לציטוסול25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לחוקרים הסטודנטים שלנו לאורך השנים. בפרט, נינה מאייר, סיביל מאייר, ג'וליאן קאים ולורה ג'אגי, שנתוניהם שימשו בפרוטוקול זה כתוצאות מייצגות. המחקר של הקבוצה שלנו שהוצגה כאן מומן על ידי מענקים מ- Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) לארמין הובר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| CO2 anaesthesia fly pad | Flystuff | 59-172 | |
| Cold light lamp (KL 1500 LCD) | Zeiss | ||
| Fiji/ImageJ | NIH | ||
| Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition) | Zeiss | ||
| Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2] and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2] |
Osram | 4050300518039 | |
| Laboratory pipette (20-200 µL) | Eppendorf | ||
| Object slide | Roth | 0656.1 | |
| Petri dish (94 mm) | Greiner Bio-One | 633102 | |
| Pipette tips (200 µL) | Labsolute | 7695844 | |
| Plasticine (Blu-Tack) | Bostik | 30811745 | |
| Stereo microscope (SMZ445) | Nikon | ||
| Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12) | Leica |
References
- Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H.
- Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
- Hardie, R. C. The photoreceptor array of the dipteran retina. Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).
- Wang, T., Montell, C. Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).
- Xiong, B., Bellen, H. J. Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly. Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).
- Bähner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
- Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).
- Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade. Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).
- Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin. European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).
- Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum. Traffic. , (2021).
- Franceschini, N., Kirschfeld, K. Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila. Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).
- Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128 (6), 815-826 (2001).
- Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).
- Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2005).
- Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL. Fly. 2 (1), 36-46 (2008).
- Zheng, L., Carthew, R. W. Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye. Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).
- Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).
- Huang, Y., Xie, J., Wang, T. A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila. PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).
- Zhao, H., Wang, J., Wang, T. The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).
- Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
- Zhao, H., Wang, T. PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila. PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).
- Cerny, A. C., et al. The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells. PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).
- Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2007).
- Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).
- Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
- Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).
