Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

EGFP-टैग किए गए प्रोटीन का उपयोग कर ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में झिल्ली प्रोटीन तस्करी का अध्ययन

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63375
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Biology, Department of Biochemistry, University of Hohenheim

Summary

यहां, फोटोरिसेप्टर झिल्ली प्रोटीन के स्थानीयकरण और ईजीएफपी प्रतिदीप्ति का उपयोग करके ड्रोसोफिला यौगिक आंख में रेटिना अध: पतन के मूल्यांकन के लिए गैर-आक्रामक तरीकों का वर्णन किया गया है।

Abstract

झिल्ली प्रोटीन तस्करी प्लाज्मा झिल्ली में रिसेप्टर्स और आयन चैनलों के निगमन और हटाने को नियंत्रित करती है। यह प्रक्रिया कोशिका समारोह और न्यूरॉन्स की कोशिका अखंडता के लिए मौलिक रूप से महत्वपूर्ण है। ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं झिल्ली प्रोटीन तस्करी का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल बन गई हैं। रोडोप्सिन के अलावा, जो रोशनी पर फोटोरिसेप्टर झिल्ली से आंतरिक हो जाता है और अवक्रमित हो जाता है, ड्रोसोफिला में क्षणिक रिसेप्टर संभावित (टीआरपीएल) आयन चैनल रैबडोमेरल फोटोरिसेप्टर झिल्ली (जहां यह अंधेरे में स्थित है) और फोटोरिसेप्टर सेल बॉडी (जिसमें इसे रोशनी पर ले जाया जाता है) के बीच एक प्रकाश-निर्भर स्थानांतरण प्रदर्शित करता है। TRPL के इस इंट्रासेल्युलर परिवहन का अध्ययन फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में eGFP-टैग किए गए TRPL को व्यक्त करके एक सरल और गैर-आक्रामक तरीके से किया जा सकता है। ईजीएफपी प्रतिदीप्ति को तब या तो गहरे स्यूडोपिपल में या पानी के विसर्जन माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जा सकता है। ये तरीके बरकरार आंखों में प्रतिदीप्ति का पता लगाने की अनुमति देते हैं और इसलिए टीआरपीएल ट्रांसलोकेशन में दोषपूर्ण ड्रोसोफिला म्यूटेंट के लिए उच्च-थ्रूपुट एसेस और आनुवंशिक स्क्रीन के लिए उपयोगी हैं। यहां, मक्खियों की तैयारी, माइक्रोस्कोपिक तकनीकों, साथ ही साथ टीआरपीएल के इस प्रकाश-ट्रिगर ट्रांसलोकेशन का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले परिमाणीकरण विधियों को विस्तार से समझाया गया है। इन तरीकों को अन्य ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर प्रोटीन पर तस्करी के अध्ययन के लिए भी लागू किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, रोडोप्सिन। इसके अलावा, ईजीएफपी-टैग किए गए रैबडोमेरल प्रोटीन का उपयोग करके, इन तरीकों का उपयोग फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के अध: पतन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

प्लाज्मा झिल्ली से प्रोटीन को वितरित करने और हटाने से, न्यूरॉन्स में झिल्ली प्रोटीन तस्करी रिसेप्टर्स के साथ-साथ आयन चैनलों के साथ प्लाज्मा झिल्ली उपकरण को नियंत्रित करती है और परिणामस्वरूप, न्यूरोनल फ़ंक्शन को नियंत्रित करती है। प्रोटीन तस्करी में गलत विनियमन या दोष आमतौर पर कोशिकाओं पर हानिकारक प्रभाव डालते हैं और इसके परिणामस्वरूप न्यूरोनल अपघटन होता है। मनुष्यों में, यह अल्जाइमर और पार्किंसंस रोग या रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा1 जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों का कारण बन सकता है। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की यौगिक आंख में फोटोरिसेप्टर झिल्ली प्रोटीन तस्करी 2 का अध्ययन करने के लिए एक इन विवो मॉडल सिस्टम बन गएहैं। यह न केवल ड्रोसोफिला की आनुवंशिक बहुमुखी प्रतिभा के कारण है जो प्रभावी आनुवंशिक स्क्रीन की अनुमति देता है, बल्कि इसलिए भी है क्योंकि प्रकाश-अवशोषित फोटोरिसेप्टर झिल्ली के सभी आवश्यक घटकों को बहुत विस्तार से विशेषता है और कुशल माइक्रोस्कोपिक तकनीकें उपलब्ध हैं जिन्हें मक्खी आंख पर लागू किया जा सकता है। ये तकनीकें इस लेख का फोकस हैं।

ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में, एपिकल प्लाज्मा झिल्ली कोशिका के एक तरफ माइक्रोविली का एक घनी पैक स्टैक बनाती है, जिसे रैबडोमेर कहा जाता है। फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं R1-6 के rhabdomeres को एक विशेषता ट्रेपोज़ॉइडल पैटर्न में व्यवस्थित किया जाता है जबकि फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं R7 और R8 इस ट्रेपोज़ॉइड3 के केंद्र में एक एकल rhabdomere बनाती हैं। झिल्ली प्रोटीन तस्करी की आवश्यकता रोडोप्सिन और प्रकाश-सक्रिय टीआरपी (क्षणिक रिसेप्टर क्षमता) और टीआरपीएल (टीआरपी-जैसे) आयन चैनलों जैसे रैबडोमेरल झिल्ली प्रोटीन के विनियमित कारोबार के लिए होती है ताकि रैबडोमेर में इन फोटोट्रांसडक्शन प्रोटीन की उचित मात्रा को सुनिश्चित किया जा सके। फोटोरिसेप्टर झिल्ली प्रोटीन को एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में संश्लेषित किया जाता है और गोल्गी तंत्र के माध्यम से रैबडोमेरे तक ले जाया जाता है। प्रकाश द्वारा रोडोप्सिन के सक्रियण के बाद, एक रोडोप्सिन अणु या तो दूसरे फोटॉन के अवशोषण से निष्क्रिय हो सकता है या क्लैथ्रिन-मध्यस्थता एंडोसाइटोसिस द्वारा रैबडोमेर से हटाया जा सकता है। एंडोसाइटोसेड रोडोप्सिन या तो लाइसोसोम में अवक्रमित हो जाता है या इसे 4,5 के रैबडोमेरे में वापस पुनर्नवीनीकरण किया जाता है। आयन चैनल TRPL भी phototransduction कैस्केड के सक्रियण के बाद internalized है और rhabdomere (जहां यह स्थित है जब मक्खियों को अंधेरे में रखा जाता है) और सेल शरीर में एक ईआर-समृद्ध भंडारण डिब्बे (जिसमें यह रोशनी पर कई घंटों के भीतर ले जाया जाता है) के बीच एक प्रकाश-निर्भर स्थानांतरण से गुजरता है)6,7,8,9,10 . एंडोसाइटोसेड रोडोप्सिन के विपरीत, टीआरपीएल की केवल थोड़ी मात्रा को एंडोलाइसोसोमल मार्ग के माध्यम से अवक्रमित किया जाता है, और अधिकांश को इसके बजाय इंट्रासेल्युलर रूप से संग्रहीत किया जाता है और अंधेरे अनुकूलन6 पर रैबडोमेरे में वापस पुनर्नवीनीकरण किया जाता है। इस प्रकार टीआरपीएल का उपयोग प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन के प्रकाश-ट्रिगर तस्करी का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। ड्रोसोफिला फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं को न्यूरोनल अपघटन के अध्ययन के लिए भी नियोजित किया जाता है। फोटोरिसेप्टर सेल अध: पतन अक्सर rhabdomeres की संरचना का आकलन करके निर्धारित किया जाता है, जो अपक्षयी प्रक्रियाओं के परिणामस्वरूप विघटित होजाता है 5।

फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं या फोटोरिसेप्टर सेल अध: पतन में टीआरपीएल और रोडोप्सिन के उपकोशिकीय स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए, दो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विधियां जो विश्लेषण की गति और संकल्प के संबंध में भिन्न होती हैं, उन्हें यहां लागू किया गया है। एक बहुत तेज, गैर-इनवेसिव विधि जिसका उपयोग आनुवंशिक स्क्रीन के लिए किया जा सकता है लेकिन एक सीमित स्थानिक संकल्प के साथ गहरे स्यूडोपपिल (डीपीपी) में प्रतिदीप्ति का पता लगाना है। डीपीपी आर्थ्रोपोड यौगिक आंखों की एक ऑप्टिकल घटना है जिसकी ज्यामितीय उत्पत्ति को 1971 11 में फ्रांसेशिनी और किर्शफेल्ड द्वारा विस्तार से समझाया गयाहै। संक्षेप में, रेटिना ओवरले के नीचे कई ऑप्टिकल विमानों पर आसन्न ओमटिडिया से rhabdomeres की छवियों को देखा जा सकता है। आंख की वक्रता के केंद्र के माध्यम से एक फोकल प्लेन पर, ये सुपरइम्पोज़्ड अनुमान एक छवि बनाते हैं जो एक एकल ओमटिडियम में रैबडोमेरेस के समलम्बीय लेआउट जैसा दिखता है, केवल परिमाण के आदेश बड़े होते हैं। इस घटना को प्रतिदीप्ति प्रोटीन की बहिर्जात अभिव्यक्ति (जैसे TRPL::eGFP8) से स्वतंत्र रूप से भी देखा जा सकता है, जो फिर भी DPP को पता लगाना आसान बनाता है (चित्रा 1A-A')12। एक दूसरी गैर-इनवेसिव विधि जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी है जो पानी के साथ आंखों के डायोप्ट्रिक तंत्र को ऑप्टिकल रूप से बेअसर करने के बाद फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन को इमेजिंग पर निर्भर करती है (चित्रा 1 बी-सी')12। जल विसर्जन विधि का उपयोग करते हुए, TRPL की सापेक्ष मात्रा: rhabdomeres या सेल बॉडी में eGFP को व्यक्तिगत फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के लिए मात्रात्मक रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है। इसके अलावा, गैर-ट्रांसलोकेटिंग प्रतिदीप्ति-टैग किए गए प्रोटीन का उपयोग रैबडोमेरल अखंडता का मूल्यांकन करने और मात्रात्मक तरीके से संभावित अध: पतन के समय पाठ्यक्रम को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जैसा कि यहां वर्णित है।

जबकि डीपीपी की रिकॉर्डिंग अब तक के सबसे आसान और सबसे तेज़ इन तरीकों में से सबसे तेज़ हैं, उनके द्वारा उत्पन्न डेटा का स्थानिक रिज़ॉल्यूशन सीमित है। इसके अलावा, ऐसे कई कारण हैं कि एक डीपीपी अनुपस्थित क्यों हो सकता है, जो आवश्यक रूप से डीपीपी इमेजिंग द्वारा ही स्पष्ट नहीं हैं। चूंकि डीपीपी कई ओमटिडिया के योग का प्रतिनिधित्व करता है, इसलिए व्यक्तिगत कोशिकाओं के बारे में जानकारी खो जाती है। इस प्रकार, कम रिज़ॉल्यूशन डीपीपी इमेजिंग बड़ी संख्या में मक्खियों की स्क्रीनिंग में एक महत्वपूर्ण कार्य करता है, लेकिन आमतौर पर पानी विसर्जन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से उच्च रिज़ॉल्यूशन रिकॉर्डिंग के बाद किया जाना चाहिए। जल विसर्जन माइक्रोग्राफ व्यक्तिगत कोशिकाओं, विकासात्मक दोषों, आंखों के आकारिकी, प्रोटीन मिसलोकलाइजेशन या रेटिना अपघटन के साथ-साथ इन प्रभावों के परिमाणीकरण के बारे में व्याख्याओं की अनुमति देते हैं। यह प्रोटोकॉल इन दो तकनीकों का विस्तार से वर्णन करता है।

Figure 1
चित्रा 1: इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत ड्रोसोफिला आंख के लिए माइक्रोस्कोपी विविधताओं का अवलोकन। योजनाबद्ध अभ्यावेदन और अनुकरणीय माइक्रोग्राफ (ए-ए') फ्लोरोसेंट डीप स्यूडोपपिल (डीपीपी) इमेजिंग, (बी-बी') फ्लोरोसेंट रैबडोमेरेस की घातक जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी, और (सी-सी') फ्लोरोसेंट रैबडोमेरेस की गैर-घातक पानी की बूंद माइक्रोस्कोपी। स्केल बार (A'): 100 μm. स्केल सलाखों (B'-C'): 10 μm. इस आंकड़े को संदर्भ13 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. सामान्य विचार

  1. रूपात्मक विश्लेषण के लिए एक स्थायी रूप से स्थित प्रतिदीप्ति प्रोटीन को व्यक्त करने वाले ड्रोसोफिला स्टॉक का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, टीआरपी: ईजीएफपी, ईजीएफपी: : एनआईएनएएसी) और प्रोटीन तस्करी के बारे में विश्लेषण के लिए प्रोटीन को स्थानांतरित करना (उदाहरण के लिए, TRPL:: eGFP, Arr2:: eGFP)।
  2. प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के लिए चयनित मक्खियों के प्रकाश जोखिम की स्थिति को पूर्वनिर्धारित करें।
    1. अंधेरे अनुकूलन के लिए, मक्खियों को 25 डिग्री सेल्सियस पर वांछित अवधि के लिए अंधेरे बक्से में रखें। ट्रांसलोकेशन प्रयोगों में 16 घंटे तक की रोशनी के लिए (उदाहरण के लिए, TRPL:: eGFP मक्खियों को व्यक्त करता है), कमरे के तापमान पर एक फ्लोरोसेंट ट्यूब के नीचे मक्खियों को रखें।
    2. फोटोरिसेप्टर अध: पतन का आकलन करने वाले प्रयोगों में (उदाहरण के लिए, टीआरपी: ईजीएफपी मक्खियों को व्यक्त करते हुए), सफेद प्रकाश के साथ 28 दिनों तक की दीर्घकालिक रोशनी के लिए 12 घंटे के प्रकाश / 12 घंटे के अंधेरे चक्र में 25 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्लोरोसेंट ट्यूब के नीचे मक्खियों को रखें।
    3. रंगीन प्रकाश के साथ मक्खियों को रोशन करने के लिए, फ्लोरोसेंट ट्यूब के साथ-साथ विभिन्न रंगीन पारदर्शी प्लास्टिक बक्से का उपयोग करें।
  3. यदि पिगमेंटेड आंखों के साथ फ्लाई स्टॉक का उपयोग किया जाता है, तो तुलनात्मक विश्लेषण के लिए उम्र के जानवरों की उम्र ठीक है, क्योंकि आंखों के रंजकता उम्र के साथ काफी बढ़ सकती है।
    नोट: डेटा व्याख्या के लिए, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि rhabdomeral संरचना के ऑप्टिकल waveguiding प्रभाव के कारण एक संकेत पूर्वाग्रह मौजूद है। तदनुसार, rhabdomere से प्रतिदीप्ति संकेत हमेशा सेल शरीर से प्राप्त संकेतों के सापेक्ष डीपीपी इमेजिंग और जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी में एक निश्चित सीमा तक प्रवर्धित किया जाएगा। यह पिगमेंटेड आंखों में सबसे प्रमुखता से देखा जाता है, जहां रैबडोमेरेस के बाहर से प्रतिदीप्ति इन वर्णकों द्वारा अवशोषित होती है और विशेष रूप से महत्वपूर्ण होती है जब इंट्रासेल्युलर रूप से ट्रांसलोकेटिंग संलयन प्रोटीन का पता लगाया जाना होता है। इस प्रकार, महत्वपूर्ण चरणों के संबंध में, यह अध्ययन सफेद और लाल आंखों वाली मक्खियों को अलग-अलग मानता है।
  4. जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी के बारे में, दो भिन्नताओं का वर्णन किया गया है। एक तेज घातक भिन्नता के साथ-साथ एक गैर-घातक भिन्नता जो बाद के अध्ययनों के लिए वसूली की अनुमति देती है।

2. डीपीपी इमेजिंग

  1. आवश्यक उपकरणों और अभिकर्मकों के साथ काम करने की जगह तैयार करें जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है। एक जीनोटाइप की एनेस्थेटाइज मक्खियों (1-3 दिन पुरानी) जो फ्लाईपैड पर सीओ2 के साथ फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में एक प्रतिदीप्ति प्रोटीन व्यक्त करती है। एक पारंपरिक प्रकाश स्रोत और कम आवर्धन (जैसे, 10x) के साथ स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत इमेजिंग के लिए जानवरों का चयन करें।

Figure 2
चित्रा 2: DPP इमेजिंग कार्यस्थान. आवश्यक सामग्री (ए) सीओ2 संज्ञाहरण उपकरण, (बी) एक यूवी लैंप और प्रतिदीप्ति फिल्टर सेट के साथ स्टीरियो माइक्रोस्कोप, (सी) प्रकाश स्रोत, (डी) माइक्रोस्कोप-घुड़सवार कैमरा (ई) सॉफ्टवेयर, (एफ) पेंट ब्रश, (जी) काले कार्डबोर्ड, और (एच) फ्लाई शीशी हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. डीपीपी इमेजिंग के लिए, चयनित मक्खियों को संवेदनाहारी रखें और उनमें से एक को माइक्रोस्कोप उद्देश्य के केंद्र में अपनी तरफ रखें ताकि या तो बाईं या दाईं आंख उद्देश्य का सामना कर रही हो , ठीक रेडियल रूप से (चित्रा 3 ए)।
    नोट: चूंकि फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं का ओमटिडियल लेआउट डोर्सोवेंट्रल मिडलाइन पर दर्पण समरूपता प्रदर्शित करता है, इसलिए डीपीपी को आंख की भूमध्य रेखा (चित्रा 3 बी) के ऊपर या नीचे सबसे अच्छा देखा जाता है।

Figure 3
चित्र 3: डीपीपी इमेजिंग के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे मक्खी की स्थिति। (ए) माइक्रोस्कोप उद्देश्य के सामने एक आंख के साथ इसके पक्ष में मक्खी का चित्रण। (बी) फ्लाई हेड को थोड़ा ऊपर या नीचे इस तरह से मोड़ने की आवश्यकता होती है कि उद्देश्य आंख की भूमध्य रेखा के ऊपर या नीचे एक बिंदु पर केंद्रित हो, जैसा कि लाल तीर द्वारा इंगित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. पूरी आंख (जैसे, 100x) को फिट करने के लिए आवर्धन बढ़ाएं और आंख के केंद्रीय ओमटिडिया को केंद्र में रखें। माइक्रोस्कोप के क्षेत्र की गहराई को कम करें, उदाहरण के लिए, डबल-आईरिस डायाफ्राम को उथले सेटिंग (चित्रा 4 ए-बी') में समायोजित करके।
  2. पारंपरिक प्रकाश स्रोत को बंद करें और अधिकतम तीव्रता पर माइक्रोस्कोप यूवी लैंप पर स्विच करें और आंखों में व्यक्त प्रतिदीप्ति प्रोटीन के अनुसार माइक्रोस्कोप के प्रतिदीप्ति फ़िल्टर सेट का चयन करें (चित्रा 4 सी-ई)। माइक्रोस्कोप-माउंटेड कैमरे की ओर प्रकाश पथ सेट करें।
  3. छवि की चमक को एक सेटिंग में समायोजित करने के लिए सॉफ़्टवेयर के भीतर लाइव इमेजिंग सुविधा का उपयोग करें जो एक्सपोज़र समय और लाभ मूल्य (उदाहरण के लिए, क्रमशः 80 एमएस और 12x) को समायोजित करके आंख से केवल विशिष्ट संकेतों का पता लगाता है। DPP (चित्रा 4C-E') की अधिरोपित छवि उत्पन्न करने के लिए माइक्रोस्कोप फोकस को "आंखों में" (कॉर्निया के नीचे) पर ध्यान केंद्रित करें।

Figure 4
चित्रा 4: डीपीपी और फ्लोरोसेंट डीपीपी इमेजिंग का चित्रण। जीएफपी फिल्टर सेट के साथ पारंपरिक और यूवी रोशनी के तहत ड्रोसोफिला आंखों की अनुकरणीय छवियां, आंखों के माध्यम से योजनाबद्ध क्रॉस-सेक्शन में सचित्र अलग-अलग फोकल विमानों के साथ ली गई हैं। (ए) एक पारंपरिक प्रकाश स्रोत की उज्ज्वल सेटिंग्स के साथ दर्ज माइक्रोग्राफ, 30 एमएस एक्सपोजर समय, 1x लाभ, क्षेत्र की गहरी गहराई, और कॉर्निया की सतह के पास फोकल प्लेन जैसा कि (ए' में सचित्र है)। (बी) माइक्रोग्राफ एक पारंपरिक प्रकाश स्रोत की उज्ज्वल सेटिंग्स के साथ दर्ज किया गया, 30 एमएस एक्सपोजर समय, 1x लाभ, क्षेत्र की उथली गहराई, और फोकल प्लेन कॉर्निया की सतह के नीचे लगभग 180 μm जैसा कि (बी' में सचित्र है। डीपीपी ने संकेत दिया। (C-E) यूवी प्रकाश स्रोत और जीएफपी फ़िल्टर सेट की उच्च तीव्रता सेटिंग्स के साथ दर्ज माइक्रोग्राफ, 80 एमएस एक्सपोजर समय, 12x लाभ, क्षेत्र की उथली गहराई, और फोकल प्लेन (सी') के पास, (डी') थोड़ा नीचे, या (ई') कॉर्निया की सतह के नीचे लगभग 180 μm। फ्लोरोसेंट डीपीपी को एक घुमावदार तीर के साथ इंगित किया जाता है। स्केल बार 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

  1. फ्लोरोसेंट डीपीपी का एक स्नैपशॉट लें। माइक्रोस्कोप को दृश्यमान प्रकाश पर वापस स्विच करें और प्रकाश पथ को वापस ओकुलर की ओर ले जाएं। अपने डीपीपी फेनोटाइप (जैसे, क्रॉस) के अनुसार आगे की कार्यवाही के लिए एक मक्खी की शीशी में चित्रित जानवर को पुनर्प्राप्त करें। चरण 2.2 में अगले जानवर के साथ जारी रखें।

3. जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी

  1. फ्लाई तैयारी
    1. आवश्यक उपकरणों और अभिकर्मकों के साथ काम करने की जगह तैयार करें जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है। एक पूर्व-ठंडा 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पूर्व निर्धारित उम्र और रोशनी की स्थिति के साथ मक्खियों को स्थानांतरित करें और उन्हें 15 से 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करके एनेस्थेटिक करें।
      नोट: संदर्भ के रूप में 1-दिन पुरानी, अंधेरे-अनुकूलित मक्खियों के साथ ले जाएं। आम तौर पर, अंधेरे-अनुकूलित मक्खियों को अंधेरे में ढक्कन के साथ आइसबॉक्स में स्थानांतरित किया जाना चाहिए। प्रकाश-अनुकूलित मक्खियों को कमरे की रोशनी में बर्फ में स्थानांतरित किया जा सकता है।

Figure 5
चित्रा 5: जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी कार्यस्थान. आवश्यक सामग्री हैं: (ए) 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, (बी) बर्फ के गुच्छे, (सी) ठंडा आसुत पानी, (डी) स्टीरियोमाइक्रोस्कोप, (ई) पेट्री डिश, (एफ) प्लास्टिसिन, (जी) ऑब्जेक्ट स्लाइड, (एच) कीट पिन या पिपेट टिप्स और स्केलपेल, (आई) (जे) सॉफ्टवेयर के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. नीचे वर्णित दो (3.1.3 घातक भिन्नता या 3.1.7 गैर-घातक भिन्नता) से उचित तैयारी का चयन करें और जब भी पिगमेंटेड और गैर-पिगमेंटेड आंखों के बीच भेदभाव किया जाता है, तो संबंधित चरणों का पालन करें।
  2. निम्नानुसार घातक भिन्नता के लिए मक्खियों को तैयार करें।
  3. एक वस्तु स्लाइड पर प्लास्टिसिन के एक टुकड़े का पालन करें और पेट्री डिश के केंद्र में एक और टुकड़ा (उदाहरण के लिए, 94 मिमी Ø) और उन्हें अभी के लिए अलग रखें। पेट्री डिश को बर्फ-ठंडा आसुत पानी और कुछ बर्फ के गुच्छे (चित्रा 6 ए) के साथ भरें।
  4. Plasticine लेपित वस्तु स्लाइड के शीर्ष पर एक stereomicroscope के नीचे एक बर्फ anesthetized मक्खी रखो. मक्खी को अपनी पीठ पर घुमाएं और वक्ष के केंद्र के माध्यम से एक कीट पिन को छेदें (चित्रा 6 बी)। प्लास्टिक-लेपित ऑब्जेक्ट स्लाइड पर पिन को क्षैतिज रूप से ठीक करें और ऊपर की ओर फ्लाई की बाईं या दाईं आंख को उन्मुख करें (चित्रा 6 सी)।
  5. ध्यान से वस्तु स्लाइड तय करें, इसके plasticine मुक्त पक्ष के साथ नीचे का सामना करना पड़ रहा है, पेट्री डिश में मक्खी के रोटेशन को रोकने. सुनिश्चित करें कि मक्खी आंख पानी के साथ कवर किया गया है (चित्रा 6 डी)। किसी भी हवा के बुलबुले को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए एक तैयारी सुई का उपयोग करें जो आंख के चारों ओर बन सकते हैं, और तुरंत सर्वोत्तम परिणामों के लिए छवि अधिग्रहण के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: छवि अधिग्रहण में महत्वपूर्ण देरी reawakening और मक्खी जो धुंधली छवियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के आंदोलनों में परिणाम.

Figure 6
चित्रा 6: घातक जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी के लिए तैयारी। (ए) प्लास्टिस्टीन-लेपित ऑब्जेक्ट स्लाइड और पेट्री डिश का चित्रण, (बी) प्लास्टिसिन ग्राउंड पर वक्ष के माध्यम से एक मक्खी को पिन करना, (सी) प्लास्टिसिन-लेपित ऑब्जेक्ट स्लाइड पर फ्लाई ओरिएंटेशन, और (डी) अंतिम प्रयोगात्मक सेटअप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. निम्नानुसार गैर-घातक भिन्नता के लिए मक्खियों को तैयार करें।
  2. एक 200 μL पिपेट टिप में एक बर्फ-anesthetized मक्खी headfirst स्थानांतरित करें और संपीड़ित हवा के साथ ध्यान से टिप की ओर मक्खी धक्का।
  3. एक स्केलपेल का उपयोग करके सिर के ठीक सामने पिपेट टिप को काट लें। चिमटी का उपयोग करते हुए, ध्यान से मक्खी को टिप से कुछ मिलीमीटर दूर धकेलें। पिपेट टिप को फिर से काट लें और मक्खी को संपीड़ित हवा के साथ टिप की ओर वापस धकेलें ताकि केवल मक्खी का सिर पिपेट टिप से बाहर निकल जाए।
  4. एक वस्तु स्लाइड पर plasticine के एक टुकड़े का पालन करें और इसमें पिपेट टिप दबाएं ताकि या तो मक्खी की बाईं या दाईं आंख ऊपर की ओर हो (चित्रा 7 ए)। छवि अधिग्रहण से ठीक पहले, पानी विसर्जन उद्देश्य (चित्रा 7 बी) के नीचे ठंडे पानी की एक बड़ी बूंद का पालन करने के लिए एक प्रयोगशाला पिपेट का उपयोग करें। तुरंत सर्वोत्तम परिणामों के लिए छवि अधिग्रहण के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: छवि अधिग्रहण में महत्वपूर्ण देरी reawakening और मक्खी जो धुंधली छवियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के आंदोलनों में परिणाम.

Figure 7
चित्रा 7: गैर-घातक पानी ड्रॉप माइक्रोस्कोपी के लिए तैयारी। (ए) का चित्रण एक 200 μL पिपेट टिप के अंदर तय एक ठंडा-एनेस्थेटिक मक्खी plasticine-लेपित वस्तु स्लाइड पर घुड़सवार और (बी) पानी विसर्जन उद्देश्य के नीचे ठंडा पानी की बूंद का आवेदन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. छवि अधिग्रहण
    1. सावधानी से पेट्री डिश (चरण 3.1.3) या ऑब्जेक्ट स्लाइड (चरण 3.1.7) को माइक्रोस्कोप चरण पर तैयार मक्खी के साथ रखें और पानी विसर्जन उद्देश्य का चयन करें।
    2. पानी के विसर्जन उद्देश्य को मैन्युअल रूप से कम करें जब तक कि यह पानी की सतह (चरण 3.1.3) से संपर्क न करे या मक्खी की आंख बूंद (चरण 3.1.7) (चित्रा 8 ए, बी) को छूती है।
    3. माइक्रोस्कोप यूवी लैंप पर स्विच करें और उपयुक्त फ़िल्टर सेट का चयन करें। उद्देश्य के तहत मक्खी की स्थिति के लिए आईपीस का उपयोग करें और आंख की सतह पर माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें।
    4. माइक्रोस्कोप कैमरे की ओर प्रकाश पथ स्विच और इसी सॉफ्टवेयर में एक लाइव छवि उत्पन्न करते हैं। कैमरे के लिए फोकस को समायोजित करें और आंख के अभिविन्यास का मूल्यांकन करें, यह देखते हुए कि आंख को माइक्रोस्कोप उद्देश्य का सामना करना पड़ता है जैसा कि चित्रा 8 सी-ई में अधिक विस्तार से चित्रित किया गया है।

Figure 8
चित्रा 8: पानी विसर्जन इमेजिंग के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत मक्खी की स्थिति। सेटअप और छवि अधिग्रहण के लिए अंतिम अभिविन्यास (ए) घातक या (बी) गैर-घातक मक्खी तैयारी प्रोटोकॉल का उपयोग करके। (सी) जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी छवियों के सर्वोत्तम परिणाम प्राप्त करने के लिए फ्लाई ओरिएंटेशन का चित्रण। आंख पर ध्यान केंद्रित करने के लिए आदर्श बिंदु पूर्वकाल / पीछे और पृष्ठीय / वेंट्रल अक्षों के संबंध में सटीक केंद्र नहीं है, लेकिन आंख की भूमध्य रेखा से थोड़ा ऊपर है, जैसा कि लाल तीर द्वारा इंगित किया गया है। (डी) एक पूरी तरह से तैनात आंख के लिए पानी विसर्जन छवि का उदाहरण। हेक्सागोनल ओम्माटिडियल टाइलिंग के सभी तीन समरूपता अक्ष सीधी रेखाओं के रूप में दिखाई देते हैं और ओमटिडिया की अधिकतम मात्रा एक ही समय में फोकस में हो सकती है। (ई) एक अनुचित रूप से स्थित आंख की जल विसर्जन छवि का उदाहरण। छवि घुमावदार अक्षों और क्षेत्र की एक उथली गहराई शामिल हैं। स्केल बार: 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

  1. ओवरसैचुरेशन (लाल पिक्सेल के रूप में इंगित) का पता लगाने के लिए इमेजिंग सॉफ़्टवेयर के भीतर उपयुक्त LUT (तालिका देखें) का उपयोग करें।
  2. गैर-पिगमेंटेड मक्खियों के मामले में, एक्सपोज़र समय को समायोजित करें जैसे कि सबसे चमकीले पिक्सेल हर छवि के लिए संतृप्ति सीमा से नीचे हों।
  3. पिगमेंटेड मक्खियों और घातक भिन्नता के मामले में, एक्सपोज़र समय को समायोजित करें जैसे कि सभी उज्ज्वल पिक्सेल कम से कम पांच व्यक्तिगत 1-दिन पुरानी, अंधेरे-अनुकूलित मक्खियों में संतृप्ति सीमा से नीचे हैं। अन्य सभी प्रयोगात्मक स्थितियों (जीनोटाइप, रोशनी की स्थिति, समय बिंदु, आदि) के लिए परिकलित औसत एक्सपोज़र समय लागू करें।
  4. पिगमेंटेड मक्खियों (जैसे, लाल आंखों वाले) और गैर-घातक भिन्नता के मामले में, एक्सपोज़र समय को समायोजित करें जैसे कि सभी उज्ज्वल पिक्सेल प्रत्येक 1-दिन पुराने, अंधेरे-अनुकूलित मक्खी के लिए संतृप्ति सीमा से नीचे हैं। इस मक्खी के अन्य सभी प्रयोगात्मक स्थितियों (रोशनी की स्थिति, समय बिंदु, आदि) के लिए इस जोखिम समय को लागू करें।
  5. एक छवि रिकॉर्ड करें और रिकॉर्डिंग के सभी संबंधित मेटाडेटा को संग्रहीत करने के लिए इसे एक कच्ची फ़ाइल के रूप में सहेजें। निम्न परिमाणीकरण के लिए छवि को एक .tif स्वरूप में निर्यात करें।
    नोट: गैर-घातक भिन्नता के मामले में, छवि अधिग्रहण के तुरंत बाद लाल बत्ती (जैसे, 630 एनएम) के साथ 5 मिनट के लिए मक्खियों को रोशन करें, यदि वे आगे के प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने का इरादा रखते हैं। लाल प्रकाश फोटोट्रांसडक्शन कैस्केड को निष्क्रिय कर देता है जिसे छवि अधिग्रहण के दौरान तीव्र शॉर्टवेव्ड प्रकाश द्वारा अत्यधिक सक्रिय किया गया है।

  1. डेटा विश्लेषण और जल विसर्जन माइक्रोग्राफ के rhabdomeres में सापेक्ष eGFP प्रतिदीप्ति के परिमाणीकरण
    1. डाउनलोड, स्थापित करें और सॉफ्टवेयर ImageJ / फिजी निष्पादित करें।
    2. विश्लेषण > सेट माप पर क्लिक करके ImageJ सेटिंग्स समायोजित करें ... और माध्य ग्रे मान के लिए केवल बॉक्स चेक करें. फ़ाइल > खोलें पर क्लिक करके एक .tif छवि आयात करें ... या खींचकर और छोड़कर। उस छवि का एक प्रतिनिधि क्षेत्र चुनें जो फोकस में है और Ctrl और + को एक साथ बार-बार दबाकर इसे 200% -300% तक बढ़ादें।
    3. ओवल उपकरण का चयन करें और Shift कुंजी दबाते समय छवि में एक परिपत्र चयन उत्पन्न करें जो एक फ्लोरोसेंट rhabdomere से काफी छोटा है। माउस बटन जारी करने से पहले, ImageJ मुख्य विंडो में उपकरण पट्टी के नीचे प्रदर्शित सटीक आकार की तलाश करें। सभी विश्लेषणों के लिए परिपत्र चयन के समान आकार का उपयोग करें.
      नोट:: पिक्सेल या माइक्रोन में परिपत्र चयन का सटीक आकार विशिष्ट सेटअप पर निर्भर करता है। 1-दिन पुराने, अंधेरे-अनुकूलित नियंत्रण मक्खियों के rhabdomeral व्यास के लगभग 1/3 या 1/4 सर्कल का उपयोग करें।
    4. परिपत्र चयन को या तो माउस-क्लिक करके और खींचकर या कुंजीपटल पर तीर कुंजियों को दबाकर ले जाएँ.
    5. परिपत्र चयन के भीतर प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए, सर्कल को पहले rhabdomere (r1) पर ले जाएं और > मापने या शॉर्टकट Ctrl + M का उपयोग करने का विश्लेषण करें पर क्लिक करें। मापा ग्रे मान सूचीबद्ध एक परिणाम विंडो पॉप अप होगा।
    6. दोहराए गए माप और पृष्ठभूमि संकेत (बी) के माप के माप के रूप में r2-r6 के माप के साथ जारी रखें। गैर-पिगमेंटेड मक्खियों के मामले में, संबंधित सेल बॉडी क्षेत्रों (c1-c6) (चित्रा 9) के अतिरिक्त माप करें।

Figure 9
चित्रा 9: ट्रांसलोकेशन अध्ययन के लिए सापेक्ष rhabdomeral प्रतिदीप्ति का परिमाणीकरण। एक जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी छवि में तीन अलग-अलग प्रतिनिधि ओमटिडिया (सफेद हलकों) की पृष्ठभूमि (बी) की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के द्वारा रैबडोमेरेस में सापेक्ष ईजीएफपी प्रतिदीप्ति के परिमाणीकरण के बारे में एक उदाहरण; स्केल बार: 10 μm. दाईं ओर एक आवर्धित ओम्मैटिडियम दिखाया गया है; स्केल बार: 2 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

  1. दो और ommatidia के लिए चरण 3.3.5 और 3.3.6 दोहराएँ, जिसके परिणामस्वरूप तीन तकनीकी प्रतिकृतियाँ होती हैं। पेंसिल उपकरण का उपयोग करके विश्लेषित ommatidia चिह्नित करें और प्रलेखन के लिए इस छवि को सहेजें।
  2. परिणाम विंडो से मापा ग्रे मानों का चयन करें और उनकी प्रतिलिपि बनाएँ और उन्हें आगे की गणना के लिए स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में चिपकाएँ. प्रतिदीप्ति तीव्रता के मूल्यों को उनके मूल के अनुसार rhabdomere (r), सेल बॉडी (c), और पृष्ठभूमि (b) श्रेणियों में सॉर्ट करें। प्रत्येक श्रेणी से माध्य तीव्रता की गणना करें (Ir, Ic, Ib)।
  3. rhabdomere (R) में मौजूद eGFP की सापेक्ष मात्रा की गणना करें, गैर-पिगमेंटेड के लिए निम्नलिखित सूत्र (1) और पिगमेंटेड आंखों के लिए सूत्र (2) का उपयोग करके:
    Equation 1(1)
    Equation 2(2)
  4. चरण 3.3.3 में अगली छवि के साथ जारी रखें। एक विश्वसनीय माप प्राप्त करने के लिए जैविक प्रतिकृति के रूप में प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के कम से कम पांच व्यक्तियों से छवियों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  1. डेटा विश्लेषण और जल विसर्जन माइक्रोग्राफ में eGFP प्रतिदीप्ति द्वारा आंख आकृति विज्ञान के परिमाणीकरण
    1. डाउनलोड, स्थापित करें और ImageJ / फिजी सॉफ़्टवेयर निष्पादित करें। फ़ाइल > खोलें पर क्लिक करके या खींचकर और छोड़कर एक .tif छवि आयात करें. फोकस में है कि छवि के एक प्रतिनिधि क्षेत्र में तीन आसन्न ommatidia चुनें।
    2. चयन के 18 rhabdomeres का मूल्यांकन व्यक्तिगत रूप से उनके eGFP तीव्रता, किनारे तीक्ष्णता, और एक अध: पतन सूचकांक उत्पन्न करने के लिए आसपास की पृष्ठभूमि संकेत के संबंध में इसके विपरीत के अनुसार। स्कोर 2 के एक मूल्य के साथ स्पष्ट रूप से दिखाई rhabdomeres, 1 के एक मूल्य के साथ कमजोर रूप से दिखाई rhabdomeres, और 0 (चित्रा 10) के मूल्य के साथ अनुपस्थित rhabdomeres.
      नोट: परिमाणीकरण के इस तरीके के परिणामस्वरूप पूरी तरह से बरकरार आंखों के लिए 36 का स्कोर और पूरी तरह से विघटित आंखों के लिए 0 का स्कोर होता है। अध: पतन सूचकांक पर 36 से 100% का स्कोर सेट करने की सिफारिश की जाती है।

Figure 10
चित्रा 10: अध: पतन अध्ययन के लिए rhabdomere मूल्यांकन के माध्यम से परिमाणीकरण। 2 (स्पष्ट रूप से दिखाई देने वाले; नीले सर्कल), 1 (कमजोर रूप से दिखाई देने वाले; नारंगी सर्कल), या 0 (अनुपस्थित; लाल सर्कल) के मूल्यों के साथ एक जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी छवि में तीन अलग-अलग प्रतिनिधि ओमटिडिया (सफेद सर्कल) के rhabdomeres स्कोरिंग द्वारा आंख आकृति विज्ञान के परिमाणीकरण के बारे में एक उदाहरण। स्केल बार: 10 μm. दाईं ओर एक आवर्धित ओम्मैटिडियम दिखाया गया है; स्केल बार: 2 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

  1. अगली छवि खोलें और चरण 3.4.2 के साथ जारी रखें। एक विश्वसनीय माप प्राप्त करने के लिए जैविक प्रतिकृति के रूप में प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह के कम से कम आठ व्यक्तियों से छवियों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    नोट:: चूंकि यह परिमाणीकरण विधि प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा स्थानांतरण को परिमाणित करने की विधि की तुलना में कम उद्देश्य है, इसलिए प्रतिकृतियों की अनुशंसित संख्या अधिक है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला मक्खियों एक TRPL व्यक्त: : रोडोप्सिन 1 प्रमोटर के नियंत्रण में eGFP संलयन प्रोटीन उत्पन्न किया गया है। इन मक्खियों में, TRPL::eGFP को यौगिक आंख के फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं R1-6 में व्यक्त किया जाता है और एक रोशनी-निर्भर स्थानीयकरण प्रदर्शित करता है। जब मक्खियों को अंधेरे में रखा जाता है, तो TRPL::eGFP को बाहरी rhabdomeres में शामिल किया जाता है। कई घंटों के लिए रोशनी के बाद, TRPL सेल शरीर में translocates जहां यह एक ईआर समृद्ध डिब्बे में संग्रहीत किया जाता है। 8,10 जब TRPL::eGFP rhabdomeres में स्थित है, तो इसकी प्रतिदीप्ति DPP में देखी जा सकती है। हालांकि, Rhabdomeral प्रतिदीप्ति TRPL के स्थानांतरण के परिणामस्वरूप प्रकाश में गायब हो जाता है: eGFP (चित्रा 11A, B)। इसका उपयोग टीआरपीएल के आंतरिककरण में दोषपूर्ण उत्परिवर्ती के लिए एक आनुवंशिक स्क्रीन करने के लिए किया गया है: ईजीएफपी (चित्रा 11 सी, डी) 14,15। संभावित होमोजीगस घातक उत्परिवर्तन के अलगाव की अनुमति देने के लिए, इस स्क्रीन को विकासशील आंखों के ऊतकों (यानी, मोज़ेक आंखों) में दैहिक सेल क्लोन की पीढ़ी के लिए खमीर एफएलपी / एफआरटी प्रणाली का उपयोग करके किया गया था। डीपीपी परख की सादगी के अलावा, इस प्रतिदीप्ति का पता लगाने की विधि के अन्य बड़े फायदे इसके उच्च थ्रूपुट के साथ-साथ इसके गैर-इनवेसिव चरित्र हैं जो जीवित मक्खियों में उत्परिवर्तन की पहचान करने और स्थिर उत्परिवर्ती मक्खी स्टॉक की पीढ़ी के लिए इन मक्खियों का उपयोग करने की अनुमति देते हैं।

Figure 11
चित्रा 11: TRPL ट्रांसलोकेशन दोषों पर एक आनुवंशिक स्क्रीन से प्रतिनिधि परिणाम। नर मक्खियों को एथिल मीथेनसल्फोनेट (ईएमएस) के साथ उत्परिवर्तित किया गया था और टीआरपीएल व्यक्त करने वाली महिलाओं को पार कर लिया गया था: फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं आर 1-6 में ईजीएफपी। होमोजाइगस उत्परिवर्ती एफएलपी / एफआरटी-प्रेरित मोज़ेक आंखों के साथ परिणामी एफ 1-पीढ़ी को अंधेरे अनुकूलन (बाएं कॉलम) के साथ-साथ प्रकाश अनुकूलन (दाएं कॉलम) की अवधि के बाद फ्लोरोसेंट गहरे स्यूडोपिपल्स (डीपीपी) की इमेजिंग द्वारा टीआरपीएल ट्रांसलोकेशन में दोषों के लिए जांच की गई थी। (A, B) गैर-उत्परिवर्तित मक्खियों को नियमित रूप से प्रकाश-प्रेरित टीआरपीएल ट्रांसलोकेशन के लिए नियंत्रण के रूप में साथ ले जाया गया था। गैर-फ्लोरोसेंट डीपीपी को एक तीर द्वारा इंगित किया जाता है। (C,D) प्रकाश-ट्रिगर TRPL ट्रांसलोकेशन में दोषपूर्ण पृथक उत्परिवर्ती का एक अनुकरणीय परिणाम। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

टीआरपीएल ट्रांसलोकेशन दोषपूर्ण (टीटीडी) उत्परिवर्ती जो इस आनुवंशिक स्क्रीन से अलग थे, बाद में पहचाने गए हैं और उनके दोषों को पानी विसर्जन इमेजिंग की मदद से अधिक विस्तार से चित्रित किया गया है। जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी को rhabdomeres और सेल निकायों में प्रोटीन के स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए या फोटोरिसेप्टर अध: पतन के कारण rhabdomeral संरचना में दोषों को ट्रैक करने के लिए लागू किया गया है जैसा कि प्रोटोकॉल में उल्लिखित है। चित्रा 12ए, बी टीआरपीएल की मात्रा के परिमाणीकरण को दर्शाता है: ईजीएफपी अंधेरे में, प्रकाश में, और दूसरे अंधेरे-अनुकूलन के बाद गैर-उत्परिवर्ती और लोलाटीटीडी 12 उत्परिवर्ती मोज़ेक आंखों के साथ मक्खियों के रैबडोमेरेस में मौजूद है। नियंत्रण (गैर उत्परिवर्ती) मक्खियों में, TRPL::eGFP रोशनी के 16 घंटे के बाद सेल शरीर में rhabdomeres से बाहर translocates के परिणामस्वरूप rhabdomeral TRPL की कमी में जिसके परिणामस्वरूप: eGFP अंधेरे अनुकूलित राज्य की तुलना में लगभग 45% के लिए। दूसरा अंधेरा इनक्यूबेशन rhabdomeral प्रतिदीप्ति को फिर से प्रारंभिक मूल्य के 95% तक बढ़ाता है। लोलाttd12 उत्परिवर्ती अपने TRPL स्थानांतरण दोष के कारण DPP स्क्रीनिंग द्वारा अलग किया गया था। तदनुसार, TRPL:: rhabdomeres के पानी विसर्जन छवियों में eGFP प्रतिदीप्ति पैटर्न के रूप में काफी के रूप में तेजी से 16 ज रोशनी और बाद में 24 घंटे के लिए अंधेरे अनुकूलन के बाद के रूप में बदलने के लिए प्रकट नहीं होता है। हालांकि, छवियों से यह भी पता चलता है कि लोलाटीटीडी 12 म्यूटेंट विकासात्मक रूप से दोषपूर्ण हैं, जो फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं की कभी-कभार अनुपस्थिति से स्पष्ट है जैसा कि पहले अन्य लोला म्यूटेंट16 के लिए वर्णित है। इन रूपात्मक दोषों के परिणामस्वरूप एक वैध पृष्ठभूमि संकेत को मापने में असमर्थता होती है, जो सूत्र (1) का उपयोग करके एक सही परिमाणीकरण को रोकती है। इसके विपरीत, vps35MH20 एक उत्परिवर्ती है जो इस तरह से ओमटिडियल आकृति विज्ञान को प्रभावित किए बिना एक TRPL ट्रांसलोकेशन दोष प्रदर्शित करताहै। इस उत्परिवर्ती में, यहां वर्णित परिमाणीकरण विधि सांख्यिकीय रूप से अत्यधिक महत्वपूर्ण रीसाइक्लिंग दोष (चित्रा 12 सी, डी) का पता लगा सकती है।

Figure 12
चित्रा 12: लोला और vps35 उत्परिवर्ती मक्खियों और परिमाणीकरण विधि की सीमाओं में एक TRPL translocating दोष के प्रतिनिधि परिणाम. (ए) टीआरपीएल:: ईजीएफपी-गैर-उत्परिवर्ती और लोलाटीटीडी 12 उत्परिवर्ती मोज़ेक-आंखों वाली मक्खियों को 3 दिनों के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट किया गया था, 16 घंटे के लिए नारंगी प्रकाश के साथ प्रकाशित किया गया था, और दूसरी बार 24 घंटे के लिए अंधेरे-अनुकूलित किया गया था। फ्लोरोसेंट rhabdomeres की छवियों को उपकोशिकीय TRPL रिकॉर्ड करने के लिए जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से लिया गया था: eGFP स्थानीयकरण के रूप में चरण 3.2.6 में वर्णित है। (बी) सूत्र (1) का उपयोग करके चरण 3.3.9 में वर्णित के रूप में गैर-उत्परिवर्ती (ग्रे) और लोलाटीटीडी 12 उत्परिवर्ती (हरे) जानवरों के rhabdomeral प्रतिदीप्ति का परिमाणीकरण। त्रुटि सलाखों SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं. (C) TRPL:: eGFP-गैर-उत्परिवर्ती और vps35MH20 उत्परिवर्ती मोज़ेक-आंखों वाली मक्खियों को व्यक्त करने वाले 3 दिनों के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट किया गया था, 16 घंटे के लिए नारंगी प्रकाश के साथ प्रकाशित किया गया था, और दूसरी बार 24 घंटे के लिए अंधेरे-अनुकूलित किया गया था। फ्लोरोसेंट rhabdomeres की छवियों को उपकोशिकीय TRPL रिकॉर्ड करने के लिए जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से लिया गया था: eGFP स्थानीयकरण के रूप में चरण 3.2.6 में वर्णित है। (घ) सूत्र (1) का उपयोग करते हुए चरण 3-3-9 में वर्णित के रूप में गैर-उत्परिवर्ती (ग्रे) और vps35MH20 उत्परिवर्ती (लाल) जानवरों के rhabdomeral प्रतिदीप्ति का परिमाणीकरण। त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं। सांख्यिकीय महत्व की गणना एनोवा के बाद बोनफेरोनी सुधार के साथ एकाधिक तुलनाओं के रूप में की गई थी (ns, महत्वपूर्ण नहीं; *, p ≤ 0.05; ***, p ≤ 0.001)। स्केल बार: 10 μm. पैनल C और D को संदर्भ10 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जैसा कि प्रोटोकॉल में पहले ही उल्लेख किया गया है, आंख रंजकता परिणामी जल विसर्जन छवि को काफी प्रभावित करती है। सफेद आंखों वाली मक्खियां rhabdomere और सेल शरीर दोनों से प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाने की अनुमति देती हैं, इस प्रकार TRPL के काफी सटीक निर्धारण को सक्षम करती हैं: eGFP वितरण अनुपात। इसके विपरीत, लाल आंखों वाली मक्खियों में TRPL:: eGFP संकेत केवल rhabdomeres में पता लगाने योग्य है, लेकिन सेल निकायों में नहीं (चित्रा 13A)। यह वर्णक अणुओं TRPL से उत्सर्जित प्रकाश को अवशोषित करने के कारण है::eGFP. फिर भी, पिगमेंटेड आंखों के लिए सूत्र (2) का उपयोग करके, परिमाणीकरण अच्छी तरह से TRPL से पता चलता है: सफेद- साथ ही लाल आंखों वाली मक्खियों में eGFP ट्रांसलोकेशन व्यवहार। तदनुसार, rhabdomere प्रतिदीप्ति के इसी मूल्य अंधेरे अनुकूलित राज्य में 100% से 25% और रोशनी के बाद 5% तक कम हो जाते हैं और एक दूसरे अंधेरे इनक्यूबेशन (चित्रा 13 बी) के परिणामस्वरूप 80% और 90% तक फिर से बढ़ जाते हैं।

Figure 13
चित्रा 13: TRPL के प्रतिनिधि परिणाम:: सफेद और लाल आंखों वाली मक्खियों में eGFP प्रतिदीप्ति( A) TRPL:: eGFP-व्यक्त सफेद और लाल आंखों वाली मक्खियों को 1 दिन के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट किया गया था, 16 घंटे के लिए नारंगी प्रकाश के साथ प्रकाशित किया गया था, और दूसरी बार 24 घंटे के लिए अंधेरे-अनुकूलित किया गया था। फ्लोरोसेंट rhabdomeres की छवियों को गैर-घातक पानी ड्रॉप माइक्रोस्कोपी के माध्यम से उपकोशिकीय TRPL रिकॉर्ड करने के लिए लिया गया था: eGFP स्थानीयकरण जैसा कि चरण 3.2.6 (सफेद आंखों वाली मक्खियों) और 3.2.8 (लाल आंखों वाली मक्खियों) में वर्णित है। (बी) सफेद आंखों (ग्रे) और लाल आंखों (लाल) मक्खियों में रैबडोमेरल प्रतिदीप्ति का परिमाणीकरण। सूत्र (2) का उपयोग करके सफेद आंखों वाली मक्खियों को सूत्र (1) और लाल आंखों वाली मक्खियों का उपयोग करके परिमाणित किया गया था, जैसा कि चरण 3.3.9 में वर्णित है। त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं. स्केल पट्टी: 10 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

फोटोरिसेप्टर अध: पतन का आकलन करने के लिए, टीआरपी के प्रतिदीप्ति पर आधारित एक अध: पतन सूचकांक: rhabdomeres में eGFP निर्धारित किया जा सकता है (प्रोटोकॉल देखें)। इस परिमाणीकरण विधि को चित्र 10 में दर्शाया गया है। यहां प्रतिनिधि परिणामों में, गैर-उत्परिवर्ती और sdhAttd11 उत्परिवर्ती मोज़ेक-आंखों वाली मक्खियों को 2 सप्ताह के लिए 12 घंटे के प्रकाश / 12 घंटे के अंधेरे चक्र में रखा गया था और Rhabdomeres की अखंडता की जांच हर 2-4 दिनों में TRP: eGFP जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 14A) का उपयोग करके की गई थी। परिणामी वक्र उत्परिवर्ती में अध: पतन सूचकांक की गिरावट दिखाता है लेकिन नियंत्रण मक्खियों में नहीं (चित्रा 14 बी)।

Figure 14
चित्रा 14: sdhA उत्परिवर्ती मक्खियों में प्रकाश-प्रेरित रेटिना अध: पतन के प्रतिनिधि परिणाम। (A) TRP:: eGFP-व्यक्त गैर-उत्परिवर्ती और sdhAttd11 उत्परिवर्ती मोज़ेक-आंखों वाली मक्खियों को 14 दिनों के लिए 12 घंटे के प्रकाश / 12 घंटे के अंधेरे चक्र में 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। रेटिना स्वास्थ्य को रिकॉर्ड करने के लिए नियमित समय अंतराल पर पानी विसर्जन माइक्रोस्कोपी के माध्यम से फ्लोरोसेंट रैबडोमेरेस की छवियों को लिया गया था। (बी) चरण 3.4 में वर्णित के रूप में जंगली प्रकार (ग्रे) और sdhAttd11 उत्परिवर्ती (नारंगी) मक्खियों के rhabdomeral प्रतिदीप्ति का परिमाणीकरण। त्रुटि पट्टियाँ SEM का प्रतिनिधित्व करती हैं. स्केल पट्टी: 10 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रतिदीप्ति प्रोटीन की प्रयोज्यता और डीपीपी इमेजिंग और रेटिना जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी द्वारा स्क्रीनिंग की सादगी को कई समूहों द्वारा सफल साबित किया गया है। यहां प्रस्तुत लोगों के समान रणनीतियों का उपयोग कई आनुवंशिक स्क्रीनों में रोडोप्सिन अभिव्यक्ति के स्तर, होमोस्टेसिस, रेटिना संगठन, या सेलुलर अखंडता में दोषों का पता लगाने के लिए किया गया है Rh1::eGFP 17,18,19,20,21 की मदद से। जैसा कि ऊपर बताया गया है, TRPL जैसे संलयन प्रोटीन को स्थानांतरित करना:: eGFP का उपयोग यह पता लगाने के लिए किया जा सकता है कि क्या rhabdomere से और rhabdomere तक प्रोटीन तस्करी प्रक्रियाएं बिगड़ा हुआ हैं, उदाहरण के लिए, म्यूटाजेनेसिस स्क्रीन में। दूसरी ओर, स्थायी रूप से rhabdomeral संलयन प्रोटीन जैसे टीआरपी:: eGFP का उपयोग rhabdomere आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए किया जा सकता है। डीपीपी और जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी को ड्रोसोफिला आंख के मॉडल के भीतर उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण और स्क्रीन के लिए उत्कृष्ट तरीकों के रूप में माना जाता है। हालांकि, यह अंततः डीपीपी या जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त परिणामों की पुष्टि करने के लिए अलग-थलग ओमटिडिया या क्रायो-सेक्शन्ड रेटिना ऊतक के हिस्टोकेमिकल विश्लेषण (इम्यूनो) हिस्टोकेमिकल विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है। उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित, ये तकनीकें सटीक उपकोशिकीय स्थानीयकरणों की ओर व्याख्याओं की अनुमति देती हैं। निम्नलिखित में, डीपीपी और रेटिना जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी की इमेजिंग प्रक्रियाओं का समस्या निवारण करने के तरीके पर कुछ दिशानिर्देश पेश किए जाते हैं जो सही मात्रात्मक विश्लेषण के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।

डीपीपी के बारे में, यदि प्रतिदीप्ति का सुपरपोजिशन धुंधला या अस्पष्ट है, तो सेटिंग्स सही नहीं हो सकती हैं। एक संभावना यह है कि आंख उद्देश्य का ठीक से रेडियल रूप से सामना नहीं कर रही है या ध्यान आंख के परिधीय क्षेत्रों पर सेट किया गया है। चूंकि फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं का ओमटिडियल लेआउट डोर्सोवेंट्रल मिडलाइन पर दर्पण समरूपता प्रदर्शित करता है, इसलिए डीपीपी में एक असामान्य पैटर्न देखा जा सकता है, अगर संकेतों का पता आंख के दोनों गोलार्धों से लगाया जाता है। डीपीपी की गुणवत्ता भी यौगिक आंख के माध्यम से एक ऑप्टिकल अनुभाग उत्पन्न करने के लिए क्षेत्र की उथली गहराई पर निर्भर करती है। यदि फ्लाईपैड की सतह ऑटोफ्लोरेसेंस प्रदर्शित करती है, तो मक्खी को फ्लाईपैड के शीर्ष पर काले गैर-फ्लोरोसेंट कार्डबोर्ड के एक छोटे से टुकड़े पर रखा जा सकता है। डीपीपी रिकॉर्ड करने में असमर्थता को विभिन्न प्रकार के अंतर्निहित कारणों से जोड़ा जा सकता है, जिसमें सबऑप्टिमल फ्लाई पोजिशनिंग, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के कम अभिव्यक्ति स्तर, एक अव्यवस्थित रेटिना आर्किटेक्चर, या अपक्षयी प्रक्रियाएं शामिल हैं। डीपीपी की इमेजिंग करते समय, यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि सफेद आंखों वाली मक्खियों में साइटोप्लाज्मिक प्रतिदीप्ति रैबडोमेरेस से सिग्नल की सीमाओं को फैला सकती है, और प्रोटीन की अभिव्यक्ति का स्तर व्यक्तियों के बीच काफी भिन्न हो सकता है और परिणामी डीपीपी की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। इस प्रकार, फ्लोरोसेंट डीपीपी इमेजिंग के मामले में, पिगमेंटेड आंखों के साथ मक्खियों का उपयोग करना फायदेमंद है। सेल निकायों से प्रतिदीप्ति संकेतों के अवशोषण के कारण, परिणामी डीपीपी सफेद आंखों वाली मक्खियों की तुलना में तेज दिखाई दे सकता है।

पानी विसर्जन माइक्रोस्कोपी में धुंधली छवियों से बचने के लिए, मक्खी की पुनरावृत्ति और आंदोलनों को रोकने के लिए मक्खी की तैयारी के बाद छवि अधिग्रहण को जल्दी से प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है। उच्च गुणवत्ता वाली छवियों के लिए, आंखों से सबसे चमकीले प्रतिदीप्ति संकेतों को सफेद आंखों वाली मक्खियों का उपयोग करते समय लगभग सभी छवियों में संतृप्ति तक पहुंचना पड़ता है। यह इमेजिंग के दौरान एक्सपोज़र समय को समायोजित करके प्राप्त किया जा सकता है। चूंकि रंजकता साइटोसोलिक ईजीएफपी प्रतिदीप्ति का पता लगाने में बाधा डालती है, इसलिए एक्सपोज़र समय को समायोजित करने के लिए सफेद आंखों वाली मक्खियों के लिए वर्णित दृष्टिकोण हमेशा पिगमेंटेड आंखों में मजबूत रैबडोमेरल प्रतिदीप्ति संकेतों के परिणामस्वरूप होगा, जो बाद की व्याख्या और परिमाणीकरण को विकृत करता है। इसके अतिरिक्त, पिगमेंटेड आंखों का उपयोग करके, नीली रोशनी के मजबूत संपर्क के कारण फोटोब्लीचिंग कमजोर संकेतों को जन्म दे सकती है और इस प्रकार डेटा की गलत व्याख्या हो सकती है। संदर्भ (यानी, घातक या गैर-घातक) के आधार पर, पिगमेंटेड आंखों के लिए प्रोटोकॉल में दो वैकल्पिक प्रक्रियाओं को प्रस्तुत किया जाता है। सामान्य तौर पर, गैर-घातक भिन्नता को पिगमेंटेड आंखों के साथ पसंद किया जाना चाहिए, क्योंकि एक ही मक्खी को बार-बार मापा जा सकता है, और प्रत्येक व्यक्तिगत मक्खी के लिए एक विशिष्ट एक्सपोजर समय का आकलन एक नमूने से उत्पन्न औसत एक्सपोजर समय के निर्धारण की तुलना में अधिक सटीक परिमाणीकरण और उच्च पुनरुत्पादन में परिणाम देता है। हालांकि, गैर-घातक भिन्नता भी बार-बार माप के दौरान उनके अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए जानवरों की हैंडलिंग में अधिक देखभाल की मांग करती है। यह पिपेट टिप में मक्खियों को स्थानांतरित करने के लिए केवल कम दबाव वाली हवा का उपयोग करके और इमेजिंग के बाद पिपेट टिप से मक्खी को मुक्त करने के लिए चिमटी का सावधानीपूर्वक उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। चूंकि मक्खियां प्रक्रिया के दौरान बर्फ-ठंडे पानी में डूबी नहीं होती हैं, इसलिए फिर से जागने का खतरा बढ़ जाता है। व्यक्तिगत नमूनों से दोहराए गए माप के परिणामस्वरूप, माप की पूरी श्रृंखला केवल तभी मान्य होती है जब मक्खी शुरू से अंत तक बिना किसी नुकसान के रहती है। नतीजतन, गैर-घातक भिन्नता बहुत श्रम-गहन और समय लेने वाली है। दूसरी ओर, घातक भिन्नता, एक उच्च थ्रूपुट की अनुमति देती है क्योंकि कई मक्खियों को एक ही कीट पिन पर उत्तराधिकार में पिन किया जा सकता है और एक छवि अधिग्रहण दौर में क्रमिक रूप से दर्ज किया जा सकता है। हालांकि, एक ही पिन पर कई मक्खियों को भी पुनर्जागरण और आंदोलनों से बचने के लिए और भी तेज इमेजिंग की आवश्यकता होती है। घातक भिन्नता का अंतिम नुकसान स्पष्ट रूप से बाद के अनुप्रयोगों के लिए इमेजिंग के बाद जानवरों को ठीक करने में असमर्थता है (उदाहरण के लिए, क्रॉस, दोहराए गए माप)।

ट्रांसलोकेशन के परिमाणीकरण के बारे में, यह प्रोटोकॉल सूत्र (1) प्रस्तुत करता है, जो रैबडोमेर के साथ-साथ सेल बॉडी से प्रतिदीप्ति संकेतों पर विचार करता है और इस प्रकार सेल के भीतर ट्रांसलोकेटिंग प्रोटीन के सापेक्ष वितरण के लिए एक बहुत अच्छा अनुमान उत्पन्न करता है (चित्रा 12 डी)। पिगमेंटेड आंखों के मामले में सेल बॉडी से प्रतिदीप्ति माप की कमी के कारण, सूत्र (2) की पेशकश की जाती है, जो इस अक्सर सामना किए जाने वाले मुद्दे (चित्रा 13 बी) के लिए अच्छी तरह से काम करता है। आंखों के रंजकता के अलावा, अन्य परिस्थितियां हैं जो इन सूत्रों में से किसी के साथ परिमाणीकरण को रोकती हैं। इन उदाहरणों में से एक को लोला ttd12 उत्परिवर्ती के रूप में चित्र 12A, B में प्रस्तुत किया गया है। इस उत्परिवर्ती में, विशेष रूप से, फोटोरिसेप्टर सेल R7 की अनुपस्थिति ओमटिडियल आकृति विज्ञान को काफी प्रभावित करती है और इस प्रकार इस क्षेत्र से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की उचित तीव्रता माप प्राप्त करने की क्षमता। यदि इन मुद्दों के बावजूद ट्रांसलोकेशन परिमाणीकरण की एक ही विधि का उपयोग किया जा रहा है, तो परिणाम उच्च मात्रा में विचरण प्रदर्शित करते हैं, नियंत्रण के साथ तुलना करना मुश्किल है, और संभावित रूप से गलत व्याख्या की जा सकती है। इस प्रकार लोलाटीटीडी 12 उत्परिवर्ती का उदाहरण इस परिमाणीकरण विधि की सीमाओं को दर्शाता है जो अनिवार्य रूप से सही तीव्रता माप के लिए "जंगली प्रकार" जैसी आकृति विज्ञान पर निर्भर करता है। दुर्लभ मामलों में जिसमें प्रोटीन ट्रांसलोकेशन दोषों को रूपात्मक रूप से दोषपूर्ण ओमटिडिया में परिमाणित किया जाना है, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल विफल हो जाता है और तदनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए। इसमें उन मापों को बाहर करने के लिए सूत्र में उपयुक्त परिवर्तन शामिल हैं जिन्हें यथोचित रूप से प्राप्त नहीं किया जा सकता है या अन्य प्रतिनिधि क्षेत्रों के अतिरिक्त माप शामिल हैं।

अपक्षयी प्रक्रियाओं के परिमाणीकरण के मामले में, प्रतिदीप्ति तीव्रता थ्रेसहोल्ड एक अच्छा संकेतक नहीं निकला, क्योंकि रैबडोमेरेस के भीतर और बीच में बहुत अधिक विचरण होता है। इस प्रसरण को ट्रांसलोकेशन को परिमाणित करने के लिए विधि में सभी 18 मापा rhabdomeres पर औसत किया जाता है। हालांकि, अध: पतन के मूल्यांकन में प्रत्येक rhabdomere के व्यक्तिगत मूल्यांकन के कारण, प्रतिदीप्ति तीव्रता में विचरण को औसत नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, तीव्रता केवल उन विशेषताओं में से एक है जिन पर विचार करने की आवश्यकता है। अन्य महत्वपूर्ण पहलू इसके विपरीत और किनारों की तीक्ष्णता हैं। नतीजतन, यह प्रोटोकॉल आंखों द्वारा उनके प्रतिदीप्ति के अनुसार rhabdomeres के आकारिकी को वर्गीकृत करने के आधार पर एक परिमाणीकरण विधि प्रस्तुत करता है। यह आवश्यक रूप से कुछ हद तक व्यक्तिपरक है। फिर भी, पर्याप्त अनुभव को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल ने अध: पतन (चित्रा 14) के लिए परिमाणीकरण की एक उपयोगी, तेज और पुनरुत्पादक विधि साबित की है और इसे कई बार22,10 बार प्रकाशित किया गया है। सभी व्यक्तिपरक मूल्यांकनों के साथ, उन्हें एक अंधे संदर्भ में प्रदर्शन करने की हमेशा सलाह दी जाती है। अन्य समूहों के प्रोटोकॉल आमतौर पर ड्रोसोफिला (rhabdomeres की उपस्थिति या अनुपस्थिति) में रेटिना अध: पतन को मापने के लिए केवल दो श्रेणियों का उपयोग करते हैं, जो कम व्यक्तिपरक हो सकते हैं, लेकिन कम सटीक भी हो सकते हैं। इसके अतिरिक्त, परिमाणीकरण के इस तरीके में अभी भी दो श्रेणियों के बीच एक कट-ऑफ बिंदु को परिभाषित करने का मुद्दा है, जो निष्पक्ष रूप से परिभाषित करने के लिए समान रूप से कठिन हो सकता है।

यहां प्रस्तुत विधियों के संशोधनों और उन्नत अनुप्रयोगों के संबंध में, डबल कलर इमेजिंग द्वारा एक साथ दो फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन की सापेक्ष मात्रा का आकलन करना भी संभव है। उदाहरण के लिए, TRPL का उपयोग करके::HcRed और TRP::eGFP, TRPL::HcRed स्थानांतरण का मूल्यांकन एक ही मक्खी23 में rhabdomeral अखंडता के विचार में किया गया है। डबल कलर इमेजिंग का उपयोग टमाटर / जीएफपी-एफएलपी / एफआरटी विधि में भी किया जाता है, उदाहरण के लिए, एपोप्टोसिस24 को प्रेरित करने वाले कारकों की पहचान करने के लिए। यह भिन्नता ninaC के माध्यम से फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के अध: पतन की कल्पना करना संभव बनाता है: eGFP फ्लोरोसेंटली लेबल सेल क्लोन में ninaC द्वारा चिह्नित: : tdTomato। जल विसर्जन माइक्रोस्कोपी का एक और अनुप्रयोग फोटोरिसेप्टर में फॉस्फोइनोसिटाइड टर्नओवर की निगरानी है। इस उद्देश्य के लिए, फ्लोरोसेंटली टैग किए गए फॉस्फोइनोसिटाइड-बाइंडिंग डोमेन जैसे कि PLCπ1 से pleckstrin homology (PH) डोमेन का उपयोग किया जाता है। ये प्रतिदीप्ति जांच समय के साथ फॉस्फोइनोसिटाइड गिरावट की ट्रैकिंग की अनुमति देती है, जो कि रैबडोमेरल प्रतिदीप्ति की कमी का पता लगाती है जो कि रैबडोमेरल से साइटोसोल25,26 तक जांच के प्रसार के कारण होती है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम वर्षों से हमारे छात्र शोधकर्ताओं को धन्यवाद देना चाहते हैं। विशेष रूप से, नीना मेयर, सिबिले मेयर, जूलियन कैम और लौरा जग्गी, जिनके डेटा का उपयोग इस प्रोटोकॉल में प्रतिनिधि परिणामों के रूप में किया गया है। यहां प्रस्तुत हमारे समूह के अनुसंधान को डॉयचे Forschungsgemeinschaft (हू 839/2-4, हू 839/7-1) से आर्मिन ह्यूबर को अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tube Greiner Bio-One 188271
CO2 anaesthesia fly pad Flystuff 59-172
Cold light lamp (KL 1500 LCD) Zeiss
Fiji/ImageJ NIH
Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition) Zeiss
Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13)
[1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2]
and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2]		 Osram 4050300518039
Laboratory pipette (20-200 µL) Eppendorf
Object slide Roth 0656.1
Petri dish (94 mm) Greiner Bio-One 633102
Pipette tips (200 µL) Labsolute 7695844
Plasticine (Blu-Tack) Bostik 30811745
Stereo microscope (SMZ445) Nikon
Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12) Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration. Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31 (2014).
  2. Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
  3. Hardie, R. C. The photoreceptor array of the dipteran retina. Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).
  4. Wang, T., Montell, C. Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).
  5. Xiong, B., Bellen, H. J. Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly. Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).
  6. Bähner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
  7. Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).
  8. Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade. Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).
  9. Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin. European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).
  10. Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum. Traffic. , (2021).
  11. Franceschini, N., Kirschfeld, K. Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila. Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).
  12. Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128 (6), 815-826 (2001).
  13. Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).
  14. Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2005).
  15. Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL. Fly. 2 (1), 36-46 (2008).
  16. Zheng, L., Carthew, R. W. Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye. Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).
  17. Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).
  18. Huang, Y., Xie, J., Wang, T. A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila. PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).
  19. Zhao, H., Wang, J., Wang, T. The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).
  20. Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
  21. Zhao, H., Wang, T. PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila. PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).
  22. Cerny, A. C., et al. The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells. PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).
  23. Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2007).
  24. Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).
  25. Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
  26. Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).

Tags

जीव विज्ञान अंक 179
EGFP-टैग किए गए प्रोटीन का उपयोग कर <em>ड्रोसोफिला</em> फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में झिल्ली प्रोटीन तस्करी का अध्ययन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger,… More

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins. J. Vis. Exp. (179), e63375, doi:10.3791/63375 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter