Artigo de método

Desenvolvimento de organoides da Pituitária do Rato como Modelo In Vitro para Explorar a Biologia das Células-Tronco Pituitárias

DOI:

10.3791/63431

⸱

25 de fevereiro de 2022

 ,  , 
1Laboratory of Tissue Plasticity in Health and Disease, Cluster of Stem Cell and Developmental Biology, Department of Development and Regeneration, Leuven Stem Cell Institute, KU Leuven (University of Leuven)

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A glândula pituitária é o principal regulador do sistema endócrino do corpo. Este artigo descreve o desenvolvimento de organoides da pituitária do camundongo como um novo modelo in vitro 3D para estudar a população de células-tronco da glândula da qual a biologia e a função permanecem mal compreendidas.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A pituitária é a glândula endócrina mestre que regula os principais processos fisiológicos, incluindo crescimento corporal, metabolismo, maturação sexual, reprodução e resposta ao estresse. Há mais de uma década, células-tronco foram identificadas na glândula pituitária. No entanto, apesar da aplicação de abordagens in vivo transgênicas, seu fenótipo, biologia e papel permanecem incertos. Para enfrentar esse enigma, um novo e inovador modelo in vitro organoide é desenvolvido para desvendar profundamente a biologia das células-tronco pituitárias. Os organoides representam estruturas celulares 3D que, sob condições culturais definidas, se auto-desenvolvem a partir das células-tronco (epiteliais) de um tecido e recapitulam múltiplas marcas dessas células-tronco e seu tecido. É mostrado aqui que organoides derivados da hipófise do rato desenvolvem-se a partir das células-tronco da glândula e recapitulam fielmente suas características fenotípicas e funcionais in vivo . Entre outros, reproduzem o estado de ativação das células-tronco como in vivo ocorrendo em resposta a danos locais transgenicamente infligidos. Os organoides são expansíveis a longo prazo, mantendo robustamente seu fenótipo de caule. O novo modelo de pesquisa é altamente valioso para decifrar o fenótipo e o comportamento das células-tronco durante as condições-chave da remodelação pituitária, que vão desde a maturação neonatal até o desbotamento associado ao envelhecimento e de glândulas saudáveis a doentes. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para estabelecer organoides derivados da pituitária do rato, que fornecem uma poderosa ferramenta para mergulhar no mundo ainda enigmático das células-tronco pituitárias.

Introdução

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A pituitária é uma pequena glândula endócrina localizada na base do cérebro, onde está conectada ao hipotálamo. A glândula integra insumos periféricos e centrais (hipotalâmicos) para gerar uma liberação hormonal afinada e coordenada, regulando assim órgãos endócrinos de alvo a jusante (como glândulas suprarrenais e gônados) para produzir hormônios apropriados no momento adequado. A pituitária é o principal regulador do sistema endócrino e, portanto, é legitimamente denominada a glândula mestre1.

A pituitária do rato é composta por três lóbulos (Figura 1), ou seja, o lobo anterior (AL), o lobo intermediário (IL) e o lobo posterior (PL). A al endócrina principal contém cinco tipos de células hormonais, incluindo somatotropes que produzem hormônio do crescimento (GH); lactotropas gerando prolactina (PRL); corticotrópicas que secretam hormônio adrenocorticotrópico (ACTH); thyrotropes responsáveis pela produção de hormônio estimulante da tireoide (TSH); e gonadotropes que fazem hormônio luteinizador (LH) e hormônio estimulante do folículo (FSH). O PL consiste em projeções axonais do hipotálamo em que os hormônios ocitocina e vasopressina (hormônio antidiurético) são armazenados. O IL está localizado entre a AL e o PL e abriga melanantropos que produzem hormônio estimulante de melanócitos (MSH). Na pituitária humana, o IL regrede durante o desenvolvimento, e os melanotropos são espalhados dentro da AL1. Além das células endócrinas, a glândula pituitária também contém um conjunto de células-tronco, essencialmente marcadas pelo fator de transcrição SOX2 2,3,4,5,6. Estas células SOX2+ estão localizadas na zona marginal (MZ), o revestimento epitelial da fissura (um lúmen remanescente embrionário entre a AL e a IL), ou são espalhadas como aglomerados por todo o parenchyma da AL, propondo assim dois nichos de células-tronco na glândula (Figura 1)2,3,4,5,6.

Dada a natureza indispensável da hipófise, o mau funcionamento da glândula está associado à morbidade grave. O hiperpituitarismo (caracterizado pela supernecreção de um ou mais hormônios) e hipopituitarismo (produção defeituosa ou ausente de um ou mais hormônios) podem ser causados por tumores neuroendócrinos pituitários (PitNETs; por exemplo, tumores produtores de ACTH que levam à doença de Cushing) ou por defeitos genéticos (por exemplo, deficiência de GH resultando em nanô)7. Além disso, cirurgia pituitária (por exemplo, para remover tumores), infecções (por exemplo, tuberculose hipotalâmica-pituitária, ou infecções após meningite bacteriana ou encefalite), síndrome de Sheehan (necrose devido ao fluxo sanguíneo insuficiente devido à forte perda de sangue ao nascer), apoplexia pituitária e lesão cerebral traumática são outras causas importantes de hipofunção pituitária8 . Foi demonstrado que a pituitária do camundongo possui a capacidade regenerativa, sendo capaz de reparar danos locais introduzidos pela ablação transgênica das células endócrinas 9,10. As células-tronco SOX2+ reagem agudamente à lesão infligida mostrando um fenótipo ativado, marcado por maior proliferação (resultando em expansão de células-tronco) e aumento da expressão de fatores e caminhos relacionados à haste (por exemplo, WNT/NOTCH). Além disso, as células-tronco começam a expressar o hormônio ablado, resultando finalmente na restauração substancial da população celular empobrecida ao longo dos seguintes (5 a 6) meses 9,10. Além disso, durante a fase de maturação neonatal da glândula (as primeiras 3 semanas após o nascimento), as células-tronco pituitárias estão prosperando em um estado ativado 6,11,12,13, enquanto o envelhecimento organismo está associado à diminuição da funcionalidade de células-tronco in situ, devido a um ambiente inflamatório crescente (micro-) ao envelhecimento (ou 'inflamação')10,14 . Além disso, a tumorigênese na glândula também está associada à ativaçãode células-tronco 7,15. Embora a ativação de células-tronco tenha sido detectada em várias situações de remodelação pituitária (revisada em 7,16), os mecanismos subjacentes permanecem incertos. Uma vez que as abordagens in vivo (como o rastreamento de linhagem em camundongos transgênicos) não forneceram uma imagem clara ou abrangente de células-tronco pituitárias, o desenvolvimento de modelos in vitro confiáveis para explorar a biologia de células-tronco em hipófise normal e doente é essencial. A cultura in vitro padrão de células-tronco primárias pituitárias permanece inadequada devido à capacidade de crescimento muito limitada e condições não fisiológicas (2D) com perda rápida de fenótipo (para uma visão geral mais detalhada, veja16). Culturas de esfera 3D (pituosferas) foram estabelecidas a partir de células-tronco pituitárias identificadas pela população lateral e fenótipo SOX2+ 2,3,4. As pituferas crescem clonalmente a partir das células-tronco, expressam marcadores de tronco e mostram capacidade de diferenciação nos tipos de células endócrinas. No entanto, eles não se expandem consideravelmente, mostrando apenas passabilidade limitada (2-3 passagens)3,4. Estruturas semelhantes a esferas também foram obtidas de aglomerados de células-tronco pituitárias não dissociados quando cultivadas em Matrigel 50% diluído por 1 semana, mas a expansão não foi mostrada17. A abordagem pituisphere é usada principalmente como uma ferramenta de leitura para números de células-tronco, mas outras aplicações são limitadas por capacidade de expansão inferior16.

Para resolver e superar essas deficiências, um novo modelo 3D foi recentemente estabelecido, ou seja, organoides, a partir da maior AL endócrina de camundongos contendo as células-tronco MZ e parenchymal. Foi demonstrado que os organoides são de fato derivados das células-tronco da hipófise e recapitulam fielmente seu fenótipo18. Além disso, os organoides são expansíveis a longo prazo, mantendo robustamente sua natureza de caule. Portanto, eles fornecem um método confiável para expandir células-tronco primárias pituitárias para exploração profunda. Tal exploração não é alcançável com o número limitado de células-tronco que podem ser isoladas de uma pituitária, que também não são expansíveis em condições 2D16. Foi demonstrado que os organoides são ferramentas valiosas e confiáveis para descobrir novas características de células-tronco pituitárias (traduzíveis para in vivo)14,18. É importante ressaltar que o modelo organoide espelha fielmente o estado de ativação de células-tronco pituitárias como ocorrendo durante danos teciduais locais e maturação neonatal, mostrando maior eficiência de formação e replicando vias moleculares regulamentadas14,18. Assim, o modelo organoide derivado da hipófise é um inovador e poderoso modelo de pesquisa de biologia de células-tronco pituitárias, bem como uma ferramenta de leitura de ativação de células-tronco.

Este protocolo descreve em detalhes o estabelecimento de organoides derivados da pituitária do rato. Para este objetivo, a AL é isolada e dissociada em células únicas, que são incorporadas em matrigel extracelular (aquion referido como ECM). O conjunto célula-ECM é então cultivado em um meio definido, essencialmente contendo fatores de crescimento de células-tronco e reguladores embrionários pituitários (ainda mais chamados de "meio organoide pituitário" (PitOM)18; Tabela 1). Uma vez que os organoides são totalmente desenvolvidos (após 10-14 dias), eles podem ser ainda mais expandidos através de passagem sequencial e submetidos a extensa exploração a jusante (por exemplo, imunofluorescência, RT-qPCR e transcrição em massa ou unicelular; Figura 1). A longo prazo, espera-se que os organoides de células-tronco pituitárias abram caminho para abordagens de reparação tecidual e medicina regenerativa.

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Protocolo

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Os experimentos em animais para este estudo foram aprovados pelo Ku Leuven Ethical Committee for Animal Experimentation (P153/2018). Todos os camundongos foram alojados na unidade animal da universidade em condições padronizadas (temperatura constante de 23 ± 1,5 °C, umidade relativa 40%-60%, e um ciclo dia/noite de 12 h), com acesso a água e alimentos ad libitum.

1. Ratos

  1. Use cepas de mouse disponíveis comercialmente, como ratos C57BL/6J, de idade para jovens adultos (8-12 semanas de idade). Em geral, 2-3 camundongos fornecem um número suficiente de células de AL para o protocolo.

2. Isolamento e dissociação do mouse AL

NOTA: Os médios A, B e C são preparados com antecedência19,20. As composições são mostradas na Tabela 2.

  1. Isolamento do rato AL
    1. Eutanize os camundongos por asfixia de CO2 , seguido de decapitação (Figura 2A). Lave cabeças de camundongos com água deionizada para remover o sangue e pulverizá-los com 70% de EtOH para gerar um ambiente estéril.
    2. Utilizando ferramentas cirúrgicas estéreis, remova a pele da cabeça entre as orelhas (Figura 2B).
    3. Abra o crânio e remova o cérebro.
      1. Quebrar a 'ponte do nariz' (ou seja, parte anterior do osso frontal; Figura 2B) com uma tesoura estéril.
      2. Abra ainda mais o crânio com uma tesoura, começando pela ponte do nariz quebrada em direção às orelhas, em ambos os lados (Figura 2C).
      3. Remova o crânio e o cérebro com pinças estéreis, sem tocar na glândula pituitária (Figura 2D).
    4. Remova o diafragma sellae com pinças sem cortes, sem danificar a pituitária. Descarte o PL e o IL da AL sob um estereoscópio.
      NOTA: O PL e o IL estão ligados e, portanto, removidos simultaneamente. Estas partes aparecem como tecido branco, em comparação com a AL cor-de-rosa (Figura 2D).
    5. Isole cuidadosamente a AL com pinças sem corte e colete-a em um frasco de 10 mL Erlenmeyer, preenchido com 3 mL de médio A (ver Tabela 2). Coloque o frasco no gelo até que seja mais processamento.
  2. Dissociação do mouse AL
    1. Retire o supernascido (SN) médio A do frasco de Erlenmeyer contendo a AL isolada. Adicione 2 mL de solução de trippsina pré-armada (37 °C) e incubar a 37 °C por 15 min.
    2. Sem remover a solução de trippsina, adicione 2 mL de solução DNase pré-armada (37 °C) (2 μg/mL em médio A; filtrado estéril através de uma malha de 0,22 μm) e gire o frasco de Erlenmeyer 10 vezes. Deixe a hipófise afundar até o fundo (~1 min) e remova o SN.
    3. Adicione 2 mL de solução inibidora de trippsina pré-armada (37 °C) (0,1 mg/mL no médio A; filtrado estéril através de uma malha de 0,22 μm) e incubar a 37 °C por 10 min. Deixe o sedimento pituitário até o fundo e remova o SN.
    4. Adicione 2 mL de pré-armado (37 °C) médio B (ver Tabela 2) e incubar a 37 °C por 5 min. Sem retirar o SN, adicione 2 mL de meio C pré-armado (37 °C) (ver Tabela 2) e incubar a 37 °C por 15 min.
    5. Deixe a hipófise afundar até o fundo e remova o SN. Enxágüe a pituitária três vezes com o meio C pré-armado (37 °C).
    6. Dissociar a pituitária em células únicas.
      1. Adicione 2 mL de meio C pré-armado (37 °C) e expulse a glândula pituitária com uma pipeta Pasteur estéril e polida de fogo várias vezes, até que os fragmentos não sejam mais visíveis.
      2. Transfira a suspensão para um tubo de 15 mL com 4,5 mL de solução DNase pré-armada (37 °C) (2 μg/mL em médio A; filtrado estéril através de uma malha de 0,22 μm). Enxágüe o Erlenmeyer três vezes com 2 mL de meio C pré-armado (37 °C) e transfira a suspensão para o tubo de 15 mL.
    7. Misture a suspensão celular coletada e filtre-a através de um coador de células de 40 μm em um tubo de 30 mL. Enxágüe o tubo de 15 mL e o coador celular três vezes com 2 mL de C médio e transfira a suspensão para o tubo de 30 mL.
    8. Posicione a ponta de uma pipeta pasteur de vidro, preenchida com 2 mL de solução de albumina de soro bovino (BSA) de 3% (no meio A; filtrada estéril através de uma malha de 0,22 μm), na parte inferior do tubo e pipeta suavemente para fora para formar uma camada de densidade visível. Centrifugar a 190 x g por 10 min a 4 °C.
    9. Remova o SN invertendo o tubo em um movimento fluente e remova as gotículas SN restantes com uma ponta P1000. Resuspenque a pelota celular em 1 mL de DMEM/F12 avançado de gelo (Adv DMEM/F12) e quantifique as células com um contador de células.

3. Estabelecimento e cultivo de organoides derivados da AL

NOTA: Descongele o ECM no gelo com antecedência (2-3 h por 1 mL) e mantenha-o no gelo durante a duração do protocolo.

  1. Semeadura e cultivo organoide
    1. Centrifugar a suspensão da célula AL a 190 x g por 10 min a 4 °C e remover o SN. Resuspende a pelota de célula no Adv DMEM/F12 usando o volume específico calculado para atingir uma densidade celular de 1,1 x 106 células/mL.
      NOTA: Por exemplo, se a suspensão da célula contiver 500.000 células/mL, deve-se resuspensar a pelota celular em 454,54 μL de Adv DMEM/F12 para atingir a densidade desejada de 1,1 x 106 células/mL.
    2. Tire o volume de suspensão celular necessário para o revestimento (de acordo com o número desejado de poços para sementes para desenvolvimento organoide) e adicione ECM em uma proporção de 30:70 (suspensão celular de 30% (em Adv DMEM/F12 ) e 70% ECM). Misture bem por pipetting para cima e para baixo.
      NOTA: Por exemplo, para uma gotícula de 30 μL (ver passo 3.1.3), deve-se (suavemente) misturar 9 μL de suspensão celular (contendo ~10.000 células quando retirado da suspensão 1.1 x 106 células/mL) com 21 μL de ECM.
    3. Por bem, deposite uma gota de 30 μL da mistura de suspensão celular/ECM (ver passo 3.1.2) em uma placa pré-aquecida (37 °C) de 48 poços. Vire a placa de cabeça para baixo e deixe o ECM solidificar a 37 °C por 20 min.
      NOTA: Pré-aqueça as placas de cultura por pelo menos 24 h a 37 °C.
    4. Retorne a placa à sua orientação adequada e adicione cuidadosamente 250 μL de PitOM pré-armado (37 °C) (ver Tabela 1) complementado com 10 μM Inibidor de Rocha (Y-27632).
    5. Continue a cultivar os organoides mudando o meio (desprovido de Y-27632) a cada 2-3 dias até que os organoides sejam totalmente cultivados, o que leva entre 10-14 dias (Figura 3A). Então, passagem os organoides.
      NOTA: Ao aspirar o meio, certifique-se de não interromper a cúpula ECM. Incline ligeiramente a placa de cultura e remova o meio da borda inferior do poço. O meio fresco (pré-armado a 37 °C) deve ser adicionado suavemente ao lado do poço. Se as gotículas de gel desacoplam, colete os organoides e resuspende e cultue-os novamente em uma nova gotícula ECM.
  2. Passagem organoide
    1. Aspire o meio suavemente e adicione 400 μL de Adv DMEM/F12 gelado para desintegrar o ECM e coletar os organoides em um tubo de microcentrifuge. Lave uma vez com 400 μL de Adv DMEM/F12 EM gelado. Centrifugar a 200 x g por 5 min a 4 °C.
    2. Remova o SN cuidadosamente e adicione 400 μL de enzima expressa trypLE (1X) pré-armada (37 °C). Misture invertendo o tubo várias vezes e incubar a 37 °C por 5 min.
    3. Adicione 400 μL de Adv DMEM/F12 gelado e centrífuga a 200 x g por 5 min a 4 °C. Remova o SN.
    4. Resuspenque a pelota com 100 μL de Adv DMEM/F12 gelado e, posteriormente, quebre os organoides, encanar vigorosamente para cima e para baixo com uma ponta P200 estreita (ou seja, empurre para baixo a ponta vazia contra a parte inferior do tubo de microcentrifuuge, para reduzir seu diâmetro de abertura) até que fragmentos organoides (com um diâmetro em torno de 50 μm) sejam obtidos (Figura 3B).
      NOTA: A mistura de dissociação deve conter fragmentos predominantemente organoides e apenas algumas células únicas. A dissociação severa dos organoides em células únicas impacta negativamente o re-crescimento dos organoides.
    5. Adicione 800 μL de Adv DMEM/F12 e centrífuga a 190 x g por 10 min a 4 °C. Remova o SN.
    6. Passagem os organoides em uma proporção de 1:2 para 1:4. Resuspenncie a pelota em um volume adequado de Adv DMEM/F12 conforme necessário para chapeamento e adicione ECM em uma proporção de 30:70 (30% de suspensão celular e 70% ECM). Misture bem por pipetting para cima e para baixo.
    7. Sementes e cultura os organoides descritos acima nas etapas 3.1.3-3.1.5.
      NOTA: Em média, 20 organoides se desenvolvem por poço a partir das 10.000 células inteiras de AL semeadas (0,2%). Estes organoides de passagem 0 podem ser divididos em uma razão de 1:2, resultando em >50 organoides se desenvolvendo por poço (passagem 1). Os organoides podem então ser divididos em uma proporção de 1:2 a 1:4 durante as passagens subsequentes. O re-crescimento dos organoides desacelera após ~10 passagens (correspondentes a 3 meses de cultura), concretizados em organoides gradualmente menores e menores.

4. Criopreservação de organoides derivados da AL e descongelamento

  1. Criopreservação de organoides
    1. Siga o protocolo de aprovação da etapa 3.2.1 até a etapa 3.2.5.
    2. Resuspende a pelota organoide (contendo fragmentos e células) com 1 mL de meio criopreservador (Tabela 3). Transfira a suspensão para um criovial e coloque-a no gelo.
      NOTA: Organoides (ou seja, fragmentos e células resultantes) de até quatro poços da placa de 48 poços podem ser combinados em um criovial.
    3. Coloque os criovias em um recipiente de congelamento e transfira-os para -80 °C.
    4. Após 24 h, transfira as amostras para uma criobox e armazene-as em nitrogênio líquido (-196 °C) para armazenamento a longo prazo.
  2. Descongelamento de organoides criopreservados
    1. Remova o criovial do tanque de nitrogênio líquido e coloque-o no gelo. Imediatamente proceda com o protocolo de descongelamento.
    2. Descongele a solução com os fragmentos organoides criopreservados e células únicas a 37 °C (banho de água).
      NOTA: Não guarde a solução por mais de 2 min a 37 °C para evitar a toxicidade celular por DMSO.
    3. Transfira o conteúdo para um tubo de 15 mL contendo 10 mL de Adv DMEM/F12 gelado com 30% de soro bovino fetal (FBS). Enxágüe o criovial com 1 mL de Adv DMEM/F12 com 30% de FBS.
    4. Centrifugar a 190 x g por 10 min a 4 °C. Resuspenja a pelota com 1 mL de Adv DMEM/F12 gelado e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga.
    5. Centrifugar a 190 x g por 10 min a 4 °C. Resuspenncie a pelota em um volume adequado de Adv DMEM/F12 conforme necessário para chapeamento e adicione ECM em uma proporção de 30:70. Misture bem por pipetting para cima e para baixo.
    6. Sementes e cultura os organoides descritos acima nas etapas 3.1.3-3.1.5.

5. Validação de organoides derivados da AL

  1. Coleta e lise de organoides para isolamento do RNA
    1. Coletar e centrifugar os organoides conforme descrito acima (passo 3.2.1).
    2. Remova o SN e adicione 350 μL de tampão de lise com 1% de 2 mercapto-etanol. Vórtice para 30 s e armazenar a -80 °C ou proceder imediatamente ao isolamento do RNA.
      ATENÇÃO: Cuidado que o 2-mercapto-etanol é um composto tóxico. Todo o trabalho deve ser feito em um capuz de fumaça química enquanto usa luvas de nitrito, uma máscara de poeira e óculos de segurança. 2-Mercapto-etanol pode causar danos irreversíveis aos olhos e à pele.
  2. Fixação e incorporação de organoides para coloração imuno-histoquímica/fluorescência
    1. Coletar e centrifugar os organoides conforme descrito acima (passo 3.2.1).
    2. Remova o SN, adicione 1 mL de paraformaldeído (PFA) e incuba por 30 minutos à temperatura ambiente (RT) em um agitador orbital (100 rpm).
      ATENÇÃO: PfA é um conhecido cancerígeno humano que pode causar danos irreversíveis à córnea. Todo o trabalho deve ser feito em um capuz de fumaça química. Luvas de nitrito e óculos de segurança devem ser sempre usados.
    3. Centrifugar a 200 x g por 5 min e remover o SN. Adicione 1 mL de PBS, incubar 10 min no RT em um agitador orbital (100 rpm), e centrífuga a 90 x g por 3 min a 4 °C. Repita o passo de lavagem duas vezes. Armazenar na PBS a 4 °C.
    4. Para processamento e desidratação tecidual, remova o SN e adicione 150 μL de gel de 2% de agarose (em PBS) à pelota organoide usando uma ponta p200 alargada pré-armada (feita cortando um pequeno pedaço da ponta). Imediatamente encarregue todo o volume e ejete na tampa do tubo de microcentrífuga.
      NOTA: É importante trabalhar rapidamente, pois o gel que contém os organoides se solidificará rapidamente.
    5. Deixe o gel solidificar firmemente por 30 minutos e mova o disco de gel para um de histologia. Mergulhe e armazene em 50% EtOH, até a desidratação no processador de tecidos.
    6. Para a incorporação da parafina, coloque o disco de gel (usando fórceps) em um molde de incorporação e encha com parafina quente (60 °C). Coloque os moldes a 4 °C até que a parafina esteja sólida (aproximadamente 45 min). Estas amostras podem ser armazenadas a 4 °C ou podem ser imediatamente submetidas à secção.
    7. Microtome os blocos de parafina contendo organoides com espessura de 5 μm e coletam as amostras em lâminas de vidro. Adicione uma gota de água deionizada por baixo de cada seção para permitir o alongamento adequado da seção e coloque os slides em uma placa de aquecimento plana a 37 °C durante a noite. Armazene os slides com seções a 4 °C ou continue diretamente com a coloração imunohistoquímica ou imunofluorescência.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Após o isolamento e dissociação da AL, as células únicas obtidas são semeadas em ECM e cultivadas em PitOM (Figura 1, Tabela 1). A Figura 3A exibe a cultura celular e a densidade na semeadura (Dia 0). Alguns pequenos detritos podem estar presentes (Figura 3A, pontas de flecha branca), mas desaparecerão na passagem. Quatorze dias após a semeadura, os organoides derivados da AL são totalmente desenvolvidos (

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os organoides derivados da AL, como descrito aqui, representam um poderoso modelo de pesquisa para estudar células-tronco pituitárias in vitro. Atualmente, essa abordagem organoide é a única ferramenta disponível para crescer e expandir as células-tronco primárias. Um modelo organoide pituitário derivado de células-tronco embrionárias (ESC) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) foi relatado anteriormente, o que recapitula de perto a organogênese embrionária pituitária23; no en...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Ku Leuven Research Fund e do Fundo de Pesquisa Científica (FWO) - Flandres. E.L. (11A3320N) e C.N. (1S14218N) são apoiados por uma Bolsa de Doutorado da FWO/FWO-SB.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Sigma-AldrichM62502 mercaptoetanol
tratadas com TC, embaladas individualmenteCostar734-1607
A83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12Gibco12634010
Albumina Bovina (grau de cultura celular)Suplemento Serva47330
B-27 ( 50X), menos vitamina AGibco12587010
Base moldesVWR720-1918
Buffer RLTQiagen79216
, Q Path MicrotwinVWR720-2191
Filtro de células, 40 µ m mesh, descartávelFalcon352340
Toxina da cólera de Vibrio choleraeSigma-AldrichC8052
Desoxirribonuclease I do pâncreas bovinoSigma-AldrichD5025
D-glicoseMerck108342
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD2650
DMEM, pó, Tubos Gibco52100039
Eppendorf Safe-Lock com alto teor de glicose, lâminasde adesão Eppendorf30120086
Epredia SuperFrost PlusThermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Epredia HistoStar, 220 a 240VacThermo Fisher Scientific12587976
Etanol Absoluto 99,8+%Thermo Fisher Scientific
Soro fetal bovino (FBS)Sigma-AldrichF7524
GlutaMAX SuplementoGibco35050061
HEPESSigma-AldrichH4034
Solução tampão HEPESGibco15630056
InSolution Y-27632Sigma-Aldrich688001
L-Glutamina (200 mM)Matrizde
Matrigel Redução do Fator de Crescimento (TFG), Livre de DEVCorning15505739
Recipiente de Congelamento Mr. FrostyThermo Fisher Scientific5100-0001
N-2 Suplemento (100X)Thermo Fisher Scientific17502048
N-Acetil-L-cisteínaSigma-AldrichA7250
Nunc Biobanking e Tubos Criogênicos de Cultura de CélulasThermo Fisher Scientific375353
Paraformaldeído para síntese (PFA)Merck818715
PBS, pH 7,4Gibco10010023
Penicilina G sal de sódioSigma-AldrichP3032
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140122
Fenol vermelhoMerck107241 Cloreto de
Potássio (KCl)ProteínaMerck 104936
, CFR& D systems236-EG
Humano Recombinante FGF básico/FGF2/bFGF (157 aa) ProteínaR& D systems234-FSE
Humano Recombinante FGF-10Peprotech100-26
Humano Recombinante IGF-1Peprotech100-11
Humano Recombinante IL-6Peprotech200-06
Cabeça Humana RecombinantePeprotech120-10C
Humano Recombinante R-Spondin-1Peprotech120-38
Recombinante Humano/Murino FGF-8bPeprotech100-25
Rato Recombinante Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-TerminusR& D systems464-SH
RNeasy micro kitQiagen74004
SB202190Sigma-AldrichS7067
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Cloreto de Sódio (NaCl)BDH102415K
Di-Hidrogenofosfato de Sódio 1-hidratoPanReac-AppliChemA1047
Sódio Carbonato de hidrogênio (NaHCO3)Merck106329
Sódio-piruvato (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP5280
Stericup-GP, 0.22 µ mMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP Unidade de Filtro Superior de Tubo de Centrífuga Estéril, 0.22 μ mMilliporeSCGP00525
Água estérilFreseniusB230531
Sal de sulfato de estreptomicinaSigma-AldrichS6501
Thermo Scientific Excelsior ES Processador de tecidosThermo Scientific12505356
Titriplex IIIEnzima Merck108418
TrypL Express (1X), vermelho de fenolThermo Fisher Scientific12605028
Inibidor de tripsina de Glycine max (soja)Sigma-AldrichT9003
Solução de tripsina 2,5Thermo Fisher Scientific15090046
Placas de 2 poços de , de 1,5 mL Estação de trabalho de incorporação 10342652 Membrana de Pouso Gibco 25030081 EGF Humana Recombinante %

Referências

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