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Developmental Biology

माउस पिट्यूटरी से ऑर्गेनोइड्स का विकास इन विट्रो मॉडल के रूप में पिट्यूटरी स्टेम सेल जीवविज्ञान का पता लगाने के लिए

Published: February 25, 2022 doi: 10.3791/63431
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Laboratory of Tissue Plasticity in Health and Disease, Cluster of Stem Cell and Developmental Biology, Department of Development and Regeneration, Leuven Stem Cell Institute, KU Leuven (University of Leuven)
* These authors contributed equally

Summary

पिट्यूटरी ग्रंथि शरीर के अंतःस्रावी तंत्र का प्रमुख नियामक है। यह लेख माउस पिट्यूटरी से ऑर्गेनोइड्स के विकास का वर्णन करता है, जो ग्रंथि के स्टेम सेल आबादी का अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास 3 डी इन विट्रो मॉडल के रूप में है, जिसमें से जीव विज्ञान और कार्य खराब रूप से समझा जाता है।

Abstract

पिट्यूटरी प्रमुख शारीरिक प्रक्रियाओं को विनियमित करने वाली मास्टर अंतःस्रावी ग्रंथि है, जिसमें शरीर की वृद्धि, चयापचय, यौन परिपक्वता, प्रजनन और तनाव प्रतिक्रिया शामिल है। एक दशक से अधिक समय पहले, पिट्यूटरी ग्रंथि में स्टेम कोशिकाओं की पहचान की गई थी। हालांकि, विवो दृष्टिकोण में ट्रांसजेनिक के आवेदन के बावजूद, उनके फेनोटाइप, जीव विज्ञान और भूमिका अस्पष्ट बनी हुई है। इस पहेली से निपटने के लिए, एक नया और अभिनव ऑर्गेनोइड इन विट्रो मॉडल पिट्यूटरी स्टेम सेल जीव विज्ञान को गहराई से उजागर करने के लिए विकसित किया गया है। ऑर्गेनोइड्स 3 डी सेल संरचनाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, जो परिभाषित संस्कृति स्थितियों के तहत, ऊतक (उपकला) स्टेम कोशिकाओं से आत्म-विकसित होते हैं और उन स्टेम कोशिकाओं और उनके ऊतकों के कई हॉलमार्क को फिर से विकसित करते हैं। यहां यह दिखाया गया है कि माउस पिट्यूटरी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स ग्रंथि की स्टेम कोशिकाओं से विकसित होते हैं और वफादारी से विवो फेनोटाइपिक और कार्यात्मक विशेषताओं में उनकी पुनरावृत्ति करते हैं। दूसरों के बीच, वे स्टेम कोशिकाओं की सक्रियण स्थिति को पुन: उत्पन्न करते हैं क्योंकि ट्रांसजेनिक रूप से स्थानीय क्षति के जवाब में विवो में होता है। ऑर्गेनोइड्स लंबे समय तक विस्तार योग्य होते हैं, जबकि मजबूती से उनके स्टेमनेस फेनोटाइप को बनाए रखते हैं। नया शोध मॉडल पिट्यूटरी रीमॉडलिंग की प्रमुख स्थितियों के दौरान स्टेम कोशिकाओं के फेनोटाइप और व्यवहार को समझने के लिए अत्यधिक मूल्यवान है, नवजात परिपक्वता से लेकर उम्र बढ़ने से जुड़े लुप्त होने तक, और स्वस्थ से रोगग्रस्त ग्रंथियों तक। यहां, माउस पिट्यूटरी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स स्थापित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है, जो पिट्यूटरी स्टेम कोशिकाओं की अभी तक रहस्यमय दुनिया में गोता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

पिट्यूटरी मस्तिष्क के आधार पर स्थित एक छोटी अंतःस्रावी ग्रंथि है, जहां यह हाइपोथैलेमस से जुड़ा हुआ है। ग्रंथि परिधीय और केंद्रीय (हाइपोथैलेमिक) इनपुट को एक ट्यून और समन्वित हार्मोन रिलीज उत्पन्न करने के लिए एकीकृत करती है, जिससे उचित समय पर उपयुक्त हार्मोन का उत्पादन करने के लिए डाउनस्ट्रीम लक्ष्य अंतःस्रावी अंगों (जैसे अधिवृक्क ग्रंथियों और गोनाड्स) को विनियमित किया जाता है। पिट्यूटरी अंतःस्रावी प्रणाली का प्रमुख नियामक है और इसलिए इसे मास्टर ग्रंथि1 कहा जाता है।

माउस पिट्यूटरी में तीन लोब (चित्रा 1) होते हैं, अर्थात्, पूर्वकाल लोब (एएल), मध्यवर्ती लोब (आईएल), और पीछे के लोब (पीएल)। प्रमुख अंतःस्रावी एएल में पांच हार्मोनल सेल प्रकार होते हैं, जिनमें सोमाटोट्रोप्स शामिल हैं जो विकास हार्मोन (जीएच) का उत्पादन करते हैं; प्रोलैक्टिन (पीआरएल) उत्पन्न करने वाले लैक्टोट्रोप; corticotropes कि adrenocorticotropic हार्मोन (ACTH) स्रावित; थायराइड-उत्तेजक हार्मोन (टीएसएच) उत्पादन के लिए जिम्मेदार थायरोट्रोप्स; और गोनाडोट्रोप्स जो ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (एलएच) और कूप-उत्तेजक हार्मोन (एफएसएच) बनाते हैं। पीएल में हाइपोथैलेमस से अक्षीय अनुमान होते हैं जिसमें हार्मोन ऑक्सीटोसिन और वैसोप्रेसिन (एंटीडाययूरेटिक हार्मोन) संग्रहीत होते हैं। आईएल एएल और पीएल के बीच में स्थित है और मेलानोट्रोप्स रखता है जो मेलानोसाइट-उत्तेजक हार्मोन (एमएसएच) का उत्पादन करता है। मानव पिट्यूटरी में, आईएल विकास के दौरान पीछे हटता है, और मेलानोट्रोप्स एएल1 के भीतर फैल जाते हैं। अंतःस्रावी कोशिकाओं के अलावा, पिट्यूटरी ग्रंथि में स्टेम कोशिकाओं का एक पूल भी होता है, जो अनिवार्य रूप से प्रतिलेखन कारकSOX2 2,3,4,5,6 द्वारा चिह्नित होता है। ये SOX2+ कोशिकाएं सीमांत क्षेत्र (MZ) में स्थित हैं, फांक के उपकला अस्तर (AL और IL के बीच एक भ्रूण अवशेष लुमेन), या AL के पैरेन्काइमा में क्लस्टर के रूप में फैले हुए हैं, जिससे ग्रंथि में दो स्टेम सेल niches का प्रस्ताव है (चित्रा 1)2,3,4,5,6।

पिट्यूटरी की अपरिहार्य प्रकृति को देखते हुए, ग्रंथि की खराबी गंभीर रुग्णता से जुड़ी हुई है। Hyperpituitarism (एक या एक से अधिक हार्मोन के अति-स्राव की विशेषता) और hypopituitarism (एक या एक से अधिक हार्मोन के दोषपूर्ण या लापता उत्पादन) पिट्यूटरी न्यूरोएंडोक्राइन ट्यूमर (PitNETs; उदाहरण के लिए, ACTH-उत्पादक ट्यूमर कुशिंग की बीमारी के लिए अग्रणी) या आनुवंशिक दोषों (जैसे, जीएच की कमी के परिणामस्वरूप बौनापन के परिणामस्वरूप) के कारण हो सकता है। इसके अलावा, पिट्यूटरी सर्जरी (उदाहरण के लिए, ट्यूमर को हटाने के लिए), संक्रमण (उदाहरण के लिए, हाइपोथैलेमिक-पिट्यूटरी तपेदिक, या बैक्टीरियल मेनिन्जाइटिस या इंसेफलाइटिस के बाद संक्रमण), शीहान सिंड्रोम (जन्म देने पर भारी रक्त हानि के कारण अपर्याप्त रक्त प्रवाह के कारण परिगलन), पिट्यूटरी एपोप्लेक्सी और दर्दनाक मस्तिष्क की चोट पिट्यूटरी हाइपोफंक्शन 8 के अन्य महत्वपूर्ण कारण हैं। . यह दिखाया गया है कि माउस पिट्यूटरी में पुनर्योजी क्षमता होती है, जो अंतःस्रावी कोशिकाओं के ट्रांसजेनिक एब्लेशन द्वारा पेश किए गए स्थानीय नुकसान की मरम्मत करने में सक्षम होतीहै 9,10। SOX2 + स्टेम कोशिकाएं एक सक्रिय फेनोटाइप को दिखाते हुए चोट पर तीव्र प्रतिक्रिया करती हैं, जो बढ़ी हुई प्रसार (जिसके परिणामस्वरूप स्टेम सेल विस्तार में होती है) और स्टेमनेस से संबंधित कारकों और मार्गों (जैसे, WNT / NOTCH) की बढ़ी हुई अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित होती है। इसके अलावा, स्टेम कोशिकाएं एब्लेटेड हार्मोन को व्यक्त करना शुरू कर देती हैं, जिसके परिणामस्वरूप अंततः निम्नलिखित (5 से 6) महीनों में 9,10 में समाप्त सेल आबादी की पर्याप्त बहाली होती है। इसके अलावा, ग्रंथि के नवजात परिपक्वता चरण (जन्म के बाद पहले 3 सप्ताह) के दौरान, पिट्यूटरी स्टेम कोशिकाएं एक सक्रिय अवस्थामें 6,11,12,13 में संपन्न होती हैं, जबकि जीवीय उम्र बढ़ने से सीटू स्टेम सेल कार्यक्षमता में गिरावट के साथ जुड़ा हुआ है, उम्र बढ़ने पर एक बढ़ती भड़काऊ (सूक्ष्म-) वातावरण (या 'सूजन')10,14 के कारण . इसके अलावा, ग्रंथि में भी स्टेम सेल सक्रियण 7,15 के साथ जुड़ा हुआ है। यद्यपि पिट्यूटरी रीमॉडलिंग (7,16 में समीक्षा की गई) की कई स्थितियों में स्टेम सेल सक्रियण का पता लगाया गया है, अंतर्निहित तंत्र अस्पष्ट रहते हैं। चूंकि विवो दृष्टिकोण (जैसे ट्रांसजेनिक चूहों में वंश अनुरेखण) में पिट्यूटरी स्टेम कोशिकाओं की एक स्पष्ट या व्यापक तस्वीर नहीं दी गई है, इसलिए सामान्य और रोगग्रस्त पिट्यूटरी में स्टेम सेल जीव विज्ञान का पता लगाने के लिए विश्वसनीय इन विट्रो मॉडल का विकास आवश्यक है। प्राथमिक पिट्यूटरी स्टेम कोशिकाओं की मानक इन विट्रो संस्कृति फेनोटाइप के तेजी से नुकसान के साथ बहुत सीमित विकास क्षमता और गैर-शारीरिक (2 डी) स्थितियों के कारण अपर्याप्त बनी हुई है (अधिक विस्तृत अवलोकन के लिए,16 देखें)। 3 डी क्षेत्र संस्कृतियों (पिटुईस्फीयर) को पिट्यूटरी स्टेम कोशिकाओं से स्थापित किया गया है जैसा कि साइड आबादी और SOX2 + फेनोटाइप 2,3,4 द्वारा पहचाना गया है। पिटुइस्फीयर क्लोनली स्टेम कोशिकाओं से बढ़ते हैं, स्टेमनेस मार्करों को व्यक्त करते हैं और अंतःस्रावी सेल प्रकारों में भेदभाव क्षमता दिखाते हैं। हालांकि, वे केवल सीमित मार्ग (2-3 मार्ग) 3,4 दिखाते हुए काफी विस्तार नहीं करते हैं। गोले जैसी संरचनाओं को गैर-विघटित पिट्यूटरी स्टेम सेल क्लस्टर से भी प्राप्त किया गया था जब 1 सप्ताह के लिए 50% पतला मैट्रिगेल में सुसंस्कृत किया गया था, लेकिन विस्तारक्षमताको 17 नहीं दिखाया गया था। पिटुइस्फियर दृष्टिकोण का उपयोग ज्यादातर स्टेम सेल संख्याओं के लिए एक रीड-आउट टूल के रूप में किया जाता है, लेकिन आगे के अनुप्रयोगों को अवर विस्तार क्षमता16 द्वारा सीमित किया जाता है।

इन कमियों को दूर करने और दूर करने के लिए, एक नया 3 डी मॉडल हाल ही में स्थापित किया गया है, यानी, ऑर्गेनोइड्स, एमजेड और पैरेन्काइमल स्टेम कोशिकाओं वाले चूहों के प्रमुख अंतःस्रावी एएल से शुरू होता है। यह दिखाया गया है कि ऑर्गेनोइड्स वास्तव में पिट्यूटरी की स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त होते हैं और ईमानदारी से उनके फेनोटाइप18 को दोहराते हैं। इसके अलावा, ऑर्गेनोइड्स दीर्घकालिक विस्तार योग्य हैं, जबकि उनकी स्टेमनेस प्रकृति को मजबूत रूप से बनाए रखते हैं। इसलिए, वे गहन अन्वेषण के लिए प्राथमिक पिट्यूटरी स्टेम कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए एक विश्वसनीय विधि प्रदान करते हैं। इस तरह की खोज स्टेम कोशिकाओं की सीमित संख्या के साथ प्राप्त करने योग्य नहीं है जिसे पिट्यूटरी से अलग किया जा सकता है, जो 2डी स्थितियों में भी विस्तार योग्य नहीं हैं। यह दिखाया गया है कि ऑर्गेनोइड्स नए पिट्यूटरी स्टेम सेल सुविधाओं को उजागर करने के लिए मूल्यवान और विश्वसनीय उपकरण हैं (विवो में अनुवाद योग्य) 14,18। महत्वपूर्ण रूप से, ऑर्गेनोइड मॉडल स्थानीय ऊतक क्षति और नवजात परिपक्वता के दौरान होने वाली पिट्यूटरी स्टेम सेल सक्रियण स्थिति को ईमानदारी से प्रतिबिंबित करता है, जो बढ़ी हुई गठन दक्षता दिखाता है और14,18 अपरेगुलेटेड आणविक मार्गों की प्रतिकृति करता है। इसलिए, पिट्यूटरी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड मॉडल एक अभिनव और शक्तिशाली पिट्यूटरी स्टेम सेल जीव विज्ञान अनुसंधान मॉडल के साथ-साथ एक स्टेम सेल सक्रियण रीडआउट टूल है।

यह प्रोटोकॉल माउस पिट्यूटरी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स की स्थापना का विस्तार से वर्णन करता है। इस उद्देश्य के लिए, एएल को एकल कोशिकाओं में अलग और अलग किया जाता है, जो बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स-नकल करने वाले मैट्रिगेल में एम्बेडेड होते हैं (यहां ईसीएम के रूप में संदर्भित)। सेल-ईसीएम असेंबली को तब एक परिभाषित माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है, जिसमें अनिवार्य रूप से स्टेम सेल विकास कारक और पिट्यूटरी भ्रूण नियामक होते हैं (जिसे आगे 'पिट्यूटरी ऑर्गेनोइड माध्यम' (पिटोम) 18 के रूप में संदर्भित किया जाता है; तालिका 1)। एक बार ऑर्गेनोइड्स पूरी तरह से विकसित हो जाते हैं (10-14 दिनों के बाद), उन्हें आगे बढ़ाया जा सकता है गर्त अनुक्रमिक पासिंग और व्यापक डाउनस्ट्रीम अन्वेषण (जैसे, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, आरटी-क्यूपीसीआर, और थोक या एकल-सेल ट्रांसक्रिप्टोमिक्स) के अधीन किया जा सकता है; चित्र1)। लंबे समय तक, यह उम्मीद की जाती है कि पिट्यूटरी स्टेम सेल ऑर्गेनोइड्स ऊतक की मरम्मत के दृष्टिकोण और पुनर्योजी चिकित्सा का मार्ग प्रशस्त करेंगे।

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Protocol

इस अध्ययन के लिए पशु प्रयोगों को पशु प्रयोग के लिए केयू ल्यूवेन एथिकल कमेटी (P153/2018) द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी चूहों को मानकीकृत परिस्थितियों (23 ± 1.5 डिग्री सेल्सियस का निरंतर तापमान, सापेक्ष आर्द्रता 40% -60%, और 12 घंटे का दिन / रात चक्र) के तहत विश्वविद्यालय की पशु सुविधा में रखा गया था, जिसमें पानी और भोजन विज्ञापन लिबिटम तक पहुंच थी।

1. चूहों

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माउस उपभेदों का उपयोग करें, जैसे कि C57BL / 6J चूहों, युवा-वयस्क उम्र (8-12 सप्ताह की उम्र) के। सामान्य तौर पर, 2-3 चूहे प्रोटोकॉल के लिए पर्याप्त संख्या में एएल कोशिकाएं प्रदान करते हैं।

2. अलगाव और माउस अल के पृथक्करण

नोट: मध्यम ए, बी, और सीअग्रिम 19,20 में तैयार किए जाते हैं। रचनाओं को तालिका 2 में दिखाया गया है।

  1. माउस AL का अलगाव
    1. CO2 श्वासावरोध द्वारा चूहों को Euthanize, decapitation (चित्रा 2A) के बाद। रक्त को हटाने के लिए विआयनीकृत पानी के साथ चूहों के सिर को धोएं और एक बाँझ वातावरण उत्पन्न करने के लिए उन्हें 70% EtOH के साथ स्प्रे करें।
    2. बाँझ सर्जिकल उपकरणों का उपयोग करके, कानों के बीच सिर की त्वचा को हटा दें (चित्रा 2 बी)।
    3. क्रैनियम खोलें और मस्तिष्क को हटा दें।
      1. 'नाक पुल' को तोड़दें (यानी, ललाट हड्डी का पूर्वकाल हिस्सा; चित्र 2B) बाँझ कैंची के साथ।
      2. कैंची के साथ क्रैनियम को आगे खोलें, दोनों तरफ कानों की ओर टूटे हुए नाक पुल से शुरू होकर (चित्रा 2 सी)।
      3. पिट्यूटरी ग्रंथि (चित्रा 2 डी) को छूने के बिना, बाँझ चिमटी के साथ क्रैनियम और मस्तिष्क को हटा दें।
    4. पिट्यूटरी को नुकसान पहुंचाए बिना, कुंद चिमटी के साथ डायाफ्रामा सेले को हटा दें। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत AL से PL और IL को छोड़ दें।
      नोट: PL और IL लिंक किए गए हैं और इस प्रकार एक साथ निकाल दिए गए हैं। ये भाग गुलाबी रंग के एएल (चित्रा 2 डी) की तुलना में सफेद ऊतक के रूप में दिखाई देते हैं।
    5. ध्यान से कुंद चिमटी के साथ एएल को अलग करें और इसे 10 मिलीलीटर एर्लेनमेयर फ्लास्क में इकट्ठा करें, जो मध्यम ए के 3 एमएल से भरा हुआ है ( तालिका 2 देखें)। आगे के प्रसंस्करण तक फ्लास्क को बर्फ पर रखें।
  2. माउस AL का पृथक्करण
    1. पृथक AL युक्त Erlenmeyer फ्लास्क से supernatant (SN) माध्यम A को निकालें। 2 mL prewarmed (37 °C) 2.5% ट्रिप्सिन समाधान जोड़ें और 15 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें।
    2. ट्रिप्सिन समाधान को हटाने के बिना, 2 मिलीलीटर प्रीवस्ट्रेड (37 डिग्री सेल्सियस) डीएनएस समाधान (मध्यम ए में 2 μg / mL; 0.22 μm जाल के माध्यम से बाँझ-फ़िल्टर किया गया) जोड़ें, और एर्लेनमेयर फ्लास्क को 10 बार घुमाएं। पिट्यूटरी को नीचे (~ 1 मिनट) में डूबने दें और एसएन को हटा दें।
    3. Prewarmed (37 °C) ट्रिप्सिन अवरोधक समाधान (मध्यम A में 0.1 mg/mL; 0.22 μm जाल के माध्यम से बाँझ-फ़िल्टर) के 2 mL जोड़ें और 10 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें। पिट्यूटरी तलछट को नीचे जाने दें और एसएन को हटा दें।
    4. Prewarmed (37 °C) मध्यम B के 2 mL जोड़ें ( तालिका 2 देखें) और 5 मिनट के लिए 37 °C पर इनक्यूबेट करें। एसएन को हटाने के बिना, 2 मिलीलीटर प्रीवस्ट्र्ड (37 डिग्री सेल्सियस) माध्यम सी ( तालिका 2 देखें) जोड़ें और 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. पिट्यूटरी को नीचे तक डूबने दें और एसएन को हटा दें। पिट्यूटरी को तीन बार प्रीवस्ट्र्ड (37 डिग्री सेल्सियस) माध्यम सी के साथ कुल्ला करें।
    6. पिट्यूटरी को एकल कोशिकाओं में विभाजित करें।
      1. Prewarmed (37 °C) माध्यम C. Aspirate के 2 mL जोड़ें और पिट्यूटरी ग्रंथि को एक बाँझ, लौ-पॉलिश पाश्चर पिपेट के साथ कई बार निष्कासित करें, जब तक कि टुकड़े अब दिखाई नहीं देते हैं।
      2. निलंबन को 4.5 मिलीलीटर के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें (37 डिग्री सेल्सियस) डीएनएस समाधान (मध्यम ए में 2 μg / mL; 0.22 μm जाल के माध्यम से बाँझ-फ़िल्टर किया गया)। Erlenmeyer prewarmed (37 °C) माध्यम सी के 2 मिलीलीटर के साथ तीन बार कुल्ला और 15 mL ट्यूब के लिए निलंबन हस्तांतरण.
    7. एकत्र सेल निलंबन मिश्रण और एक 30 मिलीलीटर ट्यूब में एक 40 μm सेल छलनी के माध्यम से यह फ़िल्टर. 15 मिलीलीटर ट्यूब और सेल छलनी को मध्यम सी के 2 एमएल के साथ तीन बार कुल्ला करें और निलंबन को 30 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    8. एक ग्लास पाश्चर पिपेट की नोक को रखें, जो 3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) समाधान के 2 एमएल से भरा हुआ है (मध्यम ए में; 0.22 μm जाल के माध्यम से बाँझ-फ़िल्टर किया गया), ट्यूब के नीचे और धीरे-धीरे एक दृश्य घनत्व परत बनाने के लिए पिपेट। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 190 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    9. एक धाराप्रवाह आंदोलन में ट्यूब उलटकर और एक P1000 टिप के साथ शेष एसएन बूंदों को हटाने के द्वारा एसएन निकालें। बर्फ-ठंडे उन्नत DMEM / F12 (Adv DMEM / F12) के 1 mL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें और सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं को निर्धारित करें।

3. स्थापना और AL-व्युत्पन्न organoids की खेती

नोट: पहले से ही बर्फ पर ईसीएम पिघलना (1 एमएल के लिए 2-3 घंटे) और प्रोटोकॉल की अवधि के लिए इसे बर्फ पर रखें।

  1. ऑर्गेनोइड सीडिंग और कल्चरिंग
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 190 x g पर AL सेल निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें और SN को हटा दें। Adv DMEM/F12 में सेल पैलेट को 1.1 x 10 6 कोशिकाओं/mL के सेल घनत्व तक पहुंचने के लिए परिकलित विशिष्ट मात्रा का उपयोग करके पुन: निलंबित करदिया गया।
      नोट: उदाहरण के लिए, यदि सेल निलंबन में 500,000 सेल /एमएल हैं, तो किसी को 1.1 x 106 सेल / एमएल के वांछित घनत्व तक पहुंचने के लिए Adv DMEM / F12 के 454.54 μL में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करना होगा।
    2. चढ़ाना के लिए आवश्यक सेल निलंबन की मात्रा को बाहर निकालें (ऑर्गेनोइड विकास के लिए बीज के लिए कुओं की वांछित संख्या के अनुसार) और 30: 70 अनुपात (30% सेल निलंबन (एडव डीएमईएम / एफ 12 में) और 70% ईसीएम) में ईसीएम जोड़ें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: उदाहरण के लिए, 30 μL की एक बूंद के लिए (चरण 3.1.3 देखें), एक को (धीरे से) सेल निलंबन के 9 μL (~ 10,000 कोशिकाओं युक्त जब 1.1 x 106 कोशिकाओं / mL निलंबन से लिया जाता है) को ईसीएम के 21 μL के साथ मिलाना चाहिए।
    3. प्रति अच्छी तरह से, सेल निलंबन / ईसीएम मिश्रण की एक 30 μL बूंद जमा करें (चरण 3.1.2 देखें) एक पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) 48-अच्छी तरह से प्लेट पर। प्लेट को उल्टा करें और ईसीएम को 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ठोस होने दें।
      नोट: 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 24 घंटे के लिए संस्कृति प्लेटों को पूर्व-गर्म करें।
    4. प्लेट को इसके उचित अभिविन्यास पर वापस करें और सावधानीपूर्वक 250 μL prewarmed (37 °C) PitOM (तालिका 1 देखें) 10 μM रॉक इनहिबिटर (Y-27632) के साथ पूरक जोड़ें।
    5. हर 2-3 दिनों में माध्यम (वाई -27632 से रहित) को बदलकर ऑर्गेनोइड्स को संस्कृति करना जारी रखें, जब तक कि ऑर्गेनोइड्स पूरी तरह से विकसित न हो जाएं, जिसमें 10-14 दिनों के बीच का समय लगता है (चित्रा 3 ए)। फिर, ऑर्गेनोइड्स को पारित करें।
      नोट:: जब माध्यम aspirating, सुनिश्चित करें कि ECM गुंबद को बाधित करने के लिए नहीं है। संस्कृति प्लेट को थोड़ा झुकाएं और अच्छी तरह से नीचे की रिम से माध्यम को हटा दें। ताजा (37 डिग्री सेल्सियस पर prewarmed) माध्यम को धीरे से कुएं के किनारे में जोड़ा जाना चाहिए। यदि जेल की बूंदें डी-संलग्न होती हैं, तो ऑर्गेनोइड्स को इकट्ठा करें और उन्हें फिर से एक नए ईसीएम ड्रॉपलेट में फिर से इकट्ठा करें और उन्हें फिर से संस्कृति करें।
  2. ऑर्गेनोइड पासिंग
    1. धीरे से माध्यम aspirate और बर्फ ठंडा Adv DMEM / F12 के 400 μL जोड़ने के लिए ECM विघटित और एक microcentrifuge ट्यूब में organoids इकट्ठा करने के लिए. बर्फ के ठंडे Adv DMEM / F12 EM के 400 μL के साथ एक बार धोलें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    2. एसएन को ध्यान से निकालें और 400 μL prewarmed (37 °C) TrypLE एक्सप्रेस एंजाइम (1X) जोड़ें। ट्यूब को कई बार उलटकर मिलाएं, और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. 4 °C पर 5 मिनट के लिए 200 x g पर बर्फ-ठंडा Adv DMEM / F12 और सेंट्रीफ्यूज के 400 μL जोड़ें। SN निकालें।
    4. बर्फ-ठंडे Adv DMEM / F12 के 100 μL के साथ गोली को फिर से निलंबित करें और बाद में एक संकुचित P200 टिप के साथ सख्ती से ऊपर और नीचे पाइपिंग करके ऑर्गेनोइड्स को तोड़ दें (यानी, माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के नीचे खाली टिप को धक्का दें, इसके शुरुआती व्यास को कम करने के लिए) जब तक ऑर्गेनोइड टुकड़े (50 μm के आसपास व्यास के साथ) प्राप्त नहीं किए जाते हैं (चित्रा 3 बी)।
      नोट: पृथक्करण मिश्रण में मुख्य रूप से ऑर्गेनोइड टुकड़े और केवल कुछ एकल कोशिकाएं होनी चाहिए। एकल कोशिकाओं में ऑर्गेनोइड्स का कठोर पृथक्करण ऑर्गेनोइड्स के पुन: विकास को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है।
    5. Adv DMEM/F12 के 800 μL और 4 °C पर 10 मिनट के लिए 190 x g पर centrifuge जोड़ें। SN निकालें।
    6. एक 1: 2 से 1: 4 अनुपात में organoids पारित करें। Adv DMEM / F12 की पर्याप्त मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें जैसा कि चढ़ाना के लिए आवश्यक है और 30: 70 अनुपात (30% सेल निलंबन और 70% ईसीएम) में ईसीएम जोड़ें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    7. बीज और संस्कृति organoids के रूप में ऊपर 3.1.3-3.1.5 चरणों में वर्णित है.
      नोट: औसतन, 20 ऑर्गेनोइड्स 10,000 पूरे-एएल कोशिकाओं (0.2%) से प्रति अच्छी तरह से विकसित होते हैं। इन मार्ग 0 ऑर्गेनोइड्स को 1: 2 अनुपात में विभाजित किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप >50 ऑर्गेनोइड्स प्रति अच्छी तरह से विकसित होते हैं (मार्ग 1)। ऑर्गेनोइड्स को बाद के मार्गों के दौरान 1: 2 से 1: 4 अनुपात में विभाजित किया जा सकता है। ऑर्गेनोइड्स का पुन: विकास ~ 10 मार्ग (संस्कृति के 3 महीने के अनुरूप) के बाद धीमा हो जाता है, धीरे-धीरे कम और छोटे ऑर्गेनोइड्स में कंक्रीट किया जाता है।

4. अल व्युत्पन्न organoids और thawing के क्रायोप्रिजर्वेशन

  1. ऑर्गेनोइड्स का क्रायोप्रिजर्वेशन
    1. चरण 3.2.1 से चरण 3.2.5 तक पासिंग प्रोटोकॉल का पालन करें।
    2. क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ ऑर्गेनोइड पैलेट (टुकड़े और कोशिकाओं वाले) को फिर से निलंबित करें (तालिका 3)। निलंबन को क्रायोवियल में स्थानांतरित करें और इसे बर्फ पर रखें।
      नोट: 48-वेल प्लेट के चार कुओं तक के ऑर्गेनोइड्स (यानी, परिणामी टुकड़े और कोशिकाएं) को एक क्रायोवियल में जोड़ा जा सकता है।
    3. क्रायोवियल्स को एक फ्रीजिंग कंटेनर में रखें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें।
    4. 24 घंटे के बाद, नमूनों को क्रायोबॉक्स में स्थानांतरित करें और उन्हें दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन (-196 डिग्री सेल्सियस) में संग्रहीत करें।
  2. क्रायोप्रिजर्व्ड ऑर्गेनोइड्स का पिघलना
    1. तरल नाइट्रोजन टैंक से क्रायोवियल को हटा दें और इसे बर्फ पर रखें। तुरंत thawing प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस (पानी के स्नान) पर क्रायोप्रिजर्व्ड ऑर्गेनोइड टुकड़े और एकल कोशिकाओं के साथ समाधान को पिघलाएं।
      नोट: DMSO द्वारा सेल विषाक्तता से बचने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट से अधिक के लिए समाधान न रखें।
    3. 30% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा Adv DMEM / F12 युक्त एक 15 mL ट्यूब के लिए सामग्री को स्थानांतरित करें। 30% FBS के साथ Adv DMEM / F12 के 1 mL के साथ क्रायोवल कुल्ला।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 190 x g पर सेंट्रीफ्यूज। बर्फ के ठंडे Adv DMEM / F12 के 1 मिलीलीटर के साथ गोली को फिर से निलंबित करें और निलंबन को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 190 x g पर सेंट्रीफ्यूज। Adv DMEM / F12 की पर्याप्त मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें जैसा कि चढ़ाना के लिए आवश्यक है और 30:70 अनुपात में ईसीएम जोड़ें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
    6. बीज और संस्कृति organoids के रूप में ऊपर 3.1.3-3.1.5 चरणों में वर्णित है.

5. AL-व्युत्पन्न organoids का सत्यापन

  1. आरएनए अलगाव के लिए ऑर्गेनोइड्स का संग्रह और लाइसिस
    1. ऊपर वर्णित के रूप में organoids इकट्ठा और सेंट्रीफ्यूज (चरण 3.2.1).
    2. एसएन निकालें और 1% 2-mercapto-इथेनॉल के साथ lysis बफर के 350 μL जोड़ें। 30 s के लिए भंवर और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या आरएनए अलगाव के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
      सावधानी: सावधान रहें कि 2-mercapto-इथेनॉल एक विषाक्त यौगिक है। सभी काम एक रासायनिक धुएं हुड में किया जाना चाहिए, जबकि नाइट्राइल दस्ताने, एक धूल मुखौटा, और सुरक्षा चश्मा पहने हुए। 2-Mercapto-इथेनॉल आंखों और त्वचा को अपरिवर्तनीय नुकसान पहुंचा सकता है।
  2. इम्युनो-हिस्टोकेमिस्ट्री /-प्रतिदीप्ति धुंधला के लिए ऑर्गेनोइड्स का निर्धारण और एम्बेडिंग
    1. ऊपर वर्णित के रूप में organoids इकट्ठा और सेंट्रीफ्यूज (चरण 3.2.1).
    2. एसएन को हटा दें, 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के 1 एमएल जोड़ें और एक कक्षीय शेकर (100 आरपीएम) पर कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      सावधानी: पीएफए एक ज्ञात मानव कार्सिनोजेन है जो कॉर्निया को अपरिवर्तनीय क्षति पहुंचा सकता है। सभी काम एक रासायनिक धुएं हुड में किया जाना चाहिए। नाइट्राइल दस्ताने और सुरक्षा चश्मा हमेशा पहना जाना चाहिए।
    3. 5 मिनट के लिए 200 x g पर सेंट्रीफ्यूज और SN को हटा दें। पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें, एक कक्षीय शेकर (100 आरपीएम) पर आरटी पर 10 मिनट इनक्यूबेट करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए 90 x जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। धोने के चरण को दो बार दोहराएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में स्टोर करें।
    4. ऊतक प्रसंस्करण और निर्जलीकरण के लिए, एसएन को हटा दें और 2% एगारोज़ जेल (पीबीएस में) के 150 μL को एक पूर्वव्यापी चौड़ा p200 टिप (टिप के एक छोटे से टुकड़े को काटकर बनाया गया) का उपयोग करके ऑर्गेनोइड गोली में जोड़ें। तुरंत पूरी मात्रा को पाइप करें और माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब के ढक्कन में बाहर निकालें।
      नोट: तेजी से काम करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि ऑर्गेनोइड्स युक्त जेल जल्दी से ठोस हो जाएगा।
    5. जेल को 30 मिनट के लिए दृढ़ता से ठोस होने दें और जेल डिस्क को एक हिस्टोलॉजी कैसेट में ले जाएं। विसर्जित करें और ऊतक प्रोसेसर में निर्जलीकरण तक, 50% EtOH में स्टोर करें।
    6. पैराफिन एम्बेडिंग के लिए, जेल डिस्क (संदंश का उपयोग करके) को एक एम्बेडिंग मोल्ड में रखें और गर्म पैराफिन (60 डिग्री सेल्सियस) से भरें। मोल्ड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि पैराफिन ठोस न हो (लगभग 45 मिनट)। इन नमूनों को या तो 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या तुरंत सेक्शनिंग के अधीन किया जा सकता है।
    7. माइक्रोटोम 5 μm मोटाई पर organoids युक्त पैराफिन ब्लॉकों और कांच स्लाइड पर नमूने एकत्र. अनुभाग के उचित खिंचाव की अनुमति देने के लिए प्रत्येक अनुभाग के नीचे विआयनीकृत पानी की एक बूंद जोड़ें और स्लाइड को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्लैट हीटिंग प्लेट पर रखें। स्लाइड्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर अनुभागों के साथ स्टोर करें या सीधे इम्यूनोहिस्टोकेमिकल या इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के साथ जारी रखें।

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Representative Results

एएल के अलगाव और पृथक्करण के बाद, प्राप्त एकल कोशिकाओं को ईसीएम में बीज दिया जाता है और पिटोम (चित्रा 1, तालिका 1) में उगाया जाता है। चित्रा 3A सीडिंग (दिन 0) पर सेल संस्कृति और घनत्व को प्रदर्शित करता है। कुछ छोटे मलबे मौजूद हो सकते हैं (चित्रा 3 ए, सफेद एरोहेड्स), लेकिन पासिंग पर गायब हो जाएंगे। सीडिंग के चौदह दिन बाद, एएल-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स पूरी तरह से विकसित होते हैं (चित्रा 3 ए)। ऑर्गेनोइड्स एक सिस्टिक आकृति विज्ञान प्रदर्शित करते हैं, जिसमें एक उपकला परत होती है जो एक लुमेन को घेरती है। इस स्तर पर, ऑर्गेनोइड्स 500 μm के व्यास तक पहुंचते हैं और उन्हें पारित किया जाना है। चित्रा 3 बी अलग-अलग ऑर्गेनोइड टुकड़ों के पुन: बीजारोपण के बाद संकेतित समय पर पासिंग के बाद एएल-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड संस्कृति को दर्शाता है।

कभी-कभी, ऑर्गेनोइड संस्कृति में एक या अधिक घनी संरचनाएं दिखाई दे सकती हैं (चित्रा 3 ए, प्रतिकूल)। जब पासिंग, घने ऑर्गेनोइड्स पर ले जाते हैं, तो कुछ मार्गों के बाद केवल घने संरचनाओं के साथ संस्कृतियों में समाप्त होते हैं (चित्रा 3 बी, प्रतिकूल)। इसलिए, यह अनुशंसा की जाती है कि उन कुओं के साथ आगे न बढ़ें जिनमें घने ऑर्गेनोइड्स होते हैं (मार्ग 0)। वैकल्पिक रूप से, घने ऑर्गेनोइड्स को अवसादन द्वारा त्याग दिया जा सकता है, जो सिस्टिक ऑर्गेनोइड्स को जारी रखने के लिए छोड़ देता है। इन घने ऑर्गेनोइड्स की उत्पत्ति वर्तमान में अस्पष्ट है, लेकिन वे कम स्पष्ट पिट्यूटरी प्रकृतिदिखाते हैं। यदि ऑर्गेनोइड्स नहीं करते हैं, या पासिंग के बाद कम कुशलता से फिर से बढ़ते हैं, तो पृथक्करण प्रक्रियाओं को अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, किसी को बहुत कठोर को अलग नहीं करने पर ध्यान देना चाहिए; ऑर्गेनोइड्स को टुकड़ों तक विभाजित किया जाना चाहिए, न कि एकल कोशिकाओं के लिए (चित्रा 3 बी, दिन 0, इनसेट)।

Immunofluorescence धुंधला विश्लेषण AL-व्युत्पन्न organoids के उपकला चरित्र की पुष्टि करता है, क्योंकि वे उपकला मार्करों ई-कैडरिन (ई-कैड) और साइटोकेराटिन 8/18 (सीके 8/18) को व्यक्त करते हैं; चित्रा 3 सी), जो, इसके अलावा, पिट्यूटरी18 में स्टेम सेल मार्करों के रूप में वर्णित किया गया है। ऑर्गेनोइड्स की स्टेमनेस प्रकृति को अतिरिक्त रूप से SOX2 और TROP2 अभिव्यक्ति द्वारा प्रदर्शित किया जाता है, जिनमें से दोनों को पिट्यूटरी स्टेम सेल मार्करों (चित्रा 3 C) 14,18 के रूप में भी पहचाना गया था। LHX3, एक प्रतिलेखन कारक विशेष रूप से (शुरुआती विकासशील) पिट्यूटरी में व्यक्त किया गया है, ऑर्गेनोइड्स के पिट्यूटरी फेनोटाइप (चित्रा 3 सी) को मान्य करता है। ऑर्गेनोइड-गठन कोशिकाओं में से कुछ एक proliferative राज्य में हैं, प्रसार मार्कर Ki67 (चित्रा 3 C) को व्यक्त करते हैं।

AL-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के पिट्यूटरी (स्टेमनेस) फेनोटाइप की आगे की खोज और सत्यापन रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन-मात्रात्मक पीसीआर (RT-qPCR) के साथ किया जाता है। स्टेमनेस मार्करों Sox2, Cdh1 (एन्कोडिंग E-Cad), Krt8, Krt18 और Trop2 की उच्च अभिव्यक्ति ऑर्गेनोइड्स में मौजूद है, जो प्राथमिक AL की तुलना में स्पष्ट रूप से अधिक है, यह दर्शाता है कि ऑर्गेनोइड्स स्टेम कोशिकाओं के लिए समृद्ध होते हैं और इस प्रकार AL स्टेम सेल डिब्बे का प्रतिनिधित्व करते हैं, जैसा कि पहले वर्णित किया गया है (चित्रा 3D)18। विशेष रूप से, विकासात्मक प्रतिलेखन कारक Pitx1 और Pitx2 AL में कई हार्मोनल सेल प्रकारों में विकास के बाद व्यक्त किए जाते हैं, और इसलिए AL में उनकी उच्च अभिव्यक्ति भी होती है। संस्कृतियां मजबूती से अपने स्टेमनेस फेनोटाइप को बनाए रखती हैं, जैसा कि कई मार्गों (चित्रा 3 डी) के बाद इन मार्करों की निरंतर (उच्च) अभिव्यक्ति द्वारा प्रदर्शित किया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: स्वस्थ और रोगग्रस्त पिट्यूटरी से ऑर्गेनोइड्स की स्थापना, रखरखाव, लक्षण वर्णन और आवेदन क्षमता का अवलोकन। एएल, पूर्वकाल लोब; आईएल, मध्यवर्ती लोब; PL, पश्चवर्ती लोब; MZ, सीमांत क्षेत्र; Pitom, पिट्यूटरी organoid माध्यम (BioRender.com के साथ बनाया गया). AL में स्टेम सेल niches बैंगनी में इंगित कर रहे हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: वयस्क euthanized माउस से पिट्यूटरी ग्रंथि का अलगाव. प्रतिनिधि छवियों को लगातार (ए) विच्छेदन, (बी) सिर की त्वचा को हटाने (नाक पुल को घेर लिया जाता है), (सी) क्रैनियम के उद्घाटन, और (डी) मस्तिष्क को हटाने, पिट्यूटरी ग्रंथि (घिरा हुआ) को उजागर करने के बाद लिया जाता है। तीर पीएल को इंगित करता है, जिसे छोड़ दिया जाता है (संबद्ध आईएल के साथ), अलगाव और पृथक्करण के लिए एएल को छोड़ देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: AL-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स की स्थापना और सत्यापन(A) AL सेल सीडिंग और PITOM में ऑर्गेनोइड विकास इंगित दिनों में (मार्ग 0)। शीर्ष पंक्ति अनुकूल ऑर्गेनोइड विकास दिखाती है, जिसमें केवल सिस्टिक संरचनाएं विकसित होती हैं। नीचे की पंक्ति एक बड़ी घनी संरचना (बॉक्स्ड) के साथ प्रतिकूल वृद्धि दिखाती है। सफेद एरोहेड्स मलबे को इंगित करते हैं, काले एरोहेड्स एकल कोशिकाओं को इंगित करते हैं (इनसेट में बढ़ाया गया)। (बी) ऑर्गेनोइड टुकड़े (इनसेट में आवर्धित) पासिंग (दिन 0) पर बीज और 7 दिन बाद देखे गए ऑर्गेनोइड्स के पुनरुत्थान पर बीज। शीर्ष पंक्ति अनुकूल ऑर्गेनोइड पुनरुत्थान दिखाती है, जिसमें केवल सिस्टिक संरचनाएं बढ़ रही हैं। नीचे की पंक्ति घने ऑर्गेनोइड्स के साथ प्रतिकूल पुनरुत्थान दिखाती है जो संस्कृति पर ले जाती है। (सी) एएल-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स में ई-कैड, SOX2, TROP2 (सभी लाल), CK8/18, LHX3 और Ki67 (सभी हरे) के इम्युनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग। नाभिक Hoechst33342 (नीले) के साथ लेबल कर रहे हैं। एरोहेड्स Ki67+ कोशिकाओं को इंगित करते हैं। स्केल सलाखों को इंगित किया जाता है। (D) स्टेमनेस मार्करों (Sox2, Cdh1, Krt8, Krt18, Trop2) और प्राथमिक AL और AL-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स (पैसेज 0 का अर्थ सेल सीडिंग के 14 दिनों के बाद) में विकासात्मक प्रतिलेखन कारकों (Pitx1, Pitx2) का जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण RT-qPCR (मतलब ± SEM) द्वारा निर्धारित किया जाता है। डेटा बिंदु जैविक प्रतिकृतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। डेल्टा चक्र थ्रेशोल्ड (डीसीटी) मूल्यों को दिखाया गया है, सूत्र का उपयोग करके गणना की जाती है: सीटी (ब्याज का जीन) - सीटी (हाउसकीपिंग जीन एक्टब)। अधिक सकारात्मक डीसीटी मान (जो शून्य एक्स-अक्ष के नीचे वाई-अक्ष पर प्रस्तुत किया जाता है), ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति का स्तर उतना ही कम होता है। कम (या अधिक नकारात्मक) dCT मान, उच्च अभिव्यक्ति स्तर 14,18,21,22. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पिट्यूटरी ऑर्गेनोइड माध्यम (PitOM)
घटक एकाग्रता
उन्नत DMEM/
हेप्स 1%
पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन 1%
ग्लूटामैक्स 1%
बी -27 पूरक (50X), माइनस विटामिन ए 1X
एल-ग्लूटामाइन (200 mM) 2 mM
पुनः संयोजक मानव FGF बुनियादी / FGF2 / bFGF (157 एए) प्रोटीन 20 ng/mL
पुनः संयोजक मानव IGF-1 100 ng/mL
N-2 पूरक (100X) 1X
एन-एसिटाइल-सिस्टीन 1.25 mM
पुनः संयोजक मानव / 200 ng/mL
पुनः संयोजक मानव FGF-10 100 ng/mL
A83-01 (activin रिसेप्टर की तरह kinase 4/5/7 अवरोधक) 0.50 μM
पुनः संयोजक माउस सोनिक हेजहोग / Shh (C25II) एन टर्मिनस 100 ng/mL
पुनः संयोजक मानव EGF प्रोटीन, सीएफ 50 ng/mL
SB202190 (p38 माइटोजेन-सक्रिय प्रोटीन किनेज अवरोधक) 10 μM
पुनः संयोजक मानव Noggin 100 ng/mL
Vibrio cholerae से हैजा विष 100 ng/mL
पुनः संयोजक मानव आर-Spondin-1 200 ng/mL
पुनः संयोजक मानव IL-6 20 ng/mL

तालिका 1. PitOM की संरचना। PitOM को 0.22 μm जाल फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है और अधिकतम 2 सप्ताह के लिए 4 °C पर संग्रहीत किया जाता है।

मध्यम A
घटक परिमाण
DMEM, पाउडर, उच्च ग्लूकोज 13.38 ग्राम
HEPES 5.96 ग्राम
सोडियम-पाइरूवेट (C3H3NaO3) 0.11 ग्राम
पेनिसिलिन जी सोडियम नमक 35.00 मिलीग्राम
स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट नमक 50.00 मिलीग्राम
सोडियम क्लोराइड (NaCl) 0.50 ग्राम
सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट (NaHCO3) 1.00 ग्राम
एल्बुमिन गोजातीय (सेल संस्कृति ग्रेड) 3.00 ग्राम
बाँझ पानी 1.00 लीटर
मध्यम C
घटक परिमाण
सोडियम क्लोराइड (NaCl) 7.50 ग्राम
पोटेशियम क्लोराइड (KCl) 0.40 ग्राम
सोडियम डाइ-हाइड्रोजन फॉस्फेट 1-हाइड्रेट 0.14 ग्राम
डी-ग्लूकोज 1.00 ग्राम
HEPES 4.76 ग्राम
स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट नमक 50.00 मिलीग्राम
पेनिसिलिन जी सोडियम नमक 35.00 मिलीग्राम
फिनोल लाल 10.00 मिलीग्राम
एल्बुमिन गोजातीय (सेल संस्कृति ग्रेड) 3.00 ग्राम
सोडियम हाइड्रोजन कार्बोनेट (NaHCO3) 1.00 ग्राम
बाँझ पानी 1.00 लीटर
मध्यम B
घटक परिमाण
Titriplex III (Edetate disodium salt dihydrate) 0.74 ग्राम
मध्यम C 100 mL

तालिका 2. मध्यम A, B और C की संरचना। सभी मीडिया को 0.22 μm जाल फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है और अधिकतम 4 महीनों के लिए 4 °C पर संग्रहीत किया जाता है। मध्यम A और C के pH को 7.3 में समायोजित किया जाना चाहिए।

क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम
घटक एकाग्रता
उन्नत DMEM/ 60%
FBS 30%
DMSO 10%

तालिका 3. क्रायोप्रिजर्वेशन माध्यम की संरचना।

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Discussion

AL-व्युत्पन्न organoids, जैसा कि यहां वर्णित है, विट्रो में पिट्यूटरी स्टेम कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली शोध मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं। वर्तमान में, यह ऑर्गेनोइड दृष्टिकोण प्राथमिक पिट्यूटरी स्टेम कोशिकाओं को मज़बूती से और मजबूती से विकसित करने और विस्तारित करने के लिए एकमात्र उपलब्ध उपकरण है। भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) या प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से व्युत्पन्न एक पिट्यूटरी ऑर्गेनोइड मॉडल को पहले बताया गया है, जो पिट्यूटरी भ्रूण ऑर्गेनोजेनेसिस23 को बारीकी से दोहराता है; हालांकि, हालांकि पिट्यूटरी विकास या मॉडल पिट्यूटरी रोग 23,24,25 का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक उपयोगी है, ईएससी / आईपीएससी से शुरू होने वाला रिपोर्ट किया गया प्रोटोकॉल, यहां वर्णित प्रोटोकॉल की तुलना में बहुत समय लेने वाला है, और परिणामी ऑर्गेनोइड्स भी विस्तार योग्य नहीं हैं।

पिट्यूटरी स्टेम सेल ऑर्गेनोइड्स की सफल खेती प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण चरणों पर निर्भर करती है। प्रारंभिक सेल सीडिंग में कोशिकाओं की एक उचित संख्या को प्लेट करना महत्वपूर्ण है। एक बहुत ही उच्च संख्या भीड़-भाड़ वाली संस्कृतियों को जन्म देगी, जो ऑर्गेनोइड्स की व्यवहार्यता को खराब करती है और पूर्ण ऑर्गेनोइड विस्तार को बाधित करती है, जबकि कोशिकाओं की बहुत कम संख्या के परिणामस्वरूप सीमित ऑर्गेनोइड गठन होगा। इसके अलावा, संस्कृति में एक बार ईसीएम गुंबद की अखंडता को परेशान नहीं करना महत्वपूर्ण है। माध्यम को जोड़ना और निकालना बहुत सावधानी से किया जाना चाहिए, जेल ड्रॉपलेट को छूने के बिना। इसके अलावा, संस्कृति माध्यम को प्रीवार्म करने से जेल के डीपोलीमराइजेशन का खतरा कम हो जाता है। अंत में, ऑर्गेनोइड्स को सही ढंग से पास करना (यानी, टुकड़ों को अलग करना और एकल कोशिकाओं के लिए नहीं) संस्कृतियों के कुशल विस्तार के लिए महत्वपूर्ण है।

इन पिट्यूटरी स्टेम सेल ऑर्गेनोइड्स का उपयोग स्टेम कोशिकाओं के फेनोटाइप, जीव विज्ञान और कार्य के बारे में सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है। वे पहले से ही उपन्यास स्टेम सेल सुविधाओं के साथ-साथ पिट्यूटरी क्षति से जुड़े स्टेम सेल सक्रियण के मार्करों को उजागर करने में मूल्यवान साबित हुए हैं और स्टेम सेल गतिविधि के लिए एक रीड-आउट टूल के रूप में (चित्रा 1) 14,18। वर्तमान प्रयासों में रोगग्रस्त पिट्यूटरी से उनकी व्युत्पत्ति शामिल है, जैसे कि हाइपोपिट्यूटरिज्म और पिटएनईटी (चित्रा 1)। आखिरकार, ऑर्गेनोइड्स को दवा की स्क्रीनिंग के लिए एक मंच में भी लगाया जा सकता है, जैसा कि अन्य बीमारियों के लिए सफलतापूर्वक स्थापित किया गयाहै 26,27। इसलिए, उच्च थ्रूपुट विश्लेषण तक पहुंचने के लिए ऑर्गेनोइड संस्कृतियों का आगे बढ़ना आवश्यक होगा। यह पहले से ही देखा गया है कि एएल-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स को 96-अच्छी तरह से प्रारूप में कुशलतापूर्वक उगाया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप अधिक समरूप संस्कृतियां भी होती हैं।

यह देखा गया है कि ~ 10 मार्ग (संस्कृति के 3 महीने के अनुरूप) के बाद, ऑर्गेनोइड वृद्धि दक्षता धीरे-धीरे कम संख्या और छोटे आकार में फिर से बढ़ने वाले ऑर्गेनोइड्स के साथ कम हो गई। यह विकास गिरावट पिट्यूटरी स्टेम कोशिकाओं की आंतरिक प्रकृति के लिए अंतर्निहित हो सकती है, जिसे विवो में ग्रंथि में कई बार आत्म-नवीनीकरण करने की आवश्यकता नहीं हो सकती है, जो केवल धीरे-धीरे बदल रही है, इस प्रकार कुछ विभाजन दौर16,28 के बाद समाप्त हो रही है। यद्यपि इस अंतिम विकास में गिरावट को एक सीमा के रूप में माना जा सकता है, मॉडल अत्यधिक उपयोगी है क्योंकि पूर्ववर्ती मार्गों के दौरान ऑर्गेनोइड विस्तार व्यापक डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पर्याप्त से अधिक है।

एक और पहलू जिसे एक सीमा के रूप में माना जा सकता है, वह यह है कि पिट्यूटरी स्टेम सेल ऑर्गेनोइड्स एएल के अंतःस्रावी सेल प्रकारों की ओर प्रमुख भेदभाव क्षमता नहीं दिखाते हैं, यहां तक कि इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों के गुर्दे के कैप्सूल के नीचे आने के बाद भी (जिसके परिणामस्वरूप जीएच + और पीआरएल + कोशिकाओं की सीमित संख्या में विस्तार से वर्णित है जैसा कि संदर्भ18 में विस्तार से वर्णित है)। या तो स्टेम कोशिकाओं को भेदभाव में चलाने के लिए सही इन विट्रो स्थितियों की अभी तक पहचान नहीं की गई है, या स्टेम कोशिकाओं की प्रमुख भूमिका (विशेष रूप से वयस्क ग्रंथि में) नई अंतःस्रावी कोशिकाओं को उत्पन्न करने में स्थित नहीं है (क्योंकि संभवतः आलसी ग्रंथि में इसकी आवश्यकता नहीं है, लेकिन केवल परेशान या चुनौतीपूर्ण परिस्थितियों में)9,10,14, १८ । इसके बजाय, प्रमुख कार्य अन्य जैविक पहलुओं में स्थित हो सकता है (उदाहरण के लिए, हार्मोनल पूर्वज / अग्रदूत या बुनियादी में परिपक्व कोशिकाओं को पैराक्राइन सिग्नलिंग, लेकिन सक्रिय (विकासात्मक, मरम्मत, बीमारी) स्थितियों में अधिक होने की संभावना है) 13,16। दरअसल, हालांकि पिट्यूटरी स्टेम कोशिकाओं को विशेष रूप से भ्रूण और नवजात अवधि में बहु-शक्तिशाली भेदभाव क्षमता के अधिकारी के रूप में दिखाया गया है, यह कल्पनीय है कि वयस्क ग्रंथि में स्टेम कोशिकाएं इस क्षमता को बनाए रखने की आवश्यकता नहीं होती हैं, वयस्क ग्रंथि के बहुत कम कारोबार को देखते हुए16,28। यह संभव है कि वयस्क पिट्यूटरी स्टेम कोशिकाएं एक पैराक्राइन सिग्नलिंग हब के रूप में अधिक कार्य करती हैं, जो आसपास के पूर्वज / अग्रदूत / अंतःस्रावी कोशिकाओं को उत्तेजित या विनियमित करने में शामिलहैं 13,16। इसलिए, हार्मोन स्राव में समाप्त होने वाले पिट्यूटरी स्टेम सेल ऑर्गेनोइड्स का मजबूत भेदभाव एक गलत उम्मीद हो सकती है जो कभी नहीं पहुंच पाएगी।

एक साथ लिया गया, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल विट्रो में 3 डी सेटिंग में प्राथमिक पिट्यूटरी स्टेम कोशिकाओं का मजबूती से विस्तार करने के लिए एक तेजी से लागू और विश्वसनीय उपकरण प्रदान करता है। प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड्स को जन्म देता है जो पिट्यूटरी स्टेम सेल फेनोटाइप को ईमानदारी से कैप्चर करते हैं। सिस्टम को पहले से ही पिट्यूटरी स्टेम सेल जीवविज्ञान और सक्रियण14,18 का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है, और निष्कर्ष विवो स्थिति में अत्यधिक अनुवाद योग्य हैं।

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Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को KU Leuven Research Fund और Fund for Scientific Research (FWO) - Flanders से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। E.L. (11A3320N), और C.N. (1S14218N) FWO / FWO-SB से पीएचडी फैलोशिप द्वारा समर्थित हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
48-well plates, TC treated, individually wrapped Costar 734-1607
A83-01 Sigma-Aldrich SML0788
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634010
Albumin Bovine (cell culture grade) Serva 47330
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A Gibco 12587010
Base moulds VWR 720-1918
Buffer RLT Qiagen 79216
Cassettes, Q Path Microtwin VWR 720-2191
Cell strainer, 40 µm mesh, disposable Falcon 352340
Cholera Toxin from Vibrio cholerae Sigma-Aldrich C8052
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D5025
D-glucose Merck 108342
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
DMEM, powder, high glucose Gibco 52100039
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL Eppendorf 30120086
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides Thermo Fisher Scientific J1800AMNZ
Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac Thermo Fisher Scientific 12587976
Ethanol Absolute 99.8+% Thermo Fisher Scientific 10342652
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
GlutaMAX Supplement Gibco 35050061
HEPES Sigma-Aldrich H4034
HEPES Buffer Solution Gibco 15630056
InSolution Y-27632 Sigma-Aldrich 688001
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25030081
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free Corning 15505739
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502048
N-Acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A7250
Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes Thermo Fisher Scientific 375353
Paraformaldehyde for synthesis (PFA) Merck 818715
PBS, pH 7.4 Gibco 10010023
Penicillin G sodium salt Sigma-Aldrich P3032
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
Phenol red Merck 107241
Potassium Chloride (KCl) Merck 104936
Recombinant Human EGF Protein, CF R&D systems 236-EG
Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein R&D systems 234-FSE
Recombinant Human FGF-10 Peprotech 100-26
Recombinant Human IGF-1 Peprotech 100-11
Recombinant Human IL-6 Peprotech 200-06
Recombinant Human Noggin Peprotech 120-10C
Recombinant Human R-Spondin-1 Peprotech 120-38
Recombinant Human/Murine FGF-8b Peprotech 100-25
Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus R&D systems 464-SH
RNeasy micro kit Qiagen 74004
SB202190 Sigma-Aldrich S7067
SeaKem LE Agarose Lonza 50004
Sodium Chloride (NaCl) BDH 102415K
Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate PanReac-AppliChem A1047
Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) Merck 106329
Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) Sigma-Aldrich P5280
Stericup-GP, 0.22 µm Millipore SCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm Millipore SCGP00525
Sterile water Fresenius B230531
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich S6501
Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor Thermo Scientific 12505356
Titriplex III Merck 108418
TrypL Express Enzyme (1X), phenol red Thermo Fisher Scientific 12605028
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) Sigma-Aldrich T9003
Trypsin solution 2.5 % Thermo Fisher Scientific 15090046

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References

  1. Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1 (2011).
  2. Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
  3. Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
  4. Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
  5. Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
  6. Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
  7. Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).
  8. Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. Hypopituitarism. Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).
  9. Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
  10. Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
  11. Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
  12. Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
  13. Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142 (2021).
  14. Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).
  15. Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
  16. Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).
  17. Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
  18. Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
  19. Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
  20. Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
  21. Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
  22. Trompeter, H. -I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111 (2013).
  23. Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
  24. Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
  25. Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
  26. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  27. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
  28. Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 180
माउस पिट्यूटरी से ऑर्गेनोइड्स का विकास <em>इन विट्रो</em> मॉडल के रूप में पिट्यूटरी स्टेम सेल जीवविज्ञान का पता लगाने के लिए
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Laporte, E., Nys, C., Vankelecom, H. Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology. J. Vis. Exp. (180), e63431, doi:10.3791/63431 (2022).

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