Summary
下垂体は、体の内分泌系の主要な調節因子である。この記事では、生物学的および機能がほとんど理解されていない腺の幹細胞集団を研究するための新しい3D in vitro モデルとして、マウス下垂体からのオルガノイドの開発を説明する。
Abstract
下垂体は、身体の成長、代謝、性的成熟、生殖、ストレス反応などの重要な生理学的プロセスを調節するマスター内分泌腺です。10年以上前、幹細胞は下垂体で同定されました。しかしながら、トランスジェニック in vivo アプローチの適用にもかかわらず、それらの表現型、生物学、および役割は不明のままである。この謎に取り組むために、下垂体幹細胞生物学を深く解明するために、新しく革新的なオルガノイド in vitro モデルが開発されています。オルガノイドは、定義された培養条件下で、組織の(上皮)幹細胞から自己発達し、それらの幹細胞およびその組織の複数の特徴を再現する3D細胞構造を表す。ここでは、マウスの下垂体由来オルガノイドが腺の幹細胞から発達し、 そのin vivo 表現型および機能的特徴を忠実に再現することが示されている。とりわけ、それらは、遺伝子導入的に加えられた局所的損傷に応答して生じる in vivo としての幹細胞の活性化状態を再現する。オルガノイドは、ステムネス表現型を堅牢に保持しながら、長期的に拡張可能である。この新しい研究モデルは、新生児の成熟から加齢に伴う退色、および健康な腺から罹患した腺に至るまで、下垂体リモデリングの重要な条件における幹細胞の表現型および挙動を解読するために非常に貴重である。ここでは、マウス下垂体由来オルガノイドを確立するための詳細なプロトコルが提示され、これは下垂体幹細胞のまだ謎めいた世界に飛び込むための強力なツールを提供する。
Introduction
下垂体は、脳の基部に位置する小さな内分泌腺であり、視床下部に接続されている。腺は、末梢および中枢(視床下部)入力を統合して、調整された調整されたホルモン放出を生成し、それによって下流の標的内分泌器官(副腎および生殖腺など)を調節して、適切なタイミングで適切なホルモンを産生する。下垂体は内分泌系の主要な調節因子であり、したがって正当にマスター腺1と呼ばれる。
マウスの下垂体は、3つの葉(図1)、すなわち、前葉(AL)、中間葉(IL)、および後葉(PL)からなる。主要な内分泌ALは、5つのホルモン細胞型を含みます, 成長ホルモンを産生するソマトトロープを含みます (GH);プロラクチン(PRL)を生成するラクトトロープ;副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)を分泌するコルチコトロペ;甲状腺刺激ホルモン(TSH)産生に関与する甲状腺綱;黄体形成ホルモン(LH)と卵胞刺激ホルモン(FSH)を作る性腺刺激薬。PLは、ホルモンオキシトシンおよびバソプレシン(抗利尿ホルモン)が貯蔵されている視床下部からの軸索突起からなる。ILはALとPLの間に位置し、メラノサイト刺激ホルモン(MSH)を産生するメラノトロープを収容する。ヒト下垂体では、ILは発生中に退行し、メラノトロープはAL1内に広がる。内分泌細胞に加えて、下垂体はまた、転写因子SOX2 2,3,4,5,6によって本質的にマークされる幹細胞のプールを含む。これらのSOX2+細胞は、辺縁帯(MZ)に位置し、裂け目の上皮内層(ALとILとの間の胚性残骸内腔)、またはALの実質全体にクラスターとして広がっている、それによって腺内の2つの幹細胞ニッチ(図1)2、3、4、5、6を提案する。
下垂体の不可欠な性質を考えると、腺の機能不全は重篤な罹患率と関連している。下垂体亢進症(1つ以上のホルモンの過剰分泌を特徴とする)および下垂体機能低下症(1つ以上のホルモンの産生の欠損または欠損)は、下垂体神経内分泌腫瘍(PitNET;例えば、クッシング病につながるACTH産生腫瘍)または遺伝的欠陥(例えば、小人症をもたらすGH欠乏症)によって引き起こされ得る7。さらに、下垂体手術(例えば、腫瘍を除去するため)、感染症(例えば、視床下部 - 下垂体結核、または細菌性髄膜炎または脳炎に続く感染症)、シーハン症候群(出産時の大量の失血による血流不足による壊死)、下垂体脳卒中および外傷性脳損傷は、下垂体機能低下の他の重要な原因である8.マウス下垂体が再生能力を有していることが示されており、内分泌細胞のトランスジェニックアブレーションによって導入された局所損傷を修復できることが示されている9、10。SOX2+幹細胞は、活性化された表現型を示す傷害に鋭く反応し、増殖の亢進(幹細胞の増殖をもたらす)および幹関連因子および経路(例えば、WNT/NOTCH)の発現増加によって特徴付けられる。さらに、幹細胞はアブレーションされたホルモンを発現し始め、最終的に9、10以下の(5〜6)ヶ月にわたって枯渇した細胞集団の実質的な回復をもたらす。また、腺の新生児成熟期(生後最初の3週間)には、下垂体幹細胞は活性化状態で繁栄しています6,11,12,13が、生物の老化は、加齢(または「炎症」)時の炎症性(マイクロ)環境の増加により、その場で幹細胞の機能が低下することと関連しています10,14.さらに、腺における腫瘍形成は、幹細胞活性化にも関連している7、15。幹細胞の活性化は、下垂体リモデリングのいくつかの状況(7,16でレビュー)で検出されているが、根底にあるメカニズムは不明のままである。in vivoアプローチ(トランスジェニックマウスにおける系統追跡など)は下垂体幹細胞の明確または包括的な画像を提供していないため、正常および罹患下垂体における幹細胞生物学を探索するための信頼性の高いin vitroモデルの開発が不可欠である。初代下垂体幹細胞の標準的な体外培養は、非常に限られた増殖能力および表現型の急速な喪失を伴う非生理学的(2D)状態のために不十分のままである(より詳細な概要については、16を参照されたい)。3Dスフェア培養物(pituispheres)は、サイド集団およびSOX2+表現型2,3,4によって同定された下垂体幹細胞から樹立されている。ピツイスフェアは幹細胞からクローン的に成長し、ステムネスマーカーを発現し、内分泌細胞型への分化能を示す。しかし、それらは限られた通過性(2〜3通路)しか示さず、かなり拡大しない3,4。スフェア様構造体は、50%希釈マトリゲル中で1週間培養した場合、非解離下垂体幹細胞クラスターからも得られたが、拡張性は示されなかった17。ピトイスフェアアプローチは、主に幹細胞数の読み出しツールとして使用されますが、さらなる用途は、劣った膨張容量16によって制限されています。
これらの欠点に対処し、克服するために、MZおよび実質幹細胞を含むマウスの主要な内分泌ALから始まる新しい3Dモデル、すなわちオルガノイドが最近確立されている。オルガノイドが実際に下垂体の幹細胞に由来し、その表現型を忠実に再現していることが示されている18。さらに、オルガノイドは長期的に拡張可能であり、その茎の性質を堅牢に維持する。したがって、それらは、深遠な探査のために初代下垂体幹細胞を拡大するための信頼できる方法を提供する。このような探査は、下垂体から単離することができる限られた数の幹細胞では達成不可能であり、これもまた、2D条件16において拡張可能ではない。オルガノイドは、新しい下垂体幹細胞の特徴(in vivoに翻訳可能)を明らかにするための貴重で信頼性の高いツールであることが示されています14,18。重要なことに、オルガノイドモデルは、局所組織損傷および新生児成熟の間に起こる下垂体幹細胞活性化状態を忠実に反映し、増強された形成効率を示し、上方制御された分子経路を複製する14、18。したがって、下垂体由来オルガノイドモデルは、革新的で強力な下垂体幹細胞生物学研究モデルであり、幹細胞活性化読み出しツールでもあります。
このプロトコールは、マウス下垂体由来オルガノイドの樹立を詳細に記載する。この目的のために、ALは単離され、単一細胞に解離し、それらは細胞外マトリックス模倣マトリゲル(本明細書ではECMと呼ぶ)に埋め込まれる。次いで、細胞-ECMアセンブリーを、幹細胞増殖因子および下垂体胚調節因子を本質的に含む定義済みの培地(さらに「下垂体オルガノイド培地」(PitOM)18; 表1)。オルガノイドが完全に発達すると(10〜14日後)、それらはさらにトラフシーケンシャル継代に拡張され、広範な下流探査(例えば、免疫蛍光、RT-qPCR、およびバルクまたは単一細胞トランスクリプトミクス; 図1)。長期的には、下垂体幹細胞オルガノイドが組織修復アプローチや再生医療への道を開くことが期待されています。
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Protocol
本研究の動物実験は、ルーヴェン大学動物実験倫理委員会(P153/2018)により承認された。すべてのマウスは、標準化された条件(23±1.5°Cの一定温度、相対湿度40%〜60%、および12時間の昼夜サイクル)で大学の動物施設で飼育され、水と食物を 自由に利用できました。
1. マウス
- C57BL/6Jマウスなど、若年成人年齢(8~12週齢)の市販のマウス系統を使用してください。一般に、2〜3匹のマウスは、プロトコールのために十分な数のAL細胞を提供する。
2. マウスALの単離と解離
注:培地A、B、およびCは、予め19,20個用意されている。組成を表2に示す。
- マウスALの単離
- CO2窒息によりマウスを安楽死させ、続いて断頭した(図2A)。マウスの頭を脱イオン水で洗浄して血液を除去し、70%EtOHを噴霧して滅菌環境を生成します。
- 滅菌手術器具を用いて、耳の間の頭部の皮膚を除去する(図2B)。
- 頭蓋を開き、脳を取り除きます。
- 「鼻橋」(すなわち、前頭骨の前部; 図2B)滅菌ハサミで。
- 折れたノーズブリッジから耳に向かって両側に向かって、はさみで頭蓋をさらに開きます(図2C)。
- 下垂体に触れることなく、滅菌ピンセットで頭蓋と脳を取り除きます(図2D)。
- 下垂体を傷つけることなく、鈍いピンセットで 横隔膜セラ を取り除きます。PLおよびILを実体顕微鏡下でALから廃棄する。
メモ: PL と IL はリンクされているため、同時に削除されます。これらの部分は、ピンク色のALと比較して、白色の組織として現れる(図2D)。 - ALを鈍いピンセットで慎重に単離し、3mLの培地Aで満たされた10mLの三角フラスコに集める( 表2参照)。さらに処理されるまでフラスコを氷の上に置きます。
- マウスALの解離
- 単離したALを入れた三角フラスコから上清(SN)培地Aを取り出し、予め加温した(37°C)2.5%トリプシン溶液2mLを加え、37°Cで15分間インキュベートする。
- トリプシン溶液を除去せずに、2 mLの予備加温(37°C)DNase溶液(培地Aに2 μg/mL;0.22 μmメッシュで滅菌ろ過)を加え、三角フラスコを10回旋回させた。下垂体を底に沈め(約1分)、SNを取り除きます。
- 予め加温した(37°C)トリプシン阻害剤溶液2mL(培地A中0.1mg/mL;0.22μmメッシュで滅菌濾過)を加え、37°Cで10分間インキュベートする。下垂体堆積物を底にしてSNを取り除きます。
- 2mLの予備加温(37°C)培地B( 表2参照)を加え、37°Cで5分間インキュベートする。SNを除去することなく、2mLの予備加温(37°C)培地C( 表2参照)を加え、37°Cで15分間インキュベートした。
- 下垂体を底に沈め、SNを外します。下垂体を予温した(37°C)培地Cで3回すすいだ。
- 下垂体を単一細胞に解離させる。
- 2 mL の予温 (37 °C) 培地 C. Aspirate を加え、破片が見えなくなるまで、滅菌された火炎研磨パスツールピペットで下垂体を複数回排出します。
- 懸濁液を、4.5 mL の予備加温 (37 °C) DNase 溶液 (培地 A で 2 μg/mL; 0.22 μm メッシュで滅菌ろ過) で 15 mL チューブに移します。三角を2 mLの予備加温(37°C)培地Cで3回すすぎ、懸濁液を15 mLチューブに移した。
- 回収した細胞懸濁液を混合し、40 μmのセルストレーナーで30 mLチューブにろ過します。15 mLチューブとセルストレーナーを2 mLの培地Cで3回すすぎ、懸濁液を30 mLチューブに移します。
- 2 mL の 3% ウシ血清アルブミン (BSA) 溶液 (培地 A 中; 0.22 μm メッシュで滅菌ろ過) で満たされたガラス製パスツールピペットの先端をチューブの底に置き、ピペットを静かに取り出して、目に見える密度層を形成します。190 x g で4°Cで10分間遠心分離する。
- 1回の流暢な動きでチューブを反転させてSNを除去し、P1000チップで残りのSN液滴を除去します。細胞ペレットを氷冷アドバンストDMEM/F12(Adv DMEM/F12)1mLに再懸濁し、セルカウンターで細胞を定量する。
3. AL由来オルガノイドの樹立・培養
注:ECMを事前に氷上で解凍し(1mLで2〜3時間)、プロトコルの期間中氷の上に保管してください。
- オルガノイドの播種と培養
- AL細胞懸濁液を190 x g で4°Cで10分間遠心分離し、SNを除去した。1.1 x106 cells/mL の細胞密度に達するように計算された比容積を使用して、細胞ペレットを Adv DMEM/F12 に再懸濁します。
注:例えば、細胞懸濁液に500,000細胞/mLが含まれている場合、1.1 x106 細胞/mLの所望の密度に達するには、細胞ペレットを454.54μLのAdv DMEM/F12に再懸濁する必要があります。 - プレーティングに必要な細胞懸濁液の量を(オルガノイド発生のために播種するウェルの所望の数に応じて)取り出し、30:70の比率でECMを添加する(30%細胞懸濁液(Adv DMEM/F12の場合)および70%ECM)。上下にピペッティングしてよく混ぜる。
注:例えば、30 μLの液滴1滴(ステップ3.1.3を参照)の場合、9 μLの細胞懸濁液(1.1 x106 cells/mLの懸濁液から採取した場合、約10,000個の細胞を含む)を21 μLのECMと(穏やかに)混合する必要があります。 - ウェルあたり、細胞懸濁液/ECM混合液の30 μL滴(ステップ3.1.2を参照)を、予め加温された(37°C)48ウェルプレート上に堆積させる。プレートを裏返し、ECMを37°Cで20分間固化させます。
注:培養プレートを37°Cで少なくとも24時間予備温めてください。 - プレートを適切な配向に戻し、10 μM Rock阻害剤(Y-27632)を添加した250 μLの予熱(37°C)PitOM( 表1参照)を慎重に加えます。
- オルガノイドが完全に増殖するまで、2~3日ごとに培地(Y-27632を欠く)を交換してオルガノイドを培養し続けると、10~14日かかります(図3A)。次いで、オルガノイドを通過させる。
メモ:メディアを吸引するときは、ECMドームを乱さないようにしてください。培養プレートを少し傾け、ウェルの底縁から培地を取り除きます。新鮮な(37°Cで予温した)培地をウェルの側面に穏やかに加える必要があります。ゲル液滴が脱付着した場合は、オルガノイドを収集し、再懸濁して新しいECM液滴で再度培養する。
- AL細胞懸濁液を190 x g で4°Cで10分間遠心分離し、SNを除去した。1.1 x106 cells/mL の細胞密度に達するように計算された比容積を使用して、細胞ペレットを Adv DMEM/F12 に再懸濁します。
- オルガノイド継代
- 培地を穏やかに吸引し、400 μLの氷冷Adv DMEM/F12を加えてECMを崩壊させ、オルガノイドを微量遠心チューブに集める。400 μL の氷冷 Adv DMEM/F12 EM で 1 回洗浄します。200 x g で4°Cで5分間遠心分離する。
- SNを注意深く除去し、400 μLの予温(37°C)TrypLE発現酵素(1X)を加える。チューブを数回反転させて混合し、37°Cで5分間インキュベートする。
- 400 μL の氷冷 Adv DMEM/F12 を加え、200 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離します。 SN を削除します。
- ペレットを100 μLの氷冷Adv DMEM/F12で再懸濁し、続いてオルガノイド断片(直径約50μm)が得られるまで、狭くなったP200チップで激しく上下にピペッティングすることによってオルガノイドを分解する(すなわち、空の先端を微量遠心管の底に押し下げ、その開口径を小さくする)。
注:解離混合物は、主にオルガノイド断片および少数の単一細胞のみを含むべきである。オルガノイドの単一細胞への過酷な解離は、オルガノイドの再増殖に悪影響を及ぼす。 - 800 μL の Adv DMEM/F12 を加え、190 x g で 4 °C で 10 分間遠心分離します。 SN を削除します。
- オルガノイドを1:2〜1:4の比率で通過させる。めっきに必要な適切な量のAdv DMEM/F12にペレットを再懸濁し、ECMを30:70の比率(30%細胞懸濁液および70%ECM)で加える。上下にピペッティングしてよく混ぜる。
- 上記のようにオルガノイドを種播種し、ステップ3.1.3〜3.1.5で培養する。
注:平均して、播種した10,000個の全AL細胞(0.2%)から1ウェルあたり20個のオルガノイドが発達する。これらの通路0オルガノイドは1:2の比率で分割することができ、その結果、ウェルあたり>50個のオルガノイドが発達する(通路1)。オルガノイドは、その後の継代中に1:2〜1:4の比率で分割することができる。オルガノイドの再増殖は、〜10継代(培養の3ヶ月に相当)後に減速し、徐々に少なくなり、より小さなオルガノイドで具体化される。
4. AL由来オルガノイドの凍結保存と解凍
- オルガノイドの凍結保存
- ステップ 3.2.1 からステップ 3.2.5 までのパスエージング・プロトコルに従います。
- オルガノイドペレット(断片および細胞を含む)を1mLの凍結保存培地で再懸濁する(表3)。懸濁液をクライオビアルに移し、氷の上に置きます。
注:48ウェルプレートの最大4つのウェルからのオルガノイド(すなわち、得られた断片および細胞)を1つのクライオビアルに組み合わせることができる。 - 凍結容器にクライオバイアルを入れ、-80°Cに移す。
- 24時間後、サンプルをクライオボックスに移し、液体窒素(-196°C)に保存して長期保存します。
- 凍結保存オルガノイドの解凍
- クライオビアルを液体窒素タンクから取り出し、氷の上に置きます。すぐに解凍プロトコルに進みます。
- 凍結保存したオルガノイド断片および単一細胞と共に溶液を37°C(水浴)で解凍する。
注:DMSOによる細胞毒性を避けるために、溶液を37°Cで2分以上保管しないでください。 - 内容物を、30%ウシ胎児血清(FBS)を含む10mLの氷冷Adv DMEM/F12を含む15mLチューブに移す。クライオビアルを 1 mL の Adv DMEM/F12 と 30% FBS ですすいでください。
- 190 x g で4°Cで10分間遠心分離する。 ペレットを氷冷Adv DMEM/F12 1 mLで再懸濁し、懸濁液を微量遠心管に移します。
- 190 x g で4°Cで10分間遠心分離する。 めっきに必要な適切な量のAdv DMEM/F12にペレットを再懸濁し、ECMを30:70の比率で加えます。上下にピペッティングしてよく混ぜる。
- 上記のようにオルガノイドを種播種し、ステップ3.1.3〜3.1.5で培養する。
5. AL由来オルガノイドのバリデーション
- RNA単離のためのオルガノイドの収集と溶解
- 上記のようにオルガノイドを収集し、遠心分離する(ステップ3.2.1)。
- SNを除去し、350μLの溶解緩衝液を1%2-メルカプトエタノールと共に加える。渦を30秒間、-80°Cで保存するか、直ちにRNA単離に進む。
注意: 2-メルカプトエタノールは有毒な化合物であることに注意してください。すべての作業は、ニトリル手袋、防塵マスク、安全眼鏡を着用しながら、化学ヒュームフード内で行う必要があります。2-メルカプトエタノールは、目や皮膚に不可逆的な損傷を引き起こす可能性があります。
- 免疫組織化学/蛍光染色のためのオルガノイドの固定と埋め込み
- 上記のようにオルガノイドを収集し、遠心分離する(ステップ3.2.1)。
- SNを除去し、1mLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を加え、オービタルシェーカー(100rpm)上で室温(RT)で30分間インキュベートする。
警告: PFA は既知のヒト発癌物質であり、角膜に不可逆的な損傷を引き起こす可能性があります。すべての作業は化学ヒュームフードで行わなければなりません。ニトリル手袋と安全メガネは常に着用する必要があります。 - 200 x g で5分間遠心分離し、SNを除去します。1 mL の PBS を加え、オービタル シェーカー (100 rpm) 上で RT で 10 分間インキュベートし、90 x g で 4 °C で 3 分間遠心分離します。 洗浄手順を 2 回繰り返します。PBSで4°Cで保存してください。
- 組織処理および脱水のために、SNを除去し、予め加温した拡幅p200先端(先端の小片を切断することによって作製される)を用いて、150μLの2%アガロースゲル(PBS中)をオルガノイドペレットに加える。直ちに全体積をピペップアップし、微量遠心管の蓋に排出する。
注:オルガノイドを含むゲルはすぐに固化するので、迅速に作業することが重要です。 - ゲルを30分間しっかりと固化させ、ゲルディスクを組織学カセットに動かします。50%EtOHに浸漬して保存し、組織プロセッサで脱水するまで保存する。
- パラフィン包埋の場合は、ゲルディスク(鉗子を使用)を包埋型に入れ、温かいパラフィン(60°C)を充填します。パラフィンが固体になるまで4°Cで金型を置きます(約45分)。これらのサンプルは、4°Cで保存するか、または直ちに切片化に供することができる。
- パラフィンブロックを5μm厚のオルガノイドを含むミクロトーム化し、スライドガラス上にサンプルを採取した。セクションの適切なストレッチを可能にするために、各セクションの下に脱イオン水を1滴加え、スライドを37°Cの平らな加熱プレート上に一晩置きます。切片付きスライドを4°Cで保存するか、免疫組織化学的または免疫蛍光染色を直接続行します。
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Representative Results
ALの単離および解離後、得られた単一細胞をECMに播種し、PitOM中で増殖させる(図1、表1)。図3Aは、播種時(Day 0)の細胞培養および密度を示す。いくつかの小さな破片が存在するかもしれないが(図3A、白い矢印)、通過時に消える。播種後14日目に、AL由来オルガノイドは完全に発達する(図3A)。オルガノイドは嚢胞性形態を示し、内腔を囲む上皮層を有する。この段階で、オルガノイドは500μmの直径に達し、通過されなければならない。図3Bは、解離したオルガノイド断片の再播種後の指示時間における継代後のAL由来オルガノイド培養物を示す。
時折、1つ以上の緻密な構造がオルガノイド培養物に現れることがある(図3A、好ましくない)。継代すると、高密度オルガノイドが引き継がれる傾向があり、数回の継代後には高密度構造のみの培養物に終わる(図3B、好ましくない)。したがって、高密度オルガノイドを含む井戸(通路0)では進行しないことをお勧めします。あるいは、高密度オルガノイドは沈降によって廃棄することができ、これは嚢胞性オルガノイドを継続させる。これらの高密度オルガノイドの起源は現時点では不明であるが、それらはそれほど顕著ではない下垂体の性質を示す18。オルガノイドが増殖しない場合、または継代後に再増殖する効率が低い場合は、解離手順を最適化する必要があります。特に、あまりにも厳しく解離しないように注意を払わなければなりません。オルガノイドは、単一細胞ではなく断片に分割されなければならない(図3B、Day 0、差し込み図)。
免疫蛍光染色分析は、AL由来オルガノイドが上皮マーカーE-カドヘリン(E-Cad)およびサイトケラチン8/18(CK8/18;図3C)は、これを、しかも、下垂体18における幹細胞マーカーとして記載した。オルガノイドのステム性の性質は、SOX2およびTROP2発現によってさらに実証され、どちらも下垂体幹細胞マーカーとしても同定された(図3C)14,18。LHX3は、(早期に発達した)下垂体に特異的に発現する転写因子であり、オルガノイドの下垂体表現型を検証します(図3C)。オルガノイド構成細胞の一部は増殖状態にあり、増殖マーカーKi67を発現している(図3C)。
AL由来オルガノイドの下垂体(stemness)表現型のさらなる探索および検証は、逆転写定量PCR(RT-qPCR)を用いて行われる。ステムネス マーカーSox2、Cdh1 (E−Cadをコードする)、 Krt8、Krt18 および Trop2 の高発現は、オルガノイド中に存在するが、初代ALにおいてよりも明らかに高く、オルガノイドが幹細胞に対して富化し、したがって前述のようにAL幹細胞区画を表すことを示す(図3D)18。特に、発生転写因子Pitx1および Pitx2 は、AL中のいくつかのホルモン細胞型において発生後も発現したままであり、したがって AL においてもそれらの高発現である。培養物は、複数回継代後にこれらのマーカーが持続的に(高い)発現を示すように、そのステムネス表現型を堅牢に保持する(図3D)。
図1:健康および罹患下垂体からのオルガノイドの確立、維持、特性評価、および適用可能性の概要。 AL, 前葉;IL, 中間葉;PL, 後葉;MZ、限界ゾーン;PitOM、下垂体オルガノイド培地(BioRender.com で作成)。AL中の幹細胞ニッチは紫色で示されている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:成体安楽死マウスからの下垂体の単離。 代表的な画像は、(A)断頭、(B)頭部皮膚の除去(鼻橋が囲まれている)、(C)頭蓋の開口部、および(D)脳の除去、下垂体を露出(囲んでいる)に続いて連続して撮影された。矢印はPLを指し、PLは(関連するILとともに)破棄され、ALを単離および解離のために残す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:AL由来オルガノイドの樹立および検証。 (A)示された日(継代0)におけるPitOMにおけるAL細胞播種およびオルガノイド発生。一番上の行は良好なオルガノイド増殖を示し、嚢胞構造のみが発達している。一番下の行は、大きな緻密な構造が現れる(箱入り)という好ましくない成長を示しています。白い矢印は破片を示し、黒い矢印は単一細胞を示す(差し込み図で拡大)。(b)継代(Day 0)で播種したオルガノイド断片(差し込み図で拡大)および7日後に観察されるオルガノイドの再増殖。一番上の行は、嚢胞構造のみが成長している良好なオルガノイド再増殖を示す。一番下の行は、高密度オルガノイドが培養物を引き継ぐという好ましくない再成長を示しています。(c)AL由来オルガノイドにおけるE-Cad、SOX2、TROP2(すべて赤色)、CK8/18、LHX3およびKi67(すべて緑色)の免疫蛍光染色。核はHoechst33342(青)でラベル付けされています。矢印はKi67+細胞を示す。スケールバーが表示されます。(d)初代ALおよびAL由来オルガノイドにおける幹マーカー(Sox2、Cdh1、Krt8、Krt18、Trop2)、および発生転写因子(Pitx1、Pitx2)の遺伝子発現解析(継代0は細胞播種後14日を意味する)をRT-qPCR(SEM±平均)により決定する。データポイントは生物学的反復を表す。デルタサイクル閾値(dCT)値は、CT(目的の遺伝子)-CT(ハウスキーピング遺伝子Actb)の式を使用して計算されます。dCT値(ゼロX軸より下のY軸に提示される)が正であるほど、目的遺伝子の発現量は低くなる。dCT値が低い(または負である)ほど、発現量14、18、21、22は高くなる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 下垂体オルガノイド培地(PitOM) | |
| コンポーネント | 濃度 |
| 高度な DMEM/F12 | |
| ヘペス | 1% |
| ペニシリン - ストレプトマイシン | 1% |
| グルタマックス | 1% |
| B-27サプリメント(50倍)、マイナスビタミンA | 1倍速 |
| L-グルタミン (200 mM) | 2ミリオンユーロ |
| 組換えヒトFGF塩基性/FGF2/bFGF(157aa)タンパク質 | 20 ng/mL |
| 組換えヒトIGF-1 | 100 ng/mL |
| N-2 サプリ (100X) | 1倍速 |
| N-アセチルシステイン | 1.25 ミリアン ペア月間 |
| 組換えヒト/マウスFGF-8b | 200 ng/mL |
| 組換えヒトFGF-10 | 100 ng/mL |
| A83-01(アクチビン受容体様キナーゼ4/5/7阻害剤) | 0.50 μM |
| 組換えマウスソニックヘッジホッグ/ Shh(C25II)N-ターミナス | 100 ng/mL |
| 組換えヒトEGFタンパク質、CF | 50 ng/mL |
| SB202190(p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ阻害剤) | 10 μM |
| 組換えヒトノギン | 100 ng/mL |
| コレラ菌からのコレラ毒素 | 100 ng/mL |
| 組換えヒトR-スポンディン-1 | 200 ng/mL |
| 組換えヒトIL-6 | 20 ng/mL |
表 1.ピトムの構成 PitOMは0.22μmメッシュフィルターでろ過され、4°Cで最大2週間保存されます。
| ミディアム A | |
| コンポーネント | 量 |
| DMEM, 粉末, 高グルコース | 13.38グラム |
| ヘーペス | 5.96グラム |
| ピルビン酸ナトリウム(C3H3NaO3) | 0.11グラム |
| ペニシリンGナトリウム塩 | 35.00 ミリグラム |
| 硫酸ストレプトマイシン塩 | 50.00 ミリグラム |
| 塩化ナトリウム(NaCl) | 0.50グラム |
| 炭酸水素ナトリウム(NaHCO3) | 1.00グラム |
| ウシのアルブミン(細胞培養グレード) | 3.00グラム |
| 滅菌水 | 1.00リットル |
| ミディアムC | |
| コンポーネント | 量 |
| 塩化ナトリウム(NaCl) | 7.50グラム |
| 塩化カリウム (KCl) | 0.40グラム |
| リン酸二水素ナトリウム1水和物 | 0.14グラム |
| D-グルコース | 1.00グラム |
| ヘーペス | 4.76グラム |
| 硫酸ストレプトマイシン塩 | 50.00 ミリグラム |
| ペニシリンGナトリウム塩 | 35.00 ミリグラム |
| フェノールレッド | 10.00 ミリグラム |
| ウシのアルブミン(細胞培養グレード) | 3.00グラム |
| 炭酸水素ナトリウム(NaHCO3) | 1.00グラム |
| 滅菌水 | 1.00リットル |
| ミディアムB | |
| コンポーネント | 量 |
| チトリプレックスIII(エデト酸二ナトリウム塩二水和物) | 0.74グラム |
| ミディアムC | 100ミリリットル |
表 2.培地A、B、およびCの組成 すべての培地を0.22μmメッシュフィルターでろ過し、4°Cで最大4ヶ月間保存します。培地AおよびCのpHは7.3に調整しなければならない。
| 凍結保存媒体 | |
| コンポーネント | 濃度 |
| 高度な DMEM/F12 | 60% |
| ティッカー | 30% |
| ティッカー | 10% |
表 3.凍結保存媒体の組成。
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Discussion
AL由来オルガノイドは、ここに記載されるように、下垂体幹細胞をインビトロで研究するための強力な研究モデルを表す。現在、このオルガノイドアプローチは、初代下垂体幹細胞を確実かつ堅牢に増殖および増殖させるための唯一の利用可能なツールである。胚性幹細胞(ESC)または人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する下垂体オルガノイドモデルが以前に報告されており、これは下垂体胚性器官形成を密接に反復する23;しかしながら、下垂体発生の研究または下垂体疾患のモデル化23,24,25にとって非常に有用であるが、ESC/iPSCから始まる報告されたプロトコルは、ここで説明されているプロトコルと比較して非常に時間がかかり、得られたオルガノイドも拡張可能ではない。
下垂体幹細胞オルガノイドの培養の成功は、プロトコールにおけるいくつかの重要なステップに依存する。最初の細胞播種時に適切な数の細胞を播種することが重要です。非常に高い数は、オルガノイドの生存率を悪化させ、完全なオルガノイド増殖を妨げるが、細胞数が非常に少ないと、オルガノイド形成が制限される。さらに、培養において一度ECMドームの完全性を妨げないことが重要です。培地の追加および除去は、ゲル液滴に触れることなく、非常に慎重に行うべきである。さらに、培養培地を予温することは、ゲルの解重合のリスクを低減する。最後に、オルガノイドを正しく継代すること(すなわち、単一細胞ではなく断片に解離すること)は、培養物の効率的な拡大にとって極めて重要である。
これらの下垂体幹細胞オルガノイドは、幹細胞の表現型、生物学、および機能に関する質問に答えるために利用することができる。これらは、新規な幹細胞の特徴や下垂体損傷関連幹細胞活性化のマーカーを発見し、幹細胞活性の読み出しツールとしてすでに価値があることが証明されています(図1)14,18。現在の努力には、下垂体機能低下症やPitNETsなどの罹患した下垂体からの誘導が含まれる(図1)。最終的に、オルガノイドは、他の疾患について首尾よく確立されたように、薬物スクリーニングのためのプラットフォームに従事することもできる26,27。したがって、ハイスループット分析に到達するためにオルガノイド培養物のさらなるアップスケーリングが必要となるであろう。AL由来オルガノイドを96ウェルフォーマットで効率的に増殖させることができ、より均質な培養をもたらすことはすでに注目されている。
〜10継代後(培養3ヶ月に相当)、オルガノイド増殖効率は徐々に低下し、オルガノイドはより低い数およびより小さいサイズで再増殖することが観察されている。この成長低下は、下垂体幹細胞の本質的な性質に固有のものかもしれないが、これは生体内の腺内で何度も自己再生する必要はないかもしれないが、これはゆっくりとしかひっくり返っておらず、したがって数回の分裂ラウンドの後に疲弊する16,28。この最終的な成長低下は限界と見なされるかもしれないが、先行する継代中のオルガノイド膨張は広範な下流分析には十分すぎるほどであるため、このモデルは非常に有用である。
制限とみなされ得る別の態様は、下垂体幹細胞オルガノイドが、免疫不全マウスの腎臓嚢下で異種移植した後でさえ、ALの内分泌細胞型に対する顕著な分化能を示さないことである(これは、参考文献18に詳細に記載されているように限られた数のGH+およびPRL+細胞をもたらした)。幹細胞を分化に駆り立てる正しいin vitro条件がまだ同定されていないか、または幹細胞(特に成体)の主な役割が新しい内分泌細胞の生成に位置していないか(怠惰腺では必要ではない可能性が高いが、摂動または挑戦された状態でのみ必要であるため)9、10、14、18。その代わりに、主要な機能は、他の生物学的側面(例えば、ホルモンの祖先/前駆体または成熟細胞へのパラクリンシグナル伝達)に位置し得るが、活性(発生、修復、疾患)状態においてより可能性が高い)13,16。実際、下垂体幹細胞は、特に胚期および新生児期に多能性分化能を有することが示されているが、成体腺の代謝回転が非常に低いことを考えると、成体腺の幹細胞がこの能力を維持しない(必要がない)ことが考えられる16,28。成体下垂体幹細胞は、周囲の前駆細胞/前駆体/内分泌細胞を刺激または調節することに関与するパラクリンシグナル伝達ハブとしてより多く作用する可能性がある13,16。したがって、ホルモン分泌で最高潮に達する下垂体幹細胞オルガノイドの堅牢な分化は、決して到達しない誤った期待である可能性があります。
まとめると、ここで提示されたプロトコルは、インビトロで3D設定で初代下垂体幹細胞を堅牢に拡張するための迅速で適用可能な信頼性の高いツールを提供します。プロトコルは、下垂体幹細胞表現型を忠実に捕捉するオルガノイドを生じさせる。このシステムは、すでに下垂体幹細胞の生物学と活性化の研究に首尾よく適用されており14,18、そしてこの知見はin vivoの状況に高度に翻訳可能である。
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Disclosures
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
この研究は、ルーヴェン工科大学とフランダース科学研究基金(FWO)からの助成金によって支援されました。E.L. (11A3320N) および C.N. (1S14218N) は、FWO/FWO-SB の博士号フェローシップによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
References
- Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1 (2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
- Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
- Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
- Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
- Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).
- Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E.
- Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
- Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
- Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
- Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
- Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142 (2021).
- Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).
- Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
- Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).
- Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
- Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
- Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
- Trompeter, H. -I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111 (2013).
- Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
- Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
- Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).
