Summary
De hypofyse is de belangrijkste regulator van het endocriene systeem van het lichaam. Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van organoïden uit de hypofyse van de muis als een nieuw 3D in vitro model om de stamcelpopulatie van de klier te bestuderen waarvan de biologie en functie slecht begrepen blijven.
Abstract
De hypofyse is de belangrijkste endocriene klier die belangrijke fysiologische processen reguleert, waaronder lichaamsgroei, metabolisme, seksuele rijping, voortplanting en stressrespons. Meer dan tien jaar geleden werden stamcellen geïdentificeerd in de hypofyse. Ondanks de toepassing van transgene in vivo benaderingen blijven hun fenotype, biologie en rol echter onduidelijk. Om dit raadsel aan te pakken, wordt een nieuw en innovatief organoïde in vitro model ontwikkeld om de hypofysestamcelbiologie diep te ontrafelen. Organoïden vertegenwoordigen 3D-celstructuren die, onder gedefinieerde kweekomstandigheden, zichzelf ontwikkelen uit de (epitheliale) stamcellen van een weefsel en meerdere kenmerken van die stamcellen en hun weefsel samenvatten. Hier wordt aangetoond dat van hypofyse afgeleide organoïden van muizen zich ontwikkelen uit de stamcellen van de klier en hun in vivo fenotypische en functionele kenmerken getrouw samenvatten. Ze reproduceren onder andere de activeringstoestand van de stamcellen als in vivo optredend als reactie op transgeen toegebrachte lokale schade. De organoïden zijn langdurig uitbreidbaar met behoud van hun stengelfenotype. Het nieuwe onderzoeksmodel is zeer waardevol om het fenotype en gedrag van de stamcellen te ontcijferen tijdens belangrijke omstandigheden van hypofyseremodellering, variërend van neonatale rijping tot verouderingsgerelateerde vervaging en van gezonde tot zieke klieren. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om van hypofyse afgeleide organoïden van muizen vast te stellen, die een krachtig hulpmiddel bieden om in de nog raadselachtige wereld van hypofysestamcellen te duiken.
Introduction
De hypofyse is een kleine endocriene klier aan de basis van de hersenen, waar het is verbonden met de hypothalamus. De klier integreert perifere en centrale (hypothalamische) inputs om een afgestemde en gecoördineerde hormoonafgifte te genereren, waardoor stroomafwaartse doel endocriene organen (zoals bijnieren en geslachtsklieren) worden gereguleerd voor het produceren van geschikte hormonen op het juiste moment. De hypofyse is de belangrijkste regulator van het endocriene systeem en wordt daarom met recht de meesterklier1 genoemd.
De hypofyse van de muis bestaat uit drie lobben (figuur 1), d.w.z. de voorkwab (AL), de tussenkwab (IL) en de achterkwab (PL). De belangrijkste endocriene AL bevat vijf hormonale celtypen, waaronder somatotropen die groeihormoon (GH) produceren; lactotropen die prolactine (PRL) genereren; corticotropen die adrenocorticotroop hormoon (ACTH) afscheiden; thyrotropen die verantwoordelijk zijn voor de productie van schildklierstimulerend hormoon (TSH); en gonadotrofen die luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) maken. De PL bestaat uit axonale projecties van de hypothalamus waarin de hormonen oxytocine en vasopressine (antidiuretisch hormoon) zijn opgeslagen. De IL bevindt zich tussen de AL en PL en herbergt melanotropen die melanocytstimulerend hormoon (MSH) produceren. In de menselijke hypofyse gaat de IL achteruit tijdens de ontwikkeling en worden melanotropen verspreid binnen de AL1. Naast de endocriene cellen bevat de hypofyse ook een pool van stamcellen, in wezen gekenmerkt door de transcriptiefactor SOX2 2,3,4,5,6. Deze SOX2+-cellen bevinden zich in de marginale zone (MZ), de epitheelbekleding van de spleet (een embryonaal restlumen tussen de AL en IL), of zijn als clusters verspreid over het parenchym van de AL, waardoor twee stamcelniches in de klier worden voorgesteld (figuur 1)2,3,4,5,6.
Gezien de onmisbare aard van de hypofyse, wordt slecht functioneren van de klier geassocieerd met ernstige morbiditeit. Hyperpituïtarisme (gekenmerkt door oversecretie van een of meer hormonen) en hypopituïtarisme (defecte of ontbrekende productie van een of meer hormonen) kunnen worden veroorzaakt door hypofyse neuro-endocriene tumoren (PitNETs; bijv. ACTH-producerende tumoren die leiden tot de ziekte van Cushing) of door genetische defecten (bijv. GH-deficiëntie resulterend in dwerggroei)7. Daarnaast zijn hypofysechirurgie (bijvoorbeeld om tumoren te verwijderen), infecties (bijv. Hypothalamus-hypofysetuberculose of infecties na bacteriële meningitis of encefalitis), het syndroom van Sheehan (necrose vanwege onvoldoende bloedstroom als gevolg van zwaar bloedverlies bij de geboorte), hypofyse-apoplexie en traumatisch hersenletsel andere belangrijke oorzaken van hypofysehypofunctie8 . Het is aangetoond dat de hypofyse van de muis het regeneratieve vermogen bezit en in staat is om lokale schade te herstellen die wordt geïntroduceerd door transgene ablatie van endocriene cellen 9,10. De SOX2+ stamcellen reageren acuut op de toegebrachte verwonding met een geactiveerd fenotype, gekenmerkt door verhoogde proliferatie (resulterend in stamcelexpansie) en verhoogde expressie van stamgerelateerde factoren en routes (bijv. WNT / NOTCH). Bovendien beginnen de stamcellen het geableerde hormoon tot expressie te brengen, wat uiteindelijk resulteert in een aanzienlijk herstel van de uitgeputte celpopulatie gedurende de volgende (5 tot 6) maanden 9,10. Ook tijdens de neonatale rijpingsfase van de klier (de eerste 3 weken na de geboorte) gedijen de hypofysestamcellen in een geactiveerde toestand 6,11,12,13, terwijl organismale veroudering geassocieerd is met verminderde in situ stamcelfunctionaliteit, als gevolg van een toenemende inflammatoire (micro-) omgeving bij veroudering (of 'ontsteken')10,14 . Bovendien is tumorigenese in de klier ook geassocieerd met stamcelactivering 7,15. Hoewel stamcelactivering is gedetecteerd in verschillende situaties van hypofyseremodellering (beoordeeld in 7,16), blijven de onderliggende mechanismen onduidelijk. Aangezien in vivo benaderingen (zoals het traceren van afstamming bij transgene muizen) geen duidelijk of volledig beeld van hypofysestamcellen hebben opgeleverd, is de ontwikkeling van betrouwbare in vitro modellen om stamcelbiologie in normale en zieke hypofyse te onderzoeken essentieel. Standaard in vitro kweek van primaire hypofysestamcellen blijft ontoereikend vanwege de zeer beperkte groeicapaciteit en niet-fysiologische (2D) omstandigheden met snel verlies van fenotype (voor een meer gedetailleerd overzicht, zie16). 3D-bolculturen (pituisferen) zijn vastgesteld uit hypofysestamcellen zoals geïdentificeerd door zijpopulatie en SOX2+ fenotype 2,3,4. De pituisferen groeien klonaal uit de stamcellen, drukken stammarkers uit en vertonen differentiatievermogen in de endocriene celtypen. Ze breiden zich echter niet aanzienlijk uit terwijl ze slechts een beperkte doorgang vertonen (2-3 passages)3,4. Bolachtige structuren werden ook verkregen uit niet-gedissocieerde hypofyse stamcelclusters wanneer gekweekt in 50% verdund Matrigel gedurende 1 week, maar de uitbreidbaarheid werd niet aangetoond17. De pituisfeerbenadering wordt meestal gebruikt als uitleesmiddel voor stamcelaantallen, maar verdere toepassingen worden beperkt door inferieure expansiecapaciteit16.
Om deze tekortkomingen aan te pakken en te overwinnen, is onlangs een nieuw 3D-model vastgesteld, d.w.z. organoïden, uitgaande van de belangrijkste endocriene AL van muizen die de MZ en parenchymale stamcellen bevatten. Het is aangetoond dat de organoïden inderdaad zijn afgeleid van de stamcellen van de hypofyse en hun fenotype18 getrouw samenvatten. Bovendien zijn de organoïden op lange termijn uitbreidbaar, terwijl ze hun stengelachtigheid robuust behouden. Daarom bieden ze een betrouwbare methode om primaire hypofysestamcellen uit te breiden voor diepgaande verkenning. Een dergelijke exploratie is niet haalbaar met het beperkte aantal stamcellen dat uit een hypofyse kan worden geïsoleerd, die ook niet uitbreidbaar zijn in 2D-omstandigheden16. Het is aangetoond dat de organoïden waardevolle en betrouwbare hulpmiddelen zijn om nieuwe hypofysestamcelkenmerken te ontdekken (vertaalbaar naar in vivo)14,18. Belangrijk is dat het organoïde model de hypofysestamcelactiveringsstatus getrouw weerspiegelt als optredend tijdens lokale weefselbeschadiging en neonatale rijping, met verbeterde vormingsefficiëntie en replicerende upregulated moleculaire routes14,18. Vandaar dat het van hypofyse afgeleide organoïdemodel een innovatief en krachtig hypofysestamcelbiologisch onderzoeksmodel is, evenals een hulpmiddel voor het uitlezen van stamcelactivering.
Dit protocol beschrijft in detail de vestiging van van hypofyse afgeleide organoïden van muizen. Om dit doel wordt de AL geïsoleerd en gedissocieerd in afzonderlijke cellen, die zijn ingebed in extracellulair matrix-nabootsend Matrigel (hierna ECM genoemd). De cel-ECM-assemblage wordt vervolgens gekweekt in een gedefinieerd medium, dat in wezen stamcelgroeifactoren en hypofyse-embryonale regulatoren bevat (verder aangeduid als 'hypofyseorganoïde medium' (PitOM)18; Tabel 1). Zodra de organoïden volledig zijn ontwikkeld (na 10-14 dagen), kunnen ze verder worden uitgebreid door sequentiële passaging en worden onderworpen aan uitgebreide downstream-exploratie (bijv. Immunofluorescentie, RT-qPCR en bulk- of eencellige transcriptomica; Figuur 1). Op de langere termijn wordt verwacht dat de hypofysestamcelorganoïden de weg vrijmaken voor weefselherstelbenaderingen en regeneratieve geneeskunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierproeven voor deze studie werden goedgekeurd door de Ethische Commissie dierproeven KU Leuven (P153/2018). Alle muizen werden gehuisvest in de dierenfaciliteit van de universiteit onder gestandaardiseerde omstandigheden (constante temperatuur van 23 ± 1,5 ° C, relatieve vochtigheid 40% -60% en een dag / nachtcyclus van 12 uur), met toegang tot water en voedsel ad libitum.
1. Muizen
- Gebruik in de handel verkrijgbare muizenstammen, zoals C57BL/6J-muizen, van jongvolwassen leeftijd (8-12 weken oud). Over het algemeen bieden 2-3 muizen een voldoende aantal AL-cellen voor het protocol.
2. Isolatie en dissociatie van muis AL
OPMERKING: Medium A, B en C worden van tevoren voorbereid19,20. De samenstellingen zijn weergegeven in tabel 2.
- Isolatie van muis AL
- Euthanasie de muizen door CO 2-verstikking, gevolgd door onthoofding (figuur 2A). Was muizenkoppen met gedeïoniseerd water om het bloed te verwijderen en besproei ze met 70% EtOH om een steriele omgeving te genereren.
- Verwijder met steriele chirurgische hulpmiddelen de huid van het hoofd tussen de oren (figuur 2B).
- Open de schedel en verwijder de hersenen.
- Breek de 'neusbrug' (d.w.z. het voorste deel van het voorste bot; Figuur 2B) met steriele schaar.
- Open de schedel verder met een schaar, beginnend vanaf de gebroken neusbrug naar de oren, aan beide zijden (figuur 2C).
- Verwijder de schedel en de hersenen met een steriel pincet, zonder de hypofyse aan te raken (figuur 2D).
- Verwijder de diafragma sellae met een stomp pincet, zonder de hypofyse te beschadigen. Gooi de PL en de IL van de AL onder een stereomicroscoop.
OPMERKING: De PL en IL zijn gekoppeld en dus tegelijkertijd verwijderd. Deze delen verschijnen als wit weefsel, in vergelijking met het roze gekleurde AL (figuur 2D). - Isoleer de AL zorgvuldig met een stomp pincet en verzamel deze in een Erlenmeyer van 10 ml, gevuld met 3 ml medium A (zie tabel 2). Leg de kolf op ijs tot verdere verwerking.
- Dissociatie van muis AL
- Verwijder het supernatant (SN) medium A uit de Erlenmeyer met de geïsoleerde AL. Voeg 2 ml voorgewarmde (37 °C) 2,5 % trypsineoplossing toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
- Voeg zonder de trypsineoplossing te verwijderen 2 ml voorgewarmde (37 °C) DNase-oplossing toe (2 μg/ml in medium A; steriel gefilterd door een gaas van 0,22 μm) en draai de Erlenmeyer 10 keer rond. Laat de hypofyse naar de bodem zinken (~1 min) en verwijder het SN.
- Voeg 2 ml voorgewarmde (37 °C) trypsineremmeroplossing toe (0,1 mg/ml in medium A; steriel gefilterd door een maaswijdte van 0,22 μm) en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C. Laat het hypofysesediment naar de bodem gaan en verwijder het SN.
- Voeg 2 ml voorverwarmd (37 °C) medium B (zie tabel 2) toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Voeg zonder het SN te verwijderen 2 ml voorverwarmd (37 °C) medium C (zie tabel 2) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten.
- Laat de hypofyse naar de bodem zakken en verwijder het SN. Spoel de hypofyse driemaal af met voorverwarmd (37 °C) medium C.
- Dissocieer de hypofyse in enkele cellen.
- Voeg 2 ml voorgewarmd (37 °C) medium C. Aspiraat toe en verwijder de hypofyse meerdere keren met een steriele, vlamgepolijste Pasteurpipet, totdat fragmenten niet meer zichtbaar zijn.
- Breng de suspensie over in een buis van 15 ml met 4,5 ml voorverwarmde (37 °C) DNase-oplossing (2 μg/ml in medium A; steriel gefilterd door een maaswijdte van 0,22 μm). Spoel de Erlenmeyer driemaal met 2 ml voorgewarmd (37 °C) medium C en breng de suspensie over op de buis van 15 ml.
- Meng de verzamelde celsuspensie en filter deze door een celzeef van 40 μm in een buis van 30 ml. Spoel de buis van 15 ml en de celzeef drie keer af met 2 ml medium C en breng de suspensie over naar de buis van 30 ml.
- Plaats de punt van een glazen Pasteur-pipet, gevuld met 2 ml 3% runderserumalbumine (BSA)-oplossing (in medium A; steriel gefilterd door een gaas van 0,22 μm), op de bodem van de buis en pipetteer voorzichtig om een zichtbare dichtheidslaag te vormen. Centrifugeer bij 190 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het SN door de buis in één vloeiende beweging om te keren en verwijder de resterende SN-druppels met een P1000-punt. Resuspend de celkorrel in 1 ml ijskoude Advanced DMEM/F12 (Adv DMEM/F12) en kwantificeer de cellen met een celteller.
3. Oprichting en kweek van van AL afgeleide organoïden
OPMERKING: Ontdooi ECM van tevoren op ijs (2-3 uur voor 1 ml) en houd het op ijs voor de duur van het protocol.
- Organoïde zaaien en kweken
- Centrifugeer de AL-celsuspensie bij 190 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verwijder het SN. Resuspend de celkorrel in Adv DMEM/F12 met behulp van het specifieke volume berekend om een celdichtheid van 1,1 x 106 cellen/ml te bereiken.
OPMERKING: Als de celsuspensie bijvoorbeeld 500.000 cellen /ml bevat, moet men de celkorrel resuspenderen in 454,54 μL Adv DMEM / F12 om de gewenste dichtheid van 1,1 x 106 cellen / ml te bereiken. - Neem het volume celsuspensie dat nodig is voor plating (volgens het gewenste aantal putten om te zaaien voor organoïde ontwikkeling) en voeg ECM toe in een verhouding van 30:70 (30% celsuspensie (in Adv DMEM / F12 ) en 70% ECM). Meng goed door op en neer te pipetteren.
OPMERKING: Bijvoorbeeld, voor één druppel van 30 μL (zie stap 3.1.3), moet men (voorzichtig) 9 μL celsuspensie (met ~ 10.000 cellen wanneer genomen uit de 1,1 x 106 cellen / ml suspensie) mengen met 21 μL ECM. - Deponeer per put een druppel van 30 μL van het celsuspensie/ECM-mengsel (zie stap 3.1.2) op een voorverwarmde (37 °C) 48-wells plaat. Draai de plaat ondersteboven en laat de ECU gedurende 20 minuten stollen bij 37 °C.
OPMERKING: Verwarm de kweekplaten ten minste 24 uur voor bij 37 °C. - Breng de plaat terug in de juiste richting en voeg voorzichtig 250 μL voorgewarmde (37 °C) PitOM (zie tabel 1) toe, aangevuld met 10 μM Rock Inhibitor (Y-27632).
- Blijf de organoïden kweken door het medium (verstoken van Y-27632) om de 2-3 dagen te veranderen totdat de organoïden volgroeid zijn, wat tussen de 10-14 dagen duurt (figuur 3A). Passeer vervolgens de organoïden.
OPMERKING: Zorg er bij het aanzuigen van het medium voor dat u de ECM-koepel niet verstoort. Kantel de kweekplaat iets en verwijder het medium van de onderrand van de put. Vers (voorgewarmd bij 37 °C) medium moet voorzichtig aan de zijkant van de put worden toegevoegd. Als geldruppeltjes zich ontvouwen, verzamel dan de organoïden en resuspend en kweek ze opnieuw in een nieuwe ECM-druppel.
- Centrifugeer de AL-celsuspensie bij 190 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verwijder het SN. Resuspend de celkorrel in Adv DMEM/F12 met behulp van het specifieke volume berekend om een celdichtheid van 1,1 x 106 cellen/ml te bereiken.
- Organoïde passageing
- Zuig het medium voorzichtig op en voeg 400 μL ijskoude Adv DMEM/F12 toe om de ECU te desintegreren en de organoïden in een microcentrifugebuis te verzamelen. Eenmaal wassen met 400 μL ijskoude Adv DMEM/F12 EM. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
- Verwijder het SN voorzichtig en voeg 400 μL voorverwarmd (37 °C) TrypLE Express Enzyme (1X) toe. Meng door de buis meerdere keren om te keren en incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten.
- Voeg 400 μL ijskoude Adv DMEM/F12 toe en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Verwijder het SN.
- Resuspend de pellet met 100 μL ijskoude Adv DMEM/F12 en breek vervolgens de organoïden af door krachtig op en neer te pipetteren met een vernauwd P200-puntje (d.w.z. duw de lege punt tegen de bodem van de microcentrifugebuis om de openingsdiameter te verkleinen) totdat organoïdefragmenten (met een diameter van ongeveer 50 μm) zijn verkregen (figuur 3B).
OPMERKING: Het dissociatiemengsel moet voornamelijk organoïde fragmenten en slechts enkele afzonderlijke cellen bevatten. Harde dissociatie van de organoïden in afzonderlijke cellen heeft een negatieve invloed op de hergroei van de organoïden. - Voeg 800 μL Adv DMEM/F12 toe en centrifugeer bij 190 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder het SN.
- Passeer de organoïden in een verhouding van 1:2 tot 1:4. Resuspend de pellet in een voldoende volume Adv DMEM/F12 indien nodig voor het plateren en voeg ECM toe in een verhouding van 30:70 (30% celsuspensie en 70% ECM). Meng goed door op en neer te pipetteren.
- Zaad en kweek de organoïden zoals hierboven beschreven in stappen 3.1.3-3.1.5.
OPMERKING: Gemiddeld ontwikkelen zich 20 organoïden per put uit de 10.000 hele AL-cellen die zijn gezaaid (0,2%). Deze passage 0 organoïden kunnen gesplitst worden in een 1:2 verhouding, waardoor zich >50 organoïden per put ontwikkelen (passage 1). Organoïden kunnen dan tijdens volgende passages in een verhouding van 1:2 tot 1:4 worden gesplitst. Hergroei van de organoïden vertraagt na ~10 passages (overeenkomend met 3 maanden cultuur), geconcretiseerd in geleidelijk minder en kleinere organoïden.
4. Cryopreservatie van al-afgeleide organoïden en ontdooien
- Cryopreservatie van organoïden
- Volg het passagingprotocol van stap 3.2.1 tot stap 3.2.5.
- Resuspend de organoïde pellet (met fragmenten en cellen) met 1 ml cryopreservatiemedium (tabel 3). Breng de suspensie over in een cryoviaal en plaats deze op ijs.
OPMERKING: Organoïden (d.w.z. resulterende fragmenten en cellen) uit maximaal vier putten van de 48-putplaat kunnen worden gecombineerd in één cryoviaal. - Plaats de cryovialen in een vriescontainer en breng ze over op -80 °C.
- Breng de monsters na 24 uur over naar een cryobox en bewaar ze in vloeibare stikstof (-196 °C) voor langdurige opslag.
- Ontdooien van gecryopreserveerde organoïden
- Verwijder het cryoviaal uit de tank met vloeibare stikstof en plaats het op ijs. Ga onmiddellijk verder met het ontdooiprotocol.
- Ontdooi de oplossing met de gecryopreserveerde organoïdefragmenten en enkele cellen bij 37 °C (waterbad).
OPMERKING: Bewaar de oplossing niet langer dan 2 minuten bij 37 °C om celtoxiciteit door DMSO te voorkomen. - Breng de inhoud over in een buis van 15 ml met 10 ml ijskoude Adv DMEM/F12 met 30% foetaal runderserum (FBS). Spoel de cryovial af met 1 ml Adv DMEM/F12 met 30% FBS.
- Centrifugeer bij 190 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Resuspend de pellet met 1 ml ijskoude Adv DMEM/F12 en breng de suspensie over naar een microcentrifugebuis.
- Centrifugeer bij 190 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Resuspend de pellet in een voldoende volume Adv DMEM/F12 indien nodig voor het beplaten en voeg ECM toe in een verhouding van 30:70. Meng goed door op en neer te pipetteren.
- Zaad en kweek de organoïden zoals hierboven beschreven in stappen 3.1.3-3.1.5.
5. Validatie van al-afgeleide organoïden
- Verzameling en lysis van organoïden voor RNA-isolatie
- Verzamel en centrifugeer de organoïden zoals hierboven beschreven (stap 3.2.1).
- Verwijder het SN en voeg 350 μL lysisbuffer toe met 1% 2-mercapto-ethanol. Vortex gedurende 30 s en bewaren bij -80 °C of onmiddellijk overgaan tot RNA-isolatie.
LET OP: Pas op dat 2-mercapto-ethanol een giftige verbinding is. Al het werk moet worden gedaan in een chemische zuurkast terwijl u nitrilhandschoenen, een stofmasker en een veiligheidsbril draagt. 2-Mercapto-ethanol kan onherstelbare schade aan de ogen en de huid veroorzaken.
- Fixatie en inbedding van organoïden voor immuno-histochemie/-fluorescentiekleuring
- Verzamel en centrifugeer de organoïden zoals hierboven beschreven (stap 3.2.1).
- Verwijder het SN, voeg 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) op een orbitale shaker (100 rpm).
LET OP: PFA is een bekend carcinogeen voor de mens dat onomkeerbare schade aan het hoornvlies kan veroorzaken. Alle werkzaamheden moeten in een chemische zuurkast worden uitgevoerd. Nitril handschoenen en veiligheidsbrillen moeten altijd worden gedragen. - Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten en verwijder het SN. Voeg 1 ml PBS toe, incubeer 10 min bij RT op een orbitale shaker (100 rpm) en centrifugeer bij 90 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Herhaal de wasstap twee keer. Bewaren in PBS bij 4 °C.
- Verwijder voor weefselverwerking en uitdroging het SN en voeg 150 μL 2% agarosegel (in PBS) toe aan de organoïde pellet met behulp van een voorverwarmde verbrede p200-tip (gemaakt door een klein stukje van de punt te snijden). Pipetteer onmiddellijk het volledige volume omhoog en werp het deksel van de microcentrifugebuis uit.
OPMERKING: Het is belangrijk om snel te werken, omdat de gel met de organoïden snel zal stollen. - Laat de gel 30 minuten stevig stollen en verplaats de gelschijf naar een histologiecassette. Dompel onder en bewaar in 50% EtOH, totdat uitdroging in de weefselverwerker.
- Voor paraffine inbedding plaatst u de gelschijf (met behulp van een tang) in een insluitvorm en vult u deze met warme paraffine (60 °C). Plaats de vormpjes op 4 °C totdat de paraffine vast is (ongeveer 45 min). Deze monsters kunnen worden opgeslagen bij 4 °C of kunnen onmiddellijk worden onderworpen aan sectie.
- Microtome de paraffineblokken die organoïden bevatten op een dikte van 5 μm en verzamel de monsters op glazen dia's. Voeg een druppel gedeïoniseerd water toe onder elke sectie om de sectie goed uit te rekken en plaats de dia's 's nachts op een vlakke verwarmingsplaat bij 37 °C. Bewaar de dia's met secties bij 4 °C of ga direct verder met immunohistochemische of immunofluorescentiekleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na isolatie en dissociatie van de AL worden de verkregen enkelvoudige cellen in ECM gezaaid en in PitOM gekweekt (figuur 1, tabel 1). Figuur 3A toont de celcultuur en dichtheid bij het zaaien (dag 0). Er kan wat klein puin aanwezig zijn (figuur 3A, witte pijlpunten), maar zal verdwijnen bij het passeren. Veertien dagen na het zaaien zijn de van AL afgeleide organoïden volledig ontwikkeld (figuur 3A). De organoïden vertonen een cystische morfologie, met een epitheliale laag die een lumen omsluit. In dit stadium bereiken de organoïden een diameter van 500 μm en moeten ze worden gepasseerd. Figuur 3B toont de al-afgeleide organoïdecultuur na passaging op het aangegeven tijdstip na herzaaiing van de gedissocieerde organoïde fragmenten.
Af en toe kunnen een of meer dichte structuren in de organoïde cultuur verschijnen (figuur 3A, Ongunstig). Bij het passeren hebben dichte organoïden de neiging om het over te nemen en eindigen ze in culturen met slechts dichte structuren na een paar passages (figuur 3B, Ongunstig). Daarom wordt aanbevolen om niet door te gaan met putten die dichte organoïden bevatten (passage 0). Als alternatief kunnen dichte organoïden worden weggegooid door sedimentatie, waardoor de cystische organoïden achterblijven om mee door te gaan. De oorsprong van deze dichte organoïden is op dit moment onduidelijk, maar ze vertonen een minder uitgesproken hypofysekarakter18. Als organoïden niet of minder efficiënt hergroeien na passaging, moeten dissociatieprocedures worden geoptimaliseerd. In het bijzonder moet men opletten niet te hard te dissociëren; de organoïden moeten worden opgesplitst in fragmenten, niet in afzonderlijke cellen (figuur 3B, dag 0, inzet).
Immunofluorescentiekleuringsanalyse bevestigt het epitheliale karakter van de van AL afgeleide organoïden, aangezien ze de epitheliale markers E-cadherine (E-Cad) en cytokeratine 8/18 (CK8/18; Figuur 3C), die bovendien zijn beschreven als stamcelmarkers in de hypofyse18. De stengelheidskarakter van de organoïden wordt bovendien aangetoond door SOX2- en TROP2-expressie, die beide ook werden geïdentificeerd als hypofysestamcelmarkers (figuur 3C)14,18. LHX3, een transcriptiefactor die specifiek tot expressie komt in de (vroeg ontwikkelende) hypofyse, valideert het hypofysefenotype van de organoïden (figuur 3C). Sommige van de organoïde-constitutieve cellen bevinden zich in een proliferatieve toestand en drukken de proliferatiemarker Ki67 uit (figuur 3C).
Verdere exploratie en validatie van het hypofyse (stengelheid) fenotype van de AL-afgeleide organoïden wordt uitgevoerd met reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Hoge expressie van de stengelheidsmarkers Sox2, Cdh1 (coderend voor E-Cad), Krt8, Krt18 en Trop2 is aanwezig in de organoïden, duidelijk hoger dan in primair AL, wat aangeeft dat de organoïden verrijken voor de stamcellen en dus het AL-stamcelcompartiment vertegenwoordigen, zoals eerder beschreven (figuur 3D)18. Met name de ontwikkelingstranscriptiefactoren Pitx1 en Pitx2 blijven tot expressie komen na ontwikkeling in verschillende hormonale celtypen in de AL, en dus ook hun hoge expressie in de AL. De culturen behouden robuust hun stengelfenotype, zoals blijkt uit de aanhoudende (hoge) expressie van deze markers na meerdere passages (figuur 3D).
Figuur 1: Overzicht van de vestiging, het onderhoud, de karakterisering en het toepassingspotentieel van organoïden uit gezonde en zieke hypofyse. AL, voorkwab; IL, tussenkwab; PL, achterkwab; MZ, marginale zone; PitOM, hypofyse organoïde medium (gemaakt met BioRender.com). Stamcelniches in de AL zijn aangegeven in paars. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Isolatie van de hypofyse van volwassen geëuthanaseerde muis. Representatieve beelden die achtereenvolgens zijn genomen na (A) onthoofding, (B) verwijdering van de hoofdhuid (neusbrug is omcirkeld), (C) opening van de schedel en (D) verwijdering van de hersenen, waardoor de hypofyse (omcirkeld) wordt blootgesteld. Pijl wijst naar de PL, die wordt weggegooid (samen met de bijbehorende IL), waardoor de AL voor isolatie en dissociatie overblijft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vaststelling en validatie van al-afgeleide organoïden. (A) AL-celzaaien en organoïdeontwikkeling in PitOM op aangegeven dagen (passage 0). De bovenste rij vertoont gunstige organoïde groei, waarbij alleen cystische structuren zich ontwikkelen. De onderste rij vertoont ongunstige groei met een grote dichte structuur die verschijnt (in een doos). Witte pijlpunten duiden op puin, zwarte pijlpunten op enkele cellen (vergroot in inzet). (B) Organoïde fragmenten (vergroot in inzet) gezaaid bij passaging (dag 0) en hergroei van organoïden zoals waargenomen 7 dagen later. De bovenste rij vertoont gunstige organoïde hergroei, met alleen cystische structuren die groeien. De onderste rij toont ongunstige hergroei met dichte organoïden die de cultuur overnemen. (C) Immunofluorescentiekleuring van E-Cad, SOX2, TROP2 (volledig rood), CK8/18, LHX3 en Ki67 (allemaal groen) in al-afgeleide organoïden. Kernen zijn gelabeld met Hoechst33342 (blauw). Pijlpunten geven Ki67+ cellen aan. Schaalbalken zijn aangegeven. (D) Genexpressieanalyse van stengelheidmarkers (Sox2, Cdh1, Krt8, Krt18, Trop2) en ontwikkelingstranscriptiefactoren (Pitx1, Pitx2) in primaire AL- en AL-afgeleide organoïden (Passage 0 betekent 14 dagen na celzaaien) bepaald door RT-qPCR (gemiddelde ± SEM). Datapunten vertegenwoordigen biologische replicaties. Delta cyclus drempel (dCT) waarden worden getoond, berekend met behulp van de formule: CT(gen van belang) - CT(huishouding gen Actb). Hoe positiever de dCT-waarde (die wordt weergegeven op de Y-as onder de nul X-as), hoe lager het expressieniveau van het gen van belang. Hoe lager (of negatiever) de dCT-waarde, hoe hoger het expressieniveau 14,18,21,22. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Hypofyse organoïde medium (PitOM) | |
| Bestanddeel | Concentratie |
| Geavanceerde DMEM/F12 | |
| Hepes | 1% |
| Penicilline-Streptomycine | 1% |
| Glutamax | 1% |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamine A | 1x |
| L-Glutamine (200mM) | 2 meter |
| Recombinant Humaan FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Eiwit | 20 ng/ml |
| Recombinant Human IGF-1 | 100 ng/ml |
| N-2 Supplement (100X) | 1x |
| N-acetyl-cysteïne | 1,25 mM |
| Recombinant Menselijk /Murine FGF-8b | 200 ng/ml |
| Recombinant Menselijk FGF-10 | 100 ng/ml |
| A83-01 (activinereceptorachtige kinase 4/5/7-remmer) | 0,50 μM |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | 100 ng/ml |
| Recombinant Humaan EGF-eiwit, CF | 50 ng/ml |
| SB202190 (p38 mitogeen-geactiveerde proteïnekinaseremmer) | 10 μM |
| Recombinant Menselijk Noggin | 100 ng/ml |
| Cholera Toxine van Vibrio cholerae | 100 ng/ml |
| Recombinant Humaan R-Spondin-1 | 200 ng/ml |
| Recombinant Human IL-6 | 20 ng/ml |
Tabel 1. Samenstelling van PitOM. PitOM wordt gefilterd door een meshfilter van 0,22 μm en maximaal 2 weken bewaard bij 4 °C.
| Gemiddeld A | |
| Bestanddeel | Hoeveelheid |
| DMEM, poeder, hoge glucose | 13,38 g |
| Hepes | 5,96 g |
| Natriumpyruvaat (C3H3Nao3) | 0,11 g |
| Penicilline G natriumzout | 35,00 mg |
| Streptomycine sulfaat zout | 50,00 mg |
| Natriumchloride (NaCl) | 0,50 g |
| Natriumwaterstofcarbonaat (NaHCO3) | 1,00 g |
| Albumine bovine (celkweek graad) | 3,00 g |
| Steriel water | 1,00 L |
| Gemiddeld C | |
| Bestanddeel | Hoeveelheid |
| Natriumchloride (NaCl) | 7,50 g |
| Kaliumchloride (KCl) | 0,40 g |
| Natriumdi-waterstoffosfaat 1-hydraat | 0,14 g |
| D-glucose | 1,00 g |
| Hepes | 4,76 g |
| Streptomycine sulfaat zout | 50,00 mg |
| Penicilline G natriumzout | 35,00 mg |
| Fenol rood | 10,00 mg |
| Albumine bovine (celkweek graad) | 3,00 g |
| Natriumwaterstofcarbonaat (NaHCO3) | 1,00 g |
| Steriel water | 1,00 L |
| Gemiddeld B | |
| Bestanddeel | Hoeveelheid |
| Titriplex III (Edetate dinatriumzout dihydraat) | 0,74 g |
| Gemiddeld C | 100 ml |
Tabel 2. Samenstelling van medium A, B en C. Alle media worden gefilterd door een meshfilter van 0,22 μm en maximaal 4 maanden bewaard bij 4 °C. De pH van medium A en C moet worden aangepast naar 7,3.
| Cryopreservatie medium | |
| Bestanddeel | Concentratie |
| Geavanceerde DMEM/F12 | 60% |
| FBS | 30% |
| DMSO | 10% |
Tabel 3. Samenstelling van cryopreservatiemedium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De al-afgeleide organoïden, zoals hier beschreven, vertegenwoordigen een krachtig onderzoeksmodel om hypofysestamcellen in vitro te bestuderen. Op dit moment is deze organoïde benadering het enige beschikbare hulpmiddel om op betrouwbare en robuuste wijze primaire hypofysestamcellen te laten groeien en uit te breiden. Eerder is een hypofyse-organoïdemodel afgeleid van embryonale stamcellen (ESC) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) gemeld, dat de hypofyse-embryonale organogenese nauw samenvat23; hoewel zeer nuttig om de ontwikkeling van hypofyse of model hypofyse 23,24,25 te bestuderen, is het gerapporteerde protocol, beginnend met ESC / iPSC, zeer tijdrovend in vergelijking met het hier beschreven protocol, en de resulterende organoïden zijn ook niet uitbreidbaar.
Succesvolle kweek van hypofyse stamcelorganoïden hangt af van enkele kritieke stappen in het protocol. Het is belangrijk om een passend aantal cellen te bepalen bij het initiële celzaaien. Een zeer hoog aantal zal aanleiding geven tot overbevolkte culturen, wat de levensvatbaarheid van de organoïden verslechtert en volledige organoïde-expansie belemmert, terwijl een zeer laag aantal cellen zal resulteren in beperkte organoïdevorming. Verder is het belangrijk om de integriteit van de ECM-koepel eenmaal in cultuur niet te verstoren. Het toevoegen en verwijderen van medium moet zeer voorzichtig gebeuren, zonder de geldruppel aan te raken. Bovendien vermindert het voorwarmen van het kweekmedium het risico op depolymerisatie van de gel. Ten slotte is het correct doorgeven van de organoïden (d.w.z. dissociëren aan fragmenten en niet aan afzonderlijke cellen) cruciaal voor een efficiënte uitbreiding van de culturen.
Deze hypofyse stamcel organoïden kunnen worden gebruikt om vragen te beantwoorden met betrekking tot het fenotype, de biologie en de functie van de stamcellen. Ze zijn al waardevol gebleken bij het blootleggen van nieuwe stamcelkenmerken en markers van hypofyseschade-geassocieerde stamcelactivering en als een uitleesinstrument voor stamcelactiviteit (figuur 1)14,18. De huidige inspanningen omvatten hun afleiding van zieke hypofyse, zoals hypopituïtarisme en PitNETs (figuur 1). Uiteindelijk kunnen organoïden ook worden betrokken bij een platform voor geneesmiddelenscreening, zoals met succes vastgesteld voor andere ziekten26,27. Daarom zal verdere opschaling van de organoïde culturen nodig zijn om een analyse met een hoge doorvoer te bereiken. Het is al opgemerkt dat AL-afgeleide organoïden efficiënt kunnen worden gekweekt in een 96-well formaat, wat ook resulteert in meer homogene culturen.
Er is waargenomen dat na ~ 10 passages (overeenkomend met 3 maanden cultuur), de groei-efficiëntie van organoïden geleidelijk afnam met organoïden die opnieuw groeiden bij lagere aantallen en kleinere afmetingen. Deze groeidaling kan inherent zijn aan de intrinsieke aard van hypofysestamcellen, die zichzelf mogelijk niet vele malen hoeven te vernieuwen in de klier in vivo, die slechts langzaam omdraait en dus uitgeput raakt na een paar delingsrondes16,28. Hoewel deze uiteindelijke groeidaling als een beperking kan worden beschouwd, is het model zeer nuttig omdat organoïde-expansie tijdens de voorgaande passages meer dan voldoende is voor uitgebreide downstream-analyses.
Een ander aspect dat als een beperking kan worden beschouwd, is dat de hypofysestamcelorganoïden geen prominent differentiatievermogen vertonen ten opzichte van de endocriene celtypen van de AL, zelfs niet na xenotransplantatie onder het nierkapsel van immunodeficiënte muizen (wat resulteerde in een beperkt aantal GH + en PRL + -cellen zoals in detail beschreven in referentie18). Ofwel zijn de juiste in vitro omstandigheden om de stamcellen tot differentiatie te drijven nog niet geïdentificeerd, ofwel is de belangrijkste rol van de stamcellen (vooral in de volwassen klier) niet gesitueerd bij het genereren van nieuwe endocriene cellen (aangezien waarschijnlijk niet nodig in de luie klier, maar alleen in verstoorde of uitgedaagde omstandigheden)9,10,14, 18. In plaats daarvan kan de belangrijkste functie zich situeren in andere biologische aspecten (bijv. paracriene signalering naar de hormonale voorloper/voorloper of volwassen cellen in basische, maar waarschijnlijk meer in actieve (ontwikkelings-, reparatie-, ziekte)aandoeningen)13,16. Hoewel is aangetoond dat hypofysestamcellen multipotent differentiatievermogen bezitten, vooral in de embryonale en neonatale periode, is het denkbaar dat stamcellen in de volwassen klier deze capaciteit niet (hoeven) te behouden, gezien de zeer lage omzet van de volwassen klier 16,28. Het is mogelijk dat de volwassen hypofysestamcellen meer fungeren als een paracriene signaleringshub, betrokken bij het stimuleren of reguleren van de omliggende voorloper / voorloper / endocriene cellen13,16. Vandaar dat robuuste differentiatie van de hypofysestamcelorganoïden, culminerend in hormoonsecretie, een onjuiste verwachting kan zijn die nooit zal worden bereikt.
Alles bij elkaar biedt het hier gepresenteerde protocol een snel toepasbaar en betrouwbaar hulpmiddel om primaire hypofysestamcellen in vitro robuust uit te breiden in een 3D-setting. Het protocol geeft aanleiding tot organoïden die het hypofysestamcelfenotype getrouw vastleggen. Het systeem is al met succes toegepast om hypofyse stamcelbiologie en activering14,18 te bestuderen, en de bevindingen zijn zeer vertaalbaar naar de in vivo situatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het KU Leuven Research Fund en het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) - Vlaanderen. E.L. (11A3320N) en C.N. (1S14218N) worden ondersteund door een Ph.D. Fellowship van het FWO/FWO-SB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
References
- Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1 (2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
- Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
- Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
- Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
- Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).
- Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E.
- Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
- Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
- Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
- Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
- Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142 (2021).
- Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).
- Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
- Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).
- Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
- Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
- Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
- Trompeter, H. -I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111 (2013).
- Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
- Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
- Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).
