Summary
Гипофиз является ключевым регулятором эндокринной системы организма. В этой статье описывается развитие органоидов из гипофиза мыши как новой 3D-модели in vitro для изучения популяции стволовых клеток железы, биология и функция которой остаются плохо изученными.
Abstract
Гипофиз является главной эндокринной железой, регулирующей ключевые физиологические процессы, включая рост тела, обмен веществ, половое созревание, размножение и реакцию на стресс. Более десяти лет назад стволовые клетки были идентифицированы в гипофизе. Однако, несмотря на применение трансгенных подходов in vivo , их фенотип, биология и роль остаются неясными. Чтобы справиться с этой загадкой, разработана новая и инновационная органоидная модель in vitro , чтобы глубоко разгадать биологию стволовых клеток гипофиза. Органоиды представляют собой 3D-клеточные структуры, которые при определенных условиях культивирования самостоятельно развиваются из стволовых клеток ткани (эпителия) и повторяют множественные признаки этих стволовых клеток и их ткани. Здесь показано, что органоиды, полученные из гипофиза мыши, развиваются из стволовых клеток железы и точно повторяют их фенотипические и функциональные характеристики in vivo . Среди прочего, они воспроизводят состояние активации стволовых клеток in vivo, происходящее в ответ на трансгенно нанесенное местное повреждение. Органоиды являются долгосрочными расширяемыми, сохраняя при этом свой фенотип ствола. Новая исследовательская модель очень ценна для расшифровки фенотипа и поведения стволовых клеток во время ключевых условий ремоделирования гипофиза, начиная от созревания новорожденных до связанного со старением увядания, и от здоровых до больных желез. Здесь представлен подробный протокол для установления органоидов, полученных из гипофиза мыши, которые обеспечивают мощный инструмент для погружения в еще загадочный мир стволовых клеток гипофиза.
Introduction
Гипофиз представляет собой крошечную эндокринную железу, расположенную у основания мозга, где она связана с гипоталамусом. Железа интегрирует периферические и центральные (гипоталамические) входы для генерации настроенного и скоординированного высвобождения гормонов, тем самым регулируя последующие эндокринные органы-мишени (такие как надпочечники и гонады) для производства соответствующих гормонов в нужное время. Гипофиз является ключевым регулятором эндокринной системы и поэтому по праву называется главной железой1.
Гипофиз мыши состоит из трех долей (рисунок 1), то есть передней доли (AL), промежуточной доли (IL) и задней доли (PL). Основная эндокринная AL содержит пять типов гормональных клеток, включая соматотропы, которые производят гормон роста (ГР); лактотропы, генерирующие пролактин (ПРЛ); кортикотропы, секретирующие адренокортикотропный гормон (АКТГ); тиреотропы, отвечающие за выработку тиреотропного гормона (ТТГ); и гонадотропы, вырабатывающие лютеинизирующий гормон (ЛГ) и фолликулостимулирующий гормон (ФСГ). PL состоит из аксональных проекций из гипоталамуса, в которых хранятся гормоны окситоцин и вазопрессин (антидиуретический гормон). IL расположен между AL и PL и содержит меланотропы, которые производят меланоцитостимулирующий гормон (MSH). В гипофизе человека IL регрессирует во время развития, и меланотропы распространяются в пределах AL1. Помимо эндокринных клеток, гипофиз также содержит пул стволовых клеток, по существу отмеченных транскрипционным фактором SOX2 2,3,4,5,6. Эти клетки SOX2+ расположены в маргинальной зоне (MZ), эпителиальной выстилке расщелины (эмбриональный остаточный просвет между AL и IL), или распространяются в виде кластеров по всей паренхиме AL, тем самым предлагая две ниши стволовых клеток в железе (рисунок 1)2,3,4,5,6.
Учитывая незаменимый характер гипофиза, нарушение работы железы связано с серьезной заболеваемостью. Гиперпитуитаризм (характеризующийся чрезмерной секрецией одного или нескольких гормонов) и гипопитуитаризм (дефектная или отсутствующая выработка одного или нескольких гормонов) могут быть вызваны нейроэндокринными опухолями гипофиза (PitNETs; например, опухоли, продуцирующие АКТГ, приводящие к болезни Кушинга) или генетическими дефектами (например, дефицит ГР, приводящий к карликовости)7. Кроме того, хирургия гипофиза (например, для удаления опухолей), инфекции (например, туберкулез гипоталамо-гипофиза или инфекции, следующие за бактериальным менингитом или энцефалитом), синдром Шихана (некроз из-за недостаточного кровотока из-за сильной кровопотери при родах), апоплексия гипофиза и черепно-мозговая травма являются другими важными причинами гипофайнкции гипофиза8 . Показано, что гипофиз мыши обладает регенеративной способностью, будучи способным восстанавливать локальные повреждения, внесенные трансгенной абляцией эндокринных клеток 9,10. Стволовые клетки SOX2+ остро реагируют на нанесенное повреждение, демонстрируя активированный фенотип, отмеченный усиленной пролиферацией (что приводит к расширению стволовых клеток) и повышенной экспрессией факторов и путей, связанных со стволовой (например, WNT / NOTCH). Более того, стволовые клетки начинают экспрессировать абляционный гормон, что в конечном итоге приводит к существенному восстановлению истощенной клеточной популяции в течение следующих (от 5 до 6) месяцев 9,10. Кроме того, во время фазы неонатального созревания железы (первые 3 недели после рождения) стволовые клетки гипофиза процветают в активированном состоянии 6,11,12,13, тогда как старение организма связано со снижением функциональности стволовых клеток in situ из-за увеличения воспалительной (микро-) среды при старении (или «воспалении»)10,14 . Кроме того, опухолевый генез в железе также связан с активацией стволовых клеток 7,15. Хотя активация стволовых клеток была обнаружена в нескольких ситуациях ремоделирования гипофиза (рассмотренных в 7,16), основные механизмы остаются неясными. Поскольку подходы in vivo (такие как отслеживание родословной у трансгенных мышей) не дают четкой или всеобъемлющей картины стволовых клеток гипофиза, разработка надежных моделей in vitro для изучения биологии стволовых клеток в нормальном и больном гипофизе имеет важное значение. Стандартная культура in vitro первичных стволовых клеток гипофиза остается неадекватной из-за очень ограниченной способности к росту и нефизиологических (2D) условий с быстрой потерей фенотипа (для более подробного обзора см.16). 3D-сферные культуры (питуисферы) были созданы из стволовых клеток гипофиза, идентифицированных по боковой популяции и фенотипуSOX2+ 2,3,4. Питуисферы клонально растут из стволовых клеток, экспрессируют маркеры стволовости и демонстрируют дифференцировочную способность в эндокринные типы клеток. Однако они существенно не расширяются, показывая лишь ограниченную проходимость (2-3 прохода)3,4. Сфероподобные структуры также были получены из недиссоциированных кластеров стволовых клеток гипофиза при культивировании в 50% разбавленном Матригеле в течение 1 недели, но расширяемость не была показана17. Подход питуисферы в основном используется в качестве инструмента считывания числа стволовых клеток, но дальнейшие применения ограничены более низкой расширительной способностью16.
Чтобы устранить и преодолеть эти недостатки, недавно была создана новая 3D-модель, то есть органоиды, начиная с основного эндокринного AL мышей, содержащих MZ и паренхиматозные стволовые клетки. Было показано, что органоиды действительно получены из стволовых клеток гипофиза и точно повторяют их фенотип18. Кроме того, органоиды являются долгосрочными расширяемыми, при этом надежно сохраняя свою стеблевую природу. Поэтому они обеспечивают надежный метод расширения первичных стволовых клеток гипофиза для глубокого исследования. Такое исследование недостижимо при ограниченном количестве стволовых клеток, которые могут быть выделены из гипофиза, которые также не могут быть расширены в 2D-условиях16. Было показано, что органоиды являются ценными и надежными инструментами для выявления новых особенностей стволовых клеток гипофиза (переводимых в in vivo)14,18. Важно отметить, что органоидная модель точно отражает статус активации стволовых клеток гипофиза, возникающий во время локального повреждения тканей и созревания новорожденных, демонстрируя повышенную эффективность формирования и репликацию регулируемых молекулярных путей14,18. Следовательно, органоидная модель, полученная из гипофиза, является инновационной и мощной исследовательской моделью биологии стволовых клеток гипофиза, а также инструментом считывания активации стволовых клеток.
Этот протокол подробно описывает создание органоидов, полученных из гипофиза мыши. С этой целью AL выделяют и диссоциируют на отдельные клетки, которые встроены во внеклеточный матрикс, имитирующий Matrigel (далее называемый ECM). Затем клеточно-ECM-сборку культивируют в определенной среде, по существу содержащей факторы роста стволовых клеток и гипофизарные эмбриональные регуляторы (далее называемые «гипофизарной органоидной средой» (PitOM)18; Таблица 1). Как только органоиды полностью развиты (через 10-14 дней), они могут быть дополнительно расширены путем последовательного прохождения и подвергнуты обширному последующему исследованию (например, иммунофлуоресценция, RT-qPCR и объемная или одноклеточная транскриптомика; Рисунок 1). В долгосрочной перспективе ожидается, что органоиды стволовых клеток гипофиза проложат путь к подходам к восстановлению тканей и регенеративной медицине.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных для этого исследования были одобрены Этическим комитетом KU Leuven по экспериментам на животных (P153/2018). Все мыши были размещены в университетском животноводческом учреждении в стандартизированных условиях (постоянная температура 23 ± 1,5 ° C, относительная влажность 40%-60% и цикл день / ночь 12 ч), с доступом к воде и пище ad libitum.
1. Мыши
- Используйте коммерчески доступные штаммы мышей, такие как мыши C57BL/ 6J, молодого взрослого возраста (8-12 недель). В целом, 2-3 мыши обеспечивают достаточное количество AL-клеток для протокола.
2. Изоляция и диссоциация мышиного AL
ПРИМЕЧАНИЕ: Среды А, В и С готовятся заранее 19,20. Составы приведены в таблице 2.
- Изоляция мыши AL
- Усыпление мышей путем удушьяCO2 с последующим обезглавливанием (рисунок 2A). Промывайте головы мышей деионизированной водой для удаления крови и опрыскивайте их 70% EtOH для создания стерильной среды.
- Используя стерильные хирургические инструменты, удалите кожу головы между ушами (рисунок 2B).
- Откройте череп и удалите мозг.
- Сломать «переносицу» (т.е. переднюю часть лобной кости; Рисунок 2B) стерильными ножницами.
- Откройте череп дальше ножницами, начиная от сломанной переносицы к ушам, с обеих сторон (рисунок 2С).
- Удаляют череп и мозг стерильным пинцетом, не касаясь гипофиза (рисунок 2D).
- Удалить диафрагму селлаем тупым пинцетом, не повреждая гипофиз. Отбросьте PL и IL из AL под стереомикроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: PL и IL связаны и, таким образом, удаляются одновременно. Эти части выглядят как белая ткань, по сравнению с розовым ЦВЕТОМ AL (рисунок 2D). - Тщательно изолируют AL тупым пинцетом и собирают его в колбу Эрленмейера объемом 10 мл, заполненную 3 мл среды А (см. таблицу 2). Поместите колбу на лед до дальнейшей обработки.
- Диссоциация мышиной AL
- Удалите супернатантную (SN) среду A из колбы Эрленмейера, содержащей выделенный AL. Добавьте 2 мл предварительно расплавленного (37 °C) 2,5% раствора трипсина и инкубируйте при 37 °C в течение 15 мин.
- Не удаляя раствор трипсина, добавляют 2 мл предварительно расплавленного (37 °C) раствора ДНКазы (2 мкг/мл в среде А; стерильно фильтруют через сетку 0,22 мкм) и закручивают колбу Эрленмейера 10 раз. Дайте гипофизу опуститься на дно (~1 мин) и удалите SN.
- Добавить 2 мл предварительного (37 °C) раствора ингибитора трипсина (0,1 мг/мл в среде А; стерильно-фильтрованного через сетку 0,22 мкм) и инкубировать при 37 °C в течение 10 мин. Дайте гипофизу отстой на дно и удалите SN.
- Добавить 2 мл предварительно расплавленной (37 °C) среды B (см. таблицу 2) и инкубировать при 37 °C в течение 5 мин. Не удаляя SN, добавляют 2 мл предварительно расплавленной (37 °C) среды C (см. таблицу 2) и инкубируют при 37 °C в течение 15 мин.
- Дайте гипофизу опуститься на дно и удалите SN. Промыть гипофиз три раза с предварительной (37 °C) средой C.
- Диссоциируют гипофиз на отдельные клетки.
- Добавьте 2 мл предварительной (37 °C) среды C. Аспирируйте и изгоните гипофиз стерильной, отполированной пламенем пипеткой Пастера несколько раз, пока фрагменты больше не будут видны.
- Переложите суспензию в пробирку объемом 15 мл с 4,5 мл предварительно расплавленного (37 °C) раствора ДНКазы (2 мкг/мл в среде А; стерильно отфильтрованную через сетку 0,22 мкм). Промыть Эрленмейер три раза 2 мл предварительно расплавленной (37 °C) среды С и перенести суспензию в трубку объемом 15 мл.
- Смешайте собранную клеточную суспензию и отфильтруйте ее через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм в трубку объемом 30 мл. Промыть трубку объемом 15 мл и клеточный ситечко три раза 2 мл среды С и перенести суспензию в трубку объемом 30 мл.
- Расположите кончик стеклянной пипетки Пастера, заполненной 2 мл 3% раствора бычьего сывороточного альбумина (BSA) (в среде А; стерильно отфильтрованной через сетку 0,22 мкм), на дне трубки и осторожно выделите пипетку, чтобы сформировать слой видимой плотности. Центрифуга при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C.
- Удалите SN, перевернув трубку одним плавным движением, и удалите оставшиеся капли SN с помощью наконечника P1000. Повторно суспендируйте ячейку гранулы в 1 мл ледяного Advanced DMEM/F12 (Adv DMEM/F12) и количественно оцените ячейки с помощью счетчика клеток.
3. Создание и культивирование органоидов, полученных из AL
ПРИМЕЧАНИЕ: Заранее разморозьте ECM на льду (2-3 ч на 1 мл) и держите его на льду в течение всего срока действия протокола.
- Посев и культивирование органоидов
- Центрифугируйте суспензию ячейки AL при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C и удалите SN. Повторное суспендирование клеточной гранулы в Adv DMEM/F12 с использованием удельного объема, рассчитанного для достижения плотности ячейки 1,1 x 106 клеток/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если клеточная суспензия содержит 500 000 клеток/мл, необходимо повторно суспендировать гранулу ячейки в 454,54 мкл Adv DMEM/F12 для достижения желаемой плотности 1,1 x 106 клеток/мл. - Извлеките объем клеточной суспензии, необходимый для покрытия (в соответствии с желаемым количеством лунок для посева для разработки органоидов) и добавьте ECM в соотношении 30:70 (30% клеточная суспензия (в Adv DMEM/F12) и 70% ECM). Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, для одной капли объемом 30 мкл (см. этап 3.1.3) следует (осторожно) смешать 9 мкл клеточной суспензии (содержащей ~10 000 клеток при взятии из суспензии 1,1 х 106 клеток/мл) с 21 мкл ECM. - На каждую скважину нанесите 30 мкл капли клеточной суспензии/ECM-смеси (см. этап 3.1.2) на предварительно нагретую (37 °C) 48-луночную пластину. Переверните пластину вверх дном и дайте ECM затвердеть при 37 °C в течение 20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно нагревайте тарелки для культивирования в течение не менее 24 ч при 37 °C. - Верните пластину в правильную ориентацию и осторожно добавьте 250 мкл предварительно разогретого (37 °C) ПитОМ (см. Таблицу 1), дополненного ингибитором породы 10 мкМ (Y-27632).
- Продолжайте культивировать органоиды, изменяя среду (лишенную Y-27632) каждые 2-3 дня, пока органоиды не будут полностью выращены, что занимает от 10 до 14 дней (рисунок 3A). Затем проходим органоиды.
ПРИМЕЧАНИЕ: При аспирации среды убедитесь, что вы не нарушаете работу купола ECM. Слегка наклоните культуральную пластину и снимите среду с нижнего края колодца. Свежую (предварительно разогретую при 37 °C) среду следует аккуратно добавлять в боковую часть лунки. Если капли геля разъединяются, соберите органоиды и повторно суспендируйте и снова культивируйте их в новой капле ECM.
- Центрифугируйте суспензию ячейки AL при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C и удалите SN. Повторное суспендирование клеточной гранулы в Adv DMEM/F12 с использованием удельного объема, рассчитанного для достижения плотности ячейки 1,1 x 106 клеток/мл.
- Пассаж органоидов
- Осторожно аспирируйте среду и добавьте 400 мкл ледяного Adv DMEM/F12 для разрушения ECM и сбора органоидов в микроцентрифужную трубку. Промыть один раз 400 мкл ледяного Adv DMEM/F12 EM. Центрифуга при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C.
- Осторожно удалите SN и добавьте 400 мкл предварительного (37 °C) фермента TrypLE Express (1X). Перемешайте, перевернув пробирку несколько раз, и инкубируйте при 37 °C в течение 5 мин.
- Добавьте 400 мкл ледяного Adv DMEM/F12 и центрифугу при 200 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите SN.
- Повторно суспендировать гранулу 100 мкл ледяного Adv DMEM/F12 и впоследствии разбить органоиды, энергично пипетируя вверх и вниз суженным наконечником P200 (т.е. прижимая пустой наконечник к дну трубки микроцентрифуги, чтобы уменьшить диаметр ее открытия) до получения фрагментов органоидов (диаметром около 50 мкм) (рисунок 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциационная смесь должна содержать преимущественно органоидные фрагменты и только несколько одиночных клеток. Резкая диссоциация органоидов на отдельные клетки негативно влияет на повторный рост органоидов. - Добавьте 800 мкл Adv DMEM/F12 и центрифугу при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C. Удалите SN.
- Прохождение органоидов в соотношении от 1:2 до 1:4. Повторно суспендируйте гранулу в достаточном объеме Adv DMEM/F12 по мере необходимости для покрытия и добавьте ECM в соотношении 30:70 (30% клеточная суспензия и 70% ECM). Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
- Семена и культивирование органоидов, как описано выше на этапах 3.1.3-3.1.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: В среднем, 20 органоидов развиваются на лунку из 10 000 посеянных цельных AL-клеток (0,2%). Эти органоиды пассажа 0 могут быть разделены в соотношении 1:2, в результате чего органоиды >50 развиваются в лунке (проход 1). Затем органоиды могут быть разделены в соотношении 1:2 к 1:4 во время последующих проходов. Повторный рост органоидов замедляется после ~10 проходов (соответствующих 3 месяцам культивирования), конкретизируется в постепенно меньшем количестве и уменьшении органоидов.
4. Криоконсервация органоидов, полученных из AL, и оттаивание
- Криоконсервация органоидов
- Следуйте протоколу пропускания с шага 3.2.1 до шага 3.2.5.
- Повторно суспендировать органоидную гранулу (содержащую фрагменты и клетки) 1 мл криоконсервационной среды (табл. 3). Перенесите суспензию в криовиальную и поместите ее на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды (т.е. результирующие фрагменты и клетки) из четырех скважин 48-луночной пластины могут быть объединены в одну криовиальную. - Поместите криовиалы в морозильную емкость и перенесите их при -80 °C.
- Через 24 ч переложите образцы в криобокс и храните их в жидком азоте (-196 °C) для длительного хранения.
- Размораживание криоконсервированных органоидов
- Извлеките криовиаль из резервуара с жидким азотом и поместите его на лед. Немедленно приступайте к протоколу оттаивания.
- Разморозить раствор криоконсервированными фрагментами органоидов и одиночными клетками при 37 °C (водяная баня).
ПРИМЕЧАНИЕ: Не держите раствор более 2 мин при температуре 37 °C, чтобы избежать клеточной токсичности ДМСО. - Перенесите содержимое в пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл ледяного Adv DMEM/F12 с 30% фетальной бычьей сывороткой (FBS). Промыть криовиал 1 мл Adv DMEM/F12 с 30% FBS.
- Центрифуга при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C. Повторно суспендировать гранулу 1 мл ледяного Adv DMEM/F12 и перенести суспензию в микроцентрифужную трубку.
- Центрифуга при 190 х г в течение 10 мин при 4 °C. Повторно суспендируйте гранулы в достаточном объеме Adv DMEM/F12 по мере необходимости для нанесения покрытия и добавьте ECM в соотношении 30:70. Хорошо перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
- Семена и культивирование органоидов, как описано выше на этапах 3.1.3-3.1.5.
5. Валидация органоидов, полученных из AL
- Сбор и лизис органоидов для выделения РНК
- Соберите и центрифугируйте органоиды, как описано выше (этап 3.2.1).
- Удалите SN и добавьте 350 мкл буфера лизиса с 1% 2-меркапто-этанолом. Вихрь в течение 30 с и хранят при -80 °C или немедленно приступают к выделению РНК.
ВНИМАНИЕ: Остерегайтесь, что 2-меркапто-этанол является токсичным соединением. Вся работа должна выполняться в химическом вытяжном капюшоне в нитриловых перчатках, пылевой маске и защитных очках. 2-меркапто-этанол может нанести необратимый ущерб глазам и коже.
- Фиксация и встраивание органоидов для иммуногистохимии/флуоресцентного окрашивания
- Соберите и центрифугируйте органоиды, как описано выше (этап 3.2.1).
- Удалите SN, добавьте 1 мл 4% параформальдегида (PFA) и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) на орбитальном шейкере (100 об/мин).
ВНИМАНИЕ: PFA является известным канцерогеном для человека, который может вызвать необратимое повреждение роговицы. Все работы должны выполняться в химическом вытяжном шкафу. Нитриловые перчатки и защитные очки необходимо всегда носить. - Центрифугу при 200 х г в течение 5 мин и удаляют SN. Добавьте 1 мл PBS, инкубируйте 10 мин при RT на орбитальном шейкере (100 об/мин) и центрифугу при 90 x g в течение 3 мин при 4 °C. Повторите этап стирки дважды. Хранить в PBS при температуре 4 °C.
- Для обработки тканей и обезвоживания удалите SN и добавьте 150 мкл 2% агарозного геля (в PBS) к органоидной грануле с использованием предварительно расплавленного расширенного наконечника p200 (сделанного путем разрезания небольшого кусочка наконечника). Немедленно поднимите весь объем вверх и выбросьте в крышку трубки микроцентрифуги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно работать быстро, так как гель, содержащий органоиды, быстро затвердеет. - Дайте гелю прочно затвердеть в течение 30 минут и переместите гелевой диск на гистологическую кассету. Погружайте и храните в 50% EtOH, до обезвоживания в тканевом процессоре.
- Для встраивания парафина поместите гель-диск (с помощью щипцов) во встраиваемую форму и заполните теплым парафином (60 °C). Поместите формы при температуре 4 °C до тех пор, пока парафин не станет твердым (приблизительно 45 мин). Эти образцы могут либо храниться при температуре 4 °C, либо могут быть немедленно подвергнуты секционированию.
- Микротомы парафиновых блоков, содержащих органоиды толщиной 5 мкм, и собирают образцы на стеклянных слайдах. Добавьте одну каплю деионизированной воды под каждую секцию, чтобы обеспечить правильное растяжение секции, и поместите слайды на плоскую нагревательную пластину при 37 °C в течение ночи. Храните слайды с секциями при 4 °C или непосредственно продолжайте иммуногистохимическое или иммунофлуоресцентное окрашивание.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После выделения и диссоциации АЛ полученные одиночные клетки засевают в ECM и выращивают в PitOM (рисунок 1, таблица 1). На рисунке 3А показана клеточная культура и плотность при посеве (день 0). Некоторые мелкие обломки могут присутствовать (рисунок 3А, белые наконечники стрел), но исчезнут при прохождении. Через четырнадцать дней после посева органоиды, полученные из AL, полностью развиты (рисунок 3A). Органоиды демонстрируют кистозную морфологию с эпителиальным слоем, который заключает в себе просвет. На этом этапе органоиды достигают диаметра 500 мкм и должны быть пройдены. На фиг.3В показана AL-полученная органоидная культура после прохождения в указанное время после повторного посева диссоциированных органоидных фрагментов.
Иногда в органоидной культуре может появляться одна или несколько плотных структур (рисунок 3А, неблагоприятный). При пассаже плотные органоиды, как правило, берут верх, попадая в культуры только с плотными структурами после пары проходов (рисунок 3B, Неблагоприятный). Поэтому рекомендуется не приступать к колодцам, содержащим плотные органоиды (пассаж 0). В качестве альтернативы, плотные органоиды могут быть отброшены путем осаждения, которое оставляет кистозные органоиды для продолжения. Происхождение этих плотных органоидов в настоящее время неясно, но они показывают менее выраженную гипофизарную природу18. Если органоиды этого не делают или менее эффективно восстанавливаются после прохождения, процедуры диссоциации должны быть оптимизированы. В частности, нужно обращать внимание на то, чтобы не диссоциировать слишком резко; органоиды должны быть разделены на фрагменты, а не на отдельные клетки (рисунок 3B, день 0, вставка).
Иммунофлуоресцентный анализ окрашивания подтверждает эпителиальный характер органоидов, полученных из AL, так как они экспрессируют эпителиальные маркеры E-кадгерин (E-Cad) и цитокератин 8/18 (CK8/18; Фиг.3С), которые, кроме того, были описаны как маркеры стволовых клеток в гипофизе18. Стволовая природа органоидов дополнительно демонстрируется экспрессией SOX2 и TROP2, оба из которых также были идентифицированы как маркеры стволовых клеток гипофиза (рисунок 3C)14,18. LHX3, транскрипционный фактор, специфически выраженный в (рано развивающемся) гипофизе, подтверждает фенотип гипофиза органоидов (рисунок 3C). Некоторые из органоидных клеток находятся в пролиферативном состоянии, экспрессируя маркер пролиферации Ki67 (рисунок 3C).
Дальнейшее исследование и валидация фенотипа гипофиза (стволовости) органоидов, полученных из AL, проводится с помощью обратной транскрипции-количественной ПЦР (RT-qPCR). Высокая экспрессия стволовых маркеров Sox2, Cdh1 (кодирующая E-Cad), Krt8, Krt18 и Trop2 присутствует в органоидах, явно выше, чем в первичном AL, что указывает на то, что органоиды обогащают стволовые клетки и, таким образом, представляют собой компартмент стволовых клеток AL, как описано ранее (рисунок 3D)18. Примечательно, что факторы транскрипции развития Pitx1 и Pitx2 остаются выраженными после развития в нескольких типах гормональных клеток в AL и, следовательно, их высокая экспрессия в AL. Культуры надежно сохраняют свой фенотип стволовости, о чем свидетельствует устойчивая (высокая) экспрессия этих маркеров после нескольких проходов (рисунок 3D).
Рисунок 1: Обзор создания, поддержания, характеристики и потенциала применения органоидов из здорового и больного гипофиза. AL, передняя доля; IL, промежуточная доля; ПЛ, задняя доля; МЗ, маргинальная зона; PitOM, органоидная среда гипофиза (создается с помощью BioRender.com). Ниши стволовых клеток в AL обозначены фиолетовым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Выделение гипофиза у взрослой усыпленной мыши. Репрезентативные изображения, последовательно сделанные после (А) обезглавливания, (В) удаления кожи головы (переносица окружена), (В) открытия черепа и (D) удаления мозга, обнажающего гипофиз (окруженный). Стрелка указывает на PL, который отбрасывается (вместе с соответствующим IL), оставляя AL для изоляции и диссоциации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Установление и валидация органоидов, полученных из AL. (A) Посев клеток AL и развитие органоидов в PitOM в указанные дни (пассаж 0). Верхний ряд показывает благоприятный рост органоидов, развиваются только кистозные структуры. Нижний ряд показывает неблагоприятный рост с появлением большой плотной структуры (коробчатой). Белые наконечники стрелок указывают на мусор, черные наконечники стрел обозначают одиночные ячейки (увеличенные во вставке). (B) Органоидные фрагменты (увеличенные во вставке), посеянные при прохождении (день 0) и росте органоидов, как это наблюдалось через 7 дней. Верхний ряд показывает благоприятный органоидный рост, при этом растут только кистозные структуры. Нижний ряд показывает неблагоприятный отрастание с плотными органоидами, захватывающими культуру. (C) Иммунофлуоресцентное окрашивание E-Cad, SOX2, TROP2 (все красные), CK8/18, LHX3 и Ki67 (все зеленые) в органоидах, полученных из AL. Ядра помечены маркировкой Hoechst33342 (синий). Наконечники стрелок обозначают ячейки Ki67+. Указаны шкалы. (D) Анализ экспрессии генов маркеров стволовости (Sox2, Cdh1, Krt8, Krt18, Trop2) и факторов транскрипции развития (Pitx1, Pitx2) в первичных органоидах, полученных из AL и AL (Пассаж 0 означает 14 дней после посева клеток), определяемых с помощью RT-qPCR (среднее ± SEM). Точки данных представляют собой биологические реплики. Показаны значения порога дельта-цикла (dCT), рассчитанные по формуле: CT(ген интереса) - CT(родовой ген Actb). Чем позитивнее значение dCT (которое представлено на оси Y ниже нулевой оси X), тем ниже уровень экспрессии интересующего гена. Чем ниже (или более отрицательно) значение dCT, тем выше уровень выражения 14,18,21,22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Органоидная среда гипофиза (PitOM) | |
| Компонент | Концентрация |
| Усовершенствованный DMEM/F12 | |
| Хепес | 1% |
| Пенициллин-Стрептомицин | 1% |
| Глутамакс | 1% |
| Добавка B-27 (50X), минус витамин А | в 1 раз |
| L-глютамин (200 мМ) | 2 мМ |
| Рекомбинантный человеческий FGF базовый/FGF2/bFGF (157 aa) белок | 20 нг/мл |
| Рекомбинантный человеческий ИФР-1 | 100 нг/мл |
| Дополнение N-2 (100X) | в 1 раз |
| N-ацетил-цистеин | 1.25 мМ |
| Рекомбинантный человек/мыши FGF-8b | 200 нг/мл |
| Рекомбинантный человеческий FGF-10 | 100 нг/мл |
| A83-01 (ингибитор активин-рецептор-подобной киназы 4/5/7) | 0.50 мкМ |
| Рекомбинантная мышь Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | 100 нг/мл |
| Рекомбинантный человеческий белок EGF, CF | 50 нг/мл |
| SB202190 (p38 ингибитор протеинкиназы, активированный митогеном) | 10 мкМ |
| Рекомбинантный человеческий ноггин | 100 нг/мл |
| Холерный токсин из холерного вибриона | 100 нг/мл |
| Рекомбинантный человеческий R-спондин-1 | 200 нг/мл |
| Рекомбинантный человеческий IL-6 | 20 нг/мл |
Таблица 1. Состав ПитОМ. PitOM фильтруют через сетчатый фильтр 0,22 мкм и хранят при 4 °C в течение максимум 2 недель.
| Медиум А | |
| Компонент | Количество |
| DMEM, порошок, высокий уровень глюкозы | 13,38 г |
| ХЕПЕС | 5,96 г |
| Пируват натрия (C3H3NaO3) | 0,11 г |
| Пенициллин G натриевая соль | 35,00 мг |
| Сульфатная соль стрептомицина | 50,00 мг |
| Хлорид натрия (NaCl) | 0,50 г |
| Гидрокарбонат натрия (NaHCO3) | 1,00 г |
| Альбумин крупного рогатого скота (сорт клеточной культуры) | 3.00 г |
| Стерильная вода | 1.00 л |
| Средний C | |
| Компонент | Количество |
| Хлорид натрия (NaCl) | 7,50 г |
| Хлорид калия (KCl) | 0,40 г |
| Дигидрофосфат натрия 1-гидрат | 0,14 г |
| D-глюкоза | 1,00 г |
| ХЕПЕС | 4,76 г |
| Сульфатная соль стрептомицина | 50,00 мг |
| Пенициллин G натриевая соль | 35,00 мг |
| Фенол красный | 10,00 мг |
| Альбумин крупного рогатого скота (сорт клеточной культуры) | 3.00 г |
| Гидрокарбонат натрия (NaHCO3) | 1,00 г |
| Стерильная вода | 1.00 л |
| Средний B | |
| Компонент | Количество |
| Титриплекс III (Дигидрат динатриевой соли эдетата) | 0,74 г |
| Средний C | 100 мл |
Таблица 2. Состав среды А, В и С. Все материалы фильтруются через сетчатый фильтр 0,22 мкм и хранятся при 4 °C в течение максимум 4 месяцев. рН среды А и С должен быть скорректирован до 7,3.
| Криоконсервационная среда | |
| Компонент | Концентрация |
| Усовершенствованный DMEM/F12 | 60% |
| ФБС | 30% |
| ДМСО | 10% |
Таблица 3. Состав криоконсервационной среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Органоиды, полученные из AL, как описано здесь, представляют собой мощную исследовательскую модель для изучения стволовых клеток гипофиза in vitro. В настоящее время этот органоидный подход является единственным доступным инструментом для надежного и надежного выращивания и расширения первичных стволовых клеток гипофиза. Ранее сообщалось о модели органоидов гипофиза, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ESC) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), которая точно повторяет эмбриональный органогенез гипофиза23; однако, хотя этот протокол весьма полезен для изучения развития гипофиза или моделирования заболевания гипофиза 23,24,25, представленный протокол, начиная с ESC/iPSC, является весьма трудоемким по сравнению с протоколом, описанным здесь, и полученные органоиды также не могут быть расширены.
Успешное культивирование органоидов стволовых клеток гипофиза зависит от некоторых критических шагов в протоколе. Важно наметить соответствующее количество клеток при начальном посеве клеток. Очень большое количество приведет к переполненным культурам, что ухудшит жизнеспособность органоидов и препятствует полному расширению органоидов, тогда как очень низкое количество клеток приведет к ограниченному органоидному образованию. Кроме того, важно не нарушать целостность купола ECM, попав в культуру. Добавление и удаление среды следует делать очень осторожно, не прикасаясь к капле геля. Кроме того, предварительное прогревание питательной среды снижает риск деполимеризации геля. Наконец, правильная передача органоидов (т. е. диссоциация на фрагменты, а не на отдельные клетки) имеет решающее значение для эффективного расширения культур.
Эти органоиды стволовых клеток гипофиза могут быть использованы для ответа на вопросы, касающиеся фенотипа, биологии и функции стволовых клеток. Они уже доказали свою ценность в раскрытии новых особенностей стволовых клеток, а также маркеров активации стволовых клеток, связанных с повреждением гипофиза, и в качестве инструмента считывания активности стволовых клеток (рисунок 1)14,18. Текущие усилия включают их получение из больных гипофизом, таких как гипопитуитаризм и питнеты (рисунок 1). В конце концов, органоиды также могут быть вовлечены в платформу для скрининга лекарств, как успешно установлено для других заболеваний26,27. Поэтому потребуется дальнейшее масштабирование органоидных культур для достижения высокопроизводительного анализа. Уже было замечено, что органоиды, полученные из AL, могут быть эффективно выращены в 96-луночном формате, что также приводит к более однородным культурам.
Было замечено, что после ~ 10 проходов (соответствующих 3 месяцам культивирования) эффективность роста органоидов постепенно снижалась с восстановлением органоидов в меньших количествах и меньших размерах. Это снижение роста может быть присуще внутренней природе стволовых клеток гипофиза, которые, возможно, не нуждаются в многократном самообновлении в железе in vivo, которая только медленно переворачивается, таким образом, истощаясь после пары раундов деления16,28. Хотя это возможное снижение роста можно рассматривать как ограничение, модель очень полезна, поскольку расширение органоидов во время предыдущих отрывков более чем достаточно для обширного последующего анализа.
Другой аспект, который можно рассматривать как ограничение, заключается в том, что органоиды стволовых клеток гипофиза не проявляют заметной дифференцировочной способности по отношению к эндокринным типам клеток AL, даже после ксенотрансплантации под почечной капсулой иммунодефицитных мышей (что привело к ограниченному количеству клеток GH+ и PRL+, как подробно описано в ссылке18). Либо правильные условия in vitro для приведения стволовых клеток к дифференцировке еще не идентифицированы, либо основная роль стволовых клеток (особенно во взрослой железе) не заключается в генерации новых эндокринных клеток (поскольку, вероятно, они не нужны в ленивой железе, а только в возмущенных или сложных условиях)9,10,14, 18. Вместо этого основная функция может быть расположена в других биологических аспектах (например, паракринная передача сигналов гормональному предшественнику/предшественнику или зрелым клеткам в основных, но, вероятно, более активных (развитие, восстановление, заболевание) условиях)13,16. Действительно, хотя было показано, что стволовые клетки гипофиза обладают мультипотентной дифференцирующей способностью, особенно в эмбриональном и неонатальном периоде, вполне возможно, что стволовые клетки во взрослой железе не поддерживают (должны) поддерживать эту способность, учитывая очень низкий оборот взрослойжелезы 16,28. Возможно, что взрослые стволовые клетки гипофиза действуют скорее как паракринный сигнальный узел, участвующий в стимуляции или регуляции окружающих предшественников/предшественников/эндокринных клеток13,16. Следовательно, надежная дифференцировка органоидов стволовых клеток гипофиза, кульминацией которой является секреция гормонов, может быть ошибочным ожиданием, которое никогда не будет достигнуто.
Взятый вместе, протокол, представленный здесь, предлагает быстро применимый и надежный инструмент для надежного расширения первичных стволовых клеток гипофиза в 3D-условиях in vitro. Протокол дает начало органоидам, которые точно захватывают фенотип стволовых клеток гипофиза. Система уже успешно применяется для изучения биологии и активации стволовых клеток гипофиза14,18, и результаты хорошо переводятся в ситуацию in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами Исследовательского фонда KU Leuven и Фонда научных исследований (FWO) - Фландрия. E.L. (11A3320N) и C.N. (1S14218N) поддерживаются докторской стипендией от FWO / FWO-SB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
References
- Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1 (2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
- Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
- Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
- Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
- Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).
- Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E.
- Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
- Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
- Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
- Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
- Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142 (2021).
- Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).
- Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
- Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).
- Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
- Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
- Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
- Trompeter, H. -I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111 (2013).
- Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
- Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
- Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).
