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O campo da biologia estrutural tornou-se um poderoso sistema de compreensão da biologia por meio dos detalhes atômicos das estruturas biomoleculares, enriquecendo nossa compreensão das vias bioquímicas e da base molecular das doenças e oferecendo uma ferramenta indispensável para a pesquisa translacional.
Ao longo dos anos, a biologia estrutural foi muito além de fornecer estruturas estáticas, para relatar também as interações moleculares, tanto em solução quanto em células, examinando escalas de tempo e dinâmicas. Informações podem ser obtidas para explicar processos em diferentes escalas de tamanho, ou seja, de átomos e moléculas individuais a partículas e células inteiras de vírus. Diferentes tecnologias fornecem um conjunto sinérgico de abordagens experimentais, incluindo métodos de espalhamento baseados em raios-X, nêutrons ou elétrons, por exemplo, cristalografia de raios-X (MX) ou espalhamento de raios-X de pequeno ângulo (SAXS); ressonância magnética nuclear (RMN) de estado sólido e solução; e reconstrução de partícula única por microscopia crioeletrônica (crio-EM). Métodos como tomografia crio-EM, tomografia de raios-X crio-mole e RMN na célula aumentam esse arsenal de abordagens para estudar sistemas macromoleculares, especialmente em conexão com outras ferramentas de imagem. Juntamente com métodos biofísicos adicionais que fornecem informações complementares sobre afinidades e escalas de tempo de interação molecular, a biologia estrutural integrativa hoje oferece um pacote formidável para entender a vida e desenvolver medicamentos, produtos biológicos (anticorpos, nanocorpos, vacinas), biomateriais e outros agentes biológicos, como enzimas que podem ser usadas para degradar o plástico e ajudar o meio ambiente.
Desde o início, a Comissão Europeia (CE) reconheceu os benefícios que a pesquisa em biologia estrutural tem para a sociedade e, desde a década de 1980, a Europa investiu fortemente na abertura gratuita de equipamentos caros de biologia estrutural para a comunidade científica em geral. Essa democratização do acesso a instalações multimilionárias foi uma força motriz e uma pedra angular para o desenvolvimento internacional da área de biologia estrutural. Isso colocou a Europa na vanguarda do campo, permitindo assim um setor industrial forte e contribuindo para as economias locais.
A CE preza uma longa e impressionante tradição de acesso e treinamento de pesquisadores externos em tecnologias de biologia estrutural. Após o sucesso do programa iNEXT (Infraestrutura para RMN, EM e Raios-X para pesquisa translacional) que permitiu o acesso gratuito da biologia estrutural a instalações de ponta e a todos os pesquisadores europeus até o final de 2019, o projeto Horizon2020 iNEXT-Discovery começou em fevereiro de 2020 para mais um período de quatro anos de acesso totalmente financiado a infraestruturas de biologia estrutural. Paralelamente, o Instruct-ERIC é um marco do Fórum Estratégico Europeu sobre Infraestruturas de Investigação, constituindo um reduto sustentável em biologia estrutural para as comunidades científicas europeias e internacionais. Juntos, eles aspiram envolver cientistas da vida e outros na pesquisa de biologia estrutural e, para isso, oferecem acesso a alguns dos melhores conhecimentos, tecnologias e instalações de biologia estrutural em todo o mundo, para pesquisadores da academia e da indústria. Juntamente com parceiros adicionais, eles também organizam workshops e treinamentos práticos.
Por causa da pandemia de Covid19, viajar para as instalações de pesquisa iNEXT-Discovery e Instruct-ERIC foi amplamente prejudicado, proibindo essencialmente oportunidades de treinamento prático. Para compensar parcialmente isso, o iNEXT-Discovery e o Instruct-ERIC organizaram uma série de webinars (https://inext-discovery.eu/events/what-can-inext-discovery-do-for-us, https://instruct-eric.eu/content/instructeric-webinar-series-structure-meets-function), bem como esta edição especial de Métodos do Journal of Visualized Experiments. Aqui, você encontrará descrições detalhadas não apenas para vários de nossos procedimentos de acesso convencionais, mas também para rotinas especializadas que estão em desenvolvimento no campo da biologia estrutural integrativa. Embora nossos métodos sejam descritos nesta edição em detalhes, alguns exigem experiência e equipamentos difíceis de estabelecer localmente. As instalações Instruct-ERIC e iNEXT-Discovery estão disponíveis para fornecer estes métodos, incluindo a produção das biomoléculas necessárias para estudos estruturais, com a ajuda e supervisão de pessoal local altamente qualificado.
Métodos aprimorados para determinar estruturas macromoleculares
Na última década, o cryo-EM se tornou uma tecnologia altamente popular para determinar estruturas complexas macromoleculares. A equipe da Universidade de Leeds (Reino Unido) fornece uma visão geral de todas as etapas envolvidas na análise EM de partícula única, com foco em variáveis que podem ser otimizadas durante o fluxo de trabalho e solução de problemas comuns1. Com a operação do microscópio on-line por usuários externos se tornando padrão, são necessários protocolos para operação remota e imagens eficientes. Com a análise de partícula única, amostras vitrificadas estão sendo fotografadas para produzir filmes mostrando partículas em orientações aleatórias. Um fluxo de trabalho de processamento de imagem identifica os parâmetros para reconstruir a amostra em estudo. O software Scipion da CSIC (ES) fornece todas as ferramentas para criar esse fluxo de trabalho, permitindo também a rastreabilidade direta dos resultados2.
A coleta de dados de difração de raios X em amostras cristalinas muito pequenas oferece grandes oportunidades de pesquisa, bem como desafios técnicos. A equipe do Diamond (Reino Unido) apresenta o uso de ferramentas crio-EM para preparar centenas de microcristais em uma única grade com o mínimo de líquido circundante em um suporte de baixo ruído, antes de coletar dados em um ambiente de linha de luz dedicado que inclui um vácuo no caminho de raios-X antes e depois da amostra3. A coleta de dados seriais de raios-X em síncrotrons também é fundamental para o estudo de outros sistemas cristalinos difíceis. Em outra contribuição, Diamond mostra instruções passo a passo, figuras e vídeos para coleta de dados usando uma variedade de sistemas de entrega de cristais, por meio de uma série de exemplos4.
Biologia estrutural integrativa moderna na descoberta de medicamentos
A cristalografia de raios-X está bem estabelecida para a descoberta de medicamentos baseada em fragmentos e já é comumente usada para identificar ocorrências que podem ser desenvolvidas suavemente em candidatos principais. As equipes de Diamond5, Helmholtz-Zentrum Berlin (DE) e MAX IV (SE)6, e a unidade EMBL Grenoble (FR)7 descrevem seus mais recentes desenvolvimentos na automação de fluxos de trabalho para cristalização eficiente de alvos, imersão de fragmentos, montagem de cristais, triagem de fragmentos orientada por cristalografia e deposição de estrutura. Seus pipelines são bastante automatizados e estão sendo usados por pesquisadores externos em todo o mundo. Eles já foram aplicados a mais de 100 alvos (muitas vezes remotamente) para identificar acertos para projetos adicionais de compostos e desenvolvimento de leads assistidos por estrutura.
A RMN também é comumente usada para triagem de fragmentos em campanhas de desenvolvimento de medicamentos, visando proteínas ou polinucleotídeos, solúveis ou ligados à membrana. A Universidade Goethe em Frankfurt (DE) apresenta pipelines de triagem de RMN otimizados, reduzindo a intervenção manual durante a experimentação e análises8. Seus trocadores de amostras lidam com centenas de amostras de RMN em uma única execução durante vários dias de experimentação ininterrupta e análise automatizada.
Além disso, os métodos biofísicos são complementares ao raio-X e à RMN. A equipe do Instituto do Câncer da Holanda (NL) apresenta um fluxo de trabalho usando calorimetria de varredura nanodiferencial para ensaios de deslocamento térmico para medir mudanças na temperatura de fusão alvo após a adição de fragmentos9. Os pré-requisitos relativos à qualidade e concentração da proteína são seguidos por um protocolo analítico para planejamento experimental, coleta de dados e análise.
Rumo à biologia estrutural celular
A tomografia crioeletrônica é frequentemente o método de escolha para examinar complexos macromoleculares nas células. Imagens de amostras vitrificadas são adquiridas em diferentes ângulos de inclinação e um tomograma 3D reconstruído, do qual subvolumes são extraídos para dar maior resolução pela média do subtomograma. Como os elétrons interagem fortemente com a matéria, esses estudos requerem amostras com menos de 200 nm de espessura. A equipe do CEITEC (CZ) apresenta um protocolo10 para o preparo de lamelas celulares após o congelamento por imersão. Embora a automação em crio-ET tenha feito um progresso impressionante, horas de coleta de dados são necessárias antes que a aquisição da série de inclinação ocorra, e os alvos normalmente ainda são identificados pela inspeção visual da grade. Um protocolo de automação foi preparado pelo EMBL Heidelberg (DE) para mapear grades e quadrados de grade, selecionar alvos e configurar a aquisição de séries de inclinação11.
Os síncrotrons ALBA (ES) e Diamond discutem juntos as armadilhas e vantagens de uma alternativa à tomografia crio-EM que permite examinar células intactas, a tomografia de raios-X crio-moles (cryo-SXT)12. A adaptação de técnicas de super-resolução a temperaturas criogênicas permite imagens correlativas com crio-ET e crio-SXT. Além disso, a microscopia de iluminação crioestruturada de alto rendimento (cryo-SIM) dobra a resolução da fluorescência convencional, levando à localização específica de moléculas ou estruturas em amostras espessas. Isso pode ser correlacionado com o crio-SXT para identificar características específicas dentro do contexto celular13.
A equipe da Universidade de Utrecht (Holanda) relata a preparação de amostras e experimentos de RMN de estado sólido de alta sensibilidade que podem ser usados para estudar sistemas fisiológicos desafiadores, incluindo membranas naturais e sistemas proteína-lipídio-glicano14. Além disso, a RMN em solução na célula está evoluindo rapidamente para elucidar processos funcionais. A equipe do CERM / CIRMMP (IT) descreve como montar e operar biorreatores que permitem a reposição de nutrientes e oxigênio para células vivas dentro da sonda de RMN no núcleo de um ímã de alto campo15. Isso permite medições estendidas e experimentos resolvidos no tempo, por exemplo, para monitorar interações proteína-ligante intracelular.
Observações finais
Esta edição do JoVE é totalmente dedicada aos recentes desenvolvimentos e aplicações da biologia estrutural nas infraestruturas de pesquisa europeias. Juntos, o iNEXT-Discovery e o Instruct-ERIC permitem que especialistas em biologia estrutural, mas cada vez mais cientistas da vida não especialistas e outros pesquisadores, persigam seus objetivos de pesquisa, oferecendo serviços de última geração.