Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ביצוע מיוגרפיה של עכבה חשמלית In Vivo ו - Ex Vivo במכרסמים

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63513
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Department of Neurology, Harvard Medical School - Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Accelerating NeuroVentures, 3Charley's Fund

Summary

מאמר זה מפרט כיצד לבצע in vivo (באמצעות מערכי אלקטרודות משטח ומחט) ו- ex vivo (באמצעות תא דיאלקטרי) מיופיוגרפיה של עכבה חשמלית על שריר גסטרוקנמיוס המכרסמים. הוא ידגים את הטכניקה הן בעכברים והן בחולדות ויפרט את השינויים הזמינים, (כלומר, בעלי חיים שמנים, גורים).

Abstract

מיוגרפיה של עכבה חשמלית (EIM) היא טכניקה נוחה שניתן להשתמש בה במחקרים פרה-קליניים וקליניים להערכת בריאות ומחלות של רקמות שריר. EIM מתקבל על ידי הפעלת זרם חשמלי בעוצמה נמוכה, ממוקד כיוון, על שריר בעל עניין על פני טווח של תדרים (כלומר, מ 1 kHz עד 10 MHz) ורישום המתחים המתקבלים. מאלה מתקבלים מספר רכיבי עכבה סטנדרטיים, כולל התגובה, ההתנגדות והפאזה. בעת ביצוע מדידות ex vivo על שריר נכרת, ניתן לחשב גם את התכונות החשמליות הפסיביות הטבועות ברקמה, כלומר המוליכות וההיתר היחסי. EIM נמצא בשימוש נרחב בבעלי חיים ובבני אדם כדי לאבחן ולעקוב אחר שינויים בשרירים במגוון מחלות, ביחס לאטרופיה פשוטה, או כמדד להתערבות טיפולית. מבחינה קלינית, EIM מציע את הפוטנציאל לעקוב אחר התקדמות המחלה לאורך זמן ולהעריך את ההשפעה של התערבויות טיפוליות, ובכך להציע את ההזדמנות לקצר את משך הניסוי הקליני ולהפחית את דרישות גודל הדגימה. מכיוון שניתן לבצע אותו באופן לא פולשני או זעיר פולשני במודלים של בעלי חיים חיים כמו גם בבני אדם, EIM מציע את הפוטנציאל לשמש ככלי תרגום חדשני המאפשר פיתוח פרה-קליני וקליני כאחד. מאמר זה מספק הוראות שלב אחר שלב כיצד לבצע מדידות in vivo ו- ex vivo EIM בעכברים ובחולדות, כולל גישות להתאמת הטכניקות לתנאים ספציפיים, כגון לשימוש בגורים או בבעלי חיים שמנים.

Introduction

מיוגרפיה של עכבה חשמלית (EIM) מספקת שיטה רבת עוצמה להערכת מצב השרירים, ועשויה לאפשר אבחון של הפרעות נוירומוסקולריות, מעקב אחר התקדמות המחלה והערכת התגובה לטיפול 1,2,3. ניתן ליישם אותו באופן אנלוגי למודלים של מחלות בעלי חיים ולבני אדם, מה שמאפשר תרגום חלק יחסית ממחקרים פרה-קליניים למחקרים קליניים. מדידות EIM מתקבלות בקלות באמצעות ארבע אלקטרודות הממוקמות באופן ליניארי, כאשר שתי החיצוניות מפעילות זרם חשמלי חלש ללא כאבים בטווח תדרים (בדרך כלל בין 1 קילוהרץ לכ-2 מגה-הרץ), ושתי הפנימיות רושמות את המתחים המתקבלים1. ממתחים אלה ניתן לקבל את מאפייני העכבה של הרקמה, כולל ההתנגדות (R), מדד של כמה קשה לזרם לעבור דרך הרקמה, והתגובה (X) או "הטעינה" של הרקמה, מדד הקשור ליכולת של הרקמה לאחסן מטען (קיבוליות). מהתגובה וההתנגדות, זווית הפאזה (θ) מחושבת באמצעות המשוואה הבאה: Equation 1, המספקת מידה אחת של עכבה מסכמת. מדידות כאלה ניתן להשיג באמצעות כל מכשיר bioimpedance רב תדרים. מכיוון שמיופייברים הם למעשה גלילים ארוכים, רקמת השריר היא גם אניזוטרופית מאוד, עם זרם זורם בקלות רבה יותר לאורך סיבים מאשר על פניהם 4,5. לפיכך, EIM מבוצע לעתים קרובות בשני כיוונים: כאשר המערך ממוקם לאורך הסיבים כך שהזרם פועל במקביל אליהם, ולרוחב השריר כך שהזרם זורם בניצב אליהם. בנוסף, מדידות in ex vivo, שבהן נפח ידוע של רקמה נמדד בתא מדידת עכבה, ניתן לגזור את התכונות החשמליות הטבועות בשריר (כלומר המוליכות וההיתר היחסי),6.

המונח "הפרעות נוירומוסקולריות" מגדיר מגוון רחב של מחלות ראשוניות ומשניות המובילות לשינוי מבניים בשרירים ולתפקוד לקוי. זה כולל טרשת אמיוטרופית צידית וצורות שונות של ניוון שרירים, כמו גם שינויים פשוטים יותר הקשורים להזדקנות (למשל, סרקופניה), ניוון דיס-שימוש (למשל, עקב משענת מיטה ממושכת או מיקרו-כבידה) או אפילו פציעה7. בעוד שהסיבות הן בשפע ויכולות לנבוע מהנוירון המוטורי, העצבים, הצמתים העצביים-שריריים או השריר עצמו, ניתן להשתמש ב- EIM כדי לזהות שינויים מוקדמים בשריר עקב רבים מהתהליכים הללו ולעקוב אחר התקדמות או תגובה לטיפול. לדוגמה, בחולים עם ניוון שרירים דושן (DMD), הוכח כי EIM מזהה התקדמות המחלה ותגובתה לקורטיקוסטרואידים8. עבודות אחרונות הראו גם ש-EIM רגיש למצבי דיס-שימוש משתנים, כולל כבידה חלקית9, כפי שחווים על הירח או על מאדים, וההשפעות של הזדקנות10,11. לבסוף, על ידי החלת אלגוריתמים של חיזוי ולמידת מכונה על מערך הנתונים המתקבל עם כל מדידה (נתונים בתדירות גבוהה ותלויי כיוון), ניתן להסיק היבטים היסטולוגיים של הרקמה, כולל גודל מיופייבר 12,13, שינויים דלקתיים ובצקת14, ותכולת רקמת חיבור ושומן 15,16.

מספר שיטות לא פולשניות אחרות או פולשניות מינימליות משמשות גם להערכת בריאות השרירים בבני אדם ובבעלי חיים, כולל אלקטרומיוגרפיה של מחט17 וטכנולוגיות הדמיה כגון הדמיית תהודה מגנטית, טומוגרפיה ממוחשבת ואולטרסאונד18,19. עם זאת, EIM מדגים יתרונות מובהקים בהשוואה לטכנולוגיות אלה. לדוגמה, אלקטרומיוגרפיה מתעדת רק את התכונות החשמליות הפעילות של קרומי המיופייבר ולא את התכונות הפסיביות, ולכן אינה יכולה לספק הערכה אמיתית של הרכב או מבנה השרירים. במובן מסוים, שיטות הדמיה קשורות קשר הדוק יותר EIM, שכן גם הם מספקים מידע על המבנה וההרכב של רקמות. אבל במובן מסוים, הם מספקים יותר מדי נתונים, ודורשים סגמנטציה מפורטת של תמונות וניתוח מומחים ולא רק מספקים פלט כמותי. יתר על כן, בהתחשב במורכבות שלהם, טכניקות הדמיה מושפעות מאוד גם מהפרטים של החומרה והתוכנה שבשימוש, באופן אידיאלי דורשות שימוש במערכות זהות כך שניתן להשוות בין מערכי נתונים. לעומת זאת, העובדה ש- EIM הוא הרבה יותר פשוט פירושה שהוא פחות מושפע מבעיות טכניות אלה ואינו דורש כל צורה של עיבוד תמונה או ניתוח מומחה.

הפרוטוקול הבא מדגים כיצד לבצע in vivo EIM בחולדות ובעכברים, תוך שימוש הן בטכניקות לא פולשניות (מערך פני השטח) והן בטכניקות זעיר פולשניות (מערך מחטים תת-עורי), כמו גם ex vivo EIM על שריר שזה עתה נכרת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז הרפואי בית ישראל תחת מספרי פרוטוקול (031-2019; 025-2019). יש ללבוש ציוד PPE מתאים לטיפול בבעלי חיים ולציית להנחיות IACUC לכל עבודה עם בעלי חיים.

1. משטח In vivo EIM

  1. הניחו את בעל החיים בקופסת הרדמה כדי לגרום להרדמה.
    הערה: עבור חולדות נעשה שימוש ב-1.5%-3.5% איזופלוראן ו-2 O 2 L·min-1, ובעכברים נעשה שימוש ב-2% איזופלוראן וב-1 O2 L·min-1.
  2. לאחר הרדמה מלאה, כפי שצוין על ידי היעדר תגובה לאחר צביטה של כף הרגל של החיה, להניח את העכבר על הספסל במצב נוטה ולהשתמש חרוט האף כדי לשמור על הרדמה באמצעות 1.5% isoflurane וזרימת חמצן של 1 L·min-1.
  3. הניחו את רגל החיה לניתוח בזווית של 45° עם מפרק הירך (הברך מורחבת) והדקו את כף הרגל באמצעות סרט רפואי.
  4. השתמש קוצץ שיער כדי לקצץ את הפרווה מעל כיסוי שריר gastrocnemius.
  5. החל שכבה עבה של קרם דפילציה על העור של החיה ולתת לו לשבת במשך 1 דקות. לאחר מכן, השתמש גזה רוויה מלוחים כדי להסיר את סוכן depilatory. חזור על תהליך זה עד שלוש פעמים עד שכל הפרווה מעל שריר gastrocnemius מוסר.
    הערה: יש להניח כרית גזה ספוגה במי מלח על העור כאשר לא נרכשות מדידות למניעת התייבשות העור.
  6. חבר את מערך פני השטח (איור 1) להתקן EIM ותן לאלקטרודות לנוח על חתיכת גזה ספוגה בתמיסת מלח.
  7. הניחו את מערך פני השטח ישירות על העור מעל שריר הגסטרוקנמיוס, בכיוון אורך לסיבי השריר.
  8. לאחר בדיקת מגע מתאים, המסומן על ידי כל הפסים המופיעים בירוק בתוכנה המציגים את יציבות ההתנגדות, התגובה וערכי הפאזה של 50 קילוהרץ, רכשו את מדידות ה- EIM.
    הערה: יש לבדוק עקומות בזמן אמת כדי להבטיח רכישת נתונים נאותה.
  9. סובבו את מערך פני השטח ב-90° והניחו אותו מחדש על העור מעל הגסטרוקנמיוס כדי לקבל את המדידות הרוחביות (בדקו אם קיימים פסים ירוקים המעידים על יציבות).
  10. חזור על שלבים 1.7, 1.8 ו- 1.9 כדי לקבל בסך הכל ארבע מדידות לכל שריר: שתיים אורכיות ושתיים רוחביות.
    הערה: אין להשתמש בחומר דפילציה יותר מפעם אחת (כלומר, עד שלושה מריחות באותו מקרה) כל שבועיים כדי למנוע גירוי ופציעה מוגזמים בעור. חשוב לבצע את המדידות תוך כ-5-10 דקות מהסרת קרם הדפילציה, שכן התפתחות בצקת מקומית בעור המושרה על ידי הגורם הדפילטורי עלולה להשפיע על נתוני העכבה שנאספו. התאוששות בעלי חיים היא מיד לאחר הפסקת הרדמה isoflurane ואת ההליך אינו דורש טיפול משכך כאבים.

2. מערך מחטים In vivo EIM

  1. הרדימו את החיה והכינו את הרגל באותו הליך כמתואר בשלבים 1.1-1.4. עם זאת, אין צורך להשתמש בסוכן depilatory בעת ביצוע in vivo EIM באמצעות מערך מחטים.
  2. חבר את מערך המחטים (איור 2A-F) להתקן EIM ותן לו לנוח בסירת שקילה המכילה תמיסת מלח. בדוק קישוריות ויציבות אות (מסומנים בפסים ירוקים).
  3. לחטא את העור והמחטים עם אלכוהול. מניחים את מערך המחטים בתנוחה אורכית בהשוואה למיופייבר ולוחצים אותו בחוזקה לתוך העור עד שכל המחטים חודרות לעור ולשריר שמתחתיו עד למגן הפלסטיק במערך. השגת נתונים.
  4. הסירו בעדינות את המערך והכניסו אותו מחדש דרך העור ולתוך השריר בזווית של 90° ביחס למדידה הראשונה, בכיוון הרוחבי. השגת נתונים.
    הערה: בעת שימוש במערכי מחטים, יש לבצע מדידות פעם אחת בלבד לכל כיוון כדי להפחית את ההשפעה של אלקטרודות המחט על העור ורקמת השריר. אם מתרחש דימום, נגבו בעדינות את הדם לפני ביצוע המדידה השנייה. התאוששות בעלי חיים היא מיד לאחר הפסקת הרדמה isoflurane ואת ההליך אינו דורש טיפול משכך כאבים.

3. Ex vivo EIM

  1. הכן את התא הדיאלקטרי ex vivo (איור 2G,H), הוסף תמיסת מלח לתא וחבר את התא להתקן EIM כדי לקבל את ערכי הייחוס.
    הערה: ערכי הפאזה והתגובה של מי מלח צריכים להישאר קבועים באפס או קרוב אליו, וערכי ההתנגדות של מי מלח צריכים להישאר קבועים בערך 100 ± 25 Ω בטווח התדרים שבין 1 קילוהרץ ל-1 מגה-הרץ.
  2. להרדים את בעל החיים בהתאם להנחיות IACUC המתאימות.
  3. בעזרת זוג מספריים, חותכים את העור ליד גיד אכילס. באמצעות פינצטה, משכו את העור בתנועה כלפי מעלה כדי לחשוף את השרירים והחיתולית שמתחת. נתחו בעדינות את שרירי הזרוע פמוריס מעל שריר הגסטרוקנמיוס וחתכו את העצב הסיאטי.
  4. חותכים את גיד אכילס כדי לשחרר את הקצה הדיסטלי של שרירי הגסטרוקנמיוס והסולאוס ומושכים בעדינות את הגיד כלפי מעלה תוך שימוש במספריים להסרת כל חיבור. לאחר הסרת כל הקבצים המצורפים, השתמש במספריים כדי לחתוך את הקצה הרוסטרלי של שריר הסולאוס ולהסיר אותו.
  5. השתמש מספריים כדי לנתח את הראשים של שריר gastrocnemius סביב patella.
    הערה: לאחר הסרת שריר הגסטרוקנמיוס, חשוב לזכור את הכיוון המקורי של המיופייבר.
  6. מניחים את שריר הגסטרוקנמיוס על יריעה של שעווה דנטלית וחותכים אותו באמצעות סכין גילוח וסרגל כדי לקבל חתך של 10 מ"מ x 10 מ"מ ממרכז שריר הגסטרוקנמיוס.
    הערה: ניתן להתאים אישית את גודל התא הדיאלקטרי. עבור חולדות נעשה שימוש בתא של 10 מ"מ x 10 מ"מ ועבור עכברים נעשה שימוש בתא של 5 מ"מ x 5 מ"מ.
  7. בעזרת פינצטה, הניחו בעדינות את הגסטרוקנמיוס בתאים הדיאלקטריים, וודאו שהסיבים מכוונים לאורך (כלומר, גפיים קאודליות ורוסטרליות צריכות לגעת באלקטרודות). ודא כי השריר נמצא במגע מלא עם אלקטרודות המתכת.
  8. חברו את החלק העליון של התא הדיאלקטרי והכניסו שתי מחטים מונופולריות (26 גרם) לשני החורים. חבר את החוטים מהתקן EIM לתא ex vivo בסדר הבא: (1: I +, 2: V+, 3: V-, 4: I-, כאשר I מייצג את אלקטרודות הזרם ו- V מייצג את אלקטרודות המתח). לרכוש את המדידה האורך.
  9. פתח את התא הדיאלקטרי וכיוון מחדש של השריר בכיוון הרוחבי על ידי סיבובו ב-90°. חברו מחדש את החלק העליון של התא הדיאלקטרי. לרכוש את המדידה הרוחבית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתן להשיג EIM בתנאים רבים, כולל מערכי פני שטח in vivo (איור 1), מערכי מחט in vivo (איור 2A-F) ותאים דיאלקטריים ex vivo (איור 2G,H).

EIM מספק תמונת מצב כמעט מיידית של מצב השרירים בהתבסס על ערכי העכבה שנמדדו. המדידות נרכשות במהירות והתוצאה היא קובץ נתוני פלט פשוט שאינו דורש תוכנה מיוחדת (איור 3A). ואכן, כל התקן עכבה רב-תדרי המספק נתונים לתדרים בודדים יוכל לייצר פלט .csv סטנדרטי שניתן לפתוח באופן עצמאי. המערכת המתוארת בפרוטוקול זה מספקת גם את השם והתנאים של הניסוי, עם ערכים של פאזה, תגובה והתנגדות עבור כל ניסוי בכל תדר שנמדד, בתוך קובץ הפלט. כדי להבטיח שכפול, שני ניסויים של ערכים אורכיים (ניסויים 1 ו-3) ורוחביים (ניסויים 2 ו-4) מתקבלים בדרך כלל וממוצעים, ומשמשים לכל הניתוחים הבאים.

כאשר הם מוצגים כפונקציה של תדירות, ערכי EIM יוצרים עקומות סטנדרטיות שניתן לנתח כדי לזהות נתונים מזויפים או מזוהמים בממצאים. חריגות כאלה קשורות בדרך כלל לבעיות מגע במדידות פני השטח, וכתוצאה מכך ערכים קיצוניים נצפים בתדרים נמוכים (בדרך כלל ערכים חיוביים או שליליים גדולים). עקומות מייצגות מוצגות עבור פאזה (איור 3B), תגובה (איור 3C) והתנגדות (איור 3D) עבור מדידות אורך (עיגולים כחולים) ורוחביים (ריבועים אפורים). מוצג גם גרף המציג את התגובה כפונקציה של התנגדות (עלילת קול-קול) הן בכיוון האורך והן בכיוון רוחבי (איור 3E). שלב זה הוא קריטי מכיוון שהוא חלק מבדיקת הנתונים, ומאפשר זיהוי פשוט של נתונים מזויפים או מזוהמים בחפץ. אם מתגלה חפץ מוגזם (בדרך כלל עקב מגע לקוי בין מערך פני השטח לעור), ניתן לעקוב אחר מספר נהלים כדי לשפר את המגע. אלה כוללים מריחת מריחה נוספת של קרם דפילציה, הרטבת העור למשך כדקה עם כרית גזה ספוגה במי מלח, או הפעלת לחץ עדין על מערך האלקטרודות. באופן כללי, התהליך הפשוט של חזרה על המדידה מספר פעמים יעזור גם הוא לפתור זאת.

מדידות EIM משקפות את התגובה של רקמת השריר לזרם חשמלי בטווח רחב של תדרים, שכל אחת מהן מכוונת למבנים שונים. לדוגמה, תדרים נמוכים (כלומר, 5 קילוהרץ) אינם חודרים את קרום המיופייבר, ובכך מספקים ניתוח של התכונות החוץ-תאיות שניתן להשתמש בהן כדי לזהות דלקת וחדירת נויטרופילים14. לעומת זאת, תדרים גבוהים (>1 מגה-הרץ) יכולים לחדור לקרום התא ולכן לחקור גם חללים תוך-תאיים וגם חוץ-תאיים ושימשו להבחנה בין סיבי שריר מסוג1.

Figure 1
איור 1: מערך משטחים מודפס בתלת-ממד. תצלומים של מערך פני שטח שהודפס בתלת-ממד כדי לקבל מדידות של עכבת פני השטח (הן אורכיות והן רוחביות) בעכברים in vivo. (A) תצלום המציג את מערך פני השטח המחובר להתקן הרכישה. (B) תקריב של מערך פני השטח המציג את הגלגל המשמש לסיבוב המערך ל-90° כדי לקבל מדידות אורך ורוחביות. (C) תקריב של אלקטרודות פני השטח. לאלקטרודות פני השטח יש את המאפיינים הבאים: רוחב אלקטרודות = 0.5 מ"מ, אורך אלקטרודות חיצוניות = 4 מ"מ, אורך אלקטרודות פנימיות = 3 מ"מ, ומרווח בין אלקטרודות = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מערכים אחרים שניתן להשתמש בהם כדי להתאים לתכנון ניסויי ספציפי. תצלומים של: (A) מערך מחטים המשמש לחולדות ומצופה (באמצעות לכה ציפורניים לא מתכתית) כדי להפחית את תרומתו של שומן תת עורי (שטח 2 מ"מ, עומק 4 מ"מ, ציפוי 2 מ"מ); (B) מערך מחטים עם מרווח של 2 מ"מ ועומק של 4 מ"מ; (C) מערך מחטים עם מרווח של 2 מ"מ ועומק של 3 מ"מ; (D) מערך מחטים עם מרווח של 2 מ"מ ועומק של 2 מ"מ; (E) מערך מחטים לבעלי חיים וגורים קטנים יותר עם מרווח של 1 מ"מ ועומק של 2 מ"מ; (F) מערך מחטים עם מרווח של 1 מ"מ ועומק של 1 מ"מ; (G) תא דיאלקטרי ex vivo המותאם לשרירי עכבר בוגרים (5 מ"מ x 5 מ"מ); ו-(H) תא דיאלקטרי ex vivo המותאם לשרירי חולדות (10 מ"מ x 10 מ"מ). שינויים (תוצאות שלא הוצגו כאן) להשגת מדידות על בעלי חיים שמנים (כלומר, עכברי ob/ob או db/db) יכולים להתבצע על ידי הגדלת אורך המחט, הוספת ציפוי לא מוליך והגדלה/הקטנה של ריווח המחטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: פלט נתונים ועקומות מייצגות המתקבלות בעכברים עם EIM במשטח in vivo בכיוונים אורכיים (כחולים) ורוחביים (אפורים). (A) קובץ פלט בפורמט .csv המתקבל לאחר רכישת שתי מדידות אורכיות (מדידות 1 ו-3, צבועות בכחול) ושתי מדידות רוחביות (מדידות 2 ו-4, צבועות באפור) מדידות EIM in vivo . הערכים מצוינים עבור כל תדירות (עמודה A). ניתוחים מבוצעים לאחר מכן באמצעות הערך הממוצע של מדידות האורך והרוחב, בהתאמה. מידע שנמצא בתאים A1:B4 מאוכלס באופן אוטומטי על ידי התוכנה, בהתאם לתוויות שנבחרו במהלך רכישת EIM. עקומות מייצגות הן עבור ערכים אורכיים (עיגולים כחולים) והן רוחביים (ריבועים אפורים) של פאזה (B), תגובה (C) והתנגדות (D) כפונקציה של תדירות. בהתאם לשיטות העבודה המקובלות בשדה העכבה, ציר ה-x מצוין באמצעות סולם לוגריתמי. (E) עקומות מייצגות של תגובה כפונקציה של התנגדות הן למדידות אורכיות והן למדידות רוחביות. LP: שלב אורכי; TP: שלב רוחבי; LX: תגובה אורכית; TX: תגובה רוחבית; LR: התנגדות אורכית; ו- TR: התנגדות רוחבית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מספק את השיטות הבסיסיות לביצוע EIM במכרסמים, הן in vivo והן ex vivo. כדי להשיג מדידות אמינות, זה קריטי לבצע סדרה של צעדים. ראשית, יש לזהות כראוי את שריר העניין, שכן לכל שריר יהיו תגובות שונות למחלות, טיפול ופתולוגיה. יש לשים לב שהנתונים הנרכשים על שריר אחד (למשל, גסטרוקנמיוס) לא יספקו את אותו מידע כמו על שריר אחר (למשל, טיביאליס קדמי). שנית, יש לבחור בקפידה את מערך האלקטרודות הטוב ביותר לביצוע מדידות העכבה. בעוד שלכל סוג מערך יש יתרונות וחסרונות, חשוב לבחור מערך שיתאים לתכנון הניסוי תוך התחשבות בהתקדמות המחלה ובהשפעה על האנטומיה (למשל, ניוון חמור). לבסוף, EIM מאפשר לחוקרים לאסוף כמות מדהימה של נתונים תוך מספר שניות, אך בקרת האיכות צריכה להתבצע כראוי כדי להבטיח את היעדר הממצאים.

מערכת EIM ניתנת להתאמה אישית במספר רמות. בעוד שהמערכת המשמשת כאן תוכננה לאיסוף נתונים קליניים ופרה-קליניים, ניתן להשתמש בכל מערכת מדידת עכבה רב-תדרית למטרה זו, כל עוד היא מספקת נתוני תדרים בודדים. באופן כללי, מערכות עכבה מספקות קובץ .csv סטנדרטי כפלט. באופן דומה, ניתן לבצע שינויים נוספים לגבי המערכים, שכן כל מה שנדרש באמת הן ארבע אלקטרודות הממוקמות בשורה. לדוגמה, בפרוטוקול זה נעשה שימוש במגוון אלקטרודות בהתאמה אישית כדי למלא דרישות, אך ניתן להתאים מערכים לצרכים האישיים באמצעות כלים פשוטים (למשל, דבק אפוקסי, מחטים תת-עוריות) או מורכבים (למשל, מדפסות תלת-ממד). לחלופין, ניתן לשלב את ארבע האלקטרודות למחט אחת, כפי שתואר קודםלכן 20. במעבדה שלנו, מערכים פותחו עבור גורים על ידי הקטנת המרווח בין האלקטרודות כדי להבטיח שניתן יהיה למדוד שרירים קטנים הן בכיוון האורך והן בכיוון הרוחבי. כאשר עובדים עם בעלי חיים שמנים, אשר יש שכבה גדולה יותר באופן משמעותי של שומן תת עורי, מומלץ להשתמש אלקטרודות מחט מצופה חלקית. זה מאפשר תרומה גדולה יותר של רקמת השריר למדידת העכבה תוך הפחתת התרומה של רקמת השומן21.

בעוד שניתן להשתמש בשיטות מחט ובשיטות פני השטח הן בחולדות והן בעכברים, כפי שתואר והודגם, מומלץ בדרך כלל להשתמש במדידות המחט בחולדות, שכן אלה מהירות יותר מכיוון שהן אינן דורשות מאמץ כדי להכין את העור. בנוסף, גודלם הגדול יותר פירושו כי אלקטרודות המחט רק פגיעה מינימלית בשריר. בעכברים, בהתחשב בגודלם הקטן, מדידות פני השטח מומלצות כדי למנוע פגיעה בשרירים ובהתחשב בכך שהכנת העור פשוטה ומהירה יחסית.

כל טכניקת EIM מגיעה עם סט מגבלות משלה. מגבלה מרכזית היא שמערכי אלקטרודות אינם זמינים בקלות דרך ספקים, ובמקום זאת דורשים ייצור מותאם אישית במעבדה. כדי לסייע לחוקרים חדשים, פרוטוקול זה כולל מדידות עבור מספר מערכים (הן בעבודת יד והן בהדפסה תלת-ממדית), והמחברים יספקו מערכים מותאמים אישית או יהפכו את קבצי ה- CAD הקשורים לזמינים לפי בקשה. כפי שצוין קודם לכן, איכות הנתונים היא קריטית, ובעיות נוספות עלולות להפריע לאיכות הנתונים עבור כל אחד מסוגי המדידה (למשל, משטח, מחט ו - ex vivo). לקבלת נתוני פני שטח טובים, יש צורך להסיר את השיער לחלוטין, וככל הנראה גם את שכבת הקרנית של העור, כדי לקבל את התוצאות הטובות ביותר עם חפץ מגע מינימלי. עם זאת, השימוש בסוכן depilatory גם אומר כי העור יהיה לאט לאט להיות edematous לאורך זמן, ולכן יש צורך להשלים במהירות את מדידות העכבה לאחר הסרת שיער. המתנה של 10 דקות או יותר עשויה להניב ערכים שונים באופן משמעותי בהשוואה לביצוע המדידות תוך דקה או שתיים מהסרת השיער. מדידות מערך המחטים בחולדות או בעכברים בדרך כלל יגרמו לפחות לכמות קטנה של דימום, מה שעלול להשפיע על הקריאות אם הוא יהפוך להמטומה גדולה יותר סביב המחטים המוחדרות. לבסוף, מדידות ex vivo דורשות טיפול מיוחד כדי להבטיח כי סיבי השריר בתוך התא הדיאלקטרי מיושרים במדויק ביחס ללוחות המתכת. לבסוף, בעכברים קטנים או חולים, ייתכן שלא ניתן להשיג מדידות רוחביות, בהתחשב בגודל הקטן של השרירים. אבל, כפי שצוין לעיל, עדיין ניתן לתכנן מערכי 4 אלקטרודות מותאמים אישית שיכולים להיות קטנים מספיק כדי לבצע מדידות אורך אפילו בתוך השרירים הקטנים ביותר.

ניתוח נתונים יכול להישמר די פשוט - למשל, על ידי מדידת פלט יחיד (למשל, פאזה) בתדר יחיד (למשל, 50 קילוהרץ) בכיוון יחיד (למשל, אורכי) - או מורכב למדי, על ידי שילוב כל פרמטרי העכבה על פני כל ספקטרום התדרים הן בכיוון האורך והן בכיוון הרוחבי. כאשר נעשה שימוש בערכי עכבה בתדר יחיד, הם בדרך כלל בטווח של 30-100 קילוהרץ, שכן שריר נוטה להיות תגובתי ביותר (כלומר, הוא "טעון" ביותר) בתחום תדרים זה. עם זאת, נעשה שימוש גם בפרמטרים מעובים או מכווצים, המנסים ללכוד את צורת ספקטרום התדרים. ערכים אלה כללו שיפועים של התאמות ליניאריות של יחסי ההתנגדות, התגובה והפאזה22 ו-2-תדרים23. לחלופין, ניתן לחשב פרמטרים של קול-קול מהתאמות של נתוני העכבה, כולל R0 (קביעת ההתנגדות בתדר אפס),R inf (קביעת ההתנגדות בתדר אינסוף) ו-fc (תדר מרכז)24,25,26,27. לבסוף, ניתן להשתמש בלמידת מכונה כדי לנתח את כל הנתונים בבת אחת ולשפר מודלים לחיזוי, הן עבור רגרסיה12,13,15,16, והן עבור סיווג.

למרות מגבלות אלה, EIM הוא כלי רב עוצמה ופשוט יחסית להערכת היבטים רבים של בריאות השרירים. בעוד שהמיקוד של כתב יד זה הוא על שריר יחיד (gastrocnemius), אין שום דבר שמונע את השימוש ב- EIM על שרירים שטחיים אחרים (למשל, quadriceps או biceps brachii) באמצעות אלקטרודות פני השטח או שרירים עמוקים יותר באמצעות מערך אלקטרודות המחט. ואכן, בבני אדם, הטכניקה שימשה במגוון רחב של שרירים, כולל שרירי גפיים עליונות ותחתונות 8,28, כמו גם שרירים ציריים (למשל שרירי פאראספינל ושרירי בטן)29,30.

הוכח כי EIM מספק אמצעים אמינים לגבי התקדמות המחלה, הפוגה של ניוון, וטיפול לאורך זמן. נתונים בתדר יחיד עשויים להספיק לחלוטין כדי להעריך את מצב המחלה לאורך זמן31; עם זאת, הערך של נתונים מרובי תדרים הוא שהם עדיין יכולים לסייע בהערכת איכות המדידה, כפי שתואר לעיל. נתונים בתדר יחיד בבידוד עלולים להיות מזוהמים באופן משמעותי על ידי ממצאי מגע, וזה לא יהיה ברור ללא סקירת כל ספקטרום העכבה. במחקרים קליניים, ניתן להשתמש ב- EIM על פני השטח לעתים קרובות כדי להשיג מדידות ללא כאבים מה שהופך אותו לכלי פשוט ליישום32. שפע זה של נתונים יכול להיות קריטי למעקב רגיש יותר אחר התקדמות המחלה. יתר על כן, הוספת EIM לפרוטוקולים קליניים יכולה להפחית באופן משמעותי את מספר המשתתפים הנדרש במהלך ניסוי קליני28,31.

EIM מוצא יישום הולך וגובר בהערכה של מגוון מצבים עצביים-שריריים בבני אדם. בהתאם לכך, היכולת לבצע את הטכניקה ביעילות במכרסמים מסייעת להרחיב את הערך המעשי הפוטנציאלי של הטכנולוגיה תוך שיפור הבנתנו את הקשר בין פלטי EIM שונים לבין ההיסטולוגיה הבסיסית. הטכניקה היא בדרך כלל קלה לשימוש ויחד עם הנתונים הכמותיים השימושיים שהיא מספקת, ראוי להיכלל בחימוש הסטנדרטי של כלים להערכת הפרעות עצבים ושרירים במודלים של מחלות מכרסמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ל- S. B. Rutkove יש הון עצמי, והוא משמש כיועץ ויועץ מדעי ל- Myolex, Inc., חברה המתכננת התקני עכבה לשימוש קליני ומחקרי, ולמערכת mView המשמשת כאן. הוא גם חבר בדירקטוריון החברה. לחברה יש גם אפשרות לרישיון לטכנולוגיית עכבה מוגנת בפטנט אשר S. B. Rutkove נקרא כממציא. למחברים האחרים אין כל זיקה רלוונטית אחרת או מעורבות כספית עם כל ארגון או ישות שיש להם אינטרס כספי או סכסוך כספי עם הנושא או החומרים הנדונים בכתב היד מלבד אלה שנחשפו.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן צ'ארלי ו- NIH R01NS055099.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Printer Formlabs Inc. Form 2 Desktop 3D printer
3D Printer Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD Creality Ender 3 V2 3D printer
3M Micropore surgical tape Fisher 19-027761 and 19-061655 models 1530-0 and 1530-1
3M TRANSPORE surgical tape Fisher 18-999-380 and 18-999-381 models 1527-0 and 1527-1
Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing Digi-Key (Sullins connector solution) S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK) Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Cotton-tipped applicators Fisher 22-363-172
Dental Wax Fisher NC9377103
Depilatory agent NAIR NA hair remover lotion with softening baby oil
Dumont #7b Forceps Fine Science Tools No. 11270-20 Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm
Electronic Digital Caliper Fisher 14-648-17 Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle
Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life Devcon series 14265, model 2217 Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Ex vivo dielectric impedance cell Custom NA Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory
Graefe Forceps Fine Science Tools No. 11051-10 Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material
Hair clipper Amazon NA Wahl professional animal BravMini+
Impedance Animal Device Myolex EIM1103 mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research
In vivo needle arrays Custom NA Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory
In vivo surface array Custom NA The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory
Isoflurane Patterson Veterinary Supplies 07-893-8441 (NDC: 46066-755-04) Pivetal - 250 mL bottle
Non-woven gauze Fisher 22-028-559 2 x 2 inch
Polystyrene Weighing Dishes Fisher S67090A Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm
Razor Blades Fisher 12-640 Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades
Student Fine Scissors Fine Science Tools No. 91460-11 Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality
Subdermal needles 27 G Neuroline Ambu 745 12-50/24 Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Surgical Scissors - Sharp Fine Science Tools No. 14002-13 Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm
TECA ELITE monopolar needle electrodes Natus 902-DMG50-S 0.46 mm diameter (26 G). Blue hub
Teknova 0.9% saline solution Fisher S5815 1000 mL sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rutkove, S. B., Sanchez, B. Electrical impedance methods in neuromuscular assessment: An overview. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (10), 034405 (2019).
  2. Rutkove, S. B. Electrical impedance myography: Background, Current State, and Future Directions. Muscle & Nerve. 40, 936-946 (2009).
  3. Sanchez, B., Rutkove, S. B. Present uses, future applications, and technical underpinnings of electrical impedance myography. Current Neurology and Neuroscience Reports. 17 (11), 86 (2017).
  4. Garmirian, L. P., Chin, A. B., Rutkove, S. B. Discriminating neurogenic from myopathic disease via measurement of muscle anisotropy. Muscle & Nerve. 39 (1), 16-24 (2009).
  5. Rutkove, S. B., et al. Loss of electrical anisotropy is an unrecognized feature of dystrophic muscle that may serve as a convenient index of disease status. Clinical Neurophysiology. 127 (12), 3546-3551 (2016).
  6. Wang, L. L., et al. Assessment of alterations in the electrical impedance of muscle after experimental nerve injury via finite-element analysis. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58 (6), 1585-1591 (2011).
  7. Katirji, B., Ruff, R. L., Kaminski, H. J. Neuromuscular Disorders in Clinical Practice. , Springer New York. New York, NY. (2014).
  8. Rutkove, S. B., et al. Electrical impedance myography for assessment of Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 81 (5), 622-632 (2017).
  9. Semple, C., et al. Using electrical impedance myography as a biomarker of muscle deconditioning in rats exposed to micro- and partial-gravity analogs. Frontiers in Physiology. 11, 557796 (2020).
  10. Kortman, H. G. J., Wilder, S. C., Geisbush, T. R., Narayanaswami, P., Rutkove, S. B. Age- and gender-associated differences in electrical impedance values of skeletal muscle. Physiological Measurement. 34 (12), 1611-1622 (2013).
  11. Clark, B. C., Rutkove, S., Lupton, E. C., Padilla, C. J., Arnold, W. D. Potential utility of electrical impedance myography in evaluating age-related skeletal muscle function deficits. Frontiers in Physiology. 12, 666964 (2021).
  12. Kapur, K., et al. Predicting myofiber size with electrical impedance myography: A study in immature mice. Muscle and Nerve. 58 (1), 106-113 (2018).
  13. Kapur, K., Nagy, J. A., Taylor, R. S., Sanchez, B., Rutkove, S. B. Estimating myofiber size with electrical impedance myography: a study in amyotrophic lateral sclerosis mice. Muscle and Nerve. 58 (5), 713-717 (2018).
  14. Mortreux, M., Semple, C., Riveros, D., Nagy, J. A., Rutkove, S. B. Electrical impedance myography for the detection of muscle inflammation induced by λ-carrageenan. PLoS ONE. 14 (10), 0223265 (2019).
  15. Pandeya, S. R., et al. Predicting myofiber cross-sectional area and triglyceride content with electrical impedance myography: A study in db/db mice. Muscle and Nerve. 63 (1), 127-140 (2021).
  16. Pandeya, S. R., et al. Estimating myofiber cross-sectional area and connective tissue deposition with electrical impedance myography: A study in D2-mdx mice. Muscle & Nerve. 63 (6), 941-950 (2021).
  17. Stålberg, E., et al. Standards for quantification of EMG and neurography. Clinical Neurophysiology. 130 (9), 1688-1729 (2019).
  18. Theodorou, D. J., Theodorou, S. J., Kakitsubata, Y. Skeletal muscle disease: Patterns of MRI appearances. British Journal of Radiology. 85 (1020), 1298-1308 (2012).
  19. Simon, N. G., Noto, Y., Zaidman, C. M. Skeletal muscle imaging in neuromuscular disease. Journal of Clinical Neuroscience. 33, 1-10 (2016).
  20. Kwon, H., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Recording characteristics of electrical impedance myography needle electrodes. Physiological Measurement. 38 (9), 1748-1765 (2017).
  21. Kwon, H., Di Cristina, J. F., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Recording characteristics of electrical impedance-electromyography needle electrodes. Physiological Measurement. 39 (5), 055005 (2018).
  22. Rutkove, S. B., et al. Characterizing spinal muscular atrophy with electrical impedance myography. Muscle and Nerve. 42 (6), 915-921 (2010).
  23. Schwartz, S., et al. Optimizing electrical impedance myography measurements by using a multifrequency ratio: A study in Duchenne muscular dystrophy. Clinical Neurophysiology. 126 (1), 202-208 (2015).
  24. Li, J., Pacheck, A., Sanchez, B., Rutkove, S. B. Single and modeled multifrequency electrical impedance myography parameters and their relationship to force production in the ALS SOD1G93A mouse. Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontotemporal Degeneration. 17 (5-6), 397-403 (2016).
  25. Hu, N., et al. Antisense oligonucleotide and adjuvant exercise therapy reverse fatigue in old mice with myotonic dystrophy. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 23, 393-405 (2021).
  26. Sanchez, B., et al. Non-invasive assessment of muscle injury in healthy and dystrophic animals with electrical impedance myography. Muscle & Nerve. 56 (6), 85-94 (2017).
  27. Sanchez, B., Li, J., Bragos, R., Rutkove, S. B. Differentiation of the intracellular structure of slow- versus fast-twitch muscle fibers through evaluation of the dielectric properties of tissue. Physics in Medicine and Biology. 59 (10), 2369-2380 (2014).
  28. Shefner, J. M., et al. Assessing ALS progression with a dedicated electrical impedance myography system. Amyotrophic Lateral Sclerosis & Frontotemporal Degeneration. 19 (7-8), 555-561 (2018).
  29. Lungu, C., et al. Quantifying muscle asymmetries in cervical dystonia with electrical impedance: a preliminary assessment. Clinical Neurophysiology. 122 (5), 1027-1031 (2011).
  30. Wang, Y., et al. Electrical impedance myography for assessing paraspinal muscles of patients with low back pain. Journal of Electrical Bioimpedance. 10 (1), 103-109 (2019).
  31. Leitner, M. L., et al. Electrical impedance myography for reducing sample size in Duchenne muscular dystrophy trials. Annals of Clinical and Translational Neurology. 7 (1), 4-14 (2020).
  32. Rutkove, S. B., et al. Improved ALS clinical trials through frequent at-home self-assessment: a proof of concept study. Annals of Clinical and Translational Neurology. 7 (7), 1148-1157 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 184 עכבה שרירים עכברים חולדות מוגרפיה אניזוטרופיה סמן ביולוגי
ביצוע מיוגרפיה של עכבה חשמלית <em>In</em> Vivo ו <em>- Ex Vivo</em> במכרסמים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mortreux, M., Nagy, J. A., Zhong,… More

Mortreux, M., Nagy, J. A., Zhong, H., Sung, D. M., Concepcion, H. A., Leitner, M., Dalle Pazze, L., Rutkove, S. B. Performing In Vivo and Ex Vivo Electrical Impedance Myography in Rodents. J. Vis. Exp. (184), e63513, doi:10.3791/63513 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter