Summary
Bu makalede, kemirgen gastroknemius kası üzerinde in vivo (yüzey ve iğne elektrot dizileri kullanılarak) ve ex vivo (dielektrik hücre kullanılarak) elektriksel empedans miyografisinin nasıl yapılacağı açıklanmaktadır. Hem farelerde hem de sıçanlarda tekniği gösterecek ve mevcut modifikasyonları detaylandıracak (yani, obez hayvanlar, yavrular).
Abstract
Elektriksel empedans miyografisi (EIM), kas dokusu sağlığını ve hastalığını değerlendirmek için klinik öncesi ve klinik çalışmalarda kullanılabilecek uygun bir tekniktir. EIM, bir frekans aralığında (yani, 1 kHz'den 10 MHz'e) ilgi duyulan bir kasın içine düşük yoğunluklu, yön odaklı bir elektrik akımı uygulanarak ve elde edilen voltajların kaydedilmesiyle elde edilir. Bunlardan, reaktans, direnç ve faz dahil olmak üzere çeşitli standart empedans bileşenleri elde edilir. Eksize kas üzerinde ex vivo ölçümler yapılırken, dokunun doğal pasif elektriksel özellikleri, yani iletkenlik ve göreceli geçirgenlik de hesaplanabilir. EIM, hayvanlarda ve insanlarda, çeşitli hastalıklardaki kas değişikliklerini teşhis etmek ve izlemek için, basit kullanım atrofisi ile ilgili olarak veya terapötik müdahalenin bir ölçüsü olarak yaygın olarak kullanılmıştır. Klinik olarak, EIM zaman içinde hastalığın ilerlemesini izleme ve terapötik müdahalelerin etkisini değerlendirme potansiyeli sunar, böylece klinik çalışma süresini kısaltma ve örneklem büyüklüğü gereksinimlerini azaltma fırsatı sunar. Canlı hayvan modellerinde ve insanlarda noninvaziv veya minimal invaziv olarak gerçekleştirilebildiği için, EIM hem klinik öncesi hem de klinik gelişimi sağlayan yeni bir translasyonel araç olarak hizmet etme potansiyeli sunmaktadır. Bu makalede, farelerde ve sıçanlarda in vivo ve ex vivo EIM ölçümlerinin nasıl gerçekleştirileceğine ilişkin adım adım talimatlar, teknikleri yavrularda veya obez hayvanlarda kullanım gibi belirli koşullara uyarlama yaklaşımları da dahil olmak üzere sunulmaktadır.
Introduction
Elektriksel empedans miyografisi (EIM), kas durumunu değerlendirmek, potansiyel olarak nöromüsküler bozuklukların teşhisini, hastalık progresyonunun izlenmesini ve tedaviye yanıtın değerlendirilmesini sağlayan güçlü bir yöntem sağlar 1,2,3. Hayvan hastalığı modellerine ve insanlara benzer şekilde uygulanabilir ve klinik öncesi çalışmalardan klinik çalışmalara nispeten sorunsuz bir çeviri sağlar. EIM ölçümleri, doğrusal olarak yerleştirilmiş dört elektrot kullanılarak kolayca elde edilir; iki dış elektrot, bir frekans aralığında (genellikle 1 kHz ile yaklaşık 2 MHz arasında) ağrısız, zayıf bir elektrik akımı uygular ve iki iç elektrot ortaya çıkan voltajları kaydeder1. Bu voltajlardan, dokunun empedans özellikleri, akımın dokudan geçmesinin ne kadar zor olduğunun bir ölçüsü olan direnç ( R ) ve dokunun reaktansı (X) veya "yüklenebilirliği" de dahil olmak üzere elde edilebilir. Reaktans ve dirençten, faz açısı (θ) aşağıdaki denklemle hesaplanır: 
, tek bir toplam empedans ölçüsü sağlar. Bu tür ölçümler herhangi bir çok frekanslı biyoempedans cihazı kullanılarak elde edilebilir. Miyolifler esasen uzun silindirler olduğundan, kas dokusu da oldukça anizotropiktir, akım lifler boyunca onlardan daha kolay akar 4,5. Bu nedenle, EIM genellikle iki yönde gerçekleştirilir: dizi, lifler boyunca, akımın onlara paralel olarak akacağı şekilde ve kas boyunca, akımın kendilerine dik olarak akacağı şekilde yerleştirilir. Ek olarak, bir empedans ölçüm hücresinde bilinen bir doku hacminin ölçüldüğü ex vivo ölçümlerde, kasın doğal elektriksel özellikleri (yani iletkenlik ve göreceli geçirgenlik) türetilebilir6.
"Nöromüsküler bozukluklar" terimi, yapısal kas değişikliği ve disfonksiyonuna yol açan çok çeşitli birincil ve ikincil hastalıkları tanımlar. Bu, amiyotrofik lateral skleroz ve çeşitli kas distrofisi formlarının yanı sıra yaşlanma (örneğin, sarkopeni), kullanılmama atrofisi (örneğin, uzun süreli yatak istirahati veya mikro yerçekimi nedeniyle) ve hatta yaralanma7 ile ilgili daha basit değişiklikleri içerir. Nedenler bol olsa da ve motor nöron, sinirler, nöromüsküler kavşaklar veya kasın kendisinden kaynaklanabilse de, EIM, bu süreçlerin çoğuna bağlı olarak kastaki erken değişiklikleri tespit etmek ve ilerlemeyi veya tedaviye yanıtı izlemek için kullanılabilir. Örneğin, Duchenne musküler distrofisi (DMD) olan hastalarda, EIM'nin hastalığın ilerlemesini ve kortikosteroidlere yanıtı tespit ettiği gösterilmiştir8. Son zamanlarda yapılan çalışmalar ayrıca, EIM'nin, Ay veya Mars'ta yaşanacağı gibi kesirli yerçekimi9 ve yaşlanmanın etkileri de dahil olmak üzere değişen kullanım dışı durumlara duyarlı olduğunu göstermiştir. Son olarak, her ölçümle elde edilen veri setine (çok frekanslı ve yönlü bağımlı veriler) öngörücü ve makine öğrenmesi algoritmaları uygulayarak, miyofiber boyutu 12,13, enflamatuar değişiklikler ve ödem 14 ve bağ dokusu ve yağ içeriği 15,16 dahil olmak üzere dokunun histolojik yönlerini çıkarmak mümkün hale gelir.
İğne elektromiyografisi 17 ve manyetik rezonans görüntüleme, bilgisayarlı tomografi ve ultrason18,19 gibi görüntüleme teknolojileri de dahil olmak üzere insanlarda ve hayvanlarda kas sağlığını değerlendirmek için diğer birçok noninvaziv veya minimal invaziv yöntem de kullanılmaktadır. Bununla birlikte, EIM bu teknolojilerle karşılaştırıldığında farklı faydalar göstermektedir. Örneğin, elektromiyografi pasif özellikleri değil, sadece miyofiber membranların aktif elektriksel özelliklerini kaydeder ve bu nedenle kas bileşiminin veya yapısının gerçek bir değerlendirmesini sağlayamaz. Belli bir açıdan, görüntüleme yöntemleri de dokunun yapısı ve bileşimi hakkında bilgi sağladıkları için EIM ile daha yakından ilişkilidir. Ancak bir anlamda, sadece nicel bir çıktı sağlamak yerine ayrıntılı görüntü segmentasyonu ve uzman analizi gerektiren çok fazla veri sağlarlar. Dahası, karmaşıklıkları göz önüne alındığında, görüntüleme teknikleri hem kullanılan donanım hem de yazılımın özelliklerinden de büyük ölçüde etkilenir ve ideal olarak veri kümelerinin karşılaştırılabilmesi için aynı sistemlerin kullanılmasını gerektirir. Buna karşılık, EIM'nin çok daha basit olması, bu teknik sorunlardan daha az etkilendiği ve herhangi bir görüntü işleme veya uzman analizi gerektirmediği anlamına gelir.
Aşağıdaki protokol, hem noninvaziv (yüzey dizisi) hem de minimal invaziv (subdermal iğne dizisi) tekniklerin yanı sıra taze eksize edilmiş kas üzerinde ex vivo EIM kullanılarak sıçanlarda ve farelerde in vivo EIM'nin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler, Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından protokol numaraları altında onaylanmıştır (031-2019; 025-2019). Hayvanları idare etmek için uygun KKD ekipmanı giyin ve tüm hayvan işleri için IACUC kurallarına uyun.
1. In vivo yüzey EIM
- Anesteziyi indüklemek için hayvanı bir anestezi kutusuna yerleştirin.
NOT: Sıçanlar için %1.5-%3.5 izofluran ve 2 O 2 L·min-1, fareler için ise %2 izofluran ve 1O2 L·min-1 kullanılmıştır. - Tamamen anestezi uygulandıktan sonra, hayvanın ayağını sıkıştırdıktan sonra yanıt yokluğu ile belirtildiği gibi, fareyi tezgahın üzerine yüzüstü bir pozisyonda yerleştirin ve% 1.5 izofluran ve 1 L · min-1 oksijen akışı kullanarak anesteziyi sürdürmek için burun konisini kullanın.
- Analiz edilecek hayvanın bacağını kalça eklemi (diz uzatılmış) ile 45° açıyla yerleştirin ve ayağı tıbbi bantla sabitleyin.
- Gastroknemius kasını kaplayan kürkü kesmek için bir saç kesme makinesi kullanın.
- Hayvanın derisine kalın bir tüy dökücü krem tabakası uygulayın ve 1 dakika bekletin. Daha sonra, tüy dökücü maddeyi çıkarmak için tuzlu doymuş gazlı bez kullanın. Gastroknemius kasını kaplayan tüm kürk çıkarılana kadar bu işlemi üç defaya kadar tekrarlayın.
NOT: Cilt dehidrasyonunu önlemek için ölçümler alınmadığında cildin üzerine tuzlu suya batırılmış bir gazlı bez pedi yerleştirin. - Yüzey dizisini (Şekil 1) EIM cihazına bağlayın ve elektrotların tuzlu su çözeltisine batırılmış bir gazlı bez parçası üzerinde durmasına izin verin.
- Yüzey dizisini doğrudan gastroknemius kası üzerinden, kas liflerine uzunlamasına yönlendirilmiş olarak cilde yerleştirin.
- Yazılımda 50 kHz direnç, reaktans ve faz değerlerinin kararlılığını gösteren yeşil görünen tüm çubuklarla gösterilen uygun teması kontrol ettikten sonra, EIM ölçümlerini alın.
NOT: Doğru veri alımını sağlamak için eğriler gerçek zamanlı olarak kontrol edilmelidir. - Yüzey dizisini 90 ° döndürün ve enine ölçümleri elde etmek için gastroknemius üzerinde cilt üzerinde yeniden konumlandırın (stabiliteyi gösteren yeşil çubukları kontrol edin).
- Kas başına toplam dört ölçüm elde etmek için 1.7, 1.8 ve 1.9 adımlarını tekrarlayın: iki uzunlamasına ve iki enine.
NOT: Aşırı cilt tahrişini ve yaralanmasını önlemek için her iki haftada bir tüy dökücü ajanı birden fazla kez (yani, aynı durumda en fazla üç uygulama) kullanmayın. Tüy dökücü kremin çıkarılmasından yaklaşık 5-10 dakika sonra ölçümlerin yapılması önemlidir, çünkü tüy dökücü ajan tarafından indüklenen lokalize cilt ödeminin gelişmesi toplanan empedans verilerini etkileyebilir. İzofluran anestezisini durdurduktan hemen sonra hayvan iyileşmesi gerçekleşir ve prosedür analjezik tedavi gerektirmez.
2. In vivo iğne dizisi EIM
- Hayvanı anestezi altına alın ve bacağı adım 1.1-1.4'te açıklandığı gibi aynı prosedürü kullanarak hazırlayın. Bununla birlikte, bir iğne dizisi kullanarak in vivo EIM gerçekleştirirken bir tüy dökücü ajan kullanmak gerekli değildir.
- İğne dizisini (Şekil 2A-F) EIM cihazına bağlayın ve tuzlu su çözeltisi içeren bir tartım teknesinde dinlendirin. Bağlantı ve sinyal kararlılığını kontrol edin (yeşil çubuklarla gösterilir).
- Cildi ve iğneleri alkolle dezenfekte edin. İğne dizisini miyoliflere kıyasla uzunlamasına bir pozisyona yerleştirin ve tüm iğneler cilde ve altta yatan kaslara dizi üzerindeki plastik koruyucuya kadar nüfuz edene kadar cilde sıkıca bastırın. Veri alın.
- Dizgeyi nazikçe çıkarın ve enine yönde, ilk ölçüme göre 90°'lik bir açıyla deriden ve kasın içine tekrar yerleştirin. Veri alın.
NOT: İğne dizileri kullanılırken, iğne elektrotlarının cilt ve kas dokusu üzerindeki etkisini azaltmak için ölçümler her yönde yalnızca bir kez alınmalıdır. Kanama meydana gelirse, ikinci ölçümü yapmadan önce kanı nazikçe silin. İzofluran anestezisini durdurduktan hemen sonra hayvan iyileşmesi gerçekleşir ve prosedür analjezik tedavi gerektirmez.
3. Ex vivo EIM
- Ex vivo dielektrik hücreyi hazırlayın (Şekil 2G, H), odaya tuzlu su çözeltisi ekleyin ve referans değerleri elde etmek için hücreyi EIM cihazına bağlayın.
NOT: Salinin faz ve reaktans değerleri sıfırda veya sıfıra yakın sabit kalmalı ve salinin direnç değerleri 1 kHz ila 1 MHz frekans aralığında yaklaşık 100 ± 25 Ω sabit kalmalıdır. - Hayvanı ilgili IACUC kurallarına göre ötenazileştirin.
- Bir çift makas kullanarak, Aşil tendonunun yakınındaki cildi kesin. Cımbız kullanarak, altta yatan kasları ve fasyayı ortaya çıkarmak için cildi yukarı doğru bir hareketle çekin. Gastroknemius kasını kaplayan biseps femoris'i nazikçe diseke edin ve siyatik siniri kesin.
- Gastroknemius ve soleus kaslarının distal ucunu serbest bırakmak için Aşil tendonunu kesin ve herhangi bir eki çıkarmak için makas kullanırken tendonu yavaşça yukarı doğru çekin. Tüm ataşmanlar çıkarıldıktan sonra, soleus kasının rostral ucunu kesmek ve çıkarmak için makas kullanın.
- Patella etrafındaki gastroknemius kasının kafalarını incelemek için makas kullanın.
NOT: Gastroknemius kasının çıkarılmasından sonra, miyoliflerin orijinal oryantasyonunu hatırlamak önemlidir. - Gastroknemius kasını bir diş balmumu tabakasına yerleştirin ve gastroknemius kasının merkezinden 10 mm x 10 mm'lik bir bölüm elde etmek için bir tıraş bıçağı ve bir cetvel kullanarak bölün.
NOT: Dielektrik hücre boyutu özelleştirilebilir. Sıçanlar için 10 mm x 10 mm'lik bir hücre kullanıldı ve fareler için 5 mm x 5 mm'lik bir hücre kullanıldı. - Cımbız kullanarak, gastroknemius'u dielektrik hücrelere nazikçe yerleştirin, liflerin uzunlamasına yönlendirildiğinden emin olun (yani, kaudal ve rostral ekstremiteler elektrotlara dokunmalıdır). Kasın metal elektrotlarla tamamen temas halinde olduğundan emin olun.
- Dielektrik hücrenin üst kısmını takın ve iki deliğe iki monopolar iğne (26 G) yerleştirin. EIM cihazından ex vivo hücreye kabloları aşağıdaki sırayla bağlayın: (1: I +, 2: V +, 3: V-, 4: I-, burada akım elektrotlarını temsil ederim ve V voltaj elektrotlarını temsil eder). Uzunlamasına ölçümü elde edin.
- Dielektrik hücreyi açın ve kası 90 ° döndürerek enine yönde yeniden yönlendirin. Dielektrik hücrenin üst kısmını yeniden takın. Enine ölçümü elde edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EIM, yüzey in vivo dizileri (Şekil 1), iğne in vivo dizileri (Şekil 2A-F) ve ex vivo dielektrik hücreler (Şekil 2G, H) dahil olmak üzere birçok koşulda elde edilebilir.
EIM, ölçülen empedans değerlerine dayanarak kas durumunun neredeyse anlık bir görüntüsünü sağlar. Ölçümler hızlı bir şekilde elde edilir ve herhangi bir özel yazılım gerektirmeyen basit bir çıktı veri dosyası ile sonuçlanır (Şekil 3A). Gerçekten de, bireysel frekanslar için veri sağlayan herhangi bir çok frekanslı empedans cihazı, bağımsız olarak açılabilen standart bir .csv çıkışı üretebilecektir. Bu protokolde açıklanan sistem ayrıca, çıktı dosyası içinde, ölçülen her frekansta her deneme için faz, reaktans ve direnç değerleri ile deneyin adını ve koşullarını sağlar. Tekrarlanabilirliği sağlamak için, uzunlamasına (deneme 1 ve 3) ve enine (deneme 2 ve 4) değerlerinin iki denemesi genellikle elde edilir ve ortalaması alınır ve sonraki tüm analizler için kullanılır.
Frekansın bir fonksiyonu olarak görüntülendiğinde, EIM değerleri sahte veya artefaktla kirlenmiş verileri tespit etmek için analiz edilebilen standart eğrilerle sonuçlanır. Bu tür düzensizlikler genellikle yüzey ölçümlerindeki temas sorunlarıyla ilgilidir ve düşük frekanslarda (tipik olarak büyük pozitif veya negatif değerler) gözlenen aşırı değerlerle sonuçlanır. Faz (Şekil 3B), reaktans (Şekil 3C) ve uzunlamasına (mavi daireler) ve enine (gri kareler) ölçümler için direnç (Şekil 3D) için temsili eğriler görüntülenir. Reaktansı hem uzunlamasına hem de enine yönlerde direncin bir fonksiyonu olarak gösteren bir grafik (Cole-Cole grafiği) de gösterilmektedir (Şekil 3E). Bu adım, veri denetiminin bir parçası olduğu için kritik öneme sahiptir ve sahte veya artefaktla kirlenmiş verilerin doğrudan algılanmasını sağlar. Aşırı artefakt (genellikle yüzey dizisi ile cilt arasındaki zayıf temas nedeniyle) tespit edilirse, teması iyileştirmek için birkaç prosedür takip edilebilir. Bunlar arasında ek bir tüy dökücü krem uygulaması, cildi tuzlu suyla ıslatılmış gazlı bezle yaklaşık 1 dakika nemlendirmek veya elektrot dizisine yumuşak basınç uygulamak sayılabilir. Genel olarak, ölçümü birkaç kez tekrarlamanın basit süreci de bunun çözülmesine yardımcı olacaktır.
EIM ölçümleri, kas dokusunun elektrik akımına tepkisini, her biri farklı yapıları hedefleyen çok çeşitli frekanslarda yansıtır. Örneğin, düşük frekanslar (yani, 5 kHz) miyofiber membrana nüfuz etmez, böylece inflamasyonu ve nötrofil infiltrasyonunu tespit etmek için kullanılabilecek hücre dışı özelliklerin bir analizini sağlar14. Buna karşılık, yüksek frekanslar (>1 MHz) hücre zarlarına nüfuz edebilir ve bu nedenle hem hücre içi hem de hücre dışı boşlukları sorgulayabilir ve kas lifi tip1'i ayırt etmek için kullanılmıştır.
Resim 1: 3D baskılı yüzey dizisi. İn vivo farelerde yüzey empedansı ölçümleri (hem uzunlamasına hem de enine) elde etmek için 3D baskılı bir yüzey dizisinin fotoğrafları. (A) Edinme cihazına bağlı yüzey dizisini gösteren bir fotoğraf. (B) Hem uzunlamasına hem de enine ölçümler elde etmek için diziyi 90°'ye döndürmek için kullanılan tekerleği gösteren yüzey dizisinin yakın çekimi. (C) Yüzey elektrotlarının yakın çekimi. Yüzey elektrotları aşağıdaki özelliklere sahiptir: elektrotlar genişliği = 0,5 mm, dış elektrotların uzunluğu = 4 mm, iç elektrotların uzunluğu = 3 mm ve elektrotlar arasındaki boşluk = 1 mm . Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Belirli deneysel tasarımları barındırmak için kullanılabilecek diğer diziler. Fotoğrafları: (A) sıçanlar için kullanılan ve deri altı yağın katkısını azaltmak için kaplanmış (metalik olmayan tırnak cilası kullanılarak) bir iğne dizisi (2 mm boşluk, 4 mm derinlik, 2 mm kaplama); (B) 2 mm aralıklı ve 4 mm derinliği olan bir iğne dizisi; (C) 2 mm aralıklı ve 3 mm derinliğe sahip bir iğne dizisi; (D) 2 mm aralıklı ve 2 mm derinliğe sahip bir iğne dizisi; (E) Küçük hayvanlar ve yavrular için 1 mm aralıklı ve 2 mm derinliğe sahip bir iğne dizisi; (F) 1 mm aralıklı ve 1 mm derinliği olan bir iğne dizisi; (G) yetişkin fare kasları için uyarlanmış bir ex vivo dielektrik hücre (5 mm x 5 mm); ve (H) sıçan kasları için uyarlanmış bir ex vivo dielektrik hücre (10 mm x 10 mm). Obez hayvanlar (yani, ob / ob veya db / db fareleri) üzerinde ölçümler elde etmek için modifikasyonlar (burada sunulmamıştır), iğne uzunluğunu artırarak, iletken olmayan kaplama ekleyerek ve iğne aralığını artırarak / azaltarak gerçekleştirilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Uzunlamasına (mavi) ve enine (gri) yönlerde in vivo yüzey EIM'li farelerde elde edilen veri çıkışı ve temsili eğriler. (A) İki uzunlamasına (ölçümler 1 ve 3, mavi renkli) ve iki enine (ölçümler 2 ve 4, gri renkli) EIM ölçümlerinin in vivo olarak elde edilmesinden sonra elde edilen .csv formattaki çıktı dosyası . Değerler her frekans için gösterilir (A sütunu). Analizler daha sonra sırasıyla uzunlamasına ve enine ölçümlerin ortalama değeri kullanılarak gerçekleştirilir. A1:B4 hücrelerinde bulunan bilgiler, EIM alımı sırasında seçilen etiketlere göre yazılım tarafından otomatik olarak doldurulur. Frekansın bir fonksiyonu olarak faz (B), reaktans (C) ve direncin (D) hem uzunlamasına (mavi daireler) hem de enine (gri kareler) değerleri için temsili eğriler. Empedans alanındaki standart uygulamalarla tutarlı olarak, x ekseni logaritmik bir ölçek kullanılarak gösterilir. (E) Hem uzunlamasına hem de enine ölçümler için direncin bir fonksiyonu olarak reaktansın temsili eğrileri. LP: uzunlamasına faz; TP: enine faz; LX: uzunlamasına reaktans; TX: enine reaktans; LR: uzunlamasına direnç; ve TR: enine direnç. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makale, hem in vivo hem de ex vivo kemirgenlerde EIM gerçekleştirmek için temel yöntemleri sunmaktadır. Güvenilir ölçümler elde etmek için, bir dizi adımın gerçekleştirilmesi çok önemlidir. İlk olarak, her kasın hastalıklara, tedaviye ve patolojiye farklı yanıtları olacağından, ilgilenilen kası doğru bir şekilde tanımlamanız gerekir. Bir kas (örneğin, gastroknemius) üzerinde elde edilen verilerin başka bir kasta (örneğin, tibialis anterior) aynı bilgiyi sağlamayacağına dikkat edilmelidir. İkincisi, empedans ölçümlerini gerçekleştirmek için en iyi elektrot dizisini dikkatlice seçmek gerekir. Her dizi tipi hem avantajlar hem de dezavantajlarla birlikte gelirken, hastalığın ilerlemesini ve anatomi üzerindeki etkisini (örneğin, şiddetli atrofi) dikkate alırken deneysel tasarıma uyacak bir dizi seçmek önemlidir. Son olarak, EIM, araştırmacıların birkaç saniye içinde inanılmaz miktarda veri toplamasına izin verir, ancak eserlerin bulunmadığından emin olmak için kalite kontrolünün uygun şekilde yapılması gerekir.
EIM sistemi çeşitli seviyelerde son derece özelleştirilebilir. Burada kullanılan sistem klinik ve klinik öncesi veri toplama için tasarlanmış olsa da, bireysel frekans verileri sağladığı sürece herhangi bir çok frekanslı empedans ölçüm sistemi bu amaçla kullanılabilir. Genel olarak, empedans sistemleri çıktı olarak standart bir .csv dosyası sağlar. Benzer şekilde, dizilerle ilgili ek değişiklikler yapılabilir, çünkü gerçekten gerekli olan tek şey bir çizgiye yerleştirilmiş dört elektrottur. Örneğin, bu protokolde, gereksinimleri karşılamak için çeşitli ısmarlama elektrotlar kullanılmıştır, ancak diziler basit (örneğin, epoksi yapıştırıcı, subdermal iğneler) veya karmaşık (örneğin, 3D yazıcılar) araçlar kullanılarak bireysel ihtiyaçlara göre uyarlanabilir. Alternatif olarak, dört elektrot daha önce tarif edildiği gibi tek bir iğnede birleştirilebilir20. Laboratuvarımızda küçük kasların hem uzunlamasına hem de enine yönlerde ölçülebilmesini sağlamak için elektrotlar arasındaki boşluk azaltılarak yavrular için diziler geliştirilmiştir. Önemli ölçüde daha büyük bir deri altı yağ tabakasına sahip obez hayvanlarla çalışırken, kısmen kaplanmış iğne elektrotlarının kullanılması önerilir. Bu, kas dokusunun empedans ölçümüne daha fazla katkıda bulunmasını sağlarken, yağ dokusunun katkısını azaltır21.
İğne yöntemleri ve yüzey yöntemleri, tarif edildiği ve gösterildiği gibi, hem sıçanlarda hem de farelerde kullanılabilirken, iğne ölçümlerinin sıçanlarda kullanılması önerilir, çünkü bunlar cildi hazırlamak için çaba gerektirmediğinden daha hızlıdır. Ek olarak, daha büyük boyutları, iğne elektrotlarının kaslara sadece minimum düzeyde zarar verdiği anlamına gelir. Farelerde, küçük boyutları göz önüne alındığında, kas yaralanmasını önlemek için yüzey ölçümleri önerilir ve cilt hazırlığının nispeten basit ve hızlı olduğu göz önüne alındığında.
Her EIM tekniği kendi sınırlamaları ile birlikte gelir. Önemli bir sınırlama, elektrot dizilerinin satıcılar aracılığıyla kolayca bulunamaması ve bunun yerine laboratuvarda özelleştirilmiş üretim gerektirmesidir. Yeni araştırmacılara yardımcı olmak için, bu protokol birkaç dizi (hem el yapımı hem de 3D baskılı) için ölçümler içerir ve yazarlar özel diziler sağlar veya ilgili CAD dosyalarını talep üzerine kullanılabilir hale getirir. Daha önce de belirtildiği gibi, veri kalitesi kritiktir ve ek sorunlar ölçüm türlerinin her biri için veri kalitesini etkileyebilir (örneğin, yüzey, iğne ve ex vivo). İyi yüzey verileri için, minimum temas artefaktı ile en iyi sonuçları elde etmek için saçları ve muhtemelen cildin stratum korneumunu tamamen çıkarmak gerekir. Bununla birlikte, tüy dökücü ajanın kullanımı aynı zamanda cildin zamanla yavaş yavaş ödemli hale geleceği anlamına gelir, bu nedenle epilasyondan sonra empedans ölçümlerini hızla tamamlamak gerekir. 10 dakika veya daha uzun süre beklemek, epilasyondan sonraki bir veya iki dakika içinde ölçümlerin yapılmasına kıyasla önemli ölçüde farklı değerler verebilir. Sıçanlarda veya farelerde iğne dizisi ölçümleri tipik olarak en az az miktarda kanamaya neden olur, bu da yerleştirilen iğnelerin etrafında daha büyük bir hematoma dönüşürse okumaları etkileyebilir. Son olarak, ex vivo ölçümler, dielektrik hücre içindeki kas liflerinin metal plakalara göre doğru bir şekilde hizalanmasını sağlamak için özel dikkat gerektirir. Son olarak, küçük veya hastalıklı farelerde, kasların küçük boyutu göz önüne alındığında, enine ölçümler elde etmek imkansız olabilir. Ancak, yukarıda belirtildiği gibi, en küçük kaslarda bile uzunlamasına ölçümler yapmak için yeterince küçük olabilecek özel 4 elektrot dizileri tasarlamak mümkün olmaya devam etmektedir.
Veri analizi oldukça basit tutulabilir - örneğin, tek bir frekansta (örneğin, 50 kHz) tek bir yönde (örneğin, uzunlamasına ) tek bir çıkışı (örneğin, 50 kHz) ölçerek - veya tüm frekans spektrumu boyunca tüm empedans parametrelerini hem uzunlamasına hem de enine yönlerde birleştirerek oldukça karmaşıktır. Tek frekanslı empedans değerleri kullanıldığında, bunlar tipik olarak 30-100 kHz aralığındadır, çünkü kas bu frekans aralığında en reaktif olma eğilimindedir (yani, en "yüklüdür"). Bununla birlikte, frekans spektrumunun şeklini yakalamaya çalışan yoğunlaştırılmış veya daraltılmış parametreler de kullanılmıştır. Bu değerler, direnç, reaktans ve faz verilerinin doğrusal uyumlarının eğimlerini22 ve 2 frekans oranları23'ü içermektedir. Alternatif olarak, Cole-Cole parametreleri, R0 (sıfır frekansta direncin belirlenmesi), Rinf (sonsuz frekansta direncin belirlenmesi) ve f c (merkez frekans) 24,25,26,27 dahil olmak üzere empedans verilerinin uyumlarından hesaplanabilir. Son olarak, makine öğrenimi tüm verileri aynı anda analiz etmek ve hem regresyon12,13,15,16 hem de sınıflandırma için tahmine dayalı modelleri geliştirmek için kullanılabilir.
Bu sınırlamalara rağmen, EIM kas sağlığının birçok yönünü değerlendirmek için güçlü ve nispeten basit bir araçtır. Bu makalenin odak noktası tek bir kas (gastroknemius) üzerinde olsa da, EIM'nin diğer yüzeysel kaslarda (örneğin, kuadriseps veya biseps brachii) yüzey elektrotları veya iğne elektrot dizisini kullanarak daha derin kaslar üzerinde kullanılmasını engelleyen hiçbir şey yoktur. Gerçekten de, insanlarda, teknik hem üst hem de alt ekstremite kasları8,28 ve eksenel kaslar (örneğin paraspinal kaslar ve karın kasları) dahil olmak üzere çok çeşitli kaslarda kullanılmıştır 29,30.
EIM'in zaman içinde hastalığın ilerlemesi, atrofinin remisyonu ve tedavisi ile ilgili güvenilir önlemler sağladığı gösterilmiştir. Tek frekanslı veriler, zaman içindeki hastalık durumunu değerlendirmek için tamamen yeterli olabilir31; Bununla birlikte, çok frekanslı verilerin değeri, yukarıda açıklandığı gibi, ölçümün kalitesini değerlendirmeye yardımcı olabilmesidir. İzolasyondaki tek frekanslı veriler, temas artefaktları tarafından büyük ölçüde kirletilebilir ve bu, tüm empedans spektrumunu gözden geçirmeden belirgin olmaz. Klinik çalışmalarda, yüzey EIM'si ağrısız ölçümler elde etmek için sıklıkla kullanılabilir ve bu da onu uygulamak için basit bir araç haline getirir32. Bu veri bolluğu, hastalığın ilerlemesini daha hassas bir şekilde izlemek için kritik öneme sahip olabilir. Ayrıca, EIM'nin klinik protokollere eklenmesi, bir klinik çalışma sırasında gerekli olan katılımcı sayısını önemli ölçüde azaltabilir28,31.
EIM, insanlarda çeşitli nöromüsküler durumların değerlendirilmesinde artan bir uygulama alanı bulmaktadır. Buna göre, tekniği kemirgenlerde etkili bir şekilde gerçekleştirme yeteneği, teknolojinin potansiyel pratik değerini genişletmeye yardımcı olurken, aynı zamanda çeşitli EIM çıktıları ile altta yatan histoloji arasındaki ilişkiyi anlamamızı da geliştirir. Tekniğin kullanımı genellikle kolaydır ve sağladığı yararlı nicel verilerle birlikte, kemirgen hastalığı modellerinde sinir ve kas bozukluklarının değerlendirilmesi için standart araç silahlandırmasına dahil edilmeyi hak etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S. B. Rutkove, klinik ve araştırma kullanımı için empedans cihazları tasarlayan bir şirket olan Myolex, Inc.'de ve burada kullanılan mView sisteminde özsermayeye sahiptir ve danışman ve bilimsel danışman olarak hizmet vermektedir. Aynı zamanda şirketin Yönetim Kurulu üyesidir. Şirket ayrıca, S. B. Rutkove'nin mucit olarak adlandırıldığı patentli empedans teknolojisini lisanslama seçeneğine de sahiptir. Diğer yazarların, makalede tartışılan konu veya materyallerle açıklananlar dışında, finansal çıkarı veya finansal çatışması olan herhangi bir kuruluş veya kuruluşla başka hiçbir ilgisi veya finansal ilişkisi yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Charley's Fund ve NIH R01NS055099 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Formlabs Inc. | Form 2 Desktop | 3D printer |
| 3D Printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD | Creality Ender 3 V2 | 3D printer |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher | 19-027761 and 19-061655 | models 1530-0 and 1530-1 |
| 3M TRANSPORE surgical tape | Fisher | 18-999-380 and 18-999-381 | models 1527-0 and 1527-1 |
| Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing | Digi-Key (Sullins connector solution) | S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK) | Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 22-363-172 | |
| Dental Wax | Fisher | NC9377103 | |
| Depilatory agent | NAIR | NA | hair remover lotion with softening baby oil |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | No. 11270-20 | Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm |
| Electronic Digital Caliper | Fisher | 14-648-17 | Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle |
| Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life | Devcon | series 14265, model 2217 | Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Ex vivo dielectric impedance cell | Custom | NA | Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | No. 11051-10 | Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material |
| Hair clipper | Amazon | NA | Wahl professional animal BravMini+ |
| Impedance Animal Device | Myolex | EIM1103 | mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research |
| In vivo needle arrays | Custom | NA | Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory |
| In vivo surface array | Custom | NA | The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory |
| Isoflurane | Patterson Veterinary Supplies | 07-893-8441 (NDC: 46066-755-04) | Pivetal - 250 mL bottle |
| Non-woven gauze | Fisher | 22-028-559 | 2 x 2 inch |
| Polystyrene Weighing Dishes | Fisher | S67090A | Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | No. 91460-11 | Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality |
| Subdermal needles 27 G Neuroline | Ambu | 745 12-50/24 | Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | No. 14002-13 | Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm |
| TECA ELITE monopolar needle electrodes | Natus | 902-DMG50-S | 0.46 mm diameter (26 G). Blue hub |
| Teknova 0.9% saline solution | Fisher | S5815 | 1000 mL sterile |
References
- Rutkove, S. B., Sanchez, B. Electrical impedance methods in neuromuscular assessment: An overview. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (10), 034405 (2019).
- Rutkove, S. B. Electrical impedance myography: Background, Current State, and Future Directions. Muscle & Nerve. 40, 936-946 (2009).
- Sanchez, B., Rutkove, S. B. Present uses, future applications, and technical underpinnings of electrical impedance myography. Current Neurology and Neuroscience Reports. 17 (11), 86 (2017).
- Garmirian, L. P., Chin, A. B., Rutkove, S. B. Discriminating neurogenic from myopathic disease via measurement of muscle anisotropy. Muscle & Nerve. 39 (1), 16-24 (2009).
- Rutkove, S. B., et al. Loss of electrical anisotropy is an unrecognized feature of dystrophic muscle that may serve as a convenient index of disease status. Clinical Neurophysiology. 127 (12), 3546-3551 (2016).
- Wang, L. L., et al. Assessment of alterations in the electrical impedance of muscle after experimental nerve injury via finite-element analysis. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58 (6), 1585-1591 (2011).
- Katirji, B., Ruff, R. L., Kaminski, H. J. Neuromuscular Disorders in Clinical Practice. , Springer New York. New York, NY. (2014).
- Rutkove, S. B., et al. Electrical impedance myography for assessment of Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 81 (5), 622-632 (2017).
- Semple, C., et al. Using electrical impedance myography as a biomarker of muscle deconditioning in rats exposed to micro- and partial-gravity analogs. Frontiers in Physiology. 11, 557796 (2020).
- Kortman, H. G. J., Wilder, S. C., Geisbush, T. R., Narayanaswami, P., Rutkove, S. B. Age- and gender-associated differences in electrical impedance values of skeletal muscle. Physiological Measurement. 34 (12), 1611-1622 (2013).
- Clark, B. C., Rutkove, S., Lupton, E. C., Padilla, C. J., Arnold, W. D. Potential utility of electrical impedance myography in evaluating age-related skeletal muscle function deficits. Frontiers in Physiology. 12, 666964 (2021).
- Kapur, K., et al. Predicting myofiber size with electrical impedance myography: A study in immature mice. Muscle and Nerve. 58 (1), 106-113 (2018).
- Kapur, K., Nagy, J. A., Taylor, R. S., Sanchez, B., Rutkove, S. B. Estimating myofiber size with electrical impedance myography: a study in amyotrophic lateral sclerosis mice. Muscle and Nerve. 58 (5), 713-717 (2018).
- Mortreux, M., Semple, C., Riveros, D., Nagy, J. A., Rutkove, S. B. Electrical impedance myography for the detection of muscle inflammation induced by λ-carrageenan. PLoS ONE. 14 (10), 0223265 (2019).
- Pandeya, S. R., et al. Predicting myofiber cross-sectional area and triglyceride content with electrical impedance myography: A study in db/db mice. Muscle and Nerve. 63 (1), 127-140 (2021).
- Pandeya, S. R., et al. Estimating myofiber cross-sectional area and connective tissue deposition with electrical impedance myography: A study in D2-mdx mice. Muscle & Nerve. 63 (6), 941-950 (2021).
- Stålberg, E., et al. Standards for quantification of EMG and neurography. Clinical Neurophysiology. 130 (9), 1688-1729 (2019).
- Theodorou, D. J., Theodorou, S. J., Kakitsubata, Y. Skeletal muscle disease: Patterns of MRI appearances. British Journal of Radiology. 85 (1020), 1298-1308 (2012).
- Simon, N. G., Noto, Y., Zaidman, C. M. Skeletal muscle imaging in neuromuscular disease. Journal of Clinical Neuroscience. 33, 1-10 (2016).
- Kwon, H., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Recording characteristics of electrical impedance myography needle electrodes. Physiological Measurement. 38 (9), 1748-1765 (2017).
- Kwon, H., Di Cristina, J. F., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Recording characteristics of electrical impedance-electromyography needle electrodes. Physiological Measurement. 39 (5), 055005 (2018).
- Rutkove, S. B., et al. Characterizing spinal muscular atrophy with electrical impedance myography. Muscle and Nerve. 42 (6), 915-921 (2010).
- Schwartz, S., et al. Optimizing electrical impedance myography measurements by using a multifrequency ratio: A study in Duchenne muscular dystrophy. Clinical Neurophysiology. 126 (1), 202-208 (2015).
- Li, J., Pacheck, A., Sanchez, B., Rutkove, S. B. Single and modeled multifrequency electrical impedance myography parameters and their relationship to force production in the ALS SOD1G93A mouse. Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontotemporal Degeneration. 17 (5-6), 397-403 (2016).
- Hu, N., et al. Antisense oligonucleotide and adjuvant exercise therapy reverse fatigue in old mice with myotonic dystrophy. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 23, 393-405 (2021).
- Sanchez, B., et al. Non-invasive assessment of muscle injury in healthy and dystrophic animals with electrical impedance myography. Muscle & Nerve. 56 (6), 85-94 (2017).
- Sanchez, B., Li, J., Bragos, R., Rutkove, S. B. Differentiation of the intracellular structure of slow- versus fast-twitch muscle fibers through evaluation of the dielectric properties of tissue. Physics in Medicine and Biology. 59 (10), 2369-2380 (2014).
- Shefner, J. M., et al. Assessing ALS progression with a dedicated electrical impedance myography system. Amyotrophic Lateral Sclerosis & Frontotemporal Degeneration. 19 (7-8), 555-561 (2018).
- Lungu, C., et al. Quantifying muscle asymmetries in cervical dystonia with electrical impedance: a preliminary assessment. Clinical Neurophysiology. 122 (5), 1027-1031 (2011).
- Wang, Y., et al. Electrical impedance myography for assessing paraspinal muscles of patients with low back pain. Journal of Electrical Bioimpedance. 10 (1), 103-109 (2019).
- Leitner, M. L., et al. Electrical impedance myography for reducing sample size in Duchenne muscular dystrophy trials. Annals of Clinical and Translational Neurology. 7 (1), 4-14 (2020).
- Rutkove, S. B., et al. Improved ALS clinical trials through frequent at-home self-assessment: a proof of concept study. Annals of Clinical and Translational Neurology. 7 (7), 1148-1157 (2020).
