Summary
توضح هذه المقالة بالتفصيل كيفية الأداء في الجسم الحي (باستخدام صفائف الأقطاب الكهربائية السطحية والإبرة) وخارج الجسم الحي (باستخدام خلية عازلة) تخطيط عضلات المعاوقة الكهربائية على عضلة القوارض المعدية القوارض. وسوف تظهر هذه التقنية في كل من الفئران والجرذان وتفصل التعديلات المتاحة ، (أي الحيوانات البدينة، والجراء).
Abstract
التصوير العضلي للمعاوقة الكهربائية (EIM) هو تقنية مريحة يمكن استخدامها في الدراسات قبل السريرية والسريرية لتقييم صحة الأنسجة العضلية والمرض. يتم الحصول على EIM عن طريق تطبيق تيار كهربائي منخفض الكثافة ومركز اتجاهيا على عضلة ذات أهمية عبر مجموعة من الترددات (أي من 1 كيلو هرتز إلى 10 ميجاهرتز) وتسجيل الفولتية الناتجة. من هذه ، يتم الحصول على العديد من مكونات المعاوقة القياسية ، بما في ذلك التفاعل والمقاومة والطور. عند إجراء قياسات خارج الجسم الحي على العضلات المستثناة ، يمكن أيضا حساب الخصائص الكهربائية السلبية المتأصلة في الأنسجة ، أي الموصلية والسماحية النسبية. تم استخدام EIM على نطاق واسع في الحيوانات والبشر لتشخيص وتتبع تغيرات العضلات في مجموعة متنوعة من الأمراض ، فيما يتعلق بضمور عدم الاستخدام البسيط ، أو كمقياس للتدخل العلاجي. سريريا ، توفر EIM إمكانية تتبع تطور المرض بمرور الوقت وتقييم تأثير التدخلات العلاجية ، مما يتيح الفرصة لتقصير مدة التجربة السريرية وتقليل متطلبات حجم العينة. نظرا لأنه يمكن إجراؤه بشكل غير جراحي أو بأقل قدر من التدخل الجراحي في النماذج الحيوانية الحية وكذلك البشر ، فإن EIM يوفر إمكانية العمل كأداة انتقالية جديدة تمكن من التطور قبل السريري والسريري. توفر هذه المقالة إرشادات خطوة بخطوة حول كيفية إجراء قياسات EIM في الجسم الحي وخارج الجسم الحي في الفئران والجرذان ، بما في ذلك طرق تكييف التقنيات مع ظروف محددة ، مثل استخدامها في الجراء أو الحيوانات البدينة.
Introduction
يوفر التصوير العضلي للمعاوقة الكهربائية (EIM) طريقة قوية لتقييم حالة العضلات ، مما قد يمكن من تشخيص الاضطرابات العصبية العضلية ، وتتبع تطور المرض ، وتقييم الاستجابة للعلاج1،2،3. يمكن تطبيقه بشكل مماثل على نماذج الأمراض الحيوانية والبشر ، مما يسمح بترجمة سلسة نسبيا من الدراسات قبل السريرية إلى الدراسات السريرية. يمكن الحصول على قياسات EIM بسهولة باستخدام أربعة أقطاب كهربائية موضوعة خطيا ، حيث يطبق القطبان الخارجيان تيارا كهربائيا ضعيفا وغير مؤلم عبر مجموعة من الترددات (عادة بين 1 كيلو هرتز وحوالي 2 ميجاهرتز) ، ويسجل الاثنان الداخليان الفولتية الناتجة1. من هذه الفولتية ، يمكن الحصول على خصائص مقاومة الأنسجة ، بما في ذلك المقاومة (R) ، وهو مقياس لمدى صعوبة مرور التيار عبر الأنسجة ، والمتفاعل (X) أو "قابلية الشحن" للنسيج ، وهو مقياس يتعلق بقدرة الأنسجة على تخزين الشحنة (السعة). من التفاعل والمقاومة ، يتم حساب زاوية الطور (θ) عبر المعادلة التالية: 
، مما يوفر مقياسا واحدا للمعاوقة التحصيلية. يمكن الحصول على هذه القياسات باستخدام أي جهاز معاوقة بيولوجية متعدد الترددات. نظرا لأن الألياف العضلية هي في الأساس أسطوانات طويلة ، فإن الأنسجة العضلية هي أيضا متباينة للغاية ، حيث يتدفق التيار بسهولة أكبر على طول الألياف مقارنة عبرها 4,5. وبالتالي ، غالبا ما يتم إجراء EIM في اتجاهين: مع وضع الصفيف على طول الألياف بحيث يعمل التيار بالتوازي معها ، وعبر العضلات بحيث يتدفق التيار عموديا عليها. بالإضافة إلى ذلك ، في القياسات خارج الجسم الحي ، حيث يتم قياس حجم معروف من الأنسجة في خلية قياس المعاوقة ، يمكن اشتقاق الخصائص الكهربائية المتأصلة للعضلة (أي الموصلية والسماحية النسبية) ،6.
يعرف مصطلح "الاضطرابات العصبية العضلية" مجموعة واسعة من الأمراض الأولية والثانوية التي تؤدي إلى تغيير العضلات الهيكلية واختلال وظائفها. وهذا يشمل التصلب الجانبي الضموري وأشكال مختلفة من ضمور العضلات ، وكذلك التغيرات الأبسط المتعلقة بالشيخوخة (على سبيل المثال ، ساركوبينيا) ، أو ضمور عدم الاستخدام (على سبيل المثال ، بسبب الراحة الطويلة في الفراش أو الجاذبية الصغرى) أو حتى الإصابة7. في حين أن الأسباب وفيرة ويمكن أن تنشأ من الخلايا العصبية الحركية أو الأعصاب أو التقاطعات العصبية العضلية أو العضلات نفسها ، يمكن استخدام EIM للكشف عن التغيرات المبكرة في العضلات بسبب العديد من هذه العمليات وتتبع التقدم أو الاستجابة للعلاج. على سبيل المثال ، في المرضى الذين يعانون من ضمور العضلات دوشين (DMD) ، ثبت أن EIM يكتشف تطور المرض والاستجابة للكورتيكوستيرويدات8. وقد أظهرت الأبحاث الحديثة أيضا أن EIM حساسة لحالات عدم الاستخدام المختلفة ، بما في ذلك الجاذبية الجزئية9 ، كما هو الحال على القمر أو المريخ ، وآثار الشيخوخة10,11. أخيرا ، من خلال تطبيق خوارزميات التنبؤ والتعلم الآلي على مجموعة البيانات التي تم الحصول عليها مع كل قياس (بيانات متعددة الترددات ومعتمدة على الاتجاه) ، يصبح من الممكن استنتاج الجوانب النسيجية للأنسجة ، بما في ذلك حجم الألياف العضلية12,13 ، والتغيرات الالتهابية والوذمة 14 ، والنسيج الضام ومحتوى الدهون15,16.
كما تستخدم العديد من الطرق الأخرى غير الغازية أو طفيفة التوغل لتقييم صحة العضلات لدى البشر والحيوانات ، بما في ذلك تخطيط كهربية العضلات بالإبرة17 وتقنيات التصوير مثل التصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير المقطعي المحوسب والموجات فوق الصوتية18,19. ومع ذلك ، يوضح EIM فوائد متميزة مقارنة بهذه التقنيات. على سبيل المثال ، يسجل تخطيط كهربية العضلات فقط الخصائص الكهربائية النشطة لأغشية الألياف العضلية وليس الخصائص السلبية ، وبالتالي لا يمكن أن يوفر تقييما حقيقيا لتكوين العضلات أو بنيتها. في بعض النواحي ، ترتبط طرق التصوير ارتباطا وثيقا ب EIM ، لأنها توفر أيضا معلومات حول بنية الأنسجة وتكوينها. ولكن بمعنى ما ، فإنها توفر الكثير من البيانات ، مما يتطلب تجزئة مفصلة للصور وتحليل الخبراء بدلا من مجرد توفير ناتج كمي. وعلاوة على ذلك، ونظرا لتعقيداتها، تتأثر تقنيات التصوير أيضا تأثرا كبيرا بخصائص كل من الأجهزة والبرامج المستخدمة، مما يتطلب من الناحية المثالية استخدام أنظمة متطابقة بحيث يمكن مقارنة مجموعات البيانات. في المقابل ، فإن حقيقة أن EIM أبسط بكثير تعني أنها أقل تأثرا بهذه المشكلات الفنية ولا تتطلب أي شكل من أشكال معالجة الصور أو تحليل الخبراء.
يوضح البروتوكول التالي كيفية الأداء في الجسم الحي EIM في الجرذان والفئران ، باستخدام كل من التقنيات غير الغازية (الصفيف السطحي) وطفيفة التوغل (صفيف الإبرة تحت الجلد) ، بالإضافة إلى EIM خارج الجسم الحي على العضلات المستأصلة حديثا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في مركز بيت إسرائيل ديكونيس الطبي بموجب أرقام البروتوكول (031-2019 ؛ 025-2019). ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة للتعامل مع الحيوانات والالتزام بإرشادات IACUC لجميع الأعمال الحيوانية.
1. في الجسم الحي سطح EIM
- ضع الحيوان في صندوق تخدير للحث على التخدير.
ملاحظة: بالنسبة للفئران ، تم استخدام 1.5٪ -3.5٪ isoflurane و 2 O 2 L·min-1 ، وبالنسبة للفئران ، تم استخدام 2٪ isoflurane و 1 O2 L·min-1. - بمجرد تخديره بالكامل ، كما هو موضح في غياب الاستجابة بعد قرص قدم الحيوان ، ضع الماوس على المقعد في وضع عرضة واستخدم مخروط الأنف للحفاظ على التخدير باستخدام 1.5٪ isoflurane وتدفق الأكسجين من 1 L·min-1.
- ضع ساق الحيوان ليتم تحليلها بزاوية 45 درجة مع مفصل الورك (تمديد الركبة) وتأمين القدم بشريط طبي.
- استخدم ماكينة قص الشعر لتقليم الفراء الذي يغطي عضلة المعدة والمعدة.
- ضع طبقة سميكة من كريم إزالة الشعر على جلد الحيوان واتركه لمدة 1 دقيقة. ثم ، استخدم الشاش المشبع بمحلول ملحي لإزالة عامل إزالة الشعر. كرر هذه العملية حتى ثلاث مرات حتى تتم إزالة كل الفراء الذي يغطي عضلة gastrocnemius.
ملاحظة: ضع وسادة شاش مبللة بمحلول ملحي على الجلد عندما لا يتم الحصول على قياسات لمنع جفاف الجلد. - قم بتوصيل الصفيف السطحي (الشكل 1) بجهاز EIM واترك الأقطاب الكهربائية ترتكز على قطعة من الشاش غارقة في محلول ملحي.
- ضع الصفيف السطحي مباشرة على الجلد فوق عضلة المعدة ، موجهة طوليا إلى ألياف العضلات.
- بعد التحقق من الاتصال المناسب ، والذي يشار إليه بجميع الأشرطة التي تظهر باللون الأخضر على البرنامج والتي تظهر استقرار مقاومة 50 كيلو هرتز والتفاعل وقيم الطور ، احصل على قياسات EIM.
ملاحظة: يجب التحقق من المنحنيات في الوقت الفعلي لضمان الحصول على البيانات بشكل صحيح. - قم بتدوير صفيف السطح بمقدار 90 درجة وأعد وضعه على الجلد فوق gastrocnemius للحصول على القياسات المستعرضة (تحقق من وجود أشرطة خضراء تشير إلى الاستقرار).
- كرر الخطوات 1.7 و 1.8 و 1.9 للحصول على ما مجموعه أربعة قياسات لكل عضلة: اثنان طوليان واثنان عرضيان.
ملاحظة: لا تستخدم عامل مزيل الشعر أكثر من مرة (أي ما يصل إلى ثلاثة تطبيقات في نفس الحالة) كل أسبوعين لمنع تهيج الجلد المفرط والإصابة. من المهم إجراء القياسات في غضون حوالي 5-10 دقائق من إزالة كريم إزالة الشعر لأن تطور وذمة الجلد الموضعية الناجمة عن عامل إزالة الشعر قد يؤثر على بيانات المعاوقة التي تم جمعها. انتعاش الحيوان هو مباشرة بعد وقف تخدير الأيزوفلوران ولا يتطلب الإجراء علاجا مسكنا.
2. في الجسم الحي إبرة صفيف EIM
- تخدير الحيوان وإعداد الساق باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح في الخطوات 1.1-1.4. ومع ذلك ، ليس من الضروري استخدام عامل مزيل للشعر عند الأداء في الجسم الحي EIM باستخدام صفيف إبرة.
- قم بتوصيل مصفوفة الإبرة (الشكل 2A-F) بجهاز EIM واتركها تستقر في قارب وزن يحتوي على محلول ملحي. تحقق من إمكانية الاتصال واستقرار الإشارة (المشار إليها بالأشرطة الخضراء).
- تطهير الجلد والإبر بالكحول. ضع مصفوفة الإبرة في وضع طولي مقارنة بالألياف العضلية واضغط عليها بقوة في الجلد حتى تخترق جميع الإبر الجلد والعضلات الأساسية حتى الواقي البلاستيكي على الصفيف. الحصول على البيانات.
- قم بإزالة الصفيف بلطف وإعادة إدخاله عبر الجلد وفي العضلات بزاوية 90 درجة بالنسبة للقياس الأول ، في الاتجاه العرضي. الحصول على البيانات.
ملاحظة: عند استخدام صفائف الإبر، يجب الحصول على القياسات مرة واحدة فقط في كل اتجاه لتقليل تأثير أقطاب الإبرة على الجلد والأنسجة العضلية. في حالة حدوث نزيف، امسح الدم برفق قبل إجراء القياس الثاني. انتعاش الحيوان هو مباشرة بعد وقف تخدير الأيزوفلوران ولا يتطلب الإجراء علاجا مسكنا.
3. خارج الجسم الحي EIM
- قم بإعداد الخلية العازلة خارج الجسم الحي (الشكل 2G ، H) ، وأضف محلول ملحي إلى الغرفة ، وقم بتوصيل الخلية بجهاز EIM للحصول على القيم المرجعية.
ملاحظة: ينبغي أن تظل قيم الطور والمفاعل للمحلول الملحي ثابتة عند الصفر أو بالقرب منه، وينبغي أن تظل قيم مقاومة المحلول الملحي ثابتة عند حوالي 100 ± 25 Ω فوق نطاق التردد من 1 كيلو هرتز إلى 1 ميغاهرتز. - القتل الرحيم للحيوان وفقا لإرشادات IACUC ذات الصلة.
- باستخدام زوج من المقص ، اقطع الجلد بالقرب من وتر أخيل. باستخدام ملاقط ، اسحب الجلد في حركة تصاعدية للكشف عن العضلات واللفافة الكامنة. تشريح بلطف عظم الفخذ ذات الرأسين التي تغطي عضلة المعدة وتقسيم العصب الوركي.
- اقطع وتر أخيل لتحرير الطرف البعيد من عضلات المعدة والنعل واسحب الوتر بلطف لأعلى أثناء استخدام المقص لإزالة أي مرفقات. بمجرد إزالة جميع المرفقات ، استخدم المقص لقطع نهاية السطح للعضلة النعلية وإزالتها.
- استخدم المقص لتشريح رؤوس عضلة المعدة حول الرضفة.
ملاحظة: بعد إزالة عضلة المعدة ، من المهم أن تتذكر الاتجاه الأصلي للألياف العضلية. - ضع عضلة المعدة على ورقة من شمع الأسنان وقسمها باستخدام شفرة حلاقة ومسطرة للحصول على قسم 10 مم × 10 مم من وسط عضلة gastrocnemius.
ملاحظة: يمكن تخصيص حجم الخلية العازلة. بالنسبة للفئران ، تم استخدام خلية 10 مم × 10 مم وبالنسبة للفئران ، تم استخدام خلية 5 مم × 5 مم. - باستخدام ملاقط ، ضع المعدة بلطف في الخلايا العازلة ، مع التأكد من أن الألياف موجهة طوليا (أي ، يجب أن تلمس الأطراف الذيلية والسطحية الأقطاب الكهربائية). تأكد من أن العضلات على اتصال كامل مع الأقطاب الكهربائية المعدنية.
- قم بتوصيل الجزء العلوي من الخلية العازلة وأدخل إبرتين أحاديتي القطب (26 جم) في الثقبين. قم بتوصيل الأسلاك من جهاز EIM بالخلية خارج الجسم الحي بالترتيب التالي: (1: I + ، 2: V + ، 3: V-، 4: I-، حيث I يمثل الأقطاب الكهربائية الحالية و V يمثل أقطاب الجهد). الحصول على القياس الطولي.
- افتح الخلية العازلة وأعد توجيه العضلات في الاتجاه العرضي عن طريق تدويرها 90 درجة. أعد توصيل الجزء العلوي من الخلية العازلة. الحصول على القياس المستعرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن الحصول على EIM في العديد من الظروف ، بما في ذلك صفائف السطح في الجسم الحي (الشكل 1) ، والإبرة في صفائف الجسم الحي (الشكل 2A-F) ، والخلايا العازلة خارج الجسم الحي (الشكل 2G ، H).
يوفر EIM لقطة شبه فورية لحالة العضلات بناء على قيم المعاوقة المقاسة. يتم الحصول على القياسات بسرعة وتؤدي إلى ملف بيانات إخراج بسيط لا يتطلب أي برنامج خاص (الشكل 3A). في الواقع ، سيكون أي جهاز معاوقة متعدد الترددات يوفر بيانات للترددات الفردية قادرا على إنتاج مخرجات .csv قياسية يمكن فتحها بشكل مستقل. يوفر النظام الموصوف في هذا البروتوكول أيضا اسم التجربة وشروطها ، مع قيم الطور والتفاعل والمقاومة لكل تجربة عند كل تردد تم قياسه ، داخل ملف الإخراج. ولضمان إمكانية التكرار، يتم عموما الحصول على تجربتين من القيم الطولية (التجربتان 1 و3) والمستعرضة (التجربتان 2 و4) ومتوسطهما، واستخدامهما في جميع التحليلات اللاحقة.
عند عرضها كدالة للتردد، تؤدي قيم EIM إلى منحنيات قياسية يمكن تحليلها للكشف عن البيانات الزائفة أو الملوثة بالقطع الأثرية. وعادة ما ترتبط هذه المخالفات بمسائل التلامس في قياسات السطح، مما يؤدي إلى قيم متطرفة لوحظت عند ترددات منخفضة (عادة ما تكون قيما إيجابية أو سلبية كبيرة). يتم عرض المنحنيات التمثيلية للطور (الشكل 3B) ، والمفاعل (الشكل 3C) ، والمقاومة (الشكل 3D) للقياسات الطولية (الدوائر الزرقاء) والمستعرضة (المربعات الرمادية). كما يتم عرض رسم بياني يوضح التفاعل كدالة للمقاومة (مخطط كول-كول) في كل من الاتجاهين الطولي والعرضي (الشكل 3E). هذه الخطوة بالغة الأهمية لأنها جزء من التحقق من البيانات ، مما يسمح بالكشف المباشر عن البيانات الزائفة أو الملوثة بالقطع الأثرية. إذا تم الكشف عن قطعة أثرية مفرطة (عادة بسبب ضعف الاتصال بين الصفيف السطحي والجلد) ، فيمكن اتباع العديد من الإجراءات لتحسين الاتصال. ويشمل ذلك تطبيق إضافي لكريم مزيل الشعر ، أو ترطيب الجلد لمدة 1 دقيقة تقريبا باستخدام وسادة شاش مبللة مالحة ، أو تطبيق ضغط لطيف على صفيف القطب الكهربائي. بشكل عام ، ستساعد العملية البسيطة لتكرار القياس عدة مرات أيضا في حل هذه المشكلة.
تعكس قياسات EIM استجابة الأنسجة العضلية للتيار الكهربائي عبر مجموعة واسعة من الترددات ، كل منها يستهدف هياكل مختلفة. على سبيل المثال ، لا تخترق الترددات المنخفضة (أي 5 كيلو هرتز) غشاء الألياف العضلية ، مما يوفر تحليلا للميزات خارج الخلية التي يمكن استخدامها للكشف عن الالتهاب وتسلل العدلات14. في المقابل ، يمكن للترددات العالية (>1 ميجاهرتز) اختراق أغشية الخلايا وبالتالي استجواب كل من المساحات داخل الخلايا وكذلك خارج الخلية وقد استخدمت للتمييز بين ألياف العضلات من النوع1.
الشكل 1: صفيف السطح المطبوع 3D. صور فوتوغرافية لمصفوفة سطحية تمت طباعتها 3D للحصول على قياسات معاوقة السطح (الطولية والعرضية) في الفئران في الجسم الحي. (أ) صورة فوتوغرافية تظهر الصفيف السطحي المتصل بجهاز الاقتناء. (ب) صورة مقربة للمصفوفة السطحية تظهر العجلة المستخدمة لتحويل الصفيف إلى 90 درجة للحصول على قياسات طولية وعرضية. (ج) صورة مقربة للأقطاب الكهربائية السطحية. تتميز الأقطاب الكهربائية السطحية بالخصائص التالية: عرض الأقطاب الكهربائية = 0.5 مم ، طول الأقطاب الخارجية = 4 مم ، طول الأقطاب الداخلية = 3 مم ، والتباعد بين الأقطاب الكهربائية = 1 مم .
الشكل 2: صفائف أخرى يمكن استخدامها لاستيعاب تصاميم تجريبية محددة. صور فوتوغرافية لما يلي: (أ) مصفوفة إبرة تستخدم للفئران ومغلفة (باستخدام ورنيش الأظافر غير المعدني) لتقليل مساهمة الدهون تحت الجلد (مساحة 2 مم ، عمق 4 مم ، طلاء 2 مم) ؛ (ب) مصفوفة إبرة ذات تباعد 2 مم وعمق 4 مم؛ (ج) مصفوفة إبرة ذات تباعد 2 مم وعمق 3 مم؛ (د) صفيف إبرة بمسافة 2 مم وعمق 2 مم؛ (ه) مصفوفة إبرة للحيوانات الصغيرة والجراء مع تباعد 1 مم وعمق 2 مم ؛ (F) صفيف إبرة بمسافة 1 مم وعمق 1 مم؛ (ز) خلية عازلة خارج الجسم الحي مصممة خصيصا لعضلات الفأر البالغة (5 مم × 5 مم) ؛ و (H) خلية عازلة خارج الجسم الحي مصممة خصيصا لعضلات الفئران (10 مم × 10 مم). يمكن إجراء التعديلات (النتائج غير المعروضة هنا) للحصول على قياسات على الحيوانات التي تعاني من السمنة المفرطة (أي الفئران ob / ob أو db / db) عن طريق زيادة طول الإبرة ، وإضافة طلاء غير موصل ، وزيادة / تقليل تباعد الإبرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: ناتج البيانات والمنحنيات التمثيلية التي تم الحصول عليها في الفئران ذات السطح الحي EIM في الاتجاهين الطولي (الأزرق) والعرضي (الرمادي). (أ) ملف الإخراج بتنسيق .csv تم الحصول عليه بعد الحصول على قياسين طوليين (القياسان 1 و 3 ، ملونان باللون الأزرق) واثنين عرضيين (القياسات 2 و 4 ، الملونة باللون الرمادي) EIM في الجسم الحي . يشار إلى القيم لكل تردد (العمود A). يتم إجراء التحليلات لاحقا باستخدام متوسط قيمة القياسات الطولية والعرضية ، على التوالي. يتم ملء المعلومات الموجودة في الخلايا A1: B4 تلقائيا بواسطة البرنامج ، وفقا للتسميات التي تم اختيارها أثناء اكتساب EIM. منحنيات تمثيلية لكل من القيم الطولية (الدوائر الزرقاء) والمستعرضة (المربعات الرمادية) للطور (B) والمتفاعل (C) والمقاومة (D) كدالة للتردد. تمشيا مع الممارسات القياسية في مجال المعاوقة ، يشار إلى المحور x باستخدام مقياس لوغاريتمي. (ه) المنحنيات التمثيلية للمفاعل كدالة للمقاومة لكل من القياسات الطولية والعرضية. LP: مرحلة طولية. TP: المرحلة المستعرضة. LX: رد فعل طولي. TX: المفاعل المستعرض. LR: المقاومة الطولية. و TR: مقاومة عرضية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
توفر هذه المقالة الطرق الأساسية لأداء EIM في القوارض ، سواء في الجسم الحي أو الجسم الحي السابق. للحصول على قياسات موثوقة ، من الأهمية بمكان تنفيذ سلسلة من الخطوات. أولا ، يحتاج المرء إلى تحديد العضلات ذات الاهتمام بشكل صحيح ، حيث سيكون لكل عضلة استجابات مختلفة للأمراض والعلاج والأمراض. يجب على المرء أن يضع في اعتباره أن البيانات التي تم الحصول عليها على عضلة واحدة (على سبيل المثال ، gastrocnemius) لن توفر نفس المعلومات كما هو الحال في عضلة أخرى (على سبيل المثال ، الظنبوب الأمامي). ثانيا ، يحتاج المرء إلى اختيار أفضل مجموعة قطب كهربائي بعناية لإجراء قياسات المعاوقة. في حين أن كل نوع من أنواع الصفيف يأتي مع كل من المزايا والعيوب ، فمن المهم اختيار صفيف يناسب التصميم التجريبي مع مراعاة تطور المرض والتأثير على علم التشريح (على سبيل المثال ، ضمور شديد). أخيرا ، يسمح EIM للمحققين بجمع كمية لا تصدق من البيانات في بضع ثوان ، ولكن يجب إجراء مراقبة الجودة بشكل صحيح لضمان عدم وجود القطع الأثرية.
نظام EIM قابل للتخصيص بدرجة عالية على عدة مستويات. في حين أن النظام المستخدم هنا قد تم تصميمه لجمع البيانات السريرية وما قبل السريرية ، يمكن استخدام أي نظام لقياس المعاوقة متعددة الترددات لهذا الغرض ، طالما أنه يوفر بيانات تردد فردية. بشكل عام ، توفر أنظمة المعاوقة ملفا قياسيا .csv كمخرجات. وبالمثل ، يمكن إجراء تعديلات إضافية فيما يتعلق بالمصفوفات ، حيث أن كل ما هو مطلوب حقا هو أربعة أقطاب كهربائية موضوعة في خط. على سبيل المثال ، في هذا البروتوكول ، تم استخدام مجموعة متنوعة من الأقطاب الكهربائية المصممة خصيصا لتلبية المتطلبات ، ولكن يمكن تصميم المصفوفات وفقا للاحتياجات الفردية باستخدام أدوات بسيطة (على سبيل المثال ، غراء الايبوكسي ، إبر تحت الجلد) أو معقدة (على سبيل المثال ، طابعات 3D). بدلا من ذلك ، يمكن دمج الأقطاب الكهربائية الأربعة في إبرة واحدة ، كما هو موضح سابقا20. في مختبرنا ، تم تطوير صفائف للجراء عن طريق تقليل التباعد بين الأقطاب الكهربائية لضمان إمكانية قياس العضلات الصغيرة في كل من الاتجاهين الطولي والعرضي. عند العمل مع الحيوانات البدينة، التي لديها طبقة أكبر بكثير من الدهون تحت الجلد، يوصى باستخدام أقطاب الإبرة المغلفة جزئيا. وهذا يتيح مساهمة أكبر للأنسجة العضلية في قياس المعاوقة مع تقليل مساهمة الأنسجة الدهنية21.
في حين يمكن استخدام طرق الإبرة وطرق السطح في كل من الجرذان والفئران ، كما هو موضح ومبين ، فمن المستحسن عموما استخدام قياسات الإبرة في الفئران ، لأنها أسرع لأنها لا تتطلب جهدا لإعداد الجلد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حجمها الأكبر يعني أن أقطاب الإبرة لا تصيب العضلات إلا بالحد الأدنى. في الفئران ، نظرا لصغر حجمها ، يوصى بإجراء قياسات سطحية لتجنب إصابة العضلات وبالنظر إلى أن إعداد الجلد بسيط وسريع نسبيا.
تأتي كل تقنية EIM مع مجموعة خاصة بها من القيود. أحد القيود الرئيسية هو أن صفائف الأقطاب الكهربائية ليست متاحة بسهولة من خلال البائعين ، وبدلا من ذلك تتطلب توليدا مخصصا في المختبر. لمساعدة المحققين الجدد ، يتضمن هذا البروتوكول قياسات للعديد من المصفوفات (سواء المصنوعة يدويا أو المطبوعة 3D) ، وسيقوم المؤلفون بتوفير صفائف مخصصة أو إتاحة ملفات CAD ذات الصلة عند الطلب. كما ذكرنا سابقا ، تعد جودة البيانات أمرا بالغ الأهمية ، ويمكن أن تتداخل المشكلات الإضافية مع جودة البيانات لكل نوع من أنواع القياس (على سبيل المثال ، السطح والإبرة والجسم الحي السابق). للحصول على بيانات سطحية جيدة ، من الضروري إزالة الشعر تماما ، ومن المحتمل أن تكون الطبقة القرنية للجلد أيضا ، للحصول على أفضل النتائج مع الحد الأدنى من القطع الأثرية الملامسة. ومع ذلك ، فإن استخدام عامل إزالة الشعر يعني أيضا أن الجلد سيصبح ببطء ذمي بمرور الوقت ، لذلك من الضروري إكمال قياسات المعاوقة بسرعة بعد إزالة الشعر. الانتظار لمدة 10 دقائق أو أكثر قد يؤدي إلى قيم مختلفة بشكل كبير مقارنة بإجراء القياسات في غضون دقيقة أو دقيقتين من إزالة الشعر. عادة ما تحفز قياسات مصفوفة الإبر في الجرذان أو الفئران كمية صغيرة على الأقل من النزيف ، مما قد يؤثر على القراءات إذا تحول إلى ورم دموي أكبر حول الإبر المدخلة. وأخيرا، تتطلب القياسات خارج الجسم الحي عناية خاصة لضمان محاذاة ألياف العضلات داخل الخلية العازلة بدقة فيما يتعلق بالصفائح المعدنية. أخيرا ، في الفئران الصغيرة أو المريضة ، قد يكون من المستحيل الحصول على قياسات عرضية ، نظرا لصغر حجم العضلات. ولكن ، كما هو مذكور أعلاه ، لا يزال من الممكن تصميم صفائف مخصصة من 4 أقطاب كهربائية يمكن أن تكون صغيرة بما يكفي لإجراء قياسات طولية داخل أصغر العضلات.
ويمكن أن يظل تحليل البيانات بسيطا جدا - على سبيل المثال، عن طريق قياس ناتج واحد (مثل الطور) على تردد واحد (مثل 50 كيلو هرتز) في اتجاه واحد (على سبيل المثال، طولي) - أو معقدا جدا، عن طريق دمج جميع بارامترات المعاوقة عبر طيف التردد بأكمله في الاتجاهين الطولي والعرضي على حد سواء. عند استخدام قيم معاوقة التردد الواحد ، فإنها عادة ما تكون في نطاق 30-100 كيلو هرتز ، لأن العضلات تميل إلى أن تكون الأكثر تفاعلا (أي أنها الأكثر "قابلية للشحن") في نطاق التردد هذا. ومع ذلك، استخدمت أيضا بارامترات مكثفة أو منهارة، تحاول التقاط شكل طيف الترددات. وقد تضمنت هذه القيم منحدرات من التناسبات الخطية للمقاومة والتفاعل وبيانات الطور22 و 2 من نسب التردد23. بدلا من ذلك ، يمكن حساب معلمات Cole-Cole من نوبات بيانات المعاوقة ، بما في ذلك R0 (تحديد المقاومة عند تردد صفر) ، Rinf (تحديد المقاومة عند تردد لا نهائي) ، و fc (تردد المركز) 24،25،26،27. وأخيرا، يمكن استخدام التعلم الآلي لتحليل جميع البيانات في وقت واحد وتحسين النماذج التنبؤية، سواء بالنسبة للانحدار12،13،15،16، أو التصنيف.
على الرغم من هذه القيود ، فإن EIM هي أداة قوية وبسيطة نسبيا لتقييم جوانب متعددة من صحة العضلات. في حين أن تركيز هذه المخطوطة ينصب على عضلة واحدة (gastrocnemius) ، لا يوجد شيء يمنع استخدام EIM على العضلات السطحية الأخرى (على سبيل المثال ، العضلة رباعية الرؤوس أو العضلة ذات الرأسين العضدية) باستخدام أقطاب سطحية أو عضلات أعمق باستخدام مصفوفة قطب الإبرة. في الواقع ، في البشر ، تم استخدام هذه التقنية في مجموعة واسعة من العضلات ، بما في ذلك عضلات الأطراف العلوية والسفلية 8,28 ، وكذلك العضلات المحورية (مثل العضلات شبه الشوكية وعضلات البطن)29,30.
وقد تبين أن EIM يوفر تدابير موثوقة فيما يتعلق بتطور المرض ، ومغفرة الضمور ، والعلاج مع مرور الوقت. وقد تكون البيانات أحادية التردد كافية تماما لتقييم حالة المرض بمرور الوقت31؛ ومع ذلك ، فإن قيمة البيانات متعددة الترددات هي أنه لا يزال بإمكانها المساعدة في تقييم جودة القياس ، كما هو موضح أعلاه. ويمكن أن تكون البيانات أحادية التردد بمعزل عن بعضها البعض ملوثة إلى حد كبير بالقطع الأثرية الملامسة، ولن يكون ذلك واضحا دون استعراض طيف المعاوقة بأكمله. في الدراسات السريرية ، يمكن استخدام EIM السطحي بشكل متكرر للحصول على قياسات غير مؤلمة مما يجعله أداة بسيطة لتطبيق32. يمكن أن تكون هذه الوفرة من البيانات حاسمة لتتبع تطور المرض بشكل أكثر حساسية. علاوة على ذلك ، فإن إضافة EIM إلى البروتوكولات السريرية يمكن أن تقلل بشكل كبير من عدد المشاركين المطلوبين خلال التجربة السريرية28,31.
تجد EIM تطبيقا متزايدا في تقييم مجموعة متنوعة من الحالات العصبية العضلية لدى البشر. وبناء على ذلك ، فإن القدرة على أداء هذه التقنية بفعالية في القوارض تساعد على توسيع القيمة العملية المحتملة للتكنولوجيا مع تعزيز فهمنا للعلاقة بين مخرجات EIM المختلفة والأنسجة الأساسية. هذه التقنية سهلة الاستخدام بشكل عام ، وإلى جانب البيانات الكمية المفيدة التي توفرها ، تستحق أن تدرج في التسلح القياسي للأدوات لتقييم اضطرابات الأعصاب والعضلات في نماذج أمراض القوارض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لدى S. B. Rutkove أسهم في شركة Myolex، Inc. ، وهي شركة تصمم أجهزة مقاومة للاستخدام السريري والبحثي ، وتعمل كمستشار ومستشار علمي لشركة Myolex، Inc. ، ونظام mView المستخدم هنا. وهو أيضا عضو في مجلس إدارة الشركة. لدى الشركة أيضا خيار ترخيص تقنية المعاوقة الحاصلة على براءة اختراع والتي تم تسمية S. B. Rutkove كمخترع لها. ليس للمؤلفين الآخرين أي انتماءات أخرى ذات صلة أو مشاركة مالية مع أي منظمة أو كيان له مصلحة مالية أو تضارب مالي مع الموضوع أو المواد التي نوقشت في المخطوطة باستثناء تلك التي تم الكشف عنها.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل صندوق تشارلي والمعاهد الوطنية للصحة R01NS055099.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Formlabs Inc. | Form 2 Desktop | 3D printer |
| 3D Printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD | Creality Ender 3 V2 | 3D printer |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher | 19-027761 and 19-061655 | models 1530-0 and 1530-1 |
| 3M TRANSPORE surgical tape | Fisher | 18-999-380 and 18-999-381 | models 1527-0 and 1527-1 |
| Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing | Digi-Key (Sullins connector solution) | S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK) | Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 22-363-172 | |
| Dental Wax | Fisher | NC9377103 | |
| Depilatory agent | NAIR | NA | hair remover lotion with softening baby oil |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | No. 11270-20 | Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm |
| Electronic Digital Caliper | Fisher | 14-648-17 | Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle |
| Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life | Devcon | series 14265, model 2217 | Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Ex vivo dielectric impedance cell | Custom | NA | Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | No. 11051-10 | Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material |
| Hair clipper | Amazon | NA | Wahl professional animal BravMini+ |
| Impedance Animal Device | Myolex | EIM1103 | mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research |
| In vivo needle arrays | Custom | NA | Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory |
| In vivo surface array | Custom | NA | The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory |
| Isoflurane | Patterson Veterinary Supplies | 07-893-8441 (NDC: 46066-755-04) | Pivetal - 250 mL bottle |
| Non-woven gauze | Fisher | 22-028-559 | 2 x 2 inch |
| Polystyrene Weighing Dishes | Fisher | S67090A | Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | No. 91460-11 | Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality |
| Subdermal needles 27 G Neuroline | Ambu | 745 12-50/24 | Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | No. 14002-13 | Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm |
| TECA ELITE monopolar needle electrodes | Natus | 902-DMG50-S | 0.46 mm diameter (26 G). Blue hub |
| Teknova 0.9% saline solution | Fisher | S5815 | 1000 mL sterile |
References
- Rutkove, S. B., Sanchez, B. Electrical impedance methods in neuromuscular assessment: An overview. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (10), 034405 (2019).
- Rutkove, S. B. Electrical impedance myography: Background, Current State, and Future Directions. Muscle & Nerve. 40, 936-946 (2009).
- Sanchez, B., Rutkove, S. B. Present uses, future applications, and technical underpinnings of electrical impedance myography. Current Neurology and Neuroscience Reports. 17 (11), 86 (2017).
- Garmirian, L. P., Chin, A. B., Rutkove, S. B. Discriminating neurogenic from myopathic disease via measurement of muscle anisotropy. Muscle & Nerve. 39 (1), 16-24 (2009).
- Rutkove, S. B., et al. Loss of electrical anisotropy is an unrecognized feature of dystrophic muscle that may serve as a convenient index of disease status. Clinical Neurophysiology. 127 (12), 3546-3551 (2016).
- Wang, L. L., et al. Assessment of alterations in the electrical impedance of muscle after experimental nerve injury via finite-element analysis. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58 (6), 1585-1591 (2011).
- Katirji, B., Ruff, R. L., Kaminski, H. J. Neuromuscular Disorders in Clinical Practice. , Springer New York. New York, NY. (2014).
- Rutkove, S. B., et al. Electrical impedance myography for assessment of Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 81 (5), 622-632 (2017).
- Semple, C., et al. Using electrical impedance myography as a biomarker of muscle deconditioning in rats exposed to micro- and partial-gravity analogs. Frontiers in Physiology. 11, 557796 (2020).
- Kortman, H. G. J., Wilder, S. C., Geisbush, T. R., Narayanaswami, P., Rutkove, S. B. Age- and gender-associated differences in electrical impedance values of skeletal muscle. Physiological Measurement. 34 (12), 1611-1622 (2013).
- Clark, B. C., Rutkove, S., Lupton, E. C., Padilla, C. J., Arnold, W. D. Potential utility of electrical impedance myography in evaluating age-related skeletal muscle function deficits. Frontiers in Physiology. 12, 666964 (2021).
- Kapur, K., et al. Predicting myofiber size with electrical impedance myography: A study in immature mice. Muscle and Nerve. 58 (1), 106-113 (2018).
- Kapur, K., Nagy, J. A., Taylor, R. S., Sanchez, B., Rutkove, S. B. Estimating myofiber size with electrical impedance myography: a study in amyotrophic lateral sclerosis mice. Muscle and Nerve. 58 (5), 713-717 (2018).
- Mortreux, M., Semple, C., Riveros, D., Nagy, J. A., Rutkove, S. B. Electrical impedance myography for the detection of muscle inflammation induced by λ-carrageenan. PLoS ONE. 14 (10), 0223265 (2019).
- Pandeya, S. R., et al. Predicting myofiber cross-sectional area and triglyceride content with electrical impedance myography: A study in db/db mice. Muscle and Nerve. 63 (1), 127-140 (2021).
- Pandeya, S. R., et al. Estimating myofiber cross-sectional area and connective tissue deposition with electrical impedance myography: A study in D2-mdx mice. Muscle & Nerve. 63 (6), 941-950 (2021).
- Stålberg, E., et al. Standards for quantification of EMG and neurography. Clinical Neurophysiology. 130 (9), 1688-1729 (2019).
- Theodorou, D. J., Theodorou, S. J., Kakitsubata, Y. Skeletal muscle disease: Patterns of MRI appearances. British Journal of Radiology. 85 (1020), 1298-1308 (2012).
- Simon, N. G., Noto, Y., Zaidman, C. M. Skeletal muscle imaging in neuromuscular disease. Journal of Clinical Neuroscience. 33, 1-10 (2016).
- Kwon, H., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Recording characteristics of electrical impedance myography needle electrodes. Physiological Measurement. 38 (9), 1748-1765 (2017).
- Kwon, H., Di Cristina, J. F., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Recording characteristics of electrical impedance-electromyography needle electrodes. Physiological Measurement. 39 (5), 055005 (2018).
- Rutkove, S. B., et al. Characterizing spinal muscular atrophy with electrical impedance myography. Muscle and Nerve. 42 (6), 915-921 (2010).
- Schwartz, S., et al. Optimizing electrical impedance myography measurements by using a multifrequency ratio: A study in Duchenne muscular dystrophy. Clinical Neurophysiology. 126 (1), 202-208 (2015).
- Li, J., Pacheck, A., Sanchez, B., Rutkove, S. B. Single and modeled multifrequency electrical impedance myography parameters and their relationship to force production in the ALS SOD1G93A mouse. Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontotemporal Degeneration. 17 (5-6), 397-403 (2016).
- Hu, N., et al. Antisense oligonucleotide and adjuvant exercise therapy reverse fatigue in old mice with myotonic dystrophy. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 23, 393-405 (2021).
- Sanchez, B., et al. Non-invasive assessment of muscle injury in healthy and dystrophic animals with electrical impedance myography. Muscle & Nerve. 56 (6), 85-94 (2017).
- Sanchez, B., Li, J., Bragos, R., Rutkove, S. B. Differentiation of the intracellular structure of slow- versus fast-twitch muscle fibers through evaluation of the dielectric properties of tissue. Physics in Medicine and Biology. 59 (10), 2369-2380 (2014).
- Shefner, J. M., et al. Assessing ALS progression with a dedicated electrical impedance myography system. Amyotrophic Lateral Sclerosis & Frontotemporal Degeneration. 19 (7-8), 555-561 (2018).
- Lungu, C., et al. Quantifying muscle asymmetries in cervical dystonia with electrical impedance: a preliminary assessment. Clinical Neurophysiology. 122 (5), 1027-1031 (2011).
- Wang, Y., et al. Electrical impedance myography for assessing paraspinal muscles of patients with low back pain. Journal of Electrical Bioimpedance. 10 (1), 103-109 (2019).
- Leitner, M. L., et al. Electrical impedance myography for reducing sample size in Duchenne muscular dystrophy trials. Annals of Clinical and Translational Neurology. 7 (1), 4-14 (2020).
- Rutkove, S. B., et al. Improved ALS clinical trials through frequent at-home self-assessment: a proof of concept study. Annals of Clinical and Translational Neurology. 7 (7), 1148-1157 (2020).
