Summary
Questo articolo descrive in dettaglio come eseguire la miografia ad impedenza elettrica in vivo (utilizzando array di elettrodi di superficie e ad ago) ed ex vivo (utilizzando una cella dielettrica) sul muscolo gastrocnemio dei roditori. Dimostrerà la tecnica sia nei topi che nei ratti e dettaglierà le modifiche disponibili (cioè animali obesi, cuccioli).
Abstract
La miografia ad impedenza elettrica (EIM) è una tecnica conveniente che può essere utilizzata in studi preclinici e clinici per valutare la salute e la malattia del tessuto muscolare. L'EIM si ottiene applicando una corrente elettrica a bassa intensità, focalizzata direzionalmente, a un muscolo di interesse attraverso una gamma di frequenze (cioè da 1 kHz a 10 MHz) e registrando le tensioni risultanti. Da questi, si ottengono diversi componenti di impedenza standard, tra cui la reattanza, la resistenza e la fase. Quando si eseguono misurazioni ex vivo sul muscolo asportato, è possibile calcolare anche le proprietà elettriche passive intrinseche del tessuto, vale a dire la conducibilità e la permittività relativa. L'EIM è stato ampiamente utilizzato negli animali e nell'uomo per diagnosticare e monitorare le alterazioni muscolari in una varietà di malattie, in relazione alla semplice atrofia da disuso o come misura di intervento terapeutico. Dal punto di vista clinico, l'EIM offre il potenziale per monitorare la progressione della malattia nel tempo e valutare l'impatto degli interventi terapeutici, offrendo così l'opportunità di abbreviare la durata della sperimentazione clinica e ridurre i requisiti di dimensione del campione. Poiché può essere eseguito in modo non invasivo o minimamente invasivo in modelli animali viventi e nell'uomo, EIM offre il potenziale per fungere da nuovo strumento traslazionale che consente sia lo sviluppo preclinico che clinico. Questo articolo fornisce istruzioni dettagliate su come eseguire misurazioni EIM in vivo ed ex vivo in topi e ratti, compresi gli approcci per adattare le tecniche a condizioni specifiche, come per l'uso in cuccioli o animali obesi.
Introduction
La miografia ad impedenza elettrica (EIM) fornisce un potente metodo per valutare le condizioni muscolari, consentendo potenzialmente la diagnosi di disturbi neuromuscolari, il monitoraggio della progressione della malattia e la valutazione della risposta alla terapia 1,2,3. Può essere applicato analogamente ai modelli di malattie animali e agli esseri umani, consentendo una traduzione relativamente fluida dagli studi preclinici a quelli clinici. Le misure EIM sono facilmente ottenute utilizzando quattro elettrodi posizionati linearmente, con i due esterni che applicano una corrente elettrica indolore e debole su un intervallo di frequenze (generalmente tra 1 kHz e circa 2 MHz), e i due interni che registrano le tensioni risultanti1. Da queste tensioni si possono ottenere le caratteristiche di impedenza del tessuto, tra cui la resistenza (R), una misura di quanto sia difficile per la corrente passare attraverso il tessuto, e la reattanza (X) o "caricabilità" del tessuto, una misura correlata alla capacità del tessuto di immagazzinare carica (capacità). Dalla reattanza e dalla resistenza, l'angolo di fase (θ) viene calcolato tramite la seguente equazione: 
, fornendo una singola misura sommativa dell'impedenza. Tali misurazioni possono essere ottenute utilizzando qualsiasi dispositivo di bioimpedenza multifrequenza. Poiché le miofibre sono essenzialmente cilindri lunghi, il tessuto muscolare è anche altamente anisotropo, con la corrente che scorre più facilmente lungo le fibre che attraverso di esse 4,5. Pertanto, l'EIM viene spesso eseguito in due direzioni: con l'array posizionato lungo le fibre in modo tale che la corrente scorra parallela a loro e attraverso il muscolo in modo tale che la corrente fluisca perpendicolarmente a loro. Inoltre, nelle misurazioni ex vivo, in cui un volume noto di tessuto viene misurato in una cella di misurazione dell'impedenza, è possibile derivare le proprietà elettriche intrinseche del muscolo (cioè la conducibilità e la permittività relativa)6.
Il termine "disturbi neuromuscolari" definisce una vasta gamma di malattie primarie e secondarie che portano ad alterazioni e disfunzioni muscolari strutturali. Ciò include la sclerosi laterale amiotrofica e varie forme di distrofia muscolare, nonché cambiamenti più semplici legati all'invecchiamento (ad esempio, sarcopenia), atrofia da disuso (ad esempio, a causa di riposo a letto prolungato o microgravità) o persino lesioni7. Mentre le cause sono abbondanti e possono provenire dal motoneurone, dai nervi, dalle giunzioni neuromuscolari o dal muscolo stesso, l'EIM può essere utilizzato per rilevare alterazioni precoci nel muscolo a causa di molti di questi processi e per monitorare la progressione o la risposta alla terapia. Ad esempio, nei pazienti con distrofia muscolare di Duchenne (DMD), l'EIM ha dimostrato di rilevare la progressione della malattia e la risposta ai corticosteroidi8. Recenti lavori hanno anche dimostrato che l'EIM è sensibile ai vari stati di disuso, tra cui la gravità frazionaria9, come si sperimenterebbe sulla Luna o su Marte, e gli effetti dell'invecchiamento10,11. Infine, applicando algoritmi predittivi e di machine learning al set di dati ottenuti con ogni misurazione (dati multifrequenza e direzionalmente dipendenti), diventa possibile dedurre aspetti istologici del tessuto, tra cui la dimensione della miofibra 12,13, le alterazioni infiammatorie e l'edema 14, e il tessuto connettivo e il contenuto di grasso 15,16.
Diversi altri metodi non invasivi o minimamente invasivi sono utilizzati anche per valutare la salute muscolare negli esseri umani e negli animali, tra cui l'elettromiografia con ago17 e tecnologie di imaging come la risonanza magnetica, la tomografia computerizzata e gli ultrasuoni18,19. Tuttavia, EIM dimostra vantaggi distinti rispetto a queste tecnologie. Ad esempio, l'elettromiografia registra solo le proprietà elettriche attive delle membrane miofibre e non le proprietà passive, e quindi non può fornire una vera valutazione della composizione o della struttura muscolare. In un certo senso, i metodi di imaging sono più strettamente correlati all'EIM, in quanto anch'essi forniscono informazioni sulla struttura e la composizione del tessuto. Ma in un certo senso, forniscono troppi dati, richiedendo una segmentazione dettagliata delle immagini e un'analisi di esperti piuttosto che fornire solo un output quantitativo. Inoltre, data la loro complessità, le tecniche di imaging sono anche fortemente influenzate dalle specifiche sia dell'hardware che del software utilizzati, idealmente richiedendo l'uso di sistemi identici in modo che i set di dati possano essere confrontati. Al contrario, il fatto che EIM sia molto più semplice significa che è meno influenzato da questi problemi tecnici e non richiede alcuna forma di elaborazione delle immagini o analisi di esperti.
Il seguente protocollo dimostra come eseguire EIM in vivo in ratti e topi, utilizzando tecniche non invasive (array di superficie) e minimamente invasive (array di aghi subdermici), nonché EIM ex vivo su muscoli appena asportati.
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Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Beth Israel Deaconess Medical Center con numeri di protocollo (031-2019; 025-2019). Indossare attrezzature DPI adeguate per gestire gli animali e aderire alle linee guida IACUC per tutto il lavoro animale.
1. EIM di superficie in vivo
- Metti l'animale in una scatola per anestesia per indurre l'anestesia.
NOTA: Per i ratti sono stati utilizzati l'1,5%-3,5% di isoflurano e 2 O 2 L·min-1, e per i topi sono stati utilizzati il 2% di isoflurano e 1 O2 L·min-1. - Una volta completamente anestetizzato, come indicato dall'assenza di risposta dopo aver pizzicato il piede dell'animale, posizionare il topo sulla panca in posizione prona e utilizzare il cono nasale per mantenere l'anestesia utilizzando l'1,5% di isoflurano e un flusso di ossigeno di 1 L·min-1.
- Posizionare la zampa dell'animale da analizzare con un angolo di 45° con l'articolazione dell'anca (ginocchio esteso) e fissare il piede con nastro adesivo medico.
- Utilizzare un tagliacapelli per tagliare la pelliccia che si sovrappone al muscolo gastrocnemio.
- Applicare uno spesso strato di crema depilatoria sulla pelle dell'animale e lasciarlo riposare per 1 minuto. Quindi, utilizzare una garza satura di soluzione salina per rimuovere l'agente depilatorio. Ripeti questo processo fino a tre volte fino a quando tutta la pelliccia che si sovrappone al muscolo gastrocnemio viene rimossa.
NOTA: Posizionare una garza imbevuta di soluzione salina sulla pelle quando le misurazioni non vengono acquisite per prevenire la disidratazione della pelle. - Collegare l'array di superficie (Figura 1) al dispositivo EIM e lasciare riposare gli elettrodi su un pezzo di garza imbevuto di soluzione salina.
- Posizionare la matrice di superficie direttamente sulla pelle sopra il muscolo gastrocnemio, orientata longitudinalmente alle fibre muscolari.
- Dopo aver controllato il contatto appropriato, che è indicato da tutte le barre che appaiono verdi sul software che mostrano la stabilità dei valori di resistenza, reattanza e fase a 50 kHz, acquisire le misurazioni EIM.
NOTA: le curve devono essere controllate in tempo reale per garantire la corretta acquisizione dei dati. - Ruotare la matrice di superficie di 90° e riposizionarla sulla pelle sopra il gastrocnemio per ottenere le misure trasversali (verificare la presenza di barre verdi che indicano la stabilità).
- Ripeti i passaggi 1.7, 1.8 e 1.9 per ottenere un totale di quattro misurazioni per muscolo: due longitudinali e due trasversali.
NOTA: Non utilizzare un agente depilatorio più di una volta (cioè fino a tre applicazioni nella stessa istanza) ogni due settimane per prevenire eccessive irritazioni e lesioni cutanee. È importante eseguire le misurazioni entro circa 5-10 minuti dalla rimozione della crema depilatoria poiché lo sviluppo di edema cutaneo localizzato indotto dall'agente depilatorio può influire sui dati di impedenza raccolti. Il recupero degli animali è immediato dopo l'interruzione dell'anestesia con isoflurano e la procedura non richiede un trattamento analgesico.
2. Array di aghi in vivo EIM
- Anestetizzare l'animale e preparare la gamba usando la stessa procedura descritta nei punti 1.1-1.4. Tuttavia, non è necessario utilizzare un agente depilatorio quando si esegue EIM in vivo utilizzando un array di aghi.
- Collegare l'array di aghi (Figura 2A-F) al dispositivo EIM e lasciarlo riposare in un recipiente di pesatura contenente soluzione salina. Verificare la connettività e la stabilità del segnale (indicata da barre verdi).
- Disinfettare la pelle e gli aghi con alcool. Posizionare l'array di aghi in posizione longitudinale rispetto alle miofibre e premerlo saldamente nella pelle fino a quando tutti gli aghi penetrano nella pelle e nel muscolo sottostante fino alla protezione plastica sull'array. Acquisire dati.
- Rimuovere delicatamente l'array e reinserirlo attraverso la pelle e nel muscolo con un angolo di 90° rispetto alla prima misurazione, nella direzione trasversale. Acquisire dati.
NOTA: Quando si utilizzano array di aghi, le misurazioni devono essere acquisite solo una volta in ciascuna direzione per ridurre l'impatto degli elettrodi ad ago sulla pelle e sul tessuto muscolare. Se si verifica sanguinamento, asciugare delicatamente il sangue prima di eseguire la seconda misurazione. Il recupero degli animali è immediato dopo l'interruzione dell'anestesia con isoflurano e la procedura non richiede un trattamento analgesico.
3. EIM ex vivo
- Preparare la cella dielettrica ex vivo (Figura 2G,H), aggiungere soluzione salina alla camera e collegare la cella al dispositivo EIM per ottenere i valori di riferimento.
NOTA: I valori di fase e di reattanza della soluzione salina devono rimanere costanti a zero o quasi a zero e i valori di resistenza della soluzione salina devono rimanere costanti a circa 100 ± 25 Ω nell'intervallo di frequenza da 1 kHz a 1 MHz. - Eutanasia dell'animale secondo le rispettive linee guida IACUC.
- Usando un paio di forbici, tagliare la pelle vicino al tendine di Achille. Usando una pinzetta, tira la pelle con un movimento verso l'alto per rivelare i muscoli sottostanti e la fascia. Sezionare delicatamente il bicipite femorale sovrapposto al muscolo gastrocnemio e sezionare il nervo sciatico.
- Tagliare il tendine di Achille per liberare l'estremità distale dei muscoli gastrocnemio e soleo e tirare delicatamente il tendine verso l'alto mentre si usano le forbici per rimuovere eventuali attacchi. Una volta rimossi tutti gli accessori, utilizzare le forbici per tagliare l'estremità rostrale del muscolo soleo e rimuoverlo.
- Usa le forbici per sezionare le teste del muscolo gastrocnemio intorno alla rotula.
NOTA: Dopo la rimozione del muscolo gastrocnemio, è importante ricordare l'orientamento originale delle miofibre. - Posizionare il muscolo gastrocnemio su un foglio di cera dentale e sezionarlo usando una lama di rasoio e un righello per ottenere una sezione di 10 mm x 10 mm dal centro del muscolo gastrocnemio.
NOTA: la dimensione della cella dielettrica può essere personalizzata. Per i ratti è stata utilizzata una cella di 10 mm x 10 mm e per i topi è stata utilizzata una cella di 5 mm x 5 mm. - Usando una pinzetta, posiziona delicatamente il gastrocnemio nelle celle dielettriche, assicurandoti che le fibre siano orientate longitudinalmente (cioè le estremità caudali e rostrali dovrebbero toccare gli elettrodi). Assicurarsi che il muscolo sia completamente a contatto con gli elettrodi metallici.
- Collegare la parte superiore della cella dielettrica e inserire due aghi monopolari (26 G) nei due fori. Collegare i fili dal dispositivo EIM alla cella ex vivo nel seguente ordine: (1: I+, 2: V+, 3: V-, 4: I-, dove I rappresenta gli elettrodi di corrente e V rappresenta gli elettrodi di tensione). Acquisire la misura longitudinale.
- Aprire la cellula dielettrica e riorientare il muscolo in direzione trasversale ruotandolo di 90°. Riattaccare la parte superiore della cella dielettrica. Acquisire la misura trasversale.
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Representative Results
L'EIM può essere ottenuto in molte condizioni, tra cui array in vivo di superficie (Figura 1), array di aghi in vivo (Figura 2A-F) e celle dielettriche ex vivo (Figura 2G,H).
EIM fornisce un'istantanea quasi istantanea della condizione muscolare in base ai valori di impedenza misurati. Le misurazioni vengono acquisite rapidamente e si traducono in un semplice file di dati di output che non richiede alcun software speciale (Figura 3A). Infatti, qualsiasi dispositivo di impedenza multifrequenza che fornisce dati per le singole frequenze sarà in grado di produrre un'uscita .csv standard che può essere aperta indipendentemente. Il sistema descritto in questo protocollo fornisce anche il nome e le condizioni dell'esperimento, con valori di fase, reattanza e resistenza per ogni prova ad ogni frequenza misurata, all'interno del file di output. Per garantire la riproducibilità, vengono generalmente ottenute e mediate due prove di valori longitudinali (prove 1 e 3) e trasversali (prove 2 e 4) e utilizzate per tutte le analisi successive.
Quando vengono visualizzati in funzione della frequenza, i valori EIM producono curve standard che possono essere analizzate per rilevare dati spuri o contaminati da artefatti. Tali irregolarità sono solitamente correlate a problemi di contatto sulle misurazioni superficiali, con conseguenti valori estremi osservati a basse frequenze (in genere grandi valori positivi o negativi). Le curve rappresentative sono visualizzate per fase (Figura 3B), reattanza (Figura 3C) e resistenza (Figura 3D) per misurazioni longitudinali (cerchi blu) e trasversali (quadrati grigi). Viene inoltre visualizzato un grafico che mostra la reattanza in funzione della resistenza (diagramma di Cole-Cole) in entrambe le direzioni longitudinale e trasversale (Figura 3E). Questo passaggio è fondamentale in quanto fa parte del controllo dei dati, consentendo il rilevamento diretto di dati spuri o contaminati da artefatti. Se viene rilevato un artefatto eccessivo (di solito a causa di uno scarso contatto tra l'array di superficie e la pelle), è possibile seguire diverse procedure per migliorare il contatto. Questi includono l'applicazione di un'ulteriore applicazione di crema depilatoria, l'inumidimento della pelle per circa 1 minuto con un tampone di garza imbevuto di soluzione salina o l'applicazione di una leggera pressione sull'array di elettrodi. In generale, il semplice processo di ripetere la misurazione più volte aiuterà anche a risolvere questo problema.
Le misurazioni EIM riflettono la risposta del tessuto muscolare alla corrente elettrica attraverso un'ampia gamma di frequenze, ognuna mirata a strutture diverse. Ad esempio, le basse frequenze (cioè 5 kHz) non penetrano nella membrana della miofibra, fornendo così un'analisi delle caratteristiche extracellulari che possono essere utilizzate per rilevare l'infiammazione e l'infiltrazione di neutrofili14. Al contrario, le alte frequenze (>1 MHz) possono penetrare le membrane cellulari e quindi interrogare sia gli spazi intracellulari che extracellulari e sono state utilizzate per differenziare le fibre muscolari di tipo1.
Figura 1: array di superfici stampate in 3D. Fotografie di un array di superfici che è stato stampato in 3D per ottenere misurazioni dell'impedenza superficiale (sia longitudinale che trasversale) nei topi in vivo. (A) Una fotografia che mostri la matrice di superfici collegata al dispositivo di acquisizione. (B) Un primo piano della matrice di superficie che mostra la ruota utilizzata per ruotare l'array a 90° per ottenere misure sia longitudinali che trasversali. (C) Un primo piano degli elettrodi di superficie. Gli elettrodi di superficie hanno le seguenti caratteristiche: larghezza degli elettrodi = 0,5 mm, lunghezza degli elettrodi esterni = 4 mm, lunghezza degli elettrodi interni = 3 mm e spaziatura tra gli elettrodi = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Altre matrici che possono essere utilizzate per ospitare progetti sperimentali specifici. Fotografie di: (A) una matrice di aghi utilizzata per ratti e rivestita (utilizzando vernice per unghie non metallica) per diminuire il contributo del grasso sottocutaneo (spazio di 2 mm, profondità di 4 mm, rivestimento di 2 mm); b) una matrice di aghi con spaziatura di 2 mm e profondità di 4 mm; C) una matrice di aghi con una spaziatura di 2 mm e una profondità di 3 mm; D) una matrice di aghi con spaziatura di 2 mm e profondità di 2 mm; E) una serie di aghi per animali più piccoli e cuccioli con spaziatura di 1 mm e profondità di 2 mm; (F) una matrice di aghi con spaziatura di 1 mm e profondità di 1 mm; (G) una cella dielettrica ex vivo adattata ai muscoli di topo adulti (5 mm x 5 mm); e (H) una cella dielettrica ex vivo su misura per i muscoli del ratto (10 mm x 10 mm). Le modifiche (risultati non presentati qui) per acquisire misurazioni su animali obesi (cioè topi ob / ob o db / db) possono essere eseguite aumentando la lunghezza dell'ago, aggiungendo un rivestimento non conduttivo e aumentando / diminuendo la spaziatura dell'ago. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Output dei dati e curve rappresentative ottenute in topi con EIM di superficie in vivo nelle direzioni longitudinale (blu) e trasversale (grigio). (A) File di output in .csv formato ottenuto a seguito dell'acquisizione di due misurazioni EIM longitudinali (misure 1 e 3, colorate in blu) e due trasversali (misure 2 e 4, colorate in grigio) in vivo . I valori sono indicati per ogni frequenza (colonna A). Le analisi vengono eseguite successivamente utilizzando il valore medio delle misurazioni longitudinali e trasversali, rispettivamente. Le informazioni trovate nelle celle A1:B4 vengono popolate automaticamente dal software, secondo le etichette scelte durante l'acquisizione EIM. Curve rappresentative sia per i valori longitudinali (cerchi blu) che trasversali (quadrati grigi) di fase (B), reattanza (C) e resistenza (D) in funzione della frequenza. Coerentemente con le pratiche standard nel campo dell'impedenza, l'asse x è indicato utilizzando una scala logaritmica. (E) Curve rappresentative di reattanza in funzione della resistenza sia per misure longitudinali che trasversali. LP: fase longitudinale; TP: fase trasversale; LX: reattanza longitudinale; TX: reattanza trasversale; LR: resistenza longitudinale; e TR: resistenza trasversale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo articolo fornisce i metodi di base per eseguire EIM nei roditori, sia in vivo che ex vivo. Per acquisire misurazioni affidabili, è fondamentale eseguire una serie di passaggi. In primo luogo, è necessario identificare correttamente il muscolo di interesse, poiché ogni muscolo avrà risposte diverse a malattie, trattamenti e patologie. Bisogna essere consapevoli che i dati acquisiti su un muscolo (ad esempio, gastrocnemio) non forniranno le stesse informazioni di un altro muscolo (ad esempio, tibiale anteriore). In secondo luogo, è necessario scegliere attentamente il miglior array di elettrodi per eseguire le misurazioni dell'impedenza. Mentre ogni tipo di array presenta sia vantaggi che svantaggi, è importante scegliere un array che si adatti al disegno sperimentale tenendo conto della progressione della malattia e dell'effetto sull'anatomia (ad esempio, grave atrofia). Infine, EIM consente agli investigatori di raccogliere un'incredibile quantità di dati in pochi secondi, ma il controllo di qualità deve essere eseguito correttamente per garantire l'assenza di artefatti.
Il sistema EIM è altamente personalizzabile a diversi livelli. Mentre il sistema utilizzato qui è stato progettato per la raccolta di dati clinici e preclinici, qualsiasi sistema di misurazione dell'impedenza multifrequenza può essere utilizzato per questo scopo, purché fornisca dati di frequenza individuali. Generalmente, i sistemi di impedenza forniscono un file di .csv standard come output. Allo stesso modo, è possibile apportare ulteriori modifiche agli array, poiché tutto ciò che è veramente richiesto sono quattro elettrodi posizionati in una linea. Ad esempio, in questo protocollo, è stata utilizzata una varietà di elettrodi personalizzati per soddisfare i requisiti, ma gli array possono essere adattati alle esigenze individuali utilizzando strumenti semplici (ad esempio, colla epossidica, aghi sottodermici) o complessi (ad esempio, stampanti 3D). In alternativa, i quattro elettrodi possono essere combinati in un unico ago, come descritto in precedenza20. Nel nostro laboratorio, sono stati sviluppati array per i cuccioli diminuendo la spaziatura tra gli elettrodi per garantire che i piccoli muscoli possano essere misurati sia nella direzione longitudinale che trasversale. Quando si lavora con animali obesi, che hanno uno strato significativamente maggiore di grasso sottocutaneo, si raccomanda l'uso di elettrodi ad ago parzialmente rivestiti. Ciò consente un maggiore contributo del tessuto muscolare alla misurazione dell'impedenza diminuendo il contributo del tessuto adiposo21.
Mentre i metodi con ago e i metodi di superficie possono essere utilizzati sia nei ratti che nei topi, come descritto e dimostrato, si raccomanda generalmente di utilizzare le misurazioni dell'ago nei ratti, poiché sono più veloci poiché non richiedono sforzi per preparare la pelle. Inoltre, le loro dimensioni maggiori significano che gli elettrodi ad ago danneggiano solo minimamente il muscolo. Nei topi, date le loro piccole dimensioni, si raccomandano misurazioni superficiali per evitare lesioni muscolari e dato che la preparazione della pelle è relativamente semplice e veloce.
Ogni tecnica EIM ha una propria serie di limitazioni. Una limitazione chiave è che gli array di elettrodi non sono prontamente disponibili attraverso i fornitori e richiedono invece una generazione personalizzata in laboratorio. Per aiutare i nuovi ricercatori, questo protocollo include misurazioni per diversi array (sia fatti a mano che stampati in 3D) e gli autori forniranno array personalizzati o renderanno disponibili i relativi file CAD su richiesta. Come accennato in precedenza, la qualità dei dati è fondamentale e ulteriori problemi possono interferire con la qualità dei dati per ciascuno dei tipi di misurazione (ad esempio, superficie, ago ed ex vivo). Per buoni dati superficiali, è necessario rimuovere completamente i peli e probabilmente anche lo strato corneo della pelle, per ottenere i migliori risultati con un artefatto di contatto minimo. Tuttavia, l'uso dell'agente depilatorio significa anche che la pelle diventerà lentamente edematosa nel tempo, quindi è necessario completare rapidamente le misurazioni dell'impedenza dopo la depilazione. Attendere 10 minuti o più può produrre valori significativamente diversi rispetto all'esecuzione delle misurazioni entro un minuto o due dalla depilazione. Le misurazioni dell'array di aghi nei ratti o nei topi in genere inducono almeno una piccola quantità di sanguinamento, che potrebbe influire sulle letture se si trasforma in un ematoma più grande intorno agli aghi inseriti. Infine, le misurazioni ex vivo richiedono particolare attenzione per garantire che le fibre muscolari all'interno della cella dielettrica siano allineate con precisione rispetto alle piastre metalliche. Infine, nei topi piccoli o malati, può essere impossibile ottenere misurazioni trasversali, date le piccole dimensioni dei muscoli. Ma, come notato sopra, rimane possibile progettare array personalizzati di 4 elettrodi che potrebbero essere sufficientemente piccoli da effettuare misurazioni longitudinali anche all'interno dei muscoli più piccoli.
L'analisi dei dati può essere mantenuta abbastanza semplice - ad esempio, misurando una singola uscita (ad esempio, fase) a una singola frequenza (ad esempio, 50 kHz) in una singola direzione (ad esempio, longitudinale) - o piuttosto complessa, incorporando tutti i parametri di impedenza attraverso l'intero spettro di frequenza sia in direzione longitudinale che trasversale. Quando vengono utilizzati valori di impedenza a frequenza singola, sono tipicamente nell'intervallo 30-100 kHz, poiché il muscolo tende ad essere più reattivo (cioè è più "caricabile") in questa gamma di frequenze. Tuttavia, sono stati utilizzati anche parametri condensati o collassati, che tentano di catturare la forma dello spettro di frequenza. Questi valori hanno incluso pendenze di adattamenti lineari dei dati di resistenza, reattanza e fase22 e rapporti di frequenza23. In alternativa, i parametri di Cole-Cole possono essere calcolati da adattamenti dei dati di impedenza, tra cui R0 (determinazione della resistenza a frequenza zero), Rinf (determinazione della resistenza alla frequenza dell'infinito) e fc (frequenza centrale) 24,25,26,27. Infine, l'apprendimento automatico può essere utilizzato per analizzare tutti i dati contemporaneamente e migliorare i modelli predittivi, sia per la regressione12,13,15,16 che per la classificazione.
Nonostante queste limitazioni, EIM è uno strumento potente e relativamente semplice per valutare molteplici aspetti della salute muscolare. Mentre il focus di questo manoscritto è su un singolo muscolo (gastrocnemio), non vi è nulla che precluda l'uso di EIM su altri muscoli superficiali (ad esempio, quadricipiti o bicipiti brachiali) utilizzando elettrodi di superficie o muscoli più profondi usando l'array di elettrodi ad ago. Infatti, nell'uomo, la tecnica è stata utilizzata in un'ampia varietà di muscoli, compresi i muscoli degli arti superiori e inferiori8,28, nonché i muscoli assiali (ad esempio muscoli paraspinali e muscoli addominali)29,30.
È stato dimostrato che l'EIM fornisce misure affidabili per quanto riguarda la progressione della malattia, la remissione dell'atrofia e il trattamento nel tempo. I dati a frequenza singola possono essere del tutto sufficienti per valutare lo stato della malattia nel tempo31; Tuttavia, il valore dei dati multifrequenza è che possono ancora aiutare a valutare la qualità della misurazione, come descritto sopra. I dati a frequenza singola isolati potrebbero essere sostanzialmente contaminati da artefatti di contatto, e questo non sarebbe evidente senza rivedere l'intero spettro di impedenza. Negli studi clinici, l'EIM di superficie può essere utilizzato frequentemente per ottenere misurazioni indolori, rendendolo uno strumento semplice da applicare32. Questa abbondanza di dati può essere fondamentale per monitorare in modo più sensibile la progressione della malattia. Inoltre, l'aggiunta di EIM ai protocolli clinici può ridurre significativamente il numero di partecipanti richiesti durante uno studio clinico28,31.
EIM sta trovando una crescente applicazione nella valutazione di una varietà di condizioni neuromuscolari negli esseri umani. Di conseguenza, la capacità di eseguire efficacemente la tecnica nei roditori aiuta ad espandere il potenziale valore pratico della tecnologia, migliorando al contempo la nostra comprensione della relazione tra i vari output EIM e l'istologia sottostante. La tecnica è generalmente di facile utilizzo e insieme agli utili dati quantitativi che fornisce, merita di essere inclusa nell'armamentario standard di strumenti per la valutazione dei disturbi nervosi e muscolari nei modelli di malattia dei roditori.
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Disclosures
S. B. Rutkove detiene partecipazioni e funge da consulente e consulente scientifico per Myolex, Inc., una società che progetta dispositivi di impedenza per uso clinico e di ricerca, e il sistema mView utilizzato qui. È anche membro del Consiglio di amministrazione della società. La società ha anche un'opzione per concedere in licenza la tecnologia di impedenza brevettata di cui S. B. Rutkove è nominato come inventore. Gli altri autori non hanno altre affiliazioni rilevanti o coinvolgimento finanziario con qualsiasi organizzazione o entità con un interesse finanziario o un conflitto finanziario con l'argomento o i materiali discussi nel manoscritto oltre a quelli divulgati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da Charley's Fund e NIH R01NS055099.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Formlabs Inc. | Form 2 Desktop | 3D printer |
| 3D Printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD | Creality Ender 3 V2 | 3D printer |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher | 19-027761 and 19-061655 | models 1530-0 and 1530-1 |
| 3M TRANSPORE surgical tape | Fisher | 18-999-380 and 18-999-381 | models 1527-0 and 1527-1 |
| Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing | Digi-Key (Sullins connector solution) | S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK) | Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 22-363-172 | |
| Dental Wax | Fisher | NC9377103 | |
| Depilatory agent | NAIR | NA | hair remover lotion with softening baby oil |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | No. 11270-20 | Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm |
| Electronic Digital Caliper | Fisher | 14-648-17 | Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle |
| Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life | Devcon | series 14265, model 2217 | Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Ex vivo dielectric impedance cell | Custom | NA | Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | No. 11051-10 | Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material |
| Hair clipper | Amazon | NA | Wahl professional animal BravMini+ |
| Impedance Animal Device | Myolex | EIM1103 | mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research |
| In vivo needle arrays | Custom | NA | Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory |
| In vivo surface array | Custom | NA | The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory |
| Isoflurane | Patterson Veterinary Supplies | 07-893-8441 (NDC: 46066-755-04) | Pivetal - 250 mL bottle |
| Non-woven gauze | Fisher | 22-028-559 | 2 x 2 inch |
| Polystyrene Weighing Dishes | Fisher | S67090A | Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | No. 91460-11 | Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality |
| Subdermal needles 27 G Neuroline | Ambu | 745 12-50/24 | Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | No. 14002-13 | Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm |
| TECA ELITE monopolar needle electrodes | Natus | 902-DMG50-S | 0.46 mm diameter (26 G). Blue hub |
| Teknova 0.9% saline solution | Fisher | S5815 | 1000 mL sterile |
References
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