Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Direkte sammenligning av hyperspektral stimulert Raman-spredning og koherent anti-Stokes Raman-spredningsmikroskopi for kjemisk avbildning

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63677
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Purdue University

Summary

Dette papiret sammenligner direkte oppløsning, følsomhet og bildekontraster av stimulert Raman-spredning (SRS) og sammenhengende anti-Stokes Raman-spredning (CARS) integrert i samme mikroskopplattform. Resultatene viser at CARS har en bedre romlig oppløsning, SRS gir bedre kontraster og spektral oppløsning, og begge metodene har lignende følsomhet.

Abstract

Stimulert Raman-spredning (SRS) og koherent anti-Stokes Raman-spredningsmikroskopi (CARS) er de mest brukte sammenhengende Raman-spredningsteknologiene. Hyperspektral SRS- og CARS-avbildning tilbyr Raman-spektralinformasjon ved hver piksel, noe som muliggjør bedre separasjon av forskjellige kjemiske sammensetninger. Selv om begge teknikkene krever to eksitasjonslasere, er deres signaldeteksjonsskjemaer og spektrale egenskaper ganske forskjellige. Målet med denne protokollen er å utføre både hyperspektral SRS- og CARS-avbildning på en enkelt plattform og sammenligne de to mikroskopiteknikkene for avbildning av forskjellige biologiske prøver. Den spektrale fokuseringsmetoden brukes til å skaffe spektral informasjon ved hjelp av femtosekund lasere. Ved å bruke standard kjemiske prøver sammenlignes følsomheten, romlig oppløsning og spektral oppløsning av SRS og CARS under de samme eksitasjonsforholdene (dvs. kraft ved prøven, pikseloppholdstid, objektivlinse, pulsenergi). Avbildningskontrastene til CARS og SRS for biologiske prøver er sidestilt og sammenlignet. Den direkte sammenligningen av CARS- og SRS-ytelser vil muliggjøre optimalt valg av modalitet for kjemisk avbildning.

Introduction

Raman-spredningsfenomenet ble først observert i 1928 av C. V. Raman1. Når et hendelsesfoton interagerer med en prøve, kan det spontant oppstå en uelastisk spredningshendelse, hvor energiendringen til fotonet samsvarer med en vibrasjonsovergang av de analyserte kjemiske artene. Denne prosessen krever ikke bruk av en kjemisk tag, noe som gjør den til et allsidig, etikettfritt verktøy for kjemisk analyse samtidig som prøveforstyrrelse minimeres. Til tross for fordelene lider spontan Raman-spredning av et lavt spredningstverrsnitt (vanligvis 1011 lavere enn det infrarøde [IR] absorpsjonstverrsnittet), noe som nødvendiggjør lange oppkjøpstider for analyse2. Dermed er jakten på å øke følsomheten til Raman-spredningsprosessen avgjørende for å presse Raman-teknologier for sanntidsbilder.

En effektiv måte å forbedre følsomheten til Raman-spredning er gjennom sammenhengende Raman-spredningsprosesser (CRS), for hvilke to laserpulser vanligvis brukes til å opphisse molekylære vibrasjonsoverganger 3,4. Når fotonenergiforskjellen mellom de to laserne samsvarer med vibrasjonsmodusene til prøvemolekyler, vil sterke Raman-signaler bli generert. De to mest brukte CRS-prosessene for avbildning er koherent anti-Stokes Raman-spredning (CARS) og stimulert Raman-spredning (SRS)5. I løpet av de siste to tiårene har den teknologiske utviklingen avanserte CARS- og SRS-mikroskopiteknikker til å bli kraftige verktøy for etikettfri kvantifisering og belysning av kjemiske endringer i biologiske prøver.

Kjemisk avbildning ved CARS-mikroskopi kan dateres til 1982 da laserskanning først ble brukt til å skaffe CARS-bilder, demonstrert av Duncan et al6. Moderniseringen av CARS-mikroskopi ble kraftig akselerert etter de brede anvendelsene av laserskanning multifotonfluorescensmikroskopi7. Tidlig arbeid fra Xie-gruppen ved hjelp av lasere med høy repetisjonshastighet har overført CARS til å være en høyhastighets, etikettfri, kjemisk bildebehandlingsplattform for karakterisering av molekyler i biologiske prøver 8,9,10. Et av de store problemene for CARS-bildebehandling er tilstedeværelsen av en ikke-resonansbakgrunn, noe som reduserer bildekontrasten og forvrenger Raman-spekteret. Mange anstrengelser har blitt gjort for å enten redusere den ikke-resonante bakgrunnen 11,12,13,14,15 eller for å trekke ut resonans Raman-signaler fra CARS-spektrene 16,17. Et annet fremskritt som har avansert feltet sterkt er hyperspektral CARS-avbildning, som muliggjør spektral kartlegging ved hver bildepiksel med forbedret kjemisk selektivitet 18,19,20,21.

Stimulert Raman-spredning (SRS) er en yngre bildeteknologi enn CARS, selv om den ble oppdaget tidligere22. I 2007 ble SRS-mikroskopi rapportert ved hjelp av en lav repetisjonsfrekvens laserkilde23. Snart demonstrerte flere grupper høyhastighets SRS-avbildning ved hjelp av lasere med høy repetisjonsfrekvens 24,25,26. En av de største fordelene med SRS-mikroskopi over CARS er fraværet av den ikke-resonante bakgrunnen27, selv om andre bakgrunner som kryssfasemodulering (XPM), forbigående absorpsjon (TA), tofotonabsorpsjon (TPA) og fototermisk (PT) effekt kan forekomme med SRS28. I tillegg har SRS-signalet og prøvekonsentrasjonen lineære forhold, i motsetning til CARS, som har en kvadratisk signalkonsentrasjonsavhengighet29. Dette forenkler kjemisk kvantifisering og spektral ublanding. Flerfarget og hyperspektral SRS har utviklet seg i forskjellige former 30,31,32,33,34,35,36, med spektral fokusering som en av de mest populære tilnærmingene for kjemisk bildebehandling 37,38.

Både CARS og SRS krever fokusering av pumpen og Stokes laserstråler på prøven for å matche den vibrasjonelle overgangen til molekylene for signaleksitasjon. CARS og SRS mikroskoper har også mye til felles. Fysikken som ligger til grunn for disse to prosessene, og signaldeteksjoner involvert i disse mikroskopiteknologiene, har imidlertid forskjeller 3,39. CARS er en parametrisk prosess som ikke har netto foton-molekyl energikobling3. SRS er imidlertid en ikke-parametrisk prosess, og bidrar til energioverføring mellom fotoner og molekylære systemer27. I CARS genereres et nytt signal ved anti-Stokes-frekvens, mens SRS manifesterer seg som energioverføringen mellom pumpen og Stokes laserstråler.

CARS-signalet tilfredsstiller Eq (1)28.

Equation 1 (1)

I mellomtiden kan SRS-signal skrives som Eq (2) 28.

Equation 1(2)

Her er Ip, Is, ICARS og ΔISRS intensiteten til henholdsvis pumpestrålen, Stokes-strålen, CARS-signalet og SRS-signalene. χ(3) er prøvens tredjeordens ikke-lineære optiske følsomhet, og er en kompleks verdi sammensatt av reelle og imaginære deler.

Disse ligningene uttrykker spektralprofilene og signalkonsentrasjonsavhengigheten til CARS og SRS. Forskjeller i fysikk resulterer i ulike deteksjonsordninger for disse to mikroskopiteknologiene. Signaldeteksjon i CARS innebærer vanligvis spektral separasjon av nylig genererte fotoner og deteksjon ved hjelp av et fotomultiplikatorrør (PMT) eller ladningskoblet enhet (CCD); For SRS måles energiutvekslingen mellom pumpen og Stokes-strålene vanligvis ved høyhastighets intensitetsmodulering ved hjelp av en optisk modulator og demodulering ved hjelp av en fotodiode (PD) parret med en låseforsterker.

Selv om mange teknologiske utviklinger og applikasjoner har blitt publisert de siste årene i både CARS og SRS-felt, har ingen systematiske sammenligninger av de to CRS-teknikkene blitt utført på samme plattform, spesielt for hyperspektrale CARS og SRS-mikroskopi. Direkte sammenligninger i følsomhet, romlig oppløsning, spektraloppløsning og kjemiske separasjonsevner vil tillate biologer å velge den beste modaliteten for kjemisk kvantifisering. I denne protokollen er det gitt detaljerte trinn for å konstruere en multimodal bildeplattform med både hyperspektrale CARS- og SRS-modaliteter basert på et femtosekund lasersystem og spektralfokusering. De to teknikkene har blitt sammenlignet i fremoverretningen for spektral oppløsning, deteksjonsfølsomhet, romlig oppløsning og bildekontraster av celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Instrumentelt oppsett for hyperspektral CRS-avbildning

MERK: Genereringen av CRS-signal krever bruk av lasere med høy effekt (dvs. klasse 3B eller klasse 4). Sikkerhetsprotokoller må tas opp og riktig personlig verneutstyr (PPE) må brukes til enhver tid når du arbeider med så høye toppkrefter. Se riktig dokumentasjon før eksperimentering. Denne protokollen fokuserer på å designe strålebanen, kvitre femtosekundpulsene og optimalisere bildeforholdene. En generell optisk layout av dette hyperspektrale CRS-mikroskopet er vist i figur 1. Konfigurasjonen som vises her, er en av mange eksisterende konfigurasjoner for CRS-mikroskopi. CRS-mikroskopisystemet som brukes i denne protokollen, er bygget på en femtosekund laserkilde med dobbel utgang og et laserskanningsmikroskop.

  1. Sørg for at laserkilden gir to femtosekund pulstog (120 fs bredde) med en repetisjonshastighet på 80 MHz, inkludert en fast bølgelengde ved 1,045 nm brukt som Stokes-strålen, og en justerbar bølgelengde fra 680 til 1,300 nm som brukes som pumpestråle. Synkroniser utgangspulsene med en optisk forsinkelsesforskjell. Bruk en mikroskopramme for å konstruere bildeplattformen.
  2. Utforme strålebanen
    1. For å kontrollere lasereffekten ved prøven, bruk en halvbølgeplate og polarisasjonsstrålesplitter (PBS) kombinasjon for hver laserstråle.
    2. Installer en akustooptisk modulator (AOM) i Stokes laserstrålebane. Fokuser strålen med et 150 mm brennviddeobjektiv inn i AOM og recollimate 0th ordreutgangen med et 400 mm brennviddeobjektiv.
    3. Bruk det samme objektivparet (150 mm og 400 mm brennvidder) for å utvide pumpestrålen slik at den samsvarer med laserstrålestørrelsen med Stokes.
    4. Plasser 400 mm brennviddeobjektivene i både pumpen og Stokes strålebaner på separate endimensjonale oversettelsestrinn for finjustering av stråledivergensen og optimalisering av strålestørrelsen før du går inn i mikroskopet.
    5. Rett pumpestrålen med et rettvinklet reflekterende speil montert på et motorisert oversettelsestrinn for optisk forsinkelsesinnstilling. Hvis Stokes-strålen trenger optisk forsinkelse, plasser disse komponentene i stedet i strålebanen.
    6. La begge strålene kombineres ved et dikroisk speil med en avskjæringsbølgelengde ved ~ 1000 nm (mellom pumpen og Stokes bølgelengder), slik at Stokes-strålen vil overføre gjennom dikroisk speil mens pumpestrålen reflekteres av det dikroiske speilet. Send de kolliderende kombinerte laserstrålene til mikroskopet.
    7. For å kvitre pumpen og Stokes-bjelkene, plasser glassstenger i strålebanene. Se trinn 1.5 for mer informasjon.
    8. For å bekrefte riktig justering og strålestørrelse, bruk irismembraner etter dikroisk speil og før mikroskopet. Spesielt installerer du en i en posisjon nær og den andre på avstand fra dikroisk speil for å bekrefte god justering og stråleoverlapping. Bruk et IR-visningskort eller IR-visningsprogram til å visualisere strålen under justering.
    9. Bruk en rask PD og et oscilloskop for å måle den optiske forsinkelsen mellom pumpen og Stokes pulser. Utløs oscilloskopet ved å ta prøver av laserpulstoget.
    10. Blokker pumpebjelken og prøv Stokes-strålen. Zoom inn på en av pulsene og plasser en vertikal markør på den for å markere dens tidsmessige plassering på oscilloskopet.
    11. Fjern blokkeringen av pumpestrålen og blokker Stokes-strålen. Oversett forsinkelsestrinnet til prøvepumpepulsene midlertidig justeres med den markerte posisjonen.
  3. Laserskanningsmikroskopet
    1. For en oppreist mikroskopkonfigurasjon, send de kombinerte laserstrålene gjennom et periskop for å klatre til et passende nivå før du når 2D galvo-skanningsspeilene.
    2. Mål laserstrålestørrelsen før mikroskopet, og sett opp riktig linsepar etter galvospeilene for å utvide laserstrålen slik at den passer best til størrelsen på inngangspartiet til objektivlinsen.
    3. Konstruer et 4-f-system ved hjelp av de to linsene, med bakåpningen på objektivlinsen og midten av de to galvospeilene som konjugatfly. Alternativt kan du bruke to separate 1D galvo speil med to 4-f linsesystemer for laserskanning.
    4. Etter kondensatoren, design et 2-tommers flip-speil for å reflektere laserstrålene for signalinnsamling. Plasser et objektiv med en diameter på 2 i den overførte strålebanen for å samle og fokusere overføringssignaler til detektorene fullt ut.
    5. Diriger CARS-signalene til PMT med et dikroisk speil som har en cutoff ved 776 nm, og la de overførte SRS-signalene oppdages av PD. Bruk et båndpassfilter (655/30 nm) før PMT for å avvise gjenværende eksitasjonslaserpulser. Bruk et kortpassfilter (980 nm kort pass) før PD for å blokkere Stokes-strålen fra å komme inn i detektoren.
    6. For CARS-signaldeteksjon, koble til en forforsterker og en strømspenningsomformer etter PMT og før du sender signalet til datainnsamlingssystemet. Juster PMT-spenningen for å optimalisere signalet og bildekontrasten.
    7. Bruk en funksjonsgenerator til å modulere AOM ved 1-10 MHz, og bruk samme frekvens som referansen for lock-in-demoduleringen. Bruk en låseforsterker til å trekke ut SRS-signaler før datainnsamling.
  4. Datainnsamling og visning
    1. Utfør datainnsamling ved hjelp av et digitalt datainnsamlingskort (DAQ) sammen med en rekkeklemme.
    2. Bruk de analoge utgangene fra DAQ til å kontrollere galvospeilene og de analoge inngangene for signalinnsamling.
    3. Bruk Lab-skrevet programvare basert på LabVIEW som har en samtidig flerkanals skjerm for sanntidsvisning og lagring av bilder (se Tilleggsfil).
  5. Chirping femtosekundkilden og måling av spektraloppløsningen
    MERK: For å oppnå en god spektraloppløsning ved bruk av spektral fokusering, brukes glassstenger til å introdusere dispersjoner og chirp laserpulser fra femtosekund til picosekund. For å oppnå den beste spektraloppløsningen må pipehastigheten til pumpestrålen være lik den for Stokes-strålen. For dette lasersystemet kan den beste spektraloppløsningen oppnås ved å kvitre laserpulsene på ~ 120 fs til 3,4 hk for pumpen og 1,8 hk for Stokes. Denne kvitringen oppnås ved å bruke en 4 + 1 kombinasjon (fire i den kombinerte strålen, en bare i Stokes-strålen) av 150 mm glassstang (SF-57) kombinasjon, som beskrevet nedenfor, og skal oppnå en 15 cm-1 spektraloppløsning. Pulsvarigheten kan måles ved hjelp av en autokorrelator.
    1. Sett inn en 150 mm glassstang i bare Stokes strålebane.
    2. Sett inn to 150 mm glassstenger i den kombinerte pumpe/Stokes strålebanen etter dikroisk strålesplitter. For å øke kvitringen, la de kombinerte laserstrålene dobbeltpassere de to glassstengene ved å plassere et dielektrisk speil i den ene enden av stengene.
    3. For å måle spektraloppløsningen, lag en standard kjemisk (f.eks. Dimetylsulfoksid [DMSO]) prøve presset mellom to glassdeksler, og skann forsinkelsestrinnet til maksimalt signal oppnås.
    4. Flytt den optiske forsinkelsen 1,000 μm i rødforskyvningsretningen. Kjør deretter 200 bilder på 10 μm / trinn mot blåforskyvningsretningen for å samle den hyperspektrale bildestakken.
    5. For å konvertere rammenumrene til bølgetall, utfør en lineær regresjon ved hjelp av symmetrisk (2,913 cm-1) og asymmetrisk (2,994 cm-1) C-H som strekker seg fra DMSO og deres tilsvarende rammenummer40.
    6. Bruk XPM-signalet til å måle den spektrale fokuseringsintensitetsprofilen. Halvlukk membranen på kondensatoren og flytt fokuset til et tomt omslag. Samle samme antall trinn som for hyperspektral SRS. For å måle CARS ikke-resonansbakgrunnen, fokuser på glassdekselet og samle det samme antall trinn for de hyperspektrale CARS-målingene.
  6. Optimalisere signal/støy-forholdet (SNR) for bilder
    1. Klargjør en kjemisk prøve for systemjustering. Følg fremgangsmåten beskrevet i trinn 3.1 for prøveklargjøring.
      MERK: DMSO er et godt valg fordi det er en vanlig laboratoriekjemikalie med sterke Raman-signaler og godt separerte C-H symmetriske og asymmetriske topper.
    2. Plasser prøven på mikroskopstadiet, og tilsett vann eller nedsenkingsolje om nødvendig for objektivlinsen eller kondensatoren. Flytt kanten av DMSO-dråpen riktig i synsfeltet og juster objektivlinsen for best mulig fokus. Sentrer kondensatoren ved hjelp av Köhler-belysningsmetoden41. Åpne membranen helt på kondensatoren.
    3. Still inn pumpestrålens bølgelengde til 800 nm (1,045 nm Stokes) for å målrette mot 2,913 cm-1 CH 3-toppen. Sett effekten til både pumpen og Stokes-strålen til ~ 30 mW før mikroskopet ved å justere halvbølgeplaten (~ 10 mW effekt ved prøveplanet).
    4. For SRS, sett låseforsterkerforsterkningen til ~ 10 med en tidskonstant på 7 μs (når du bruker en 10 μs pikselbotid). Kontroller at tidskonstanten er mindre enn pikselens oppholdstid. Bruk Demod R for AUX-utgangen for SRS-signaler.
    5. For BILER sender du PMT-utgangen til forforsterkeren og strømspenningsomformeren. Bruk DAQ til å hente utdataene fra omformeren.
    6. Angi parametrene for bildeinnhenting i anskaffelsesprogramvaren. Bruk et pikselnummer på 200 x 200 med en skannestørrelse på ~100 x 100 μm2. Forsikre deg om at bildet inneholder både DMSO-dråpen og et tomt område.
    7. Skann prøven og sjekk bildet på dataskjermen. Skann det motoriserte forsinkelsestrinnet i Stokes/pumpestrålen mens du overvåker sanntidsbildene. Skann over forsinkelsen til signalet er maksimert.
    8. Flytt DMSO-dråpen for å dekke hele synsfeltet og sjekk om dc-signalet maksimalt er sentrert i bildet (signalet er pumpestråleavhengig). Juster enten posisjonen til pumpestrålen via et speil eller spenningsforskyvningen i bildeprogramvaren.
    9. Etter DC-optimalisering, juster Stokes-strålespeilene til AC-signalet maksimeres ved å justere terskelverdien for å vise ~ 50% metning. Kontroller om metningen er sentrert i bildet. Hvis ikke, finjuster speilene bare i Stokes-strålen. Overvåk signalet under justering som tilbakemelding i sanntid om kvaliteten på justeringen.
    10. For å bestemme SNR, velg et lite område av DMSO-bildet og måle middelverdien. For støyen velger du et lite område i det tomme området av bildet og bestemmer både gjennomsnittlig middelverdi og standardavvik. Trekk støymiddelverdien fra signalmiddelverdien og del resultatene med standardavviket til det tomme området.
    11. Hvis den beregnede SNR ikke er høy nok (vanligvis 800-1000 for SRS og >10 000 for BILER ved en PMT-spenning på 0,4 V med denne effektkombinasjonen), kontroller og optimaliser stråleoverlappingen, strålestørrelsene og forsinkelsestrinnposisjonen, finjuster AOM og endre funksjonsgeneratormodulasjonsfrekvensen til forventet SNR er oppnådd.

2. Bildeanalyse og databehandling

  1. SNR-analyse
    1. Åpne ImageJ-programvaren. Hvis du vil importere det lagrede DMSO-eksemplet .txt filen, klikker du fil | Importere | | for tekstbilde Åpen.
    2. Når bildet er importert, trykker du CTRL + shift + C for å få opp lysstyrke- og kontrastfunksjonen (B &C). For å finne det maksimale prøvesignalet, trykk på auto-knappen i B &C til et område av DMSO-prøven virker mettet.
    3. Klikk på det ovale markeringsverktøyet på ImageJ-grensesnittet og et lite område av det mettede DMSO-området. Når du er uthevet, trykker du på M for å måle gjennomsnittet og standardavviket til det valgte området.
    4. For å måle bakgrunnen, juster stolpene i B &C-funksjonen til signalet til det tomme området kan observeres. Klikk det ovale merket og merk et område av bakgrunnen i samme størrelse som for trinn 2.1.3. Kontroller at regionen som er valgt, ikke inneholder DMSO. Trykk på M for å måle statistikken for det valgte området.
    5. Beregn SNR i henhold til trinn 1.6.10.
  2. Behandling av hyperspektrale CRS-bilder
    1. Importer den .txt filen i henhold til trinn 2.1.1. Når den er importert, klikker du på Bilde | Stabler | Verktøy | Montasje til Stack ... for å konvertere filen til en bildestakk.
    2. Bla gjennom montasjen til den første DMSO-toppen er synlig. Velg en region på DMSO og klikk på Image | Stable | Tegn inn Z-akseprofil for å tegne inn intensitets- kontra rammenummerspekteret. For å trekke ut de rå spektraldataene, klikk på listen og kopier profildataene.
    3. Hvis du vil konvertere det gjenvunnede spekteret til bølgetallsenheter, utfører du en lineær regresjon som beskrevet i trinn 1.5.5.
  3. Tilpasning for måling av spektral oppløsning
    MERK: Lorentzian-funksjoner brukes til å passe til SRS- og CARS-spektrene28.
    1. Åpne tilpasningsprogramvaren, og kopier og lim deretter inn de lineære regresjonsdataene i programmet. Hvis du vil tilpasse SRS-dataene, uthever du dataene og tegner deretter dataene som et punktdiagram.
    2. Trekk opp spredningsplottet. Klikk på Analyse | Topper og baseline | Flere Peak Fit-| Åpne Dialog for å hente frem toppanalysatoren. Når du trekker opp, må du kontrollere at inngangen er gjeldende plott og endre toppfunksjonen til Lorentzian (Lorentz).
    3. Dobbeltklikk på hver av de to DMSO-toppene på grafen for å markere regionene som skal monteres. Deretter klikker du på Åpne NLfit for å få frem monteringsvinduet . Klikk på Fit til konvergert-knappen , og deretter OK, for å se et tabulert sammendrag av tilpasningskoeffisientene (se Eq (3)).
      MERK: Ligningen nedenfor viser Lorentzian-funksjonsformatet i programvaren. A1/2 er amplitudene til monteringstoppene, w1/2 er breddene på de monterte toppene, og x01/02-verdiene er sentrene til de monterte toppene. Den uavhengige variabelen er x og den avhengige variabelen er y.
      Equation 1 (3)
    4. For CARS spektralmontering, klikk på Analyse | Passende | Ikke-lineær kurvetilpasning | Åpne dialogen. Velg kategori: ny for å definere en ny funksjon for BILER. Bruk en to-topp CARS monteringsfunksjon definert nedenfor (se Eq (4)) for CARS spektralmontering.
      Equation 1 (4)
  4. Bestemme den romlige oppløsningen
    MERK: Før dette trinnet er det viktig å vite konverteringen mellom pikselstørrelsen ved en bestemt forstørrelse, pikselnummer og trinnstørrelsen i μm. Dette kan utføres ved å bruke en prøve av en kjent diameter som er større enn forventet bildeoppløsning, måle linjeprofilen og montere en Gauss-funksjon for å bestemme full bredde ved halv maksimum (FWHM) verdi. Oppløsningsmål eller ensartede prøver som polymere perler kan brukes.
    1. Skaff deg et bilde av celler eller polymerpartikler mindre enn 200 nm i diameter.
    2. Bruk ImageJ til å tegne en linje over den minste partikkelen i bildet.
    3. Trykk K for å tegne inn intensitetsprofilen.
    4. Klikk på listen fra popup-vinduet og kopier informasjonen til tilpasningsprogramvare.
    5. Plott profilen i tilpasningsprogramvare og bruk Gaussisk tilpasning (klikk på Analyse | Passende | Ikke-lineær kurvetilpasning | Åpne dialog | Kategori: Grunnleggende funksjoner; Funksjon: Gauss).
    6. Les toppbredden etter montering. Bruk piksel til størrelse konvertering for å oppnå den faktiske oppløsningen av mikroskopet.

3. Fremstilling av prøver for hyperspektral CRS-avbildning

  1. Fremstilling av bildediagnostikk og kjemiske prøver
    1. Plasser et stykke dobbeltsidig tape på et omslag, og kutt ut en liten rektangulær form av båndet fra midten av det plasserte båndet for å skape et åpent område for prøven som skal plasseres.
    2. Pipetter 1-2 μL ren DMSO og dispenser dråpen i midten av den ledige stillingen.
    3. Plasser toppdekselet forsiktig og trykk forsiktig på kantene på dekslene for å forsegle kammeret mens du sørger for at DMSO-prøven ikke kommer i kontakt med kantene på båndet.
    4. For følsomhetseksperimenter, klargjør serielle fortynninger av DMSO i deuteriumoksid (D2O) for å gi et konsentrasjonsområde på 50% -0%. Ta 1-2 μL av hver løsning og lag pressede prøver som beskrevet ovenfor.
  2. Cell forberedelse
    1. Frø cellene i en 35 mm glassbunnsfat (eller større) i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% føtalt storfeserum (FBS) og 1% penicillin/ streptomycin.
    2. Inkuber cellene i et inkubasjonskammer ved 37 °C med en atmosfære på 5 % CO2 over natten eller lenger til ~50 %-80 % konfluens oppnås.
    3. Bilde de levende cellene direkte eller fikse cellene med en 10% formalinløsning for avbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sammenligninger av spektraloppløsningen
Figur 2 sammenligner spektral oppløsning av hyperspektral SRS (figur 2A) og CARS (figur 2B) mikroskopi ved hjelp av et DMSO-utvalg. For SRS-spekteret ble to Lorentzian-funksjoner (se protokolltrinn 2.3) brukt for å passe til spekteret, og en oppløsning på 14,6 cm-1 ble oppnådd ved bruk av 2,913 cm-1-toppen . For CARS ble en to-topp-monteringsfunksjon med gaussisk bakgrunn (se protokolltrinn 2.3) brukt til montering, noe som ga spektraloppløsningen på 17,1 cm-1. Disse resultatene viser at SRS i samme måletilstand har en bedre spektraloppløsning enn CARS. Den reduserte spektraloppløsningen i CARS er hovedsakelig bidratt av involvering av den ikke-resonante bakgrunnen. I tillegg ble det funnet at de symmetriske (2,913 cm-1) og asymmetriske (2,995 cm-1) toppforholdene var svært forskjellige for SRS og CARS. Dette skyldes de ulike signalkorrelasjonene med tredjeordens ikke-lineær optiske følsomhet, som beskrevet i ligningene (1) og (2). Med den kvadratiske avhengigheten av CARS forsterkes intensitetsforskjellen mellom de to toppene. De symmetriske linjeformene til SRS-toppene og de asymmetriske linjeformene til CARS-toppene kan observeres i spekteret. Asymmetrien i CARS-signalet skyldes hovedsakelig tilstedeværelsen av den ikke-resonante bakgrunnsinterferensen. CARS-spektraltoppene virker litt rødforskjøvet (1-2 cm-1) til SRS-toppene. Dette oppstår også fra den ikke-resonante bakgrunnsinterferensen med resonanstopper.

Sammenligninger av deteksjonsfølsomheten
Figur 3 sammenligner deteksjonssensitiviteten til hyperspektral SRS- og CARS-mikroskopi. SNR for DMSO SRS-signalene (2,913 cm-1) som funksjonen av DMSO-konsentrasjonen i D2O ved høye konsentrasjoner plottes først (1%-50%, figur 3A). Resultatene viser et lineært forhold, tilfredsstillende ligning (2). Figur 3B plotter DMSO-spektrene ved 0,1 % og 0,01 % konsentrasjoner, der 2 913 cm-1-toppen kan løses i førstnevnte, men ikke i sistnevnte, noe som indikerer at deteksjonsgrensen er mellom 0,1 % og 0,01 % DMSO. Ved å bruke grensen for tomme kriterier estimerte vi at grensen for SRS-deteksjon er 0,021 % DMSO. Figur 3C plotter CARS SNR som funksjonen til DMSO-konsentrasjonen (1%-50%), og viser en kvadratisk avhengighet i samsvar med ligningen (1). De faseinnhentede CARS-spektrene er vist i figur 3D for DMSO på 0,1 % og 0,01 %. For å oppnå disse spektraene ble det brukt en spektral faseinnhentingsmetode basert på Kramers-Kronig-relasjoner, og ytterligere fjerning av bakgrunn ble utført16. I likhet med SRS-spektrene kan DMSO 2,913 cm-1-toppen klart løses for 0.1% DMSO, men ikke 0.01%, noe som indikerer en deteksjonsgrense mellom disse to konsentrasjonene. Ved å bruke grensen for tomme kriterier estimerte vi at SRS-deteksjonsgrensen er 0,015 % DMSO. DMSO på 0,02 % tilsvarer 2,8 mM. Derfor er deteksjonsgrensen for det hyperspektrale CRS-mikroskopet som brukes her ~ 2,1-2,8 mM DMSO.

Sammenligninger av den romlige oppløsningen
Figur 4 sammenligner oppløsningen til en liten mobilfunksjon oppdaget i SRS -bilder (figur 4A) og CARS (figur 4B). Intensitetsprofilene fra samme linje vises og tilpasses ved hjelp av en Gauss-funksjon for å bestemme FWHM-verdier for oppløsningssammenligning. SRS-signalet ga en oppløsning på 398,6 nm (figur 4C), mens CARS-signalet ga en oppløsning på 330,3 nm (figur 4D). Oppløsningen av CARS var ~ 1.2x bedre enn for SRS. Årsaken til oppløsningsforskjellen ligger også i ligningene (1) og (2). Både pumpe- og Stokes-bjelker har en gaussisk punktspredningsfunksjon i fokus. Signalet til CARS er da proporsjonalt med multiplikasjonen av tre Gauss-funksjoner, noe som grovt reduserer bredden med en faktor på √3. På samme måte, for SRS, reduseres bredden med en faktor på √2. Derfor var oppløsningen til CARS √3/√2 = 1,2 ganger bedre enn SRS.

Sammenligninger av bildene av celler
Figur 5 sammenligner SRS- og CARS-bilder fra MIA PaCa-2-celler ved forskjellige optiske forsinkelsesposisjoner. Figur 5A viser SRS-bildene ved den optiske forsinkelsen som ga det sterkeste signalet. I dette bildet kan lipiddråper (LDer), endoplasmatisk retikulum (ER) og kjerne (NU) detekteres, med LDer som har de sterkeste signalene vist som lyse prikker. Figur 5B viser CARS-kanalbildet ved samme optiske forsinkelse, med mye reduserte kontraster for LDer. Hovedårsakene til denne kontrastforskjellen er tilstedeværelsen av den ikke-resonante bakgrunnen og det røde skiftet av den samme Raman-toppen i CARS-spektra. Ved denne optiske forsinkelsen har det genererte signalet et stort bidrag fra den ikke-resonante bakgrunnen av vann. For å øke lipidkontrasten i CARS ble den optiske forsinkelsen innstilt til en rødforskjøvet verdi. Rødforskyvningen forbedret lipidkontrastene ved å konsentrere mer energi til 2,850 cm-1 for både SRS (figur 5C) og CARS (figur 5D), selv om det generelle signalnivået ble redusert. For CARS ble en lignende kontrast av LDer som SRS oppnådd ved et ~ 98 cm-1 rødt skifte i spektralfokusering (figur 5D), selv om en bakgrunn høyere enn den i SRS-bildet fortsatt ble observert. Ved denne optiske forsinkelsen viser SRS-bildet mye mindre protein- og nukleinsyreinnhold, men sterkt lipidinnhold i LDer, ER og cellemembraner (figur 5C).

CARS er en parametrisk prosess mens SRS er ikke-parametrisk. En slik forskjell bidrar også til kontrastforskjeller i de to modalitetene. De parametriske CARS-signalene bestemmes av interferensen fra CARS-signaler fra forskjellige lag nær laserfokuset, som kan vise negative kontraster som indikert av pilene i figur 5B og figur 5D (også i figur 4B). Slike signalinterferensinduserte negative kontraster er fraværende i SRS-bildene. Den negative kontrasten i CARS kan gi informasjon om den aksiale posisjonen til målet av interesse.

SRS-signalene har et lineært forhold til molekylkonsentrasjonen, mens CARS-signalene tilfredsstiller en nesten kvadratisk konsentrasjonsavhengighet. Derfor viser de CH2-rike LDene et mye sterkere signal enn ER og cellemembranene i CARS-bildet enn i SRS-bildet (figur 5E, F). SRS-spektrene kan ekstraheres fra hyperspektrale bilder. Figur 5G viser de typiske SRS-spektrene fra LDer, ER, cytosol (CY) og NU. Både intensiteten og spektralformen er forskjellig for forskjellige cellulære rom. LD viser et mye sterkere signal ved 2,850 cm-1 enn andre organeller. Når det gjelder BILER, kan lignende spektra, selv om de er forskjellige i former, oppnås. De rå CARS-spektrene viser et lite rødt skifte sammenlignet med de tilsvarende SRS-spektrene. Spektral faseinnhenting kan videre brukes til å trekke ut Raman-responsene ved hjelp av CARS-spektrene.

Figure 1
Figur 1: Et skjema av det hyperspektrale CARS/SRS-mikroskopet. Forkortelser: CARS = sammenhengende anti-Stokes Raman spredning; SRS = stimulert Raman-spredning; PBS = polarisasjonsstråle splitter; PD = fotodiode; PMT = fotomultiplikatorrør; AOM = akustooptisk modulator. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: DMSO-spektra. (A) SRS og (B) CARS-spektra av DMSO. Prikker er eksperimentelle data; kurver er spektrale tilpasningsresultater. Forkortelser: CARS = sammenhengende anti-Stokes Raman spredning; SRS = stimulert Raman-spredning; DMSO = dimetylsulfoksid; w = spektral oppløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Signal-til-støy-forhold og spektra av DMSO. (A) Signal-til-støy-forhold for DMSO symmetrisk topp ved 2,913 cm-1 som en funksjon av konsentrasjon i D2O målt ved SRS. Prikkene er eksperimentelle data; linjen er det lineære tilpasningsresultatet. (B) SRS-spektrene på 0,1 % og 0,01 % DMSO i D2O. (C) Signal-til-støy-forholdet mellom DMSO symmetrisk topp ved 2 913 cm-1 som en funksjon av konsentrasjonen i D2O målt av CARS. Prikkene er eksperimentelle data; kurven er andregrads polynomtilpasningsresultat. (D) CARS-spektrene på 0,1 % og 0,01 % DMSO i D2O. Forkortelser: CARS = sammenhengende anti-Stokes Raman-spredning; SRS = stimulert Raman-spredning; DMSO = dimetylsulfoksid; SNR = signal-til-støy-forhold; D2O = deuteriumoksid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: SRS- og CARS-bilder og intensitetsprofiler av en MIA PaCa-2-celle. (A) Et SRS-bilde av en MIA PaCa-2-celle. (B) Et CARS-bilde av en MIA PaCa-2-celle i samme synsfelt som panel A. (C) Intensitetsprofil for SRS langs den gule linjen i panel A. (D) Intensitetsprofil for BILER langs den gule linjen i panel B. Prikker er eksperimentelle data; kurver er Gaussiske funksjonstilpasningsresultater. Skala barer = 5 μm. Forkortelser: CARS = sammenhengende anti-Stokes Raman spredning; SRS = stimulert Raman-spredning; w = oppløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Bilder og intensitetsprofil av MIA PaCa-2-celler. (A) Et SRS-bilde av MIA PaCa-2-celler ved optimalisert tidsforsinkelse for SRS-intensitet. (B) Et CARS-bilde med samme forsinkelse som i panel A. (C) Et SRS-bilde ved 98 cm-1 rødforskjøvde forsinkelser som i panel A. (D) Et CARS-bilde med samme optiske forsinkelse som i panel C. (E,F) SRS- og CARS-intensitetsprofilene plottet langs de stiplede linjene i panel A og D. (G) Typiske SRS-spektra fra lipiddråpene, endoplasmatisk retikulum, cytosol og kjerne. (H) Typiske CARS-spektra av de fire cellulære komposisjonene. De grønne og røde stiplede linjene er forsinkelsesposisjoner for henholdsvis panelene A/B og C/D. Skala barer = 10 μm. Forkortelser: CARS = sammenhengende anti-Stokes Raman spredning; SRS = stimulert Raman-spredning; LD = lipiddråper; ER = endoplasmatisk retikulum; CY = cytosol; NU = kjerne. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil: Lab-skrevet programvare basert på LabVIEW som har en samtidig flerkanalsskjerm for sanntidsvisning og lagring av bilder. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som presenteres her beskriver konstruksjonen av et multimodalt CRS-mikroskop og den direkte sammenligningen mellom CARS og SRS-avbildning. For mikroskopkonstruksjonen er de kritiske trinnene romlig og tidsmessig stråleoverlapping og strålestørrelsesoptimalisering. Det anbefales å bruke en standardprøve som DMSO før den biologiske avbildningen for optimalisering av SNR og kalibrering av Raman-skift. Direkte sammenligning mellom CARS- og SRS-bilder avslører at CARS har en bedre romlig oppløsning, mens SRS gir bedre spektraloppløsning og mindre innviklede kjemiske kontraster. Både CARS og SRS har lignende deteksjonsgrenser.

CARS og SRS-avbildning bruker høyenergi pulslasere for eksitasjon. Dette gjør det mulig for plattformen å integrere andre ikke-lineære optiske bildemodaliteter som multifotoneksitasjonsfluorescens, harmonisk generering og forbigående absorpsjon for ytterligere kjemiske kontraster28,39.

CARS og SRS har blitt mye brukt til å studere lipidsammensetning med høy kjemisk selektivitet. Teknologiene er imidlertid ikke begrenset til å kvantifisere lipider. SRS har blitt brukt for å kartlegge legemiddelfordeling42, proteinsyntese43 og DNA44. CARS og SRS har også blitt brukt til å avbilde farmasøytiske ingredienser og hjelpestoffer i tabletter 45,46,47,48. Hyperspektrale CARS og SRS har funnet applikasjoner i kreftdiagnose49, kardiovaskulær sykdom evaluering50 og nevral bildebehandling51. De kan også søkes om COVID-19-studier52. Bredbåndsbiler, som kan dekke spektralvinduer så brede som 3000 cm-1, kan belyse rike kjemiske strukturer i biologiske prøver53. På grunn av den langsomme avlesningshastigheten til CCD er pikselens oppholdstid på nivået millisekunder, mye langsommere enn mikrosekundpikselets oppholdstid for SRS-mikroskopi34. Hyperspektral SRS-mikroskopi har for tiden en typisk båndbredde på 200-300 cm-1, begrenset av laserbåndbredden og mangelen på lock-in-integrated array detektorer34. Fouriertransform SRS-mikroskopi er en alternativ måte å potensielt utvide SRS-spektraldekningen35.

Selv om CARS og SRS gir rik kjemisk informasjon uten behov for merking, ligger den kjemiske selektiviteten i kjemiske bindinger, noe som gjør det vanskelig å skille mellom spesifikke proteiner. Raman-tagger har vist potensialet for å forbedre den kjemiske selektiviteten til CARS og SRS54,55. Imidlertid har koherent Raman-avbildning fortsatt mye lavere følsomhet sammenlignet med fluorescensdeteksjon. Overflateforbedring ble brukt til spontan Raman-spredningsspektroskopi for å forbedre signalnivåene56. Det ble også brukt på CARS og SRS for signalforsterkning 57,58,59. Selv om forbedringsfaktoren ikke er så høy som spontan Raman-spredning, viser overflateforsterket CARS og SRS-mikroskopi fortsatt potensialet til å oppdage enkeltmolekyler59,60. Likevel frarøver bruken av metallpartikler eller overflater fordelen med den etikettfrie tilnærmingen. Forbedring av følsomheten til koherent Raman-mikroskopi uten bruk av metalloverflater vil i stor grad utvide anvendelsen av teknologien i biologisk vitenskap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne forskningen ble støttet av Purdue University Department of Chemistry oppstartsfond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D galvo scanner set Thorlabs GVS002
Acousto-optic modulator Isomet M1205-P80L-0.5
AOM driver Isomet 532B-2
Data acquisition card National Instruments PCle 6363 Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage Zaber X-LSM050A
Deuterium oxide Millipore Sigma 151882-100G
Dichroic mirror for beam combination Thorlabs DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation Semrock FF776-Di01-25x36
DMSO MiliporeSigma 200-664-3
MIA PaCa 2 Cells ATCC CRL-1420
Femtosecond laser system Spectral Physics InSightX3+
Filter for CARS Chroma AT655/30m
Filter for SRS Chroma ET980sp
Function generator Rigol DG1022Z
Glass rods Lattice Electro Optics SF-57
Half-wave plate Newport 10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020 National Instruments This is the image acquisition software
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI
Microscope housing Olympus BX51W1
Objective lens Olympus UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b OriginLab Corporation This is the spectral fitting software
Oscilloscope Tektronix TBS2204B
Photodiode Hamamatsu S3994-01
PMT detector Hamamatsu H7422P-40
PMT voltage amplifier Advanced Research Instrument Corp. PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube Thorlabs PBS255
Terminal block National Instruments BNC-2110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raman, C. V. A change of wave-length in light scattering. Nature. 121 (3051), 619 (1928).
  2. Li, S., Li, Y., Yi, R., Liu, L., Qu, J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and its applications. Frontiers in Physics. 8, 515 (2020).
  3. Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 883-909 (2008).
  4. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 507-530 (2011).
  5. Suhalim, J. L., Boik, J. C., Tromberg, B. J., Potma, E. O. The need for speed. Journal of Biophotonics. 5 (5-6), 387-395 (2012).
  6. Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Optics Letters. 7 (8), 350-352 (1982).
  7. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  8. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
  9. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: instrumentation, theory, and applications. The Journal of Physical Chemistry B. 108 (3), 827-840 (2004).
  10. Evans, C. L., et al. Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807 (2005).
  11. Cheng, J. -X., Volkmer, A., Book, L. D., Xie, X. S. An epi-detected coherent anti-Stokes Raman scattering (E-CARS) microscope with high spectral resolution and high sensitivity. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (7), 1277-1280 (2001).
  12. Volkmer, A., Book, L. D., Xie, X. S. Time-resolved coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Imaging based on Raman free induction decay. Applied Physics Letters. 80 (9), 1505-1507 (2002).
  13. Marks, D. L., Boppart, S. A. Nonlinear interferometric vibrational imaging. Physical Review Letters. 92 (12), 123905 (2004).
  14. Ganikhanov, F., Evans, C. L., Saar, B. G., Xie, X. S. High-sensitivity vibrational imaging with frequency modulation coherent anti-Stokes Raman scattering (FM CARS) microscopy. Optics Letters. 31 (12), 1872-1874 (2006).
  15. Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241-243 (2006).
  16. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363-1365 (2009).
  17. Masia, F., Karuna, A., Borri, P., Langbein, W. Hyperspectral image analysis for CARS, SRS, and Raman data. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (8), 727-734 (2015).
  18. Knutsen, K. P., Johnson, J. C., Miller, A. E., Petersen, P. B., Saykally, R. J. High spectral resolution multiplex CARS spectroscopy using chirped pulses. Chemical Physics Letters. 387 (4-6), 436-441 (2004).
  19. Okuno, M., Kano, H., Leproux, P., Couderc, V., Hamaguchi, H. -o Ultrabroadband multiplex CARS microspectroscopy and imaging using a subnanosecond supercontinuum light source in the deep near infrared. Optics Letters. 33 (9), 923-925 (2008).
  20. Masia, F., Glen, A., Stephens, P., Borri, P., Langbein, W. Quantitative chemical imaging and unsupervised analysis using hyperspectral coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 85 (22), 10820-10828 (2013).
  21. Pegoraro, A. F., Slepkov, A. D., Ridsdale, A., Moffatt, D. J., Stolow, A. Hyperspectral multimodal CARS microscopy in the fingerprint region. Journal of Biophotonics. 7 (1-2), 49-58 (2014).
  22. Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
  23. Ploetz, E., Laimgruber, S., Berner, S., Zinth, W., Gilch, P. Femtosecond stimulated Raman microscopy. Applied Physics B. 87 (3), 389-393 (2007).
  24. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  25. Nandakumar, P., Kovalev, A., Volkmer, A. Vibrational imaging based on stimulated Raman scattering microscopy. New Journal of Physics. 11 (3), 033026 (2009).
  26. Slipchenko, M. N., Le, T. T., Chen, H., Cheng, J. -X. High-speed vibrational imaging and spectral analysis of lipid bodies by compound Raman microscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 113 (21), 7681-7686 (2009).
  27. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62 (1), 507-530 (2011).
  28. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. -X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Annual Review of Biomedical Engineering. 17 (1), 415-445 (2015).
  29. Prince, R. C., Frontiera, R. R., Potma, E. O. Stimulated Raman scattering: from bulk to nano. Chemical Reviews. 117 (7), 5070-5094 (2017).
  30. Lu, F. -K., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy. Molecular Physics. 110 (15-16), 1927-1932 (2012).
  31. Ozeki, Y., et al. High-speed molecular spectral imaging of tissue with stimulated Raman scattering. Nature Photonics. 6 (12), 845-851 (2012).
  32. Wang, P., et al. Label-free quantitative imaging of cholesterol in intact tissues by hyperspectral stimulated raman scattering microscopy. Angewandte Chemie International Edition. 125 (49), 13280-13284 (2013).
  33. Freudiger, C. W., et al. Stimulated Raman scattering microscopy with a robust fibre laser source. Nature Photonics. 8 (2), 153-159 (2014).
  34. Liao, C. -S., et al. Microsecond scale vibrational spectroscopic imaging by multiplex stimulated Raman scattering microscopy. Light: Science & Applications. 4 (3), 265 (2015).
  35. Liao, C. -S., et al. Spectrometer-free vibrational imaging by retrieving stimulated Raman signal from highly scattered photons. Science Advances. 1 (9), 1500738 (2015).
  36. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  37. Andresen, E. R., Berto, P., Rigneault, H. Stimulated Raman scattering microscopy by spectral focusing and fiber-generated soliton as Stokes pulse. Optics Letters. 36 (13), 2387-2389 (2011).
  38. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  39. Zhang, C., Aldana-Mendoza, J. A. Coherent Raman scattering microscopy for chemical imaging of biological systems. Journal of Physics: Photonics. , (2021).
  40. Martens, W. N., Frost, R. L., Kristof, J., Theo Kloprogge, J. Raman spectroscopy of dimethyl sulphoxide and deuterated dimethyl sulphoxide at 298 and 77 k. Journal of Raman Spectroscopy. 33 (2), 84-91 (2002).
  41. Gill, G. W. Cytopreparation: Principles & Practice. Gill, G. W. , Springer. New York. 309-323 (2013).
  42. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  43. Wei, L., Yu, Y., Shen, Y., Wang, M. C., Min, W. Vibrational imaging of newly synthesized proteins in live cells by stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11226-11231 (2013).
  44. Lu, F. -K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  45. Slipchenko, M. N., et al. Vibrational imaging of tablets by epi-detected stimulated Raman scattering microscopy. Analyst. 135 (10), 2613-2619 (2010).
  46. Slipchenko, M. N., Zhou, B., Pinal, R., Teresa Carvajal, M., Cheng, J. -X. RAMAN-chemical imaging of solid dosage forms based on stimulated Raman scattering. American Pharmaceutical Review. 15 (3), 66 (2012).
  47. Sarri, B., et al. Discriminating polymorph distributions in pharmaceutical tablets using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 50 (12), 1896-1904 (2019).
  48. Fussell, A. L., Kleinebudde, P., Herek, J., Strachan, C. J., Offerhaus, H. L. Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy visualizes pharmaceutical tablets during dissolution. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (89), e51847 (2014).
  49. Freudiger, C. W., et al. Multicolored stain-free histopathology with coherent Raman imaging). Laboratory Investigation. 92 (10), 1492-1502 (2012).
  50. Lim, R. S., et al. Multimodal CARS microscopy determination of the impact of diet on macrophage infiltration and lipid accumulation on plaque formation in ApoE-deficient mice [S]. Journal of Lipid Research. 51 (7), 1729-1737 (2010).
  51. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  52. Tabish, T. A., Narayan, R. J., Edirisinghe, M. Rapid and label-free detection of COVID-19 using coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Mrs Communications. 10 (4), 566-572 (2020).
  53. Camp, C. H., et al. High-speed coherent Raman fingerprint imaging of biological tissues. Nature Photonics. 8 (8), 627-634 (2014).
  54. Wei, L., et al. Live-cell bioorthogonal chemical imaging: stimulated Raman scattering microscopy of vibrational probes. Accounts of Chemical Research. 49 (8), 1494-1502 (2016).
  55. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  56. Nie, S., Emory, S. R. Probing single molecules and single nanoparticles by surface-enhanced Raman scattering. Science. 275 (5303), 1102-1106 (1997).
  57. Steuwe, C., Kaminski, C. F., Baumberg, J. J., Mahajan, S. Surface enhanced coherent anti-Stokes Raman scattering on nanostructured gold surfaces. Nano Letters. 11 (12), 5339-5343 (2011).
  58. Fast, A., Kenison, J. P., Syme, C. D., Potma, E. O. Surface-enhanced coherent anti-Stokes Raman imaging of lipids. Applied Optics. 55 (22), 5994-6000 (2016).
  59. Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  60. Yampolsky, S., et al. Seeing a single molecule vibrate through time-resolved coherent anti-Stokes Raman scattering. Nature Photonics. 8 (8), 650-656 (2014).

Tags

Kjemi utgave 182
Direkte sammenligning av hyperspektral stimulert Raman-spredning og koherent anti-Stokes Raman-spredningsmikroskopi for kjemisk avbildning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Clark, M. G., Brasseale III, K. A.,… More

Clark, M. G., Brasseale III, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging. J. Vis. Exp. (182), e63677, doi:10.3791/63677 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter