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Chemistry

Comparación directa de la dispersión Raman estimulada hiperespectral y la microscopía de dispersión Raman antiespecial coherente para imágenes químicas

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63677
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Purdue University

Summary

Este artículo compara directamente la resolución, la sensibilidad y los contrastes de imagen de la dispersión Raman estimulada (SRS) y la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) integradas en la misma plataforma de microscopio. Los resultados muestran que CARS tiene una mejor resolución espacial, SRS da mejores contrastes y resolución espectral, y ambos métodos tienen una sensibilidad similar.

Abstract

La dispersión Raman estimulada (SRS) y la microscopía coherente de dispersión Raman anti-Stokes (CARS) son las tecnologías de imágenes de dispersión Raman coherente más utilizadas. Las imágenes hiperespectrales SRS y CARS ofrecen información espectral Raman en cada píxel, lo que permite una mejor separación de las diferentes composiciones químicas. Aunque ambas técnicas requieren dos láseres de excitación, sus esquemas de detección de señales y propiedades espectrales son bastante diferentes. El objetivo de este protocolo es realizar imágenes hiperespectrales SRS y CARS en una sola plataforma y comparar las dos técnicas de microscopía para obtener imágenes de diferentes muestras biológicas. El método de enfoque espectral se emplea para adquirir información espectral utilizando láseres de femtosegundo. Mediante el uso de muestras químicas estándar, se comparan la sensibilidad, la resolución espacial y la resolución espectral de SRS y CARS en las mismas condiciones de excitación (es decir, potencia en la muestra, tiempo de permanencia de píxeles, lente objetivo, energía de pulso). Los contrastes de imagen de CARS y SRS para muestras biológicas se yuxtaponen y comparan. La comparación directa de los rendimientos de CARS y SRS permitiría una selección óptima de la modalidad de imagen química.

Introduction

El fenómeno de dispersión Raman fue observado por primera vez en 1928 por C. V. Raman1. Cuando un fotón incidente está interactuando con una muestra, puede ocurrir espontáneamente un evento de dispersión inelástica, en el que el cambio de energía del fotón coincide con una transición vibratoria de la especie química analizada. Este proceso no requiere el uso de una etiqueta química, por lo que es una herramienta versátil y sin etiquetas para el análisis químico al tiempo que minimiza la perturbación de la muestra. A pesar de sus ventajas, la dispersión Raman espontánea sufre de una sección transversal de dispersión baja (típicamente 1011 más baja que la sección transversal de absorción infrarroja [IR]), lo que requiere largos tiempos de adquisición para el análisis2. Por lo tanto, la búsqueda de aumentar la sensibilidad del proceso de dispersión Raman es esencial para impulsar las tecnologías Raman para obtener imágenes en tiempo real.

Una forma efectiva de mejorar en gran medida la sensibilidad de la dispersión Raman es a través de procesos coherentes de dispersión Raman (CRS), para los cuales generalmente se utilizan dos pulsos láser para excitar transiciones vibracionales moleculares 3,4. Cuando la diferencia de energía de fotones entre los dos láseres coincide con los modos vibratorios de las moléculas de muestra, se generarán fuertes señales Raman. Los dos procesos CRS más utilizados para la obtención de imágenes son la dispersión Raman anti-Stokes coherente (CARS) y la dispersión Raman estimulada (SRS)5. En las últimas dos décadas, los desarrollos tecnológicos han avanzado las técnicas de microscopía CARS y SRS para convertirse en herramientas poderosas para la cuantificación y elucidación sin etiquetas de los cambios químicos en muestras biológicas.

Las imágenes químicas por microscopía CARS se pueden fechar en 1982, cuando el escaneo láser se aplicó por primera vez para adquirir imágenes CARS, demostrado por Duncan et al6. La modernización de la microscopía CARS se aceleró enormemente después de las amplias aplicaciones de la microscopía de fluorescencia multifotónica de barrido láser7. Los primeros trabajos del grupo Xie utilizando láseres de alta tasa de repetición han hecho que CARS sea una plataforma de imágenes químicas de alta velocidad, sin etiquetas, para la caracterización de moléculas en muestras biológicas 8,9,10. Uno de los principales problemas para las imágenes CARS es la presencia de un fondo no resonante, lo que reduce el contraste de la imagen y distorsiona el espectro Raman. Se han hecho muchos esfuerzos para reducir el fondo no resonante 11,12,13,14,15 o para extraer señales Raman resonantes de los espectros CARS 16,17. Otro avance que ha avanzado mucho en el campo es la imagen hiperespectral CARS, que permite el mapeo espectral en cada píxel de imagen con una selectividad química mejorada 18,19,20,21.

La dispersión Raman estimulada (SRS) es una tecnología de imagen más joven que CARS, aunque se descubrió antes22. En 2007, se informó de microscopía SRS utilizando una fuente láser de baja tasa de repetición23. Pronto, varios grupos demostraron imágenes SRS de alta velocidad utilizando láseres de alta tasa de repetición 24,25,26. Una de las principales ventajas de la microscopía SRS sobre CARS es la ausencia del fondo no resonante27, aunque otros fondos como la modulación de fase cruzada (XPM), la absorción transitoria (TA), la absorción de dos fotones (TPA) y el efecto fototérmico (PT), pueden ocurrir con SRS28. Además, la señal SRS y la concentración de la muestra tienen relaciones lineales, a diferencia de CARS, que tiene una dependencia cuadrática de concentración de señal29. Esto simplifica la cuantificación química y la desmezcla espectral. El SRS multicolor e hiperespectral ha evolucionado en diferentes formas 30,31,32,33,34,35,36, siendo el enfoque espectral uno de los enfoques más populares para la obtención de imágenes químicas 37,38.

Tanto CARS como SRS requieren el enfoque de la bomba y los rayos láser Stokes en la muestra para que coincida con la transición vibratoria de las moléculas para la excitación de la señal. Los microscopios CARS y SRS también comparten mucho en común. Sin embargo, la física subyacente a estos dos procesos, y las detecciones de señales involucradas en estas tecnologías de microscopía tienen disparidades 3,39. CARS es un proceso paramétrico que no tiene acoplamiento neto de energía fotón-molécula3. SRS, sin embargo, es un proceso no paramétrico, y contribuye a la transferencia de energía entre fotones y sistemas moleculares27. En CARS, se genera una nueva señal a frecuencia anti-Stokes, mientras que SRS se manifiesta como la transferencia de energía entre la bomba y los rayos láser stokes.

La señal CARS satisface Eq (1)28.

Equation 1 (1)

Mientras tanto, la señal SRS se puede escribir como Eq (2)28.

Equation 1(2)

Aquí, Ip, Is, ICARS y ΔISRS son las intensidades del haz de la bomba, el haz de Stokes, la señal CARS y las señales SRS, respectivamente. χ(3) es la susceptibilidad óptica no lineal de tercer orden de la muestra, y es un valor complejo compuesto de partes reales e imaginarias.

Estas ecuaciones expresan los perfiles espectrales y la dependencia de la concentración de señal de CARS y SRS. Las diferencias en la física dan como resultado esquemas de detección dispares para estas dos tecnologías de microscopía. La detección de señales en CARS generalmente implica la separación espectral de fotones recién generados y la detección utilizando un tubo fotomultiplicador (PMT) o un dispositivo de carga acoplada (CCD); para SRS, el intercambio de energía entre la bomba y los haces de Stokes generalmente se mide mediante modulación de intensidad de alta velocidad utilizando un modulador óptico y demodulación utilizando un fotodiodo (PD) emparejado con un amplificador de bloqueo.

Aunque en los últimos años se han publicado muchos desarrollos y aplicaciones tecnológicas en los campos CARS y SRS, no se han realizado comparaciones sistemáticas de las dos técnicas CRS en la misma plataforma, especialmente para CARS hiperespectrales y microscopía SRS. Las comparaciones directas en sensibilidad, resolución espacial, resolución espectral y capacidades de separación química permitirían a los biólogos seleccionar la mejor modalidad para la cuantificación química. En este protocolo, se proporcionan pasos detallados para construir una plataforma de imágenes multimodales con modalidades hiperespectrales CARS y SRS basadas en un sistema láser de femtosegundo y enfoque espectral. Las dos técnicas se han comparado en la dirección hacia adelante para la resolución espectral, la sensibilidad de detección, la resolución espacial y los contrastes de imágenes de las células.

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Protocol

1. Configuración instrumental para imágenes de CRS hiperespectrales

NOTA: La generación de señal CRS requiere el uso de láseres de alta potencia (es decir, clase 3B o clase 4). Se deben abordar los protocolos de seguridad y se debe usar el equipo de protección personal (EPP) adecuado en todo momento cuando se trabaja a potencias de pico tan altas. Consulte la documentación adecuada antes de la experimentación. Este protocolo se centra en el diseño de la trayectoria del haz, el canto de los pulsos de femtosegundos y la optimización de las condiciones de imagen. En la Figura 1 se muestra un diseño óptico general de este microscopio CRS hiperespectral. La configuración que se muestra aquí es una de las muchas configuraciones existentes para la microscopía CRS. El sistema de microscopía CRS utilizado en este protocolo se basa en una fuente láser de femtosegundo de doble salida y un microscopio de barrido láser.

  1. Asegúrese de que la fuente láser proporcione dos trenes de pulso de femtosegundos (120 fs de ancho) con una tasa de repetición de 80 MHz, incluida una longitud de onda fija a 1.045 nm utilizada como haz stokes, y una longitud de onda sintonizable de 680 a 1.300 nm utilizada como haz de bomba. Sincronice los pulsos de salida con una diferencia de retardo óptico. Utilice un marco de microscopio para construir la plataforma de imágenes.
  2. Diseño de la trayectoria del haz
    1. Para controlar la potencia del láser en la muestra, utilice una combinación de placa de media onda y divisor de haz de polarización (PBS) para cada rayo láser.
    2. Instale un modulador acústico-óptico (AOM) en la trayectoria del rayo láser stokes. Enfoca el haz con un objetivo de distancia focal de 150 mm en el AOM y recuerda la salida de0º orden con un objetivo de distancia focal de 400 mm.
    3. Utilice el mismo par de lentes (distancias focales de 150 mm y 400 mm) para expandir el haz de la bomba para que coincida con el tamaño del rayo láser con el Stokes.
    4. Coloque las lentes de distancia focal de 400 mm tanto en la bomba como en las trayectorias del haz Stokes en etapas de traslación unidimensionales separadas para ajustar la divergencia del haz y optimizar el tamaño del haz antes de ingresar al microscopio.
    5. Dirija el haz de la bomba con un espejo reflectante de ángulo recto montado en una etapa de traslación motorizada para la sintonización de retardo óptico. Si el haz de Stokes necesita retardo óptico, coloque estos componentes en su camino de haz.
    6. Permita que ambos haces se combinen en un espejo dicroico con una longitud de onda de corte a ~ 1,000 nm (entre la bomba y las longitudes de onda de Stokes), de modo que el haz de Stokes transmita a través del espejo dicroico mientras que el haz de la bomba es reflejado por el espejo dicroico. Envíe los rayos láser casi combinados al microscopio.
    7. Para chirriar la bomba y las vigas Stokes, coloque varillas de vidrio en sus trayectorias de haz. Consulte el paso 1.5 para obtener más información.
    8. Para confirmar la alineación adecuada y el tamaño del haz, use diafragmas de iris después del espejo dicroico y antes del microscopio. Específicamente, instale uno en una posición cercana y el otro a una distancia del espejo dicroico para confirmar una buena alineación y superposición del haz. Utilice una tarjeta de visualización IR o un visor IR para visualizar el haz durante la alineación.
    9. Utilice un PD rápido y un osciloscopio para medir aproximadamente el retardo óptico entre la bomba y los pulsos de Stokes. Active el osciloscopio mediante el muestreo del tren de pulsos láser.
    10. Bloquee el haz de la bomba y muestree el haz de Stokes. Haga zoom en uno de los pulsos y coloque un cursor vertical sobre él para marcar su ubicación temporal en el osciloscopio.
    11. Desbloquee el haz de la bomba y bloquee el haz de Stokes. Traduzca la etapa de retardo hasta que los pulsos de la bomba de muestra se alineen temporalmente con la posición marcada.
  3. El microscopio de barrido láser
    1. Para una configuración de microscopio vertical, envíe los rayos láser combinados a través de un periscopio para subir a un nivel apropiado antes de llegar a los espejos de escaneo galvo 2D.
    2. Mida el tamaño del rayo láser antes del microscopio y configure el par de lentes adecuado después de los espejos galvo para expandir el rayo láser para que coincida mejor con el tamaño de la pupila de entrada de la lente objetivo.
    3. Construya un sistema 4-f utilizando las dos lentes, con la apertura posterior de la lente del objetivo y el centro de los dos espejos galvo siendo planos conjugados. Alternativamente, use dos espejos galvo 1D separados con dos sistemas de lentes 4-f para el escaneo láser.
    4. Después del condensador, diseñe un espejo abatible de 2 pulgadas para reflejar los rayos láser para la recolección de señales. Coloque una lente con un diámetro de 2 pulgadas en la trayectoria del haz transmitido para recoger y enfocar completamente las señales de transmisión a los detectores.
    5. Dirija las señales CARS al PMT con un espejo dicroico que tenga un corte a 776 nm, y permita que las señales SRS transmitidas sean detectadas por el PD. Utilice un filtro de paso de banda (655/30 nm) antes del PMT para rechazar los pulsos láser de excitación residual. Utilice un filtro de paso corto (paso corto de 980 nm) antes del PD para impedir que el haz de Stokes entre en el detector.
    6. Para la detección de señal CARS, conecte un preamplificador y un convertidor de corriente-voltaje después del PMT y antes de enviar la señal al sistema de adquisición de datos. Ajuste el voltaje PMT para optimizar la señal y el contraste de la imagen.
    7. Utilice un generador de funciones para modular la OMA a 1-10 MHz y utilice la misma frecuencia que la referencia para la demodulación de bloqueo. Utilice un amplificador de bloqueo para extraer señales SRS antes de la adquisición de datos.
  4. Adquisición y visualización de datos
    1. Realice la adquisición de datos utilizando una tarjeta de adquisición de datos digitales (DAQ) junto con un bloque de terminales.
    2. Utilice las salidas analógicas del DAQ para controlar los espejos galvo y las entradas analógicas para la adquisición de señal.
    3. Utilice software escrito en laboratorio basado en LabVIEW que tiene una pantalla multicanal simultánea para ver y guardar imágenes en tiempo real (consulte Archivo suplementario).
  5. Chirriar la fuente de femtosegundos y medir la resolución espectral
    NOTA: Para lograr una buena resolución espectral utilizando el enfoque espectral, se utilizan varillas de vidrio para introducir dispersiones y pulsos láser de chirrido de femtosegundo a picosegundo. Para lograr la mejor resolución espectral, la velocidad de chirrido del haz de la bomba debe ser igual a la del haz de Stokes. Para este sistema láser, la mejor resolución espectral se puede lograr chirriando los pulsos láser de salida de ~ 120 fs a 3.4 ps para la bomba y 1.8 ps para el Stokes. Este canto se logra mediante el uso de una combinación de 4 + 1 (cuatro en el haz combinado, uno solo en el haz Stokes) de una combinación de varilla de vidrio de 150 mm (SF-57), como se describe a continuación, y debe lograr una resolución espectral de 15 cm-1 . La duración del pulso se puede medir utilizando un autocorrelador.
    1. Inserte una varilla de vidrio de 150 mm solo en la trayectoria del haz stokes.
    2. Inserte dos varillas de vidrio de 150 mm en la trayectoria combinada de la bomba/haz Stokes después del divisor de haz dicroico. Para aumentar el chirrido, deje que los rayos láser combinados pasen dos veces las dos varillas de vidrio colocando un espejo dieléctrico en un extremo de las varillas.
    3. Para medir la resolución espectral, prepare una muestra química estándar (por ejemplo, dimetilsulfóxido [DMSO]) prensada entre dos cubiertas de vidrio y escanee la etapa de retardo hasta que se alcance la señal máxima.
    4. Mueva el retardo óptico 1.000 μm en la dirección de desplazamiento al rojo. Luego, ejecute 200 cuadros a 10 μm / paso hacia la dirección de desplazamiento azul para recopilar la pila de imágenes hiperespectrales.
    5. Para convertir los números de fotograma en números de onda, realice una regresión lineal utilizando el C-H simétrico (2.913 cm-1) y asimétrico (2.994 cm-1) que se extiende desde DMSO y sus correspondientes números de fotograma40.
    6. Utilice la señal XPM para medir el perfil de intensidad de enfoque espectral. Cierre a medias el diafragma del condensador y mueva el foco a una funda en blanco. Recopile el mismo número de pasos que para el SRS hiperespectral. Para medir el fondo no resonante de CARS, concéntrese en la cubierta de vidrio y recopile el mismo número de pasos para las mediciones hiperespectrales de CARS.
  6. Optimización de la relación señal-ruido (SNR) de las imágenes
    1. Prepare una muestra química para la alineación del sistema. Siga el procedimiento descrito en el paso 3.1 para la preparación de la muestra.
      NOTA: DMSO es una buena opción porque es un químico de laboratorio común con fuertes señales Raman y picos simétricos y asimétricos C-H bien separados.
    2. Coloque la muestra en el escenario del microscopio y agregue agua o aceite de inmersión si es necesario para la lente o el condensador del objetivo. Mueva correctamente el borde de la gota DMSO en el campo de visión y ajuste la lente del objetivo para obtener el mejor enfoque. Centrar el condensador utilizando el método de iluminación de Köhler41. Abra completamente el diafragma en el condensador.
    3. Ajuste la longitud de onda del haz de la bomba a 800 nm (Stokes de 1.045 nm) para apuntar al pico CH 3 de 2.913 cm-1. Ajuste la potencia tanto de la bomba como del haz stokes a ~30 mW antes del microscopio ajustando la placa de media onda (~10 mW de potencia en el plano de muestra).
    4. Para SRS, establezca la ganancia del amplificador de bloqueo en ~ 10 con una constante de tiempo de 7 μs (cuando se usa un tiempo de permanencia de píxeles de 10 μs). Asegúrese de que la constante de tiempo sea menor que el tiempo de permanencia de píxeles. Utilice Demod R para la salida AUX para señales SRS.
    5. Para CARS, envíe la salida PMT al preamplificador y al convertidor de corriente-voltaje. Utilice el DAQ para adquirir la salida del convertidor.
    6. Establezca los parámetros de adquisición de imágenes en el software de adquisición. Utilice un número de píxel de 200 x 200 con un tamaño de escaneo de ~100 x 100 μm2. Asegúrese de que la imagen contenga tanto la gota DMSO como un área vacía.
    7. Escanee la muestra y verifique la imagen en la pantalla de la computadora. Escanee la etapa de retardo motorizado en el haz Stokes/bomba mientras monitorea las imágenes en tiempo real. Escanee sobre el retraso hasta que se maximice la señal.
    8. Mueva la gota DMSO para cubrir todo el campo de visión y compruebe si el máximo de señal de CC está centrado en la imagen (la señal depende del haz de la bomba). Ajuste la posición del haz de la bomba a través de un espejo o el desplazamiento de voltaje en el software de imágenes.
    9. Después de la optimización de CC, ajuste los espejos de haz stokes hasta que la señal de CA se maximice ajustando el valor umbral para mostrar ~ 50% de saturación. Compruebe si la saturación está centrada en la imagen. Si no, afina los espejos solo en el rayo Stokes. Monitoree la señal durante la alineación como retroalimentación en tiempo real sobre la calidad de la alineación.
    10. Para determinar el SNR, seleccione una pequeña región de la imagen DMSO y mida el valor medio. Para el ruido, seleccione un área pequeña en la región vacía de la imagen y determine tanto el valor medio como la desviación estándar. Reste el valor medio de ruido del valor medio de la señal y divida los resultados por la desviación estándar de la región vacía.
    11. Si el SNR calculado no es lo suficientemente alto (típicamente 800-1,000 para SRS y >10,000 para CARS a un voltaje PMT de 0.4 V con esta combinación de potencia), verifique y reoptimice la superposición del haz, los tamaños del haz y la posición de la etapa de retardo, ajuste el AOM y cambie la frecuencia de modulación del generador de funciones hasta que se obtenga el SNR esperado.

2. Análisis de imágenes y procesamiento de datos

  1. Análisis SNR
    1. Abra el software ImageJ. Para importar el archivo de .txt de ejemplo DMSO guardado, haga clic en archivo | Importar | | de imagen de texto Abierto.
    2. Una vez importada la imagen, presione CTRL+mayús+C para que aparezca la función de brillo y contraste (B&C). Para encontrar la señal de muestra máxima, presione el botón automático en el B&C hasta que una región de la muestra DMSO aparezca saturada.
    3. Haga clic en la herramienta de selección ovalada en la interfaz de ImageJ y resalte una pequeña área de la región DMSO saturada. Una vez resaltado, presione M para medir la media y la desviación estándar del área seleccionada.
    4. Para medir el fondo, ajuste las barras en la función B&C hasta que se pueda observar la señal de la región vacía. Haga clic en la selección ovalada y resalte una región del fondo del mismo tamaño que para el paso 2.1.3. Asegúrese de que la región seleccionada no contenga DMSO. Pulse M para medir las estadísticas del área seleccionada.
    5. Calcule el SNR de acuerdo con el paso 1.6.10.
  2. Procesamiento de imágenes CRS hiperespectrales
    1. Importe el archivo de .txt de acuerdo con el paso 2.1.1. Una vez importado, haga clic en imagen | Pilas | Herramientas | Montaje para apilar... para convertir el archivo en una pila de imágenes.
    2. Desplácese por el montaje hasta que el primer pico dmSO sea visible. Seleccione una región en el DMSO y haga clic en imagen | | de pila Trazar el perfil del eje Z para trazar el espectro de intensidad versus número de fotograma. Para extraer los datos espectrales sin procesar, haga clic en la lista y copie los datos del perfil.
    3. Para convertir el espectro recuperado en unidades de número de onda, realice una regresión lineal como se describe en el paso 1.5.5.
  3. Ajuste para medir la resolución espectral
    NOTA: Las funciones lorentzianas se utilizan para adaptarse a los espectros SRS y CARS28.
    1. Abra el software de ajuste y, a continuación, copie y pegue los datos de regresión lineal en el programa. Para ajustar los datos de SRS, resalte los datos y, a continuación, trace los datos como un gráfico de dispersión.
    2. Levanta el diagrama de dispersión. Haga clic en análisis | Picos y | de referencia Múltiples | peak fit Abra el cuadro de diálogo para abrir el analizador de picos. Cuando se levante, compruebe que la entrada es la gráfica actual y cambie la función de pico a Lorentzian (Lorentz).
    3. Haga doble clic en cada uno de los dos picos DMSO en el gráfico para resaltar las regiones que se instalarán. A continuación, haga clic en Abrir NLfit para abrir la ventana de ajuste . Haga clic en el botón Ajustar hasta que converja y, a continuación, en Aceptar, para ver un resumen tabulado de los coeficientes de ajuste (consulte Eq (3)).
      NOTA: La siguiente ecuación muestra el formato de la función lorentziana en el software. A1/2 son las amplitudes de los picos de ajuste, w1/2 son los anchos de los picos ajustados, y los valores x01/02 son los centros de los picos ajustados. La variable independiente es x y la variable dependiente es y.
      Equation 1 (3)
    4. Para el ajuste espectral CARS, haga clic en Análisis | | de ajuste Ajuste de curva no lineal | Abrir cuadro de diálogo. Seleccionar categoría: nuevo para definir una nueva función para CARS. Utilice una función de ajuste CARS de dos picos definida a continuación (consulte Eq (4)) para el ajuste espectral CARS.
      Equation 1 (4)
  4. Determinación de la resolución espacial
    NOTA: Antes de este paso, es importante conocer la conversión entre el tamaño de píxel a un aumento específico, el número de píxel y el tamaño de paso en μm. Esto se puede realizar utilizando una muestra de un diámetro conocido que es mayor que la resolución de imagen esperada, midiendo su perfil de línea y ajustando una función gaussiana para determinar el ancho completo a la mitad del valor máximo (FWHM). Se pueden utilizar objetivos de resolución o muestras uniformes como perlas poliméricas.
    1. Adquirir una imagen de células o partículas poliméricas de menos de 200 nm de diámetro.
    2. Utilice ImageJ para dibujar una línea a través de la partícula más pequeña de la imagen.
    3. Pulse K para trazar el perfil de intensidad.
    4. Haga clic en la lista en la ventana emergente y copie la información en el software de ajuste.
    5. Trazar el perfil en el software de ajuste y utilizar el ajuste gaussiano (haga clic en Análisis | | de ajuste Ajuste de curva no lineal | Abrir | de diálogo Categoría: Funciones básicas; Función: Gauss).
    6. Lea el ancho máximo después de la instalación. Utilice la conversión de píxel a tamaño para obtener la resolución real del microscopio.

3. Preparación de muestras para imágenes hiperespectrales de CRS

  1. Preparación de diapositivas de imagen y muestras químicas
    1. Coloque un trozo de cinta adhesiva de doble cara en una cubierta y recorte una pequeña forma rectangular de la cinta desde el centro de la cinta colocada para crear un área abierta para que se coloque la muestra.
    2. Pipete 1-2 μL de DMSO puro y dispense la gota en el centro de la vacante.
    3. Coloque con cuidado la cubierta superior y presione suavemente los bordes de las cubiertas para sellar la cámara mientras se asegura de que la muestra DMSO no entre en contacto con los bordes de la cinta.
    4. Para experimentos de sensibilidad, prepare diluciones seriadas de DMSO en óxido de deuterio (D2O) para dar un rango de concentración de 50% -0%. Tome 1-2 μL de cada solución y prepare muestras prensadas como se describió anteriormente.
  2. Preparación celular
    1. Sembra las células en un plato con fondo de vidrio de 35 mm (o más grande) en el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina.
    2. Incubar las células en una cámara de incubación a 37 °C con una atmósfera de CO2 al 5% durante la noche o más hasta que se logre una confluencia de ~50%-80%.
    3. Tome imágenes de las células vivas directamente o fije las células con una solución de formalina al 10% para obtener imágenes.

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Representative Results

Comparaciones de la resolución espectral
La Figura 2 compara la resolución espectral de la microscopía hiperespectral SRS (Figura 2A) y CARS (Figura 2B) utilizando una muestra DMSO. Para el espectro SRS, se aplicaron dos funciones lorentzianas (ver paso de protocolo 2.3) para ajustarse al espectro, y se obtuvo una resolución de 14,6 cm-1 utilizando el pico de 2.913 cm-1 . Para CARS, se utilizó una función de ajuste de dos picos con un fondo gaussiano (consulte el paso de protocolo 2.3) para el ajuste, que dio la resolución espectral de 17.1 cm-1. Estos resultados muestran que, en la misma condición de medición, SRS tiene una mejor resolución espectral que CARS. La resolución espectral reducida en CARS es causada principalmente por la participación del fondo no resonante. Además, se encontró que las relaciones de pico simétricas (2.913 cm-1) y asimétricas (2.995 cm-1) eran muy diferentes para SRS y CARS. Esto se debe a las diferentes correlaciones de señal con la susceptibilidad óptica no lineal de tercer orden, como se describe en las ecuaciones (1) y (2). Con la dependencia cuadrática de CARS, la diferencia de intensidad entre los dos picos se amplifica. Las formas de línea simétrica de los picos SRS y las formas de línea asimétrica de los picos CARS se pueden observar en el espectro. La asimetría en la señal CARS se debe principalmente a la presencia de la interferencia de fondo no resonante. Los picos espectrales CARS aparecen ligeramente desplazados al rojo (1-2 cm-1) a los picos SRS. Esto también surge de la interferencia de fondo no resonante con picos resonantes.

Comparaciones de la sensibilidad de detección
La Figura 3 compara la sensibilidad de detección de la microscopía hiperespectral SRS y CARS. El SNR de las señales DMSO SRS (2.913 cm-1) en función de la concentración de DMSO en D2O a altas concentraciones se traza primero (1%-50%, Figura 3A). Los resultados muestran una relación lineal, ecuación satisfactoria (2). La Figura 3B traza los espectros DMSO a concentraciones de 0.1% y 0.01%, en las que el pico de 2,913 cm-1 se puede resolver en el primero pero no en el segundo, lo que indica que el límite de detección está entre 0.1% y 0.01% DMSO. Utilizando el límite de criterios en blanco, estimamos que el límite de detección de SRS es de 0,021% DMSO. La Figura 3C traza el CARS SNR como la función de la concentración de DMSO (1%-50%), mostrando una dependencia cuadrática de acuerdo con la ecuación (1). Los espectros CARS recuperados en fase se muestran en la Figura 3D para el DMSO de 0.1% y 0.01%. Para lograr estos espectros, se utilizó un método de recuperación de fase espectral basado en relaciones Kramers-Kronig y se realizó una eliminación de fondo adicional16. Similar a los espectros SRS, el pico DMSO 2,913 cm-1 se puede resolver claramente para el DMSO 0.1% pero no para el 0.01%, lo que indica un límite de detección entre estas dos concentraciones. Utilizando el límite de criterios en blanco, estimamos que el límite de detección de SRS es de 0,015% DMSO. El DMSO del 0,02% corresponde a 2,8 mM. Por lo tanto, el límite de detección del microscopio CRS hiperespectral utilizado aquí es ~ 2.1-2.8 mM DMSO.

Comparaciones de la resolución espacial
La Figura 4 compara la resolución de una pequeña característica celular detectada en imágenes SRS (Figura 4A) y CARS (Figura 4B). Los perfiles de intensidad de la misma línea se muestran y ajustan utilizando una función gaussiana para determinar los valores de FWHM para la comparación de resolución. La señal SRS dio una resolución de 398.6 nm (Figura 4C), mientras que la señal CARS dio una resolución de 330.3 nm (Figura 4D). La resolución de CARS fue ~ 1.2x mejor que la del SRS. La razón de la diferencia de resolución también radica en las ecuaciones (1) y (2). Tanto la bomba como los haces de Stokes tienen una función de dispersión de puntos gaussiana en el foco. La señal de CARS es entonces proporcional a la multiplicación de tres funciones gaussianas, lo que reduce aproximadamente el ancho en un factor de √3. Del mismo modo, para SRS, el ancho se reduce en un factor de √2. Por lo tanto, la resolución de CARS fue √3/√2 = 1,2 veces mejor que la del SRS.

Comparaciones de las imágenes de las células
La Figura 5 compara las imágenes SRS y CARS de las celdas MIA PaCa-2 en diferentes posiciones de retardo óptico. La Figura 5A muestra las imágenes SRS en el retardo óptico que dio la señal más fuerte. En esta imagen, se pueden detectar gotas de lípidos (LD), retículo endoplásmico (ER) y núcleo (NU), y los LD tienen las señales más fuertes que se muestran como puntos brillantes. La Figura 5B muestra la imagen del canal CARS con el mismo retardo óptico, con contrastes muy reducidos para los LD. Las principales razones de esta diferencia de contraste son la presencia del fondo no resonante y el desplazamiento al rojo del mismo pico Raman en los espectros CARS. A este retraso óptico, la señal generada tiene una gran contribución del fondo no resonante del agua. Para mejorar el contraste de lípidos en CARS, el retardo óptico se ajustó a un valor desplazado al rojo. El desplazamiento al rojo mejoró los contrastes lipídicos al concentrar más energía a los 2.850 cm-1 tanto para SRS (Figura 5C) como para CARS (Figura 5D), aunque el nivel general de señal se redujo. Para CARS, se logró un contraste similar de LD como SRS mediante un desplazamiento al rojo de ~ 98 cm-1 en el enfoque espectral (Figura 5D), aunque todavía se observó un fondo más alto que el de la imagen SRS. Con este retraso óptico, la imagen SRS muestra mucho menos contenido de proteínas y ácidos nucleicos, pero un fuerte contenido de lípidos en LD, ER y membranas celulares (Figura 5C).

CARS es un proceso paramétrico, mientras que SRS no es paramétrico. Tal diferencia también contribuye a contrastar las diferencias en las dos modalidades. Las señales CARS paramétricas están determinadas por la interferencia de las señales CARS de diferentes capas cercanas al foco láser, que pueden mostrar contrastes negativos como lo indican las flechas en la Figura 5B y la Figura 5D (también en la Figura 4B). Tales contrastes negativos inducidos por interferencia de señal están ausentes en las imágenes SRS. El contraste negativo en CARS podría proporcionar información sobre la posición axial del objetivo de interés.

Las señales SRS tienen una relación lineal con la concentración molecular, mientras que las señales CARS satisfacen una dependencia de concentración casi cuadrática. Por lo tanto, los LD ricos en CH2 muestran una señal mucho más fuerte que el ER y las membranas celulares en la imagen CARS que en la imagen SRS (Figura 5E, F). Los espectros SRS se pueden extraer de imágenes hiperespectrales. La Figura 5G muestra los espectros SRS típicos de LDs, ER, citosol (CY) y NU. Tanto la intensidad como la forma espectral son diferentes para diferentes compartimentos celulares. LD muestra una señal mucho más fuerte a 2.850 cm-1 que otros orgánulos. En cuanto a CARS, se pueden obtener espectros similares, aunque diferentes en formas. Los espectros CARS en bruto muestran un pequeño desplazamiento al rojo en comparación con los espectros SRS correspondientes. La recuperación de fase espectral se puede utilizar para extraer las respuestas Raman utilizando los espectros CARS.

Figure 1
Figura 1: Un esquema del microscopio hiperespectral CARS/SRS. Abreviaturas: CARS = dispersión raman anti-Stokes coherente; SRS = dispersión Raman estimulada; PBS = divisor de haz de polarización; PD = fotodiodo; PMT = tubo fotomultiplicador; AOM = modulador acústico-óptico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Espectros DMSO. (A) Espectros SRS y (B) CARS de DMSO. Los puntos son datos experimentales; las curvas son resultados de ajuste espectral. Abreviaturas: CARS = dispersión raman anti-Stokes coherente; SRS = dispersión Raman estimulada; DMSO = dimetilsulfóxido; w = resolución espectral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Relación señal-ruido y espectros de DMSO. (A) Relación señal-ruido del pico simétrico DMSO a 2.913 cm-1 en función de la concentración en D2O medida por SRS. Los puntos son datos experimentales; la línea es el resultado de ajuste lineal. (B) Los espectros SRS de 0.1% y 0.01% DMSO en D2O. (C) Relación señal-ruido del pico simétrico DMSO a 2,913 cm-1 en función de la concentración en D2O medida por CARS. Los puntos son datos experimentales; la curva es el resultado de ajuste polinómico de segundo grado. (D) Los espectros CARS de 0.1% y 0.01% DMSO en D2O. Abreviaturas: CARS = dispersión Raman anti-Stokes coherente; SRS = dispersión Raman estimulada; DMSO = dimetilsulfóxido; SNR = relación señal-ruido; D2O = óxido de deuterio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imágenes SRS y CARS y perfiles de intensidad de una célula MIA PaCa-2. (A) Una imagen SRS de una célula MIA PaCa-2. (B) Una imagen CARS de una celda MIA PaCa-2 en el mismo campo de visión que el panel A. C) Perfil de intensidad del SRS a lo largo de la línea amarilla del panel A. D) Perfil de intensidad de los CARS a lo largo de la línea amarilla del panel B. Los puntos son datos experimentales; las curvas son resultados de ajuste de funciones gaussianas. Barras de escala = 5 μm. Abreviaturas: CARS = dispersión raman anti-Stokes coherente; SRS = dispersión Raman estimulada; w = resolución. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Imágenes y perfil de intensidad de las células MIA PaCa-2. (A) Una imagen SRS de las células MIA PaCa-2 en el retardo de tiempo optimizado para la intensidad SRS. B) Una imagen cars con el mismo retraso que en el panel A. (C) Una imagen SRS en los retardos desplazados al rojo de 98 cm-1 como en el panel A. D) Una imagen CARS con el mismo retardo óptico que en el panel C. (E,F) Los perfiles de intensidad SRS y CARS trazados a lo largo de las líneas punteadas en los paneles A y D. (G) Espectros típicos de SRS de las gotas lipídicas, el retículo endoplásmico, el citosol y el núcleo. (H) Espectros CARS típicos de las cuatro composiciones celulares. Las líneas punteadas verdes y rojas son posiciones de retardo para los paneles A/B y C/D, respectivamente. Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: CARS = dispersión raman anti-Stokes coherente; SRS = dispersión Raman estimulada; LD = gotas lipídicas; ER = retículo endoplásmico; CY = citosol; NU = núcleo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo presentado aquí describe la construcción de un microscopio CRS multimodal y la comparación directa entre CARS y SRS imaging. Para la construcción del microscopio, los pasos críticos son la superposición espacial y temporal del haz y la optimización del tamaño del haz. Se recomienda utilizar una muestra estándar como DMSO antes de la imagen biológica para optimizar el SNR y calibrar los turnos Raman. La comparación directa entre las imágenes CARS y SRS revela que CARS tiene una mejor resolución espacial, mientras que SRS ofrece una mejor resolución espectral y contrastes químicos menos enrevesados. Tanto CARS como SRS tienen límites de detección similares.

Las imágenes CARS y SRS utilizan láseres de pulso de alta energía para la excitación. Esto permite a la plataforma integrar otras modalidades de imágenes ópticas no lineales, como la fluorescencia de excitación multifotónica, la generación de armónicos y la absorción transitoria para contrastes químicos adicionales28,39.

CARS y SRS se han utilizado ampliamente para estudiar la composición lipídica con alta selectividad química. Sin embargo, las tecnologías no se limitan a cuantificar los lípidos. SRS se ha aplicado para mapear la distribución de fármacos42, la síntesis de proteínas43 y el ADN44. CARS y SRS también se han aplicado a ingredientes farmacéuticos de imagen y excipientes en tabletas 45,46,47,48. Los CARS hiperespectrales y el SRS han encontrado aplicaciones en el diagnóstico del cáncer49, la evaluación de enfermedades cardiovasculares50 y la imagen neural51. También se pueden aplicar para estudios de COVID-1952. Los CARS de banda ancha, que pueden cubrir ventanas espectrales tan anchas como 3.000 cm-1, pueden dilucidar estructuras químicas ricas en muestras biológicas53. Sin embargo, debido a la lenta velocidad de lectura del CCD, el tiempo de permanencia de píxeles está en el nivel de milisegundos, mucho más lento que el tiempo de permanencia de píxeles de microsegundos para la microscopía SRS34. La microscopía SRS hiperespectral tiene actualmente un ancho de banda típico de 200-300 cm-1, limitado por el ancho de banda del láser y la falta de detectores de matriz integrados de bloqueo34. La microscopía SRS de transformada de Fourier es una forma alternativa de ampliar potencialmente la cobertura espectral del SRS35.

Aunque CARS y SRS proporcionan información química rica sin la necesidad de etiquetado, la selectividad química radica en los enlaces químicos, lo que dificulta la distinción de proteínas específicas. Las etiquetas Raman han demostrado el potencial de mejorar la selectividad química de CARS y SRS54,55. Sin embargo, las imágenes Raman coherentes todavía tienen una sensibilidad mucho menor en comparación con la detección de fluorescencia. La mejora de la superficie se utilizó para la espectroscopia de dispersión Raman espontánea para mejorar los niveles de señal56. También se aplicó a CARS y SRS para la amplificación de señal 57,58,59. Aunque el factor de mejora no es tan alto como la dispersión Espontánea de Raman, la microscopía CARS y SRS mejorada en superficie todavía muestra el potencial para detectar moléculas individuales59,60. Sin embargo, el uso de partículas o superficies metálicas priva a la ventaja del enfoque sin etiquetas. Mejorar la sensibilidad de la microscopía Raman coherente sin usar superficies metálicas ampliaría en gran medida la aplicación de la tecnología en la ciencia biológica.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Acknowledgments

Esta investigación fue apoyada por el fondo de inicio del Departamento de Química de la Universidad de Purdue.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2D galvo scanner set Thorlabs GVS002
Acousto-optic modulator Isomet M1205-P80L-0.5
AOM driver Isomet 532B-2
Data acquisition card National Instruments PCle 6363 Custom ordered filter (980 sp)
Delay stage Zaber X-LSM050A
Deuterium oxide Millipore Sigma 151882-100G
Dichroic mirror for beam combination Thorlabs DMLP1000
Dichroic mirror for signal separation Semrock FF776-Di01-25x36
DMSO MiliporeSigma 200-664-3
MIA PaCa 2 Cells ATCC CRL-1420
Femtosecond laser system Spectral Physics InSightX3+
Filter for CARS Chroma AT655/30m
Filter for SRS Chroma ET980sp
Function generator Rigol DG1022Z
Glass rods Lattice Electro Optics SF-57
Half-wave plate Newport 10RP02-51; 10RP02-46
LabVIEW 2020 National Instruments This is the image acquisition software
Lock-in amplifier Zurich Instrument HF2LI
Microscope housing Olympus BX51W1
Objective lens Olympus UPLSAPO60XW
Origin Pro 2019b OriginLab Corporation This is the spectral fitting software
Oscilloscope Tektronix TBS2204B
Photodiode Hamamatsu S3994-01
PMT detector Hamamatsu H7422P-40
PMT voltage amplifier Advanced Research Instrument Corp. PMT4V3
Polarizing beamsplitter cube Thorlabs PBS255
Terminal block National Instruments BNC-2110

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Química Número 182
Comparación directa de la dispersión Raman estimulada hiperespectral y la microscopía de dispersión Raman antiespecial coherente para imágenes químicas
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Clark, M. G., Brasseale III, K. A., Gonzalez, G. A., Eakins, G., Zhang, C. Direct Comparison of Hyperspectral Stimulated Raman Scattering and Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy for Chemical Imaging. J. Vis. Exp. (182), e63677, doi:10.3791/63677 (2022).

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