Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الجمع بين المواد العضوية البشرية وتكنولوجيا الأعضاء على الرقاقة لنمذجة الوظائف الخاصة بالمنطقة المعوية

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63724
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2,3
1Emulate Inc. Boston, 2Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Division of Pediatric General and Thoracic Surgery, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

يتم دمج المواد العضوية المعوية المشتقة من الخزعة وتقنيات الأعضاء على الرقائق في منصة فسيولوجية دقيقة لتلخيص وظائف الأمعاء الخاصة بالمنطقة.

Abstract

الغشاء المخاطي المعوي هو حاجز فيزيائي وكيميائي حيوي معقد يؤدي عددا لا يحصى من الوظائف المهمة. إنه يتيح نقل وامتصاص واستقلاب العناصر الغذائية و xenobiotics مع تسهيل العلاقة التكافلية مع الميكروبات وتقييد غزو الكائنات الحية الدقيقة. التفاعل الوظيفي بين أنواع الخلايا المختلفة وبيئتها الفيزيائية والكيميائية الحيوية أمر حيوي لإنشاء والحفاظ على توازن الأنسجة المعوية. إن نمذجة هذه التفاعلات المعقدة وفسيولوجيا الأمعاء المتكاملة في المختبر هو هدف هائل مع إمكانية تحويل الطريقة التي يتم بها اكتشاف وتطوير الأهداف العلاجية الجديدة والأدوية المرشحة.

تم مؤخرا الجمع بين تقنيات العضوية و Organ-on-a-Chip لتوليد رقائق الأمعاء ذات الصلة بالإنسان المناسبة لدراسة الجوانب الوظيفية لفسيولوجيا الأمعاء والفيزيولوجيا المرضية في المختبر. يتم زرع المواد العضوية المشتقة من خزعات الأمعاء الدقيقة (الاثني عشر) والأمعاء الغليظة في المقصورة العلوية لشريحة العضو ثم تتوسع بنجاح كطبقات أحادية مع الحفاظ على السمات الخلوية والجزيئية والوظيفية المميزة لكل منطقة معوية. يتم دمج الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الخاصة بأنسجة الأمعاء البشرية في المقصورة السفلية لشريحة العضو لإعادة إنشاء الواجهة الظهارية البطانية. تسهل هذه المنصة الجديدة التعرض المضيء للمغذيات والأدوية والكائنات الحية الدقيقة ، مما يتيح دراسات النقل المعوي والنفاذية والتفاعلات بين الميكروبات المضيفة.

هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل لإنشاء رقائق الأمعاء التي تمثل الاثني عشر البشري (رقاقة الاثني عشر) والقولون (رقاقة القولون) ، وثقافتها اللاحقة تحت التدفق المستمر والتشوهات الشبيهة بالتمعج. نحن نوضح طرقا لتقييم استقلاب الدواء وتحريض CYP3A4 في رقاقة الاثني عشر باستخدام محفزات وركائز نموذجية. وأخيرا، نحن نقدم إجراء خطوة بخطوة للنمذجة في المختبر لاضطراب حاجز الإنترفيرون غاما (IFNγ) بوساطة (متلازمة الأمعاء المتسربة) في رقاقة القولون، بما في ذلك طرق لتقييم تغيير نفاذية الخلايا شبه الخلوية، والتغيرات في إفراز السيتوكين، والتنميط النسخي للخلايا داخل الشريحة.

Introduction

الأمعاء البشرية هي عضو معقد ومتعدد المهام قادر على تجديد الذات. وهي مقسمة إلى الأمعاء الدقيقة والغليظة. تتمثل الوظيفة الأساسية للأمعاء الدقيقة في زيادة هضم الطعام القادم من المعدة ، وامتصاص جميع العناصر الغذائية ، وتمرير البقايا إلى الأمعاء الغليظة ، التي تستعيد الماء والشوارد. تنقسم الأمعاء الدقيقة أيضا إلى مناطق متعددة متميزة تشريحيا: الاثني عشر ، الصائم ، والدقاق ، كل منها يتم تكييفه لأداء وظائف محددة. على سبيل المثال ، يساعد الاثني عشر على تحطيم الكيموس (محتويات المعدة) لتمكين الامتصاص السليم للمغذيات التي تحتوي على البروتينات والكربوهيدرات والفيتامينات والمعادن في الصائم. هذا الجزء القريب من الأمعاء الدقيقة هو أيضا الموقع الرئيسي لامتصاص الأدوية المعوية والتمثيل الغذائي ، ويتميز بالتعبير العالي عن إنزيمات استقلاب الأدوية (على سبيل المثال ، CYP3A4) مقارنة بتعبيرها في الدقاق والقولون1. بالإضافة إلى دورها الرئيسي في هضم وامتصاص العناصر الغذائية ، تعد الأمعاء أيضا حاجزا فعالا ضد المحتويات المضيئة الضارة المحتملة ، مثل الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض ، والأيضات الميكروبية ، والمستضدات الغذائية ، والسموم 2,3. يشار إلى أن القولون البشري يسكنه عدد كبير من الكائنات الحية الدقيقة، وهو ما يتجاوز بكثير مجموع الخلايا في جسم الإنسان، والتي توفر العديد من الفوائد للتغذية والتمثيل الغذائي والمناعة. لذلك ، فإن الحفاظ على سلامة الحاجز المخاطي الذي تشكله الخلايا الظهارية المعوية أمر بالغ الأهمية للسماح بالعلاقة التكافلية بين ميكروبات الأمعاء والخلايا المضيفة عن طريق فصلها جسديا لتجنب تنشيط الخلايا المناعية غير الضرورية2. بالإضافة إلى ذلك ، يلعب موت الخلايا المعوية المبرمج دورا أساسيا كآلية للحماية الذاتية تمنع الخلايا المصابة من الاستمرار أو التكاثر - وبالتالي نشر مسببات الأمراض المحتملة3 - في حين أن التجديد الذاتي المستمر للظهارة المعوية كل أربعة إلى سبعة أيام يعوض عن فقدان الخلايا مما يضمن سلامة الحاجز وتوازن الأنسجة. قد يؤدي ضعف وظائف الأمعاء الموصوفة ، بما في ذلك امتصاص العناصر الغذائية ، أو سلامة الحاجز ، أو عدم التوازن في موت الخلايا المعوية والتجديد الذاتي ، إلى تطور مجموعة من اضطرابات الجهاز الهضمي ، بما في ذلك سوء التغذية ومرض التهاب الأمعاء (IBD) 2,3.

في السابق ، تم استخدام النماذج الحيوانية وخطوط الخلايا المعوية المشتقة من السرطان المحولة لدراسة الوظائف الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية للأنسجة المعوية البشرية. ومع ذلك، فإن المخاوف البارزة بشكل متزايد بشأن قابلية ترجمة البحوث الحيوانية إلى البشر، الناجمة عن وجود تفاوتات كبيرة بين النوعين، سلطت الضوء على الحاجة إلى طرق بديلة ذات صلة بالإنسان4. تشمل خطوط الخلايا المعوية الشائعة الاستخدام في المختبر خلايا T84 و Caco-2 و HT29. في حين أنها تحاكي جوانب معينة من وظيفة الحاجز المعوي ونقل الغشاء ، إلا أنها تتميز بتعبير متغير عن إنزيمات استقلاب الأدوية5 ، والمستقبلات السطحية ، والناقلات4. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تفتقر إلى خصوصية الجزء المعوي وتفشل في تلخيص تعقيد الظهارة المعوية ، حيث يحتوي كل نموذج على واحد فقط من أصل خمسة أنواع من الخلايا الظهارية الموجودة في الأمعاء6.

في الآونة الأخيرة ، تم تقديم مزارع عضوية معوية بشرية تم إنشاؤها من خزعات جديدة من الأمعاء الدقيقة والقولون 7,8 أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC)9 كنماذج تجريبية بديلة مع إمكانية استكمال التجارب على الحيوانات وتقليلها وربما استبدالها في المستقبل. في حين يمكن الحصول على iPSCs بطريقة غير جراحية ، فإن إنشاء المواد العضوية من iPSCs يتطلب استخدام بروتوكولات معقدة وطويلة (مع عدة خطوات تجريبية) ويولد ثقافات تشبه أنسجة الجنين البشري. في المقابل ، فإن المواد العضوية المشتقة من الخزعة قابلة للتطوير بشكل كبير ، حيث يمكنها الاستفادة من قدرة التجديد المتأصلة للأنسجة المعوية ويمكن تمريرها ونشرها في المختبر إلى أجل غير مسمى. الأهم من ذلك ، أن المواد العضوية المشتقة من الخزعة تحافظ على المرض والخصائص الخاصة بالمنطقة المعوية للأنسجة الأولية التي تم تطويرها منها وتحاكي التنوع الخلوي للظهارة المعوية. يمكن استخدام المواد العضوية كصور رمزية خاصة بالمريض في المختبر لكشف البيولوجيا والتسبب في مختلف اضطرابات الجهاز الهضمي وتحسين إدارتها العلاجية. على الرغم من أن المواد العضوية المعوية قد حققت درجة رائعة من الوظائف الفسيولوجية ، إلا أنها لا تزال تفشل في إعادة إنتاج تعقيد الأعضاء الأصلية بسبب افتقارها إلى المكونات اللحمية الحرجة - بما في ذلك الأوعية الدموية والأنسجة الضامة والأعصاب الطرفية والخلايا المناعية - بالإضافة إلى التحفيز الميكانيكي. من المعروف أن المعلمات الميكانيكية ، مثل التدفق وإجهاد القص والتمدد والضغط ، تؤثر على تكوين الأنسجة والتوازن في الجسم الحي ، وقد ثبت سابقا أنها تحسن نضج الخلايا في المختبر10،11،12،13. عيب إضافي مهم للأنظمة العضوية هو عدم إمكانية الوصول إلى التجويف ، وبالتالي إلى الجانب القمي من الظهارة. وهذا يمثل تحديا للتحقيق في الآليات المختلفة المرتبطة بالتعبير المستقطب لناقلات الأيونات والأدوية، والتفاعلات بين الميكروبيوم والمضيف، واختبار السمية الصيدلانية. وأخيرا، تعاني الثقافات العضوية من تباين كبير في الحجم والمورفولوجيا والوظيفة، بسبب الطبيعة العشوائية لعملية التنظيم الذاتي في المختبر وخيارات مصير الخلية. لذلك ، لتحقيق الإمكانات الكاملة للعضويات المعوية في نمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، والطب التجديدي ، من الضروري استكشاف استراتيجيات جديدة تقلل من التباين في التطور العضوي ، وتحسين الوصول إلى المقصورة المضيئة ، ودمج التفاعلات المفقودة بين الخلايا الخلوية.

أدخلت تقنية Organ-on-a-Chip العديد من التقنيات لدمج القوى الميكانيكية وتدفق السوائل إلى مزارع الخلايا المعوية في المختبر. ومع ذلك ، نظرا لأن معظم دراسات إثبات المفهوم الأولية قد استخدمت خطوط الخلايا المشتقة من السرطان التي لم تظهر تنوعا خلويا كافيا ، فقد تم التشكيك في أهمية هذه الأنظمة. في الآونة الأخيرة ، قمنا بدمج المواد العضوية المعوية بشكل تآزري وتكنولوجيا الأعضاء على رقاقة لدمج أفضل ميزات كل نهج في نظام واحد في المختبر 14،15،16. تلخص رقاقة الأمعاء الناتجة البنية متعددة الخلايا للظهارة المعوية ، ووجود واجهة الأنسجة الظهارية البطانية ، والقوى الميكانيكية لتدفق السوائل وامتدادها ، مما يتيح محاكاة وظائف على مستوى الأعضاء في المختبر. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام المواد العضوية المشتقة من الأنسجة الأولية (والتي يمكن أخذ عينات منها من مناطق مختلفة من الأمعاء البشرية) كمادة أولية يزيد من تنوع هذا النموذج ، حيث يمكن إنشاء رقائق تمثل الاثني عشر البشري والصائم والدقاق والقولون باتباع إجراءات مماثلة للبذر والثقافة. الأهم من ذلك ، تمكن رقائق الأمعاء من التقييم في الوقت الفعلي لما يلي: سلامة الحاجز المعوي. نشاط حدود الفرشاة وإنزيمات استقلاب الدواء ؛ إنتاج الموسينات. إفراز السيتوكينات. وتفاعل الخلايا المعوية مع الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض والمشتركة ، كما هو موضح في التقارير المنشورة سابقا. ومن الجدير بالذكر أنه عندما تم إنشاء رقائق الأمعاء باستخدام المواد العضوية الناتجة عن أنسجة الأفراد المختلفة ، التقطت هذه النماذج التباين المتوقع بين المانحين في الاستجابات الوظيفية لمختلف الأدوية والعلاجات. وإجمالا، فإن دمج المواد العضوية مع تقنية Organ-on-a-Chip يفتح الباب أمام نماذج أكثر تقدما وشخصية وذات صلة بالجسم الحي يمكنها تحسين الأهمية الفسيولوجية ودقة النتائج في المختبر بالإضافة إلى استقرائها للبشر. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لإنشاء رقاقة الأمعاء وتطبيقها في دراسات الوظائف الفسيولوجية للقطاعين المعويين: الاثني عشر والقولون. أولا ، يتم وصف طرق تقييم نشاط إنزيم استقلاب الدواء CYP3A4 في رقاقة الاثني عشر ، وكذلك تحريضه بواسطة مركبات نموذجية مثل ريفامبيسين وفيتامين D3. ثانيا ، يتم تحديد الخطوات المطلوبة لنمذجة "الأمعاء المتسربة" في رقاقة القولون في البروتوكول ، مع تعطيل الحاجز الظهاري باستخدام السيتوكينات المميزة المتورطة في التسبب في مرض الأمعاء الالتهابي. باختصار ، يتم نشر المواد العضوية المشتقة من الخزعات البشرية في المختبر ، وتخضع للهضم الأنزيمي ، ويتم إدخالها في القناة العليا للرقاقة. في وجود التروية المستمرة مع وسائل الإعلام الغنية بعامل النمو ، فإنها تتطور إلى طبقة أحادية ظهارية متقاربة مع بنية 3D وسطح خلية قمي يسهل الوصول إليه. يتم زرع الجزء السفلي من المقصورة "الوعائية" بخلايا بطانية الأوعية الدموية الدقيقة المعزولة من الأمعاء الدقيقة أو الغليظة. يتم فصل الظهارة والبطانة بواسطة غشاء قابل للتمدد مسامي ، مما يسهل تفاعلات paracrine بين الأنسجة ، وعندما يتعرض لتشوهات دورية ، يحاكي حركات تشبه التمعج في الأمعاء البشرية. يتم الحفاظ على الزراعة المشتركة في ظل ظروف التدفق الديناميكي الناتجة عن التروية المضيئة والوعائية مع وسائط زراعة الخلايا المناسبة. وأخيرا، نصف أنواعا عديدة من المقايسات وتحليلات نقاط النهاية التي يمكن إجراؤها مباشرة على الرقاقة أو من النفايات السائلة المستنبتة من زراعة الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: يجب التعامل مع جميع مزارع الخلايا باستخدام تقنية تعقيم مناسبة.

تم الحصول على المواد العضوية المعوية البشرية المستخدمة في هذه الدراسة من جامعة جونز هوبكنز وتم تنفيذ جميع الطرق وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح المعتمدة. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة جونز هوبكنز (IRB #NA 00038329).

1. تحضير كواشف زراعة الخلايا

  1. تحضير وسط النمو العضوي البشري باتباع تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد) واستكماله ب 100 ميكروغرام / مل من البريموسين.
  2. قم بإعداد وسط نمو الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية باتباع تعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد) واستكملها ب 1:20 vol / vol FBS و 50 ميكروغرام / مل بدلا من 100 ميكروغرام / مل من البريموسين.
  3. أعد تعليق Y-27632 (مثبط Rho-kinase) في BSA معقم بنسبة 0.1٪ في DPBS لإعداد محلول مخزون 10 mM. Aliquot في أنابيب دقيقة معقمة وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  4. أعد تعليق CHIR99021 (مثبط GSK-3) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد معقم (DMSO) لإعداد محلول مخزون 5 ملليمتر. Aliquot في أنابيب دقيقة معقمة وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  5. تحضير محلول الهضم العضوي البشري عن طريق خلط محلول تفكك عضوي 1: 1 vol / vol (جدول المواد) مع محلول DPBS (جدول المواد) واستكماله بمحلول مخزون 10 ميكرومتر من Y-27632. يجب أن يكون هذا الكاشف طازجا لكل استخدام.

2. زراعة الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة المعوية البشرية (HIMECs)

  1. ابدأ ثقافة HIMEC (جدول المواد) قبل 7 أيام من بذرها على الشريحة. يمكن استخدام HIMECs فقط في الممر 1-6 لبذر الرقائق.
  2. أضف 5 مل من محلول عامل التعلق (جدول المواد) إلى قارورة T150 ؛ احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة وتجاهل المحلول.
  3. أضف 19 مل من وسط نمو الخلايا البطانية المسخن مسبقا في درجة حرارة الغرفة (انظر الخطوة 1.2) إلى القارورة.
  4. قم بإذابة قارورة مجمدة من HIMEC (2 مليون خلية / قارورة) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  5. انقل محتويات القارورة إلى القارورة وهز القارورة بلطف لتوزيع الخلايا بالتساوي. ضع القارورة في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل للسماح للخلايا البطانية بالالتصاق.
  6. استبدل الوسط ب 20 مل من وسط نمو الخلايا البطانية الذي تم تسخينه مسبقا في درجة حرارة الغرفة في اليوم التالي وكل 3 أيام بعد ذلك. يجب أن تصل الثقافات إلى 90٪ من الالتقاء في يوم حصاد الخلايا لتجارب الرقائق.

3. التصنيع الدقيق وإعداد الشريحة

  1. الحصول على رقائق من مورد تجاري (جدول المواد). قم بفك الرقائق ووضعها في مهد الرقائق الموضوعة في طبق بتري مربع (جدول المواد). قم بتسمية الجانب الأمامي من كل حامل رقاقة بالظروف التجريبية (الشكل 1A).
    ملاحظة: في حين أن البروتوكول المقدم يعتمد على استخدام رقاقة وأجهزة محددة متاحة تجاريا، إلا أن هناك العديد من أجهزة الموائع الدقيقة المقدمة من خلال بائعين مختلفين، والتي قد تقدم مزايا بديلة ولكنها تفتقر إلى القدرة على دمج التمدد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء التصنيع الدقيق للأعضاء على الرقائق "في المنزل" باتباع الإجراءات الموضحة في Huh et al.21.

4. تنشيط وطلاء ECM للغشاء

  1. إعداد حل التنشيط
    1. أحضر كواشف ER-1 وER-2 (جدول المواد) إلى درجة حرارة الغرفة لتحقيق التوازن قبل الاستخدام. ER-1 حساس للضوء ويجب التعامل معه في الظلام.
    2. أعد تشكيل ER-1 في 10 مل من كاشف ER-2 لجعل التركيز النهائي 0.5 ملغ / مل والتأكد من أن ER-1 قد ذاب تماما.
  2. تنشيط السطح
    1. ادفع بلطف 50 ميكرولتر من محلول ER-1 من خلال قناتي الشريحة (الشكل 1A).
    2. قم بإزالة أي محلول ER-1 زائد من سطح الشريحة باستخدام شفط.
    3. افحص الرقائق للتأكد من أن جميع الرقائق قد تلقت حل ER-1. في حالة وجود فقاعات هوائية ، أدخل المزيد من محلول ER-1 حتى تتم إزالة الفقاعات بالكامل.
    4. احتضان الرقائق داخل غرفة مصباح الأشعة فوق البنفسجية (جدول المواد) لمدة 15 دقيقة. تأكد من ضبط مصباح الأشعة فوق البنفسجية على الإعداد متناسق.
    5. أعد الرقائق المنشطة ER-1 إلى خزانة السلامة الأحيائية (BSC). استنشاق حل ER-1 من كلتا القناتين. اغسل أي بقايا من محلول ER-1 باستخدام 200 ميكرولتر من ER-2.
    6. ادفع 200 ميكرولتر من محلول دولبيكو الملحي المعقم المخزن بالفوسفات (DBPS) عبر القنوات (جدول المواد) واترك DBPS في القنوات حتى الخطوة التالية.
  3. إعداد مصفوفة خارج الخلية (ECM) وطلاء الغشاء
    1. إعداد حلول المخزون لمكونات إدارة المحتوى المؤسسي
      1. إعادة تشكيل الكولاجين الرابع (جدول المواد) والفيبرونيكتين (جدول المواد) باستخدام المياه المعقمة من الدرجة زراعة الخلايا (جدول المواد) إلى تركيز نهائي من 1 ملغ / مل. تحضير الأليكوتات وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. إعداد حل عمل ECM لطلاء الأغشية
      1. قم بإعداد 1.5 مل من كل حل ECM للقناة العلوية والسفلية لكل 12 رقاقة يتم طلاؤها. يجب دائما إعداد حل ECM قبل الاستخدام مباشرة.
      2. بالنسبة للقناة العلوية ، امزج الكولاجين IV ومصفوفة الغشاء السفلي المذاب (BMM) (جدول المواد) في DBPS بارد معقم عند 200 ميكروغرام / مل و 100 ميكروغرام / مل ، على التوالي. بالنسبة للقناة السفلية ، امزج الكولاجين IV والفيبرونيكتين في DPBS البارد المعقم عند 200 ميكروغرام / مل و 30 ميكروغرام / مل ، على التوالي.
    3. طلاء ECM للرقائق
      1. قم بشفط DBPS من كلتا قناتي الرقائق واستبدلها بحل عمل ECM المناسب لكل قناة (الشكل 1A).
      2. افحص كل شريحة للتأكد من أنها تلقت محلول الطلاء. في حالة وجود فقاعات هواء ، ادفع المزيد من محلول الطلاء حتى تتم إزالة جميع الفقاعات بالكامل.
      3. أضف DPBS المعقمة إلى مهد الرقائق وضع طبق بتري الذي يحتوي على رقائق في حاضنة 37 درجة مئوية. احتضان بين عشية وضحاها للسماح لبروتينات ECM لتشكيل روابط أيونية مع غشاء PDMS المنشط. إذا رغبت في ذلك ، يمكن زرع الخلايا في أي وقت بين 2 ساعة و 1 يوم بعد طلاء الرقائق. بدلا من ذلك ، يمكن تخزين الرقائق المطلية في درجة حرارة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها ، تليها الحضانة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية وبذر الرقائق.

5. بذر الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة المعوية (HIMECs) في القناة السفلية للرقاقة

ملاحظة: يتم زرع HIMECs المعوية والقولون الصغيرة في القناة السفلية للاثني عشر وشريحة القولون ، على التوالي.

  1. تحضير رقائق البطاطس
    1. انقل الرقائق المغلفة ب ECM إلى BSC. استنشق طلاء ECM بلطف من كل من قنوات الرقائق ، ثم اغسل كلتا القناتين ب 200 ميكرولتر من وسط النمو العضوي ووسط نمو الخلايا البطانية ، على التوالي.
    2. قم بتخزين الرقائق المغسولة في حاضنة 37 درجة مئوية حتى المضي قدما في بذر الخلايا البطانية.
  2. حصاد الخلايا البطانية
    1. أحضر قارورة ثقافة HIMEC إلى BSC واغسلها باستخدام DPBS المعقمة.
    2. أضف 3 مل من محلول التفكك إلى القارورة وضعها في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة للسماح بانفصال الخلية الكامل.
    3. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي 15 مل وأضف وسائط نمو الخلايا البطانية حتى تصل إلى 10 مل. عينة 15-20 ميكرولتر من تعليق الخلية لعد الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 150 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. استنشق بعناية supernatant وأعد تعليق HIMECs إلى كثافة 8-10 × 106 خلايا / مل في وسائط نمو الخلايا البطانية.
  3. الخلايا البطانية البذرية في القناة السفلية للرقاقة
    1. أحضر طبق بتري الذي يحتوي على رقائق البطاطس إلى BSC وقم بإزالة جميع الوسائط بلطف من القناة السفلية باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
    2. أدخل 10-15 ميكرولتر من تعليق HIMEC في القناة السفلية للرقاقة. افحص الشريحة مباشرة بعد البذر لضمان كثافة البذر المثلى (80٪ -90٪ من التغطية) وتوزيع الخلايا المتجانسة داخل القناة (الشكل 1D). إذا كانت كثافة البذر أعلى أو أقل من المتوقع أو غير متساوية ، اغسل القناة 2x ب 200 ميكرولتر من وسائط نمو الخلايا البطانية وكرر إجراء البذر.
    3. اقلب طبق بتري مباشرة بعد بذر كل دفعة من ست رقائق للسماح بربط الخلايا البطانية بالجانب السفلي من غشاء PDMS. ضع أطباق بتري في الحاضنة التي تبلغ درجة حرارتها 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة ، أو حتى يتم توصيل HIMECs في القناة السفلية بالغشاء (الشكل 1D).
  4. اغسل الرقائق
    1. ادفع بلطف 200 ميكرولتر من وسائط نمو الخلايا البطانية من خلال مدخل القناة السفلية لإزالة أي خلايا غير متصلة وتجديد العناصر الغذائية في الوسائط.
    2. اغسل الخلايا التي لم تعلق في القناة العلوية مع 200 ميكرولتر من وسط النمو العضوي المكمل ب 5 ميكرومتر CHIR99021 و 10 ميكرومتر Y-27632.
    3. ضع الرقائق في الحاضنة التي تبلغ درجة حرارتها 37 درجة مئوية حتى تنتقل إلى بذر الخلايا الظهارية.

6. بذر شظايا العضوية في القناة العليا للرقاقة

ملاحظة: يمكن استزراع المواد العضوية المعزولة من الخزعات من مختلف المناطق المعوية في رقاقة الأمعاء7. اتبع الإجراءات الموضحة في Fujii et al. لعزل سراديب الأمعاء البشرية وإنشاء ثقافات عضوية22. هنا ، يتم استخدام الاثني عشر والقولون العضوي لتوليد رقائق الاثني عشر والقولون ، على التوالي. وبالنظر إلى التباين الكبير من دفعة إلى دفعة ومن متبرع إلى مانح في تكوين العضوية ونموها، يقترح إجراء تقييم تجريبي لكثافة الخلايا في مزرعة التعليق العضوي (شكل صفيحة 24 بئرا) لتحقيق كثافة البذر المثلى البالغة 8 ملايين خلية/مل.

  1. تقييم تجريبي لأعداد الخلايا / بئر الثقافة العضوية الثابتة.
    ملاحظة: الإجراء التالي هو فقط لتحديد عدد آبار ثقافة التعليق العضوي المطلوبة لبذر الرقائق. لا ينبغي استخدام الخلايا المفردة الناتجة لبذر الرقائق.
    1. استنشق بعناية supernatant من ثلاثة آبار من لوحة الثقافة العضوية. أضف 500 ميكرولتر من محلول تفكك BMM البارد (جدول المواد) إلى كل بئر واستخدم مكشطة بلاستيكية لفصل BMM المذاب عن البلاستيك.
    2. اجمع التعليق العضوي في أنبوب مخروطي معقم منخفض البروتين باستخدام ماصة مثلجة 1000 ميكرولتر. احتضني الثلج لمدة 60 دقيقة ، واخلطي كل 15 دقيقة عن طريق هز الأنبوب برفق. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    3. شفط supernatant وإضافة 2 مل من التربسين. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لهضم المواد العضوية إلى مستوى خلية واحدة وإضافة 10 مل من وسط النمو العضوي الكامل لوقف التفاعل الأنزيمي. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    4. أعد تعليق بيليه الخلية في 1 مل من وسط النمو العضوي الكامل واحسب العدد الإجمالي للخلايا باستخدام مقياس خلايا الدم وفقا للطرق القياسية.
  2. تحضير شظايا العضوية وبذرها في الشريحة
    ملاحظة: يمكن استخدام الإجراءات التالية لزرع المواد العضوية الاثني عشر أو القولون في القناة العلوية للرقاقة. يعتمد إنشاء طبقة أحادية ظهارية مع بنية خلوية ثلاثية الأبعاد ذات صلة في الجسم الحي على وجود تدفق15,23 والبذر الناجح للشظايا العضوية.
    1. استنشق الوسط بعناية من عدد آبار الثقافة العضوية الثابتة ، وهو ما يكفي ، كما هو محدد في الخطوة 6.1 ، لتحقيق كثافة البذر النهائية البالغة 8 ملايين خلية / مل. أضف 500 ميكرولتر من محلول تفكك BMM البارد المثلج إلى كل بئر.
    2. افصل BMM القابل للذوبان عن سطح الآبار باستخدام مكشطة بلاستيكية أو ماصة 1000 ميكرولتر. اجمع التعليق في أنبوب مخروطي منخفض البروتين 15 مل.
    3. قم بتخزين التعليق على الثلج لمدة 60 دقيقة ، واخلطه كل 15 دقيقة عن طريق هز الأنبوب برفق. انتقل إلى الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. يجب أن تكون الكريات العضوية المحددة جيدا مرئية بعد الطرد المركزي. إذا لوحظت طبقة هلام شفافة فوق حبيبات الخلية (بقايا BMM القابلة للذوبان) (الشكل 1B) ، فتابع الخطوات التالية.
      1. امزج حبيبة supernatant و cell وأضف حجما متساويا من محلول تفكك BMM في الأنبوب. اخلطي بلطف واخزني على الثلج لمدة 10 دقائق إضافية، وتابعي الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      2. إذا لزم الأمر، كرر الخطوة 6.2.3.1 حتى لا توجد بقايا BMM قابلة للذوبان.
    4. تخلص من السوبرناتانت وأعد تعليق الكريات العضوية بمحلول الهضم العضوي (انظر الخطوة 1.5). استخدم كمية كافية من محلول الهضم العضوي لضمان غمر كامل للبيليه. 2 مل من المحلول مناسب لما يقرب من 2,400-12,000 مادة عضوية متوسطة الحجم (الشكل 1D ، ما بعد البذر). تحضن في 37 درجة مئوية لمدة 1-3 دقائق.
    5. أضف DMEM/F-12 المتقدم إلى الأنبوب لإيقاف التفاعل الإنزيمي. استخدم أربعة أضعاف حجم محلول الهضم المستخدم. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
    6. شفط supernatant وإعادة تعليق بيليه شظايا العضوية في وسط نمو عضوي كامل مع استكمال 5 μM CHIR99021 و 10 μM Y-27632 لتحقيق 8 ملايين خلية / مل. قم بإعداد 360 ميكرولتر من التعليق في أنابيب ربط معقمة منخفضة البروتين 1.5 مل لمنع تقليل كثافة الخلايا بسبب التعلق على الجدران.
    7. قم بإزالة الوسط من القناة العلوية للرقائق المطلية. أضف 30 ميكرولتر من تعليق الخلايا في القناة العلوية لكل شريحة. احتضن الرقائق بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية للسماح للشظايا العضوية بالالتصاق بالغشاء المغلف ب ECM (الشكل 1D).

7. الثقافة الديناميكية لرقاقة الأمعاء - بدء ، والحفاظ على التدفق والحركات الشبيهة بالتمعج

  1. إعداد وسائل الإعلام وتفريغ الغاز
    1. للحفاظ على تدفق صفائحي ثابت عبر الرقاقة ، اسمح لدرجة حرارة الوسائط بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بتعريضها للترشيح المدفوع بالتفريغ لمدة 10 دقائق باستخدام مضخة تفريغ وأنابيب مخروطية مرشح PVDF (تفريغ الوسائط).
  2. فتيلة الوحدات المحمولة
    ملاحظة: الوحدات المحمولة هي خزانات تعمل كواجهة بين الرقائق ووحدة الثقافة مما يسمح بتكرار أخذ العينات وجرعات الوسائط.
    1. افتح الوحدات المحمولة ، في BSC ، وضعها على صواني وحدة الثقافة ، وهي حاويات متخصصة لمحاذاة الوحدات المحمولة.
    2. أضف 3 مل من وسط النمو العضوي الكامل المتوازن مسبقا مع 5 ميكرومتر CHIR99021 و 10 ميكرومتر Y-27632 إلى خزان المدخل العلوي و 3 مل من وسط نمو الخلايا البطانية المتوازنة مسبقا في خزان المدخل السفلي (الشكل 1C). أضف 300 ميكرولتر من نفس الوسائط في خزانات المخرج المعنية.
    3. أحضر الصواني إلى الحاضنة التي تبلغ درجة حركتها 37 درجة مئوية وقم بتحريكها في وحدة الثقافة (الشكل 1C). استخدم عناصر التحكم على شاشة وحدة الثقافة لتشغيل "Prime Cycle" (بطول 1 دقيقة). عندما يشير شريط الحالة إلى "جاهز" ، تكتمل الدورة الرئيسية. كرر الدورة الرئيسية لضمان تكوين قطرات كافية لتوصيل الرقائق بنجاح.
    4. تأكد من أن جميع الوحدات المحمولة جاهزة وتحتوي على قطرات وسائط مرئية.
  3. إدخال التدفق
    ملاحظة: يبدأ التدفق عادة بعد 24 ساعة من بذر شظايا عضوي للسماح للخلايا الظهارية المعوية بالالتصاق بقوة بالغشاء.
    1. اغسل كلتا القناتين من الرقائق المبذرة ب 200 ميكرولتر من الوسائط المعنية لإزالة أي فقاعات أو حطام خلايا. اترك قطرات صغيرة من الوسائط على المنافذ بعد الغسيل. حرك حامل الشريحة في الوحدة المحمولة (الشكل 1C).
    2. ضع الوحدات المحمولة على الصواني ، ثم في وحدة الثقافة. استخدم عناصر التحكم الموجودة على شاشة وحدة الثقافة لبرمجة ظروف زراعة رقاقة الأعضاء المناسبة (معدل التدفق والتمدد).
      ملاحظة: بالنسبة لظروف زراعة رقاقة الاثني عشر والقولون القياسية، اضبط معدل التدفق على 30 ميكرولتر/ساعة15 و60 ميكرولتر/ساعة16 على التوالي، لكل من القنوات العلوية والسفلية. ومع ذلك ، يتم التحكم في معدلات التدفق لكل قناة بشكل مستقل ويمكن ضبطها بين 0-1000 ميكرولتر / ساعة. يمكن استخدام المحاقن أو المضخات التمعجية ، بدلا من وحدات الاستزراع المعروضة هنا ، لإدخال التدفق الرقائقي إلى رقائق الموائع الدقيقة. ومع ذلك ، قد يكون إنشاء اتصالات سائلة موثوقة بين الرقائق والمضخات باستخدام الأنابيب والموصلات أمرا صعبا تقنيا عندما تكون هناك حاجة إلى تروية متزامنة لرقائق متعددة.
    3. ابدأ "دورة التنظيم" (بطول 2 ساعة) التي تضغط على وسائط الثقافة في الوحدة المحمولة والرقاقة لمنع نواة فقاعات الهواء. سيتم استئناف الشروط المبرمجة بعد الانتهاء من دورة التنظيم.
  4. تغيير وسائل الإعلام
    1. قم بإعداد وسائط جديدة لكلتا القناتين وتجديدها كل 48 ساعة عن طريق إضافة 2 مل من الوسط الطازج إلى خزانات المدخل (الشكل 1C).
    2. أوقف وحدات الثقافة مؤقتا وأحضر الصواني إلى BSC. استنشاق الوسائط في جميع الخزانات وتجديدها بوسائط جديدة. أعد الصواني وأعد تشغيل التدفق.
  5. مقدمة من تمتد
    ملاحظة: اسمح للخلايا بالنمو إلى التقاء بنسبة 100٪ قبل تطبيق السلالة الدورية. عادة ما يتم إدخال التمدد بعد 3 أيام من البذر أو 48 ساعة بعد بدء الثقافة السائلة. يتم تطبيق إجهاد دوري بنسبة 2٪ عند تردد 0.2 أو 0.15 هرتز ، لشريحة الأمعاء الاثني عشر11 والقولون 24 ، على التوالي ، على مدار24 ساعة الأولية. ثم يتم زيادته إلى 10٪ طوال المدة المتبقية من زراعة رقاقة الأمعاء لتشبه إلى حد كبير السلالة الدورية التي تعاني منها الخلايا الظهارية المعوية في الجسم الحي (الشكل 1D)25. يمكن أن تدعم وحدة الثقافة تطبيق سلالة دورية بنسبة 2٪ -12٪ وتردد يصل إلى 0.4 هرتز.
    1. لإدخال الامتداد إلى الثقافة المائعة المستمرة ، أوقف وحدة الثقافة مؤقتا. باستخدام عناصر التحكم على الشاشة، قم بتغيير إعدادات التمدد إلى امتداد 2٪، وتردد 0.2 أو 0.15 هرتز، وأعد تشغيل وحدة الثقافة.
    2. بعد 24 ساعة، كرر الخطوة 7.5.1 لتطبيق امتداد 10٪ أو تردد 0.2 أو 0.15 هرتز.

8. CYP450 الحث باستخدام محفزات CYP النموذجية في رقاقة الاثني عشر

ملاحظة: يتيح اختبار تحريض السيتوكروم P450 (CYP450) تقييم ما إذا كان مركب الاختبار يزيد من مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال و/أو النشاط الحفاز لإنزيمات CYP450 المحددة. هنا ، نصف بروتوكول تقييم تحريض CYP3A4 بواسطة معيار الصناعة والمنظم الموصى به في محفزات CYP المختبرية ، Rifampicin (RIF) و 1,2-dihydroxy vitamin D3 (VD3). يمكن استخدام الطريقة المقدمة لتحديد إمكانات مركبات الاختبار المختلفة للحث على أشكال مختلفة من CYP450 في الأنسجة المعوية البشرية. ستحتاج إلى اختيار مجموعات محددة من الاشعال وركيزة المسبار لكل شكل من أشكال الإنزيم ليتم تقييمها.

  1. التعرض لمحفزات CYP
    1. إعداد حلول المخزون من 20 mM RIF و 100 mM VD3 و 200 mM Testosterone (جدول المواد) باستخدام DMSO المعقم.
      تحذير: التستوستيرون هو مادة خاضعة للرقابة من الجدول الثالث. اتبع الإجراءات التنظيمية أثناء المناولة.
    2. قم بإعداد وسائط الجرعات باستخدام محفزات CYP عن طريق تخفيف محاليل المخزون في وسط نمو عضوي كامل ووسط نمو الخلايا البطانية لتحقيق 20 ميكرومتر RIF ، 100 نانومول / لتر من VD3. قم بإعداد التحكم في السيارة عن طريق تخفيف DMSO في الوسائط المعنية لتحقيق 0.1٪ من DMSO.
    3. أوقف وحدة الثقافة مؤقتا وأحضر الصواني إلى BSC. استبدل الوسائط الموجودة في جميع خزانات المدخل ب 2 مل من وسائط الجرعات مع المحفزات أو التحكم في السيارة. أعد الوحدات المحمولة مرة أخرى إلى وحدة الثقافة وأعد تشغيل التدفق عند 30 ميكرولتر/ساعة.
    4. بعد 24 ساعة، استبدل الوسائط بمحلول محفز، وكرر الخطوات 8.1.2-8.1.3. يجب إعداد المحاليل المحفزة طازجة يوميا وتجديدها كل 24 ساعة على مدار التجربة ، والتي عادة ما تكون 48-72 ساعة.
  2. الحضانة مع الركيزة النموذجية (التستوستيرون)
    1. في يوم الحصاد ، قم بإعداد محلول الركيزة المسبار من هرمون التستوستيرون جنبا إلى جنب مع المحفزات المقابلة في Advanced DMEM / F12 لإنتاج تركيز نهائي قدره 200 ميكرومتر.
    2. أحضر الصواني إلى BSC ، واستنشق وسيط الجرعات من جميع الخزانات. اغسل واستبدل خزانات المدخل العلوية والسفلية بمتوسط DMEM/F12 المتقدم الدافئ ووسط نمو الخلايا البطانية، على التوالي.
    3. قم بإزالة وسط الغسيل من الخزانات واستبدله بمحلول ركيزة مسبار 1 مل ، تم إعداده في الخطوة 8.2.1. قم بدمج الرقائق بمعدل تدفق مرتفع يبلغ 1000 ميكرولتر / ساعة لمدة 5 دقائق وقم بشفط كل من خزانات المخرج العلوية والسفلية. أعد الرقائق إلى وحدة الثقافة واحتضنها لمدة 1 ساعة تحت التدفق المستمر البالغ 300 ميكرولتر / ساعة.
  3. تحليل البيانات
    1. جمع العينات لتحليل LCMS
      1. Aliquot 200 ميكرولتر من محلول التوقف الذي يحتوي على الأسيتونيتريل مع 0.1٪ من حمض الفورميك في أنابيب 1.5 مل المصنفة مسبقا ووضعها على الجليد. قد يختلف تكوين حل إيقاف LCMS بناء على الركيزة التي تحتاج إلى تحليل.
      2. بعد اكتمال 1 ساعة من العلاج ، أوقف التدفق وأعد الصواني إلى BSC. جمع 100 ميكرولتر من النفايات السائلة من خزان المخرج العلوي ، وإضافته إلى الأنبوب المقابل الذي يحتوي على محلول التوقف (الشكل 2A). ضع الأنابيب فورا على الثلج الجاف. قم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية قبل الشروع في التحليل.
      3. استخراج وتحليل العينات باستخدام تقنيات HPLC أو LC-MS / MS ، ومراقبة تكوين مستقلب 6β-hydroxytestosterone (6β-OH-T). يمكن التعبير عن نشاط إنزيم CYP على أنه بروتين pmol / min / mg حيث يشير pmol إلى كمية المستقلب (6β-OH-T) التي تشكلت أثناء التفاعل. يتم تحديد إجمالي محتوى البروتين لكل رقاقة (البروتين ؛ ملغ) عن طريق إجراء فحص برادفورد الموصوف في الخطوة 8.3.2.
        Equation 1
        يتم حساب نشاط تحريض الطي بواسطة: نشاط CYP (المستحث) / نشاط CYP (المركبة).
      4. في حالة جمع عينات لتحليل الحمض النووي الريبوزي المرسال، راجع الخطوة 8.3.3.
    2. تحلل الخلايا لتحليل التعبير عن البروتين
      ملاحظة: يتم استخراج البروتين من الخلايا الموجودة على الرقاقة باستخدام مخزن مؤقت لتحلل البروتين ، مع استكمال مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (جدول المواد). ثم يتم تحديد كمية البروتين المستخرج باستخدام فحص برادفورد واستخدامه في تحليل المصب.
      1. افصل الرقائق عن الوحدات المحمولة وضعها في طبق بتري. اغسل كلتا القناتين ب 200 ميكرولتر من DPBS المعقمة.
      2. قم بحظر منفذ القناة السفلية باستخدام طرف ماصة مرشح 200 ميكرولتر. Perfuse 50 ميكرولتر من محلول التفكك من خلال القناة السفلية واحتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      3. فحص للتأكد من الانفصال الكامل للخلايا البطانية. ماصة لأعلى ولأسفل 1-2 مرات وإزالة حل التفكك من القناة. كرر الغسيل.
      4. قم بحظر منفذ القناة العلوي باستخدام طرف ماصة مرشح 200 ميكرولتر. بيرفوز 75 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل البروتين من خلال القناة العلوية. اترك طرف الماصة مدرجا ، لمنع مدخل القناة العلوية واحتضانه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ماصة لأعلى ولأسفل 5-10 مرات وجمع تحلل الخلايا في أنبوب 1.5 مل المسمى مسبقا.
      5. كرر الخطوة 8.3.2.4. حتى يتم ملاحظة انفصال كامل للخلايا. جمع الخلية lysates في نفس أنبوب 1.5 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
      6. استخراج جزء البروتين وفقا للطرق القياسية وتحديد كمية البروتين الكلي باستخدام فحص برادفورد (جدول المواد).
    3. تحلل الخلايا لتحليل التعبير الجيني
      ملاحظة: يمكن تحقيق تحلل الخلايا على الرقاقة لاستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مخزن مؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي ، مع استكماله بنسبة 0.1٪ 2-mercaptoethanol (جدول المواد). وبدلا من ذلك، يمكن استخدام مخزن مؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي قائم على الفينول إذا كانت هناك حاجة إلى غلات عالية من الحمض النووي الريبي عالي الجودة المناسب لتحليل NGS والمصفوفات الدقيقة.
      1. اتبع الخطوات من 8.3.2.1 إلى 8.3.2.2 لإعداد شريحة الأمعاء للتحلل.
      2. قم بحظر مخرج القناة العلوية باستخدام طرف ماصة مرشح 200 ميكرولتر. Perfuse 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي من خلال القناة العلوية. اترك طرف الماصة مدرجا لحظر مدخل القناة العلوية. حضانة لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بالنسبة للتحلل باستخدام مخزن مؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي قائم على الفينول ، استخدم 350 ميكرولتر من الكاشف.
      3. ماصة لأعلى ولأسفل 5-10 مرات وجمع تحلل الخلية في أنبوب 1.5 مل المسمى مسبقا. كرر الخطوة مع 150 ميكرولتر أخرى من المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي وجمعها. تخزين تحلل الخلية عند -80 درجة مئوية حتى التحليل. في حالة تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي اللاحق ، تابع التحليل في غضون 1 شهر بعد التحلل .
      4. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من التحلل الخلوي باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي.
      5. النسخ العكسي إلى cDNA باستخدام مجموعة النسخ العكسي وتنفيذ PCR في الوقت الفعلي باستخدام دورة PCR في الوقت الفعلي والاشعال والمخزن المؤقت المناسب. حدد النتائج باستخدام طريقة 2-ΔΔCt .

9. اضطراب الحاجز الظهاري باستخدام السيتوكينات الالتهابية في رقاقة القولون

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تعطيل الحاجز الظهاري المعوي بواسطة جاما الإنترفيرون السيتوكين (IFNγ)26،27،28،29. يتم إعطاء السيتوكين جرعة في القناة السفلية لرقاقة القولون نظرا للتعبير القاعدي الجانبي لمستقبلات IFNγ على الخلايا الظهارية المعوية.  يتم تقديم الحافز الالتهابي في الشريحة في اليوم 5 من الثقافة ، بمجرد استقرارتطبيق P أقل من 0.5 × 10-6 سم / ثانية. يمكن استخدام نظام جرعات مماثل للسيتوكينات المسببة للالتهابات الأخرى والعوامل المدمرة للحاجز.

  1. التحفيز باستخدام IFNγ
    1. تحضير 100 ميكروغرام / مل من محلول المخزون من IFNγ (جدول المواد) في ماء زراعة الخلايا المعقمة. قم بتخزين محلول المخزون عند -80 درجة مئوية على مدار التجربة. لكل تجربة، استخدم دائما مخزونا طازجا من IFNγ وتجنب أكثر من ثلاث دورات تجميد وإذابة.
    2. تحضير محلول الجرعات IFNγ عن طريق تخفيف محلول المخزون في وسط نمو الخلايا البطانية المنزوعة الغاز لتحقيق تركيز نهائي من 10-100 نانوغرام / مل.
    3. أحضر الصواني إلى BSC وقم بإزالة الوسط من خزانات مدخل القناة السفلية واستبدله ب 3 مل من الوسط الذي يحتوي على IFNγ. قم بتحديث وسيط الجرعات IFNγ يوميا.
    4. ضع الصواني في وحدة الاستزراع وقم بأداء الرقائق بمعدل تدفق مرتفع يبلغ 1000 ميكرولتر / ساعة لمدة 5 دقائق لبدء معالجة IFNγ. قم بتبديل معدل التدفق مرة أخرى إلى 60 ميكرولتر / ساعة واستمر في الثقافة المائعة.
  2. تحليل البيانات
    1. تقييم وظيفة الحاجز الظهاري. يمكن قياس النفاذية الظاهرية الظهارية (Papp) ، أو وظيفة الحاجز ، في نقاط زمنية مختلفة من الثقافة بعد المعالجة باستخدام IFNγ ، في وسائط النفايات السائلة لخزانات مدخل ومخرج كلتا القناتين. يجب إضافة متتبع الفلورسنت إلى وسط نمو عضوي القناة العلوي قبل 4 ساعات من تقييمتطبيق P. عادة ، يتم استخدام 3 kDa Dextran Cascade Blue كمقتفي الفلورسنت ويضاف في الوسط 24 ساعة من قبل.
      1. أوقف وحدة الثقافة مؤقتا وأحضر الصواني إلى BSC.
      2. قم بتسمية وإعداد لوحة ذات جدران سوداء من 96 بئرا مع 100 ميكرولتر من DPBS لكل بئر. باستخدام ماصة متعددة القنوات سعة 200 ميكرولتر، قم بجمع وإضافة 50 ميكرولتر من النفايات السائلة من جميع الخزانات إلى الآبار المعنية (الشكل 2B).
      3. لإعداد المنحنى القياسي ، قم بتخفيف الوسط الذي يحتوي على 100 ميكروغرام / مل من 3 kDa dextran Cascade Blue 1: 3 في DPBS. قم لاحقا بإجراء تخفيفات تسلسلية باستخدام تخفيف ثلاثي الأضعاف لوسط نمو الخلايا البطانية في DPBS.
      4. اقرأ التألق عند إثارة 375 نانومتر وانبعاث 420 نانومتر باستخدام قارئ لوحة. استخدم قيم OD المقاسة لحساب النفاذية الظاهرية (تطبيق P) كما يلي:
        Equation 2
    2. تلطيخ التألق المناعي للخلايا على الرقاقة
      1. يغسل باستخدام 200 ميكرولتر من DPBS لكل قناة ، ثلاث مرات.
      2. Perfuse 200 ميكرولتر من الحل المثبت (4٪ PFA في DPBS) في كل قناة. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      3. كرر خطوة الغسيل 9.2.2.1. في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الرقائق المغسولة لمدة تصل إلى 7 أيام عند 4 درجات مئوية.
      4. تخلل الخلايا باستخدام 200 ميكرولتر من محلول النفاذية (0.1٪ Triton-X 100 في مصل الحمير الطبيعي بنسبة 10٪ (NDS) في DPBS) لكل قناة. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر خطوة الغسيل 9.2.2.1.
      5. قم بحظر الخلايا الموجودة على الشريحة باستخدام 200 ميكرولتر من محلول الحظر (10٪ NDS في DPBS) لكل قناة. حضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      6. قم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية في محلول الأجسام المضادة (5٪ NDS في DPBS) على النحو التالي: Anti-Zonula Occludens 1 (ZO-1) (1:100 ، علامة تقاطع ضيقة ظهارية) ، anti-Occludin (1:100 ، علامة تقاطع ضيقة ظهارية) ، anti-Claudin 4 (1:100 ، علامة تقاطع ضيقة ظهارية) ، anti-E-cadherin (1:100 ، علامة تقاطع العصابات اللاصقة (جدول المواد). قم بتدوير 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي من خلال كل قناة واحتضنها بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. كرر خطوة الغسيل 9.2.2.1.
      7. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في محلول الأجسام المضادة (1:300 ، 5٪ NDS في DPBS). قم باختراق 200 ميكرولتر من هذا المحلول من خلال كل قناة واحتضنه لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة. كرر خطوة الغسيل 9.2.2.1. إذا رغبت في ذلك ، يمكن إضافة phalloidin ، وهو علامة هيكلية خلوية ، إلى محلول الأجسام المضادة الثانوي.
      8. قم بإعداد محلول 50 ميكروغرام / مل من محلول 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) في DPBS واستخدمه لاختراق 200 ميكرولتر عبر كل قناة. تحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. كرر خطوة الغسيل. في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الرقائق الملطخة لمدة تصل إلى 14 يوما عند 4 درجات مئوية.
    3. تقييم انقسام كاسباز 3
      1. عزل وقياس الكمية الإجمالية للبروتين من الخلايا الظهارية كما هو موضح في الخطوة 8.3.2. حذف خطوة الغسيل 8.3.2.1. تمييع العينات باستخدام DPBS إلى تركيز نهائي قدره 400 ميكروغرام / مل.
      2. حدد مستويات caspase 3 الكلي والمشقوق باستخدام مجموعة أدوات الكشف caspase 3 باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
    4. تقييم إفراز السيتوكينات الالتهابية
      1. استخدم النفايات السائلة التي تم جمعها من مخرج كلتا قناتي رقاقة القولون لتحديد كمية السيتوكينات المسببة للالتهابات في المرحلة الحادة المفرزة ، باتباع البروتوكولات المقدمة من الشركة المصنعة. قم بإجراء تخفيف 5 أضعاف لمجموعة V-PLEX لإصابات الأوعية الدموية 2 Human Kit وتخفيف مزدوج للوحة V-PLEX البشرية المضادة للالتهابات II.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يلخص الشكل 1D الجدول الزمني لزراعة رقاقة الأمعاء ويوضح الخلايا البطانية المعوية والمواد العضوية قبل وعند البذر على الشريحة. علاوة على ذلك ، فإنه يوضح الاختلافات المورفولوجية المتميزة بين رقائق الاثني عشر والقولون ، والتي أبرزها وجود تكوينات تشبه الزغب في رقاقة الاثني عشر وتمثل البنية المعوية الصغيرة.

يوضح الشكل 3A ، B استجابات تحريض CYP3A4 الطية في رقاقة الاثني عشر من ثلاثة متبرعين عضويين مختلفين. تعرضت الرقائق ل 20 ميكرومتر RIF أو 100 نانومتر VD3 لمدة 48 ساعة واستخدمت لتقييم مستويات mRNA (A) و / أو النشاط الحفاز الطوي (B) لإنزيم CYP450. لوحظت مستويات متزايدة من مستقلب هرمون التستوستيرون ، 6β-hydroxytestosterone (6β-OH-T) ، بما يتفق مع التعبير الجيني المرتفع CYP3A4 mRNA في شريحة الاثني عشر المعرضة ل RIF و VD3 مما يشير إلى استجابات حثية مناسبة عبر جميع المانحين الثلاثة الذين تم اختبارهم. يتم عرض وسائل SEM ± n = 3 رقائق مستقلة بيولوجيا.

ويصور الشكل 4 النتائج التمثيلية لنمذجة متلازمة الأمعاء المتسربة في رقاقة القولون، بما في ذلك (A,C) التغيرات في مورفولوجيا الخلايا الظهارية وسلامة الوصلة الضيقة، (B) انخفاض وظيفة الحاجز، (D) تحريض موت الخلايا المبرمج و (E) زيادة إفراز السيتوكين استجابة لعلاج IFNγ.

ويبين الشكل 4A صورا تمثيلية ساطعة لطبقة التحكم والطبقة الظهارية الأحادية المعالجة بتقنية IFNγ (50 نانوغرام/مل، 48 ساعة) لرقاقة القولون. تمت إزالة الرقائق من وحدة الثقافة وتم تقييم التشكل الظهاري تحت المجهر يوميا. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر برايتفيلد وهدف 10x. تظهر رقائق القولون المعالجة ب IFNγ مورفولوجيا الخلية المعرضة للخطر وفقدان الظهارة العمودية.

يوضح الشكل 4B نتيجة تمثيلية لفحص النفاذية الظاهر الذي تم إجراؤه على رقائق القولون المستزرعة في ظل ظروف خط الأساس أو عند التحفيز باستخدام IFNγ. تمت إضافة 3 kDa Dextran Cascade Blue tracer إلى خزان القناة العلوي إلى تركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام / مل. تم إعطاء IFNγ بتركيز نهائي قدره 50 نانوغرام / مل في القناة السفلية في اليوم 5 من الثقافة. تم تشغيل الرقائق بسرعة 60 مل / ساعة. بعد ذلك ، تم جمع الوسائط يوميا (حتى اليوم 72 ساعة بعد التعرض) من خزانات المدخل والمخرج لكل من القنوات العلوية والسفلية. تم جمع 50 ميكرولتر من كل عينة ، ومعالجتها كما هو موضح في الخطوة 9.2.1 من البروتوكول ، وفحصها للتأكد من تألقها عند 375-420 نانومتر باستخدام قارئ لوحة. لوحظت زيادة كبيرة في نفاذية الخلايا شبه الخلوية الظهارية بعد 48 ساعة من تحفيز IFNγ.

ويبين الشكل 4C صورا تمثيلية للفلورسنت المناعي للظهارة الضيقة (Zonula Occludens 1 - ZO-1 و Occludin-و Claudin-4) وتلتصق (E-cadherin) في السيطرة و IFNγ المعالجة (50 نانوغرام / مل ، 48 ساعة) رقاقة القولون. تم إصلاح الرقائق بنسبة 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتمت معالجتها بشكل أكبر كما هو موضح في الخطوة 9.2.2 من البروتوكول. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤرة وهدف 20x لمسافات طويلة ومعالجتها باستخدام فيجي الإصدار 2.0 وفقا للبروتوكولات القياسية. يؤدي العلاج باستخدام IFNγ إلى إزاحة ZO-1 و Claudin-4 واستيعاب Occludin و E-cadherin ، كما هو موضح في زيادة الإشارة السيتوبلازمية.

يمثل الشكل 4D المسار الزمني لانقسام Caspase 3 في رقاقة القولون استجابة ل 50 نانوغرام / مل من IFNγ مما يدل على تنشيط موت الخلايا المبرمج. تم تحليل الخلايا الظهارية على الرقائق وتم تنقية عينات البروتين وفقا للطرق القياسية. تم قياس المحتوى داخل الخلايا من Caspase 3 الكلي والمشقوق كما هو موضح في الخطوة 9.2.3 من البروتوكول. IFNγ يحفز تنشيط موت الخلايا المبرمج ، كما هو موضح سابقا29 ، في الخلايا الظهارية القولونية المزروعة على الشريحة ، بعد 48 ساعة من التحفيز.

يوضح الشكل 4E المسار الزمني لإفراز السيتوكين من رقاقة القولون عند التحفيز ب 50 نانوغرام / مل IFNγ. تم جمع 200 ميكرولتر من وسائط النفايات السائلة يوميا من خزانات المخرج لكل من القنوات العلوية والسفلية. تم تخزين عينات النفايات السائلة عند -80 درجة مئوية و 24 ساعة قبل أن يتم إذابة التحليل بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. تم تقييم مستويات السيتوكين في وسائط زراعة الرقائق باستخدام تقنية Meso Scale Discovery كما هو موضح في الخطوة 9.2.4 من البروتوكول. تسبب IFNγ في إفراز مستقطب للجزيئات المحفزة للالتهابات في رقاقة القولون ، كما هو موضح في الإفراز القاعدي الجانبي لبروتين التصاق الخلايا الوعائية 1 (VCAM-1) و Interleukin 6 (IL-6) والإفراز القمي لجزيء الالتصاق بين الخلايا 1 (ICAM-1) وبروتين أميلويد المصل A (SAA). تستخدم مستويات المصل للأشكال القابلة للذوبان من VCAM-1 و ICAM-1 و IL-6 و SAA في المختبرات السريرية كمؤشر على الالتهاب30,31.

Figure 1
الشكل 1: إنشاء رقاقة الأمعاء15,16. (أ) مخطط تنشيط الرقاقة وطلائها. باختصار ، يتم وضع الرقائق في مهد رقاقة ، ويتم دمجها مع محلول ER1 وتنشيطها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. بعد ذلك ، يتم غسل الرقائق باستخدام ER2 و DPBS. وأخيرا ، يتم طلاء الرقائق بمحلول ECM بارد ، خاص بكل نوع من أنواع الخلايا ، ويتم تحضينها بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. (B) Schematic الذي يصور عملية إدخال المواد العضوية في الشريحة. يتم نقل المواد العضوية من صفيحة 24 بئرا إلى أنبوب مخروطي ويتم احتضانها على الجليد في وجود محلول تفكك BMM لاستعادة المواد العضوية من BMM المذاب. ثم يتم طرد التعليق العضوي مركزيا وتقييمه لوجود بقايا BMM قابلة للذوبان. إذا كانت طبقة شفافة من BMM لا تزال مرئية فوق بيليه الخلية ، فيجب تكرار العملية. إذا لوحظت حبيبات محددة جيدا بدون بقايا هلام مرئية ، يتم فصل المواد العضوية إنزيميا وإدخالها في القناة العلوية (الزرقاء) للرقاقة. يتم زرع القناة السفلية (أرجوانية) للرقاقة بخلايا بطانية وعائية دقيقة خاصة بالأنسجة. (ج) مخطط يوضح اتصال الرقائق بوحدة الاستزراع ، والتي تدعم تدفق الوسائط والتمدد الدوري الشبيه بالتمعج. تمكن دورة التحضير من توليد قطرات متوسطة من زراعة الخلايا فوق منافذ الرقائق وفي نهاية مقاومات الوحدات المحمولة. وهذا يضمن إنشاء واجهة سائلة سائلة بين الشريحة والوحدة المحمولة ، مما يسهل انزلاق الشريحة إلى الوحدة واتصالها الآمن. أخيرا ، يتم وضع الوحدات المحمولة في صواني ، ويتم إدخال الصواني في وحدة الثقافة. (د) جدول زمني تجريبي يسلط الضوء على الخطوات الرئيسية لإنشاء منصة رقاقة الأمعاء المشتقة من الخزعة، بما في ذلك الاثني عشر ورقاقة القولون. توضح صور Brightfield الخلايا البطانية والعضوية المشتقة في اليوم 0 ، قبل وبعد البذر في الشريحة ، بالإضافة إلى تكوين أنسجة ظهارية متقاربة و 3D في اليوم 8 من ثقافة الرقائق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: جمع وسائط النفايات السائلة من رقاقة الأمعاء . (أ) مخطط يصور جمع النفايات السائلة من الوسائط من الوحدة المحمولة. يتم جمع الوسائط من خزانات المخرج للقناة العلوية والسفلية وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من تحليل ELISA أو LC-MS / LC-MS / MS. (ب) مخطط يوضح جمع عينات النفايات السائلة باستخدام ماصة متعددة القنوات ونقلها إلى صفيحة ذات جدران سوداء ذات 96 بئرا لتقييم النفاذية الظاهرية الظهارية في المراحل النهائية (Papp). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحريض CYP3A4 في رقاقة الاثني عشر 15. (أ) تحريض مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال CYP3A4 في رقاقة الاثني عشر بالتعرض لمدة 48 ساعة إلى 20 ميكرومتر RIF و 100 نانومتر VD3. متوسط ± SEM ، N = 3 رقائق / حالة / مانح ، ANOVA ثنائي الاتجاه ، اختبار Tukey اللاحق المخصص ، ****p < 0.0001 (مقارنة عبر عناصر تحكم DMSO). (ب) تحريض نشاط CYP3A4 في رقاقة الاثني عشر المعرضة للمحفزات النموذجية كما تم تقييمها بواسطة LC-MS/MS كميا لمستقلب ركيزة المسبار: 6β-hydroxytestosterone. لوحظت زيادة كبيرة في نشاط CYP3A4 في رقاقة الاثني عشر المعالجة ب 20 ميكرومتر RIF أو 100 نانومتر VD3 لمدة 48 ساعة. متوسط ± SEM ، N = 3 رقائق / حالة / مانح ، ANOVA ثنائي الاتجاه ، اختبار Tukey اللاحق المخصص ، ****p < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تعطيل الحاجز الظهاري في رقاقة القولون باستخدام IFNγ16. (A) صور برايتفيلد التي تظهر مورفولوجيا الخلايا الظهارية تحت ظروف خط الأساس وعند التحفيز مع 50 نانوغرام / مل IFNγ لمدة 48 ساعة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر (B) النفاذية الواضحة للحاجز الظهاري إلى 3 kDa Dextran على مدار تحفيز 72 ساعة مع 50 نانوغرام / مل من IFNγ. متوسط ± 95٪ CI ، N = 5-9 رقائق / حالة ، ANOVA ثنائي الاتجاه ، اختبار Tukey اللاحق المخصص ، ****p < 0.0001. (ج) صور التألق المناعي التي تصور اضطراب الظهارة الضيقة وتلتصق بالتقاطعات عند التحفيز مع 50 نانوغرام / مل من IFNγ لمدة 48 ساعة. زونوولا أوكلودينز 1 (ZO-1) (أحمر) تقاطعات ضيقة ، E-cadherin (أحمر) تلتصق بالتقاطعات ، تقاطعات ضيقة أوكلودين (أحمر) ، تقاطعات ضيقة كلودين - 4 (أحمر) ، 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (أزرق) نوى. شريط المقياس: 50 ميكرومتر (D) تحريض انقسام Caspase 3 في رقاقة القولون عن طريق العلاج مع 50 نانوغرام / مل من IFNγ. تم تقييم أربع نقاط زمنية مختلفة عبر 72 ساعة من التعرض. متوسط ± 95٪ CI ، N = 3-6 رقائق / حالة ، ANOVA ثنائي الاتجاه ، اختبار Tukey اللاحق ، ****p < 0.0001. (ه) زيادة إفراز السيتوكينات: بروتين التصاق الخلايا الوعائية 1 (VCAM-1) والإنترلوكين 6 (IL-6)، في القناة السفلية، وجزيء الالتصاق بين الخلايا 1 (ICAM-1) وبروتين أميلويد المصل A (SAA) في وسائط النفايات السائلة ذات القناة العليا، على مدار 72 ساعة من تحفيز رقاقة القولون مع 50 نانوغرام/مل من IFNγ. متوسط ± 95٪ CI ، N = 3 رقائق / حالة ، ANOVA ثنائي الاتجاه ، اختبار Tukey اللاحق المخصص ، *: p < 0.05 ، **: p < 0.01 ، ***: p < 0.001 ، **** p < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إن الجمع بين تقنية العضو على الرقاقة والمواد العضوية المعوية يبشر بالخير لنمذجة دقيقة لفسيولوجيا الأمعاء البشرية والفيزيولوجيا المرضية. هنا ، نقدم بروتوكولا بسيطا وقويا خطوة بخطوة (موضح في الشكل 1) لإنشاء شريحة الأمعاء التي تحتوي على ظهارة معوية صغيرة أو القولون مشتقة من الخزعة والخلايا البطانية الوعائية الدقيقة المعوية المستزرعة في جهاز الموائع الدقيقة. تتضمن هذه المحاكاة القائمة على الرقائق للأمعاء البشرية التدفق الفسيولوجي والمضيء والوعائي وحركات تشبه التمعج. بالإضافة إلى ذلك ، نصف إجراءات لتقييم وظائف الأمعاء الحرجة ، مثل استقلاب الدواء في رقاقة الاثني عشر ووظيفة الحاجز في رقاقة القولون.

لتلخيص التفاعلات الخلوية الظهارية البطانية ، والتي تعد ضرورية للحفاظ على توازن الأمعاء وبالتالي النمذجة الدقيقة للأنسجة المعوية على الرقاقة ، من الأهمية بمكان إنشاء طبقات أحادية الخلية الوظيفية والسليمة على جانبي غشاء PDMS. الخطوة الأولى نحو نجاح بذر الرقائق هي التنشيط الكيميائي لسطح PDMS الذي يسمح بتطوير رابط مستقر بين سطح PDMS وبروتينات ECM. قد يعيق التنشيط غير السليم تعلق الخلايا ويؤدي إلى تكوين طبقات أحادية خلوية غير مكتملة. يجب تحضير محلول التنشيط طازجا لأنه حساس للضوء وعرضة للتدهور. أثناء تنشيط الأشعة فوق البنفسجية وطلاء ECM اللاحق ، من المهم ضمان توزيع متساو للكواشف داخل كل قناة. تم تحسين التركيب والتركيز المحددين للمحاليل المستخدمة لطلاء القنوات العلوية والسفلية لتناسب احتياجات الخلايا الظهارية والبطانية ، على التوالي. إذا كانت هناك حاجة إلى تغييرات في التركيب الخلوي لشريحة الأمعاء ، فقد تحتاج ظروف ECM إلى إعادة تحسينها لتحقيق أفضل النتائج.

بعد طلاء ECM ، من المهم زرع HIMECs بكثافة عالية لبذر الخلايا (8 × 106 خلايا / مل) للحصول على طبقة أحادية كاملة ومتجانسة على الجانب السفلي من غشاء PDMS. إذا لم يتم تحقيق الالتقاء الخلية الكامل ، الالتقاء ، ينصح بزيادة كثافة تعليق الخلية البطانية أثناء البذر أو تأخير بذر شظايا العضوية في القناة العليا للرقاقة حتى تصبح HIMECs ملتقية تماما. وقد تبين سابقا أن استخدام المواد العضوية المجزأة ، بدلا من تعليق الخلايا المفردة التي تم الحصول عليها من خلال الهضم الأنزيمي للعضويات ، يحسن نجاح وقابلية تكرار تكوين الطبقة الأحادية المعوية داخل شريحة الأمعاء14. لذلك ، ينصح بشدة بمراقبة عملية الهضم العضوي عن كثب لضمان الوقت الأمثل للحضانة مع الإنزيم مما يؤدي إلى شظايا عضوية تتكون من حوالي 10-30 خلية (40-100 ميكرومتر في الحجم). يمكن أن يؤدي التفكك غير الكافي إلى إصلاح البنية العضوية الكيسية في رقائق الموائع الدقيقة بدلا من الطبقة الأحادية المطلوبة. بالإضافة إلى ذلك ، من الأهمية بمكان تجنب التفكك العضوي المفرط في خلايا مفردة يمكن أن يؤدي إلى تضاؤل بقاء الخلية والتعافي والفشل في تكوين طبقة أحادية متقاربة داخل الشريحة.

وقد ثبت أن دمج تدفق السوائل (إجهاد القص) والإجهاد الدوري في ثقافة رقاقة الأمعاء ، المدعومة باستخدام وحدة الثقافة ، يعزز تكوين الحاجز المعوي الوظيفي ويعزز التطور التلقائي للبنية ثلاثية الأبعاد للأنسجة الظهارية13. ومع ذلك ، عند إجراء تجارب الموائع الدقيقة باستخدام Organ-on-Chips ، من الأهمية بمكان تسخين وسائط زراعة الخلايا وتفكيكها مسبقا لتجنب تكوين فقاعات دقيقة في القنوات التي يمكن أن تؤدي إلى الإجهاد الخلوي أو حتى الانفصال عن الغشاء.

إلى جانب التطبيقات المحددة الموضحة هنا ، يمكن استخدام نموذج رقاقة الأمعاء لمعالجة مجموعة متنوعة من الأسئلة العلمية ، من العلوم الأساسية إلى اكتشاف واختبار أدوية جديدة أو تقنيات توصيل الأدوية. يمكن أن يسهل دراسات تطور الأمعاء البشرية ، ونضج الخلايا الجذعية ، ووظيفة الخلايا الظهارية. خاصة في سياق تقييم دور الميكانيكا في نمو وتوازن الأنسجة المعوية. كشفت الاكتشافات الحديثة أن التوازن الديناميكي للظهارة المعوية السليمة يعتمد على قدرتها على التنسيق الدقيق للقوى المختلفة التي تحدد بنية الزغب المشفر ، وتقسيم أنواع الخلايا ، والهجرة المباشرة للخلايا ، وتنظيم هوية الخلية ، والانتشار ، والموت في المكان والزمان32. توفر رقاقة الأمعاء فرصة لتوضيح التفاعل بين القوى الميكانيكية بشكل أفضل (على سبيل المثال ، التوتر أو إجهاد القص) ، ومصير الخلية ، والوظيفة للإجابة على بعض الأسئلة الرائعة العديدة التي لا تزال في المجال الناشئ لعلم الأحياء الميكانيكي المعوي. علاوة على ذلك ، قد يسمح بدراسات عمليات الاستشعار والنقل المعوي ، وذلك بفضل وجود خلايا الغدد الصماء المعوية المفرزة للهرمونات والتوطين الصحيح لمختلف ناقلات المغذيات15,16. يمكن أيضا تعديل نموذج رقاقة الأمعاء لدمج الخلايا المناعية وكذلك الكائنات الحية الدقيقة المصاحبة أو المسببة للأمراض للدراسات حول الاضطرابات الالتهابية في الأمعاء ، ومسببات الأمراض المضيفة ، والتفاعلات بين الميكروبيوم المضيف ، وكذلك للتنبؤ بدقة بالسمية غير المستهدفة لمنتجات الأورام المناعية ، كما هو موضح سابقا17،20،33،34،35.

بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام عينات الخزعة السريرية من الأفراد ذوي الخصائص الجينية والمظهرية المحددة يمكن أن يمكن من تحليل آليات المرض الخاصة بالمريض وكذلك الاستجابة للعلاجات، مما يساعد على تطوير الطب الشخصي في المستقبل.

القيد الرئيسي لهذه الطريقة هو أن شظايا من عدد كبير من المواد العضوية (~ 60-80) مطلوبة لتشكيل ظهارة معوية متقاربة على كل رقاقة. وذلك لأن شظايا العضوية تتطلب بذر عالي الكثافة لضمان وجود عدد كاف من الخلايا الجذعية المعوية لدعم التوسع التكاثري للطبقة الأحادية وإنشاء بنية أنسجة 3D. تمتلك الظهارة المعوية المتمايزة تماما على الشريحة جميع أنواع الخلايا الظهارية المعوية الرئيسية (الخلايا المعوية الاستيعابية ، وخلايا Paneth ، والخلايا الكأسية ، والخلايا الصماوية المعوية) وملف تعريف النسخ يشبه إلى حد كبير نظيره في الجسم الحي . ومع ذلك ، لا يزال النموذج الحالي يفتقر إلى مكونات مهمة أخرى للأمعاء الحية ، بما في ذلك الخلايا الليفية المعوية ، والخلايا المناعية المقيمة (على سبيل المثال ، البلاعم ، والخلايا الليمفاوية داخل الظهارة ، والخلايا المتغصنة) ، والجهاز العصبي المعوي.

في حين أن هذه عيوب محتملة ، فقد أظهرت الدراسات السابقة أن قوة نهج تكنولوجيا Organ-on-a-Chip تكمن في قدرتها على محاكاة التعقيد الهيكلي والوظيفي للأعضاء البشرية من خلال دمج المكونات المختلفة للأنسجة في الجسم الحي وبيئتها الدقيقة واحدة تلو الأخرى واحدة تلو الأخرى36,37. يوفر نهج البيولوجيا التركيبية هذا لهندسة الأنسجة في المختبر طريقة لدراسة مساهمة المكونات الخلوية والجزيئية الفردية في الاستجابات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية على مستوى الأعضاء بمستويات متفاوتة من تعقيد النظام. علاوة على ذلك ، فإنه يسمح بإجراء التحليل الكيميائي الحيوي والجيني والمجهري للأنسجة المتفاعلة بشكل فردي وفي الوقت الفعلي ، واكتساب نظرة ثاقبة حول كيفية مساهمة الإشارات بين الخلايا والتفاعلات بين الأنسجة في سلوكيات محددة على مستوى الأعضاء. سمة أخرى بارزة لتكنولوجيا رقاقة الأمعاء هي التنوع. يتيح التحكم الدقيق في العناصر البيئية الدقيقة ضبطا دقيقا لمعدلات تدفق الوسائط ومعلمات الإجهاد لإعادة إنتاج القوى الطبيعية التي تعاني منها الخلايا في جسم الإنسان ، مثل إجهاد القص الذي تستشعره الخلايا البطانية المعرضة لتدفق الدم والحركات التمعجية الدورية للأنسجة المعوية. علاوة على ذلك ، تتيح الهندسة التآزرية للعضويات والأعضاء على الرقائق إنشاء أعضاء وعائية على رقائق تمثل مناطق مختلفة من الأنسجة المعوية التي يمكن ربطها بشكل سائل مع بعضها البعض لدراسة التفاعلات الفسيولوجية بين الأمعاء الدقيقة والغليظة. وبالتالي ، نعتقد أن رقاقة الأمعاء تمثل نموذجا متفوقا للظهارة المعوية وقد تساعد في تنفيذ مبدأ 3Rs (التخفيض والصقل والاستبدال) في العلوم الأساسية وكذلك في الإعداد قبل السريري والتنظيمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

غوري كولكارني وأثاناسيا أبوستولو ولورنا إيوارت وكارولينا لوتشيسي وماجدالينا كاسيندرا هم موظفون حاليون أو سابقون في شركة Emulate Inc. وقد يحتفظون بالأسهم. Emulate Inc. هي الشركة التي تصنع أجهزة رقاقة الأعضاء وقد نشرت براءات اختراع ذات صلة بالعمل المذكور في هذه المقالة.

Acknowledgments

نشكر البروفيسور مارك دونويتز على توفير المواد العضوية المشتقة من خزعة الأمعاء وبريت كلير على تصميم الرسوم التوضيحية العلمية لوحدة الشريحة والمحمولة والثقافة. تم إنشاء جميع الرسوم التوضيحية العلمية المتبقية باستخدام BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells AlphaBioRegen ALHE15 0.5 cells M/ml ; cryopreserved
colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells AlphaBioRegen ALHE16 0.5 cells M/ml ; cryopreserved
Biopsy-derived Human Duodenal Organoids John Hopkin's University - The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).
Biopsy-derived Human Colonic Organoids John Hopkin's University - The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).
Zoë CM-1™ Culture Module Emulate Inc. - Culture module
Orb-HM1™ Hub Module Emulate Inc. - 5% CO2, vacuum stretch, and power supply
Chip-S1™ Stretchable Chip Emulate Inc. - Organ-Chip
Pod™ Portable Modules Emulate Inc. - Portable module
UV Light Box Emulate Inc. - -
Chip Cradle Emulate Inc. - 1 per square culture dish
Steriflip®-HV Filters EMD Millipore SE1M003M00 0.45 μm PVDF filter
Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm) VWR 82051-068 -
Handheld vacuum aspirator Corning 4930  -
Aspirating pipettes Corning / Falcon 357558 2 mL, polystyrene, individually wrapped
Aspirating tips  - Sterile (autoclaved)
Serological pipettes  - 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile
Pipette P20, P200, P1000 and standard multichannel
Pipette tips  P20, P200, and P1000.
Conical tubes (Protein LoBind® Tubes) Eppendorf 0030122216; 0030122240 15 mL, 50 mL tubes
Eppendorf Tubes® lo-bind Eppendorf 022431081 1.5 mL tubes
96 wells black walled plate - - for epithelial permeability analysis
Microscope (with camera) - - For bright-field imaging
Water bath (or beads) - - Set to 37°C
Vacuum set-up  - - Minimum pressure: -70 kPa
Cell scrapers Biotium 220033
T75 flasks BD Falcon 353136 Cell culture flask
Emulate Reagent-1 (ER-1) Emulate Inc. - Chip coating solution
Emulate Reagent-2 (ER-2) Emulate Inc. - Chip coating solution
Dulbecco’s PBS (DPBS) Corning 21-031-CV 1X
Cell Culture Grade Water Corning MT25055CV
Trypan blue Sigma 93595 For cell counting
TryplE Express ThermoFisher Scientific 12604013 Organoids dissociation and endothelium cells detachment solution
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634028 Medium
IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) Stem Cell technologies 06010 Organoid Growth Medium
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 Promocell C-22121 Endothelial medium
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F4135 Serum
Primocin™  InvivoGen ANT-PM-1 antimicrobial agent
Attachment Factor™ Cell Systems 4Z0-210 coating solution for flask
Matrigel - Growth Factor Reduced Corning 356231 Solubilized basement membrane matrix
Collagen IV Sigma C5533 ECM component
Fibronectin Corning 356008 ECM component
Y-27632 Stem Cell technologies 72304 organoid media supplement
CHIR99021 Reprocell 04-0004-10 organoid media supplement
Cell Recovery Solution Corning 354253 Basement mebrane matrix dissociationsolution
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9576 30%, Sterile
Cell Culture Grade Water Corning MT25055CV Sterile, Water
DMSO Sigma D2650 solvent
3KDa Dextran Cascade Blue Invitrogen D7132 10 mg powder
Rifampicin (RIF) Sigma Cat# R3501 CYP inducer
Testosterone hydrate Sigma T1500 CYP substrate
1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3) Sigma Cat# D1530 CYP inducer
Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid Sigma 159002 LCMS stop solution
IFNγ Peprotech 300-02
4% Paraformaldehyde (PFA) EMS 157-4 Fixative
Triton-X 100 Sigma T8787
Normal Donkey Serum (NDS) Sigma 566460
anti-Occludin ThermoFisher Scientific 33-1500 tight junctions marker
anti-Claudin 4 ThermoFisher Scientific 36-4800 tight junctions marker
anti-E-cadherin Abcam ab1416 epithelial adherens junctions marker
anti-VE-cadherin Abcam ab33168 endothelial adherent junctions marker
anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) Thermo Fischer 339194 tight junctions marker
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 nuclear stain
2-mercaptoethanol Sigma M6250
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183020 RNA lysis, isolation and purification kit
SuperScript™ IV VILO™ Master Mix Invitrogen 11756050 reverse transcriptase kit
TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Applied Biosystems 4444557 qPCR reagent
QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System Applied Biosystems A28573 Real-time PCR cycler
18S primer ThermoFisher Scientific Hs99999901_s1 Eukaryotic 18S rRNA
CYP3A4 primer ThermoFisher Scientific Hs00604506_m1 Cytochrome  family 3 subfamily A member 4
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit ThermoFisher Scientific 23236 Protein quantification kit
MSD Tris lysis buffer Meso Scale Diagnostics R60TX-3 Protein lysis buffer
Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit Meso Scale Diagnostics K15140D Caspase 3 detection kit
V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit Meso Scale Diagnostics K15198D
V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) Meso Scale Diagnostics K15053D
Zeiss LSM 880 Zeiss - Confocal microscope
Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 Zeiss - 20X long-distance objective lenses
Zeiss AXIOvert.A1 Zeiss - Brightfield microscope
Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 Zeiss - 10X objective lenses

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
  2. Okumura, R., Takeda, K. Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers. Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).
  3. Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. Cell death at the intestinal epithelial front line. FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).
  4. Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  5. Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Yu, H., et al. The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology. Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  9. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  10. Durel, J. F., Nerurkar, N. L. Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis. Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).
  11. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  12. Xu, Y., et al. Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells. Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).
  13. Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS One. 8 (7), 68761 (2013).
  14. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  15. Kasendra, M., et al. Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model. eLife. 9, 50135 (2020).
  16. Apostolou, A., et al. A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).
  17. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583 (2019).
  18. Yin, J., et al. Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).
  19. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  20. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43 (2019).
  21. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
  22. Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).
  23. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  24. Sarna, S. K. Colonic motility: From bench side to bedside. Morgan & Claypool Life Sciences. , San Rafael (CA). (2010).
  25. Basson, M. D. Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology. Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).
  26. Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).
  27. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-Catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  28. Madara, J. L., Stafford, J. Interferon-γ directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers. Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).
  29. Bruewer, M., et al. Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms. The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).
  30. Jones, S. C., et al. Adhesion molecules in inflammatory bowel disease. Gut. 36 (5), 724-730 (1995).
  31. Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant. European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).
  32. Pérez-González, C., Ceada, G., Matejčić, M., Trepat, X. Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium. Current Opinion in Genetics & Development. 72, 82-90 (2022).
  33. In, J., et al. Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).
  34. Grassart, A., et al. Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection. Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).
  35. Kerns, S. J., et al. Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies. eLife. 10, 67106 (2021).
  36. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  37. Ingber, D. E. Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips. Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 183،
الجمع بين المواد العضوية البشرية وتكنولوجيا الأعضاء على الرقاقة لنمذجة الوظائف الخاصة بالمنطقة المعوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kulkarni, G., Apostolou, A., Ewart,… More

Kulkarni, G., Apostolou, A., Ewart, L., Lucchesi, C., Kasendra, M. Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality. J. Vis. Exp. (183), e63724, doi:10.3791/63724 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter