Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kombinera mänskliga organoider och organ-på-ett-chip-teknik för att modellera tarmregionspecifik funktionalitet

Published: May 5, 2022 doi: 10.3791/63724
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2,3
1Emulate Inc. Boston, 2Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Division of Pediatric General and Thoracic Surgery, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Biopsi-härledda tarmorganoider och organ-on-a-chips-teknologier kombineras till en mikrofysiologisk plattform för att rekapitulera regionspecifik tarmfunktionalitet.

Abstract

Tarmslimhinnan är en komplex fysisk och biokemisk barriär som uppfyller en myriad av viktiga funktioner. Det möjliggör transport, absorption och metabolism av näringsämnen och xenobiotika samtidigt som det underlättar ett symbiotiskt förhållande med mikrobiota och begränsar invasionen av mikroorganismer. Funktionell interaktion mellan olika celltyper och deras fysiska och biokemiska miljö är avgörande för att etablera och upprätthålla tarmvävnadshomeostas. Att modellera dessa komplexa interaktioner och integrerad tarmfysiologi in vitro är ett formidabelt mål med potential att förändra hur nya terapeutiska mål och läkemedelskandidater upptäcks och utvecklas.

Organoider och Organ-on-a-Chip-teknologier har nyligen kombinerats för att generera mänskligt relevanta tarmchips som är lämpliga för att studera de funktionella aspekterna av tarmfysiologi och patofysiologi in vitro. Organoider som härrör från biopsierna i den lilla (tolvfingertarmen) och tjocktarmen sås in i det övre facket i ett organchip och expanderar sedan framgångsrikt som monolager samtidigt som de distinkta cellulära, molekylära och funktionella egenskaperna hos varje tarmregion bevaras. Mänskliga tarmvävnadsspecifika mikrovaskulära endotelceller införlivas i organchipets nedre fack för att återskapa epitel-endotelgränssnittet. Denna nya plattform underlättar luminal exponering för näringsämnen, läkemedel och mikroorganismer, vilket möjliggör studier av tarmtransport, permeabilitet och värd-mikrobinteraktioner.

Här tillhandahålls ett detaljerat protokoll för etablering av tarmchips som representerar det mänskliga tolvfingertarmen (tolvfingertarmschip) och tjocktarmen (kolonchip) och deras efterföljande kultur under kontinuerligt flöde och peristaltikliknande deformationer. Vi demonstrerar metoder för att bedöma läkemedelsmetabolism och CYP3A4-induktion i tolvfingertarmschip med hjälp av prototypiska inducerare och substrat. Slutligen tillhandahåller vi ett steg-för-steg-förfarande för in vitro-modellering av interferon gamma (IFNγ) -medierad barriärstörning (läckande tarmsyndrom) i ett kolonchip, inklusive metoder för att utvärdera förändringen av paracellulär permeabilitet, förändringar i cytokinsekretion och transkriptomisk profilering av cellerna i chipet.

Introduction

Människans tarm är ett komplext och multitasking-organ som kan regenerera sig själv. Det är uppdelat i tunn- och tjocktarmen. Tunntarmens primära funktion är att ytterligare smälta mat som kommer från magen, absorbera alla näringsämnen och överföra resterna till tjocktarmen, som återvinner vattnet och elektrolyterna. Tunntarmen är vidare uppdelad i flera anatomiskt distinkta regioner: tolvfingertarmen, jejunum och ileum, som var och en är anpassad för att utföra specifika funktioner. Till exempel hjälper tolvfingertarmen att bryta ner chymen (maginnehållet) för att möjliggöra korrekt absorption av näringsämnen som involverar proteiner, kolhydrater, vitaminer och mineraler i jejunum. Denna proximala del av tunntarmen är också huvudplatsen för intestinal läkemedelsabsorption och metabolism, och den kännetecknas av det högre uttrycket av läkemedelsmetaboliserande enzymer (t.ex. CYP3A4) jämfört med deras uttryck i ileum och kolon1. Förutom sin huvudsakliga roll vid smältning och absorption av näringsämnen är tarmen också en effektiv barriär mot potentiellt skadligt luminalt innehåll, såsom patogena mikroorganismer, mikrobiella metaboliter, dietantigener och toxiner 2,3. Det är anmärkningsvärt att den mänskliga kolon är bebodd av ett stort antal mikroorganismer, som långt överstiger det totala antalet celler i människokroppen, vilket ger många fördelar för näring, metabolism och immunitet. Därför är upprätthållandet av integriteten hos slemhinnebarriären som bildas av tarmepitelceller avgörande för att möjliggöra det symbiotiska förhållandet mellan tarmmikrobiotan och värdcellerna genom att fysiskt separera dem för att undvika onödig immuncellaktivering2. Dessutom spelar programmerad tarmcellsdöd en viktig roll som en självskyddande mekanism som förhindrar att infekterade celler kvarstår eller sprider sig - och därigenom sprider potentiella patogener3 - medan den kontinuerliga självförnyelsen av tarmepitelet var fjärde till sjunde dag kompenserar för cellförlusten som säkerställer barriärintegritet och vävnadshomeostas. Försämringar av beskrivna tarmfunktioner, inklusive näringsupptag, barriärintegritet eller obalans i tarmcellsdöd och självförnyelse, kan leda till utveckling av en rad gastrointestinala störningar, inklusive undernäring och inflammatorisk tarmsjukdom (IBD)2,3.

Tidigare har djurmodeller och transformerade cancer-härledda tarmcellinjer använts för att studera de fysiologiska och patofysiologiska funktionerna hos mänsklig tarmvävnad. Den allt mer framträdande oron över djurforskningens överförbarhet till människor, orsakad av förekomsten av betydande skillnader mellan de två arterna, belyste dock behovet av människorelevanta alternativa metoder4. De vanliga in vitro-tarmcellinjerna inkluderar T84-, Caco-2- och HT29-celler. Medan de efterliknar vissa aspekter av tarmbarriärfunktionen och membrantransporten, kännetecknas de av ett förändrat uttryck av läkemedelsmetaboliserande enzymer5, ytreceptorer och transportörer4. Dessutom saknar de tarmsegmentspecificitet och misslyckas med att rekapitulera komplexiteten hos tarmepitel, där varje modell endast innehåller en av de fem epitelcelltyperna som finns i tarmen6.

Nyligen introducerades humana tarmorganoidkulturer etablerade från färska biopsier i tunntarmen och tjocktarmen 7,8 eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)9 som alternativa experimentella modeller med potential att komplettera, minska och kanske ersätta djurförsök i framtiden. Medan iPSCs kan erhållas på ett icke-invasivt sätt, kräver etablering av organoider från iPSCs användning av komplexa och långa protokoll (med flera experimentella steg) och genererar kulturer som liknar mänsklig fostervävnad. Däremot är biopsi-härledda organoider mycket skalbara, eftersom de kan utnyttja den inneboende förnyelsekapaciteten hos tarmvävnad och kan passeras på obestämd tid och förökas in vitro. Viktigt är att biopsi-härledda organoider upprätthåller sjukdoms- och tarmregionspecifika egenskaper hos den primära vävnaden från vilken de utvecklades och emulerar den cellulära mångfalden i tarmepitelet. Organoider kan användas som patientspecifika avatarer in vitro för att avslöja biologin och patogenesen av olika gastrointestinala störningar och förbättra deras terapeutiska hantering. Även om tarmorganoider har uppnått en imponerande grad av fysiologisk funktionalitet, misslyckas de fortfarande med att reproducera komplexiteten hos de infödda organen på grund av deras brist på kritiska stromakomponenter - inklusive blodkärl, bindväv, perifera nerver och immunceller - samt mekanisk stimulering. Mekaniska parametrar, såsom flöde, skjuvspänning, stretch och tryck, är kända för att påverka vävnadsmorfogenes och homeostas in vivo och har tidigare visat sig förbättra mognaden av celler in vitro 10,11,12,13. En ytterligare viktig nackdel med organoidsystem är lumenets otillgänglighet och därmed till epitelets apikala sida. Detta utgör en utmaning för att undersöka olika mekanismer associerade med det polariserade uttrycket av jon- och läkemedelstransportörer, värd-mikrobiominteraktioner och farmaceutisk toxicitetstestning. Slutligen lider organoidkulturer av betydande variationer i storlek, morfologi och funktion på grund av den stokastiska karaktären hos in vitro-självorganisationsprocessen och cell ödesval. För att förverkliga den fulla potentialen hos tarmorganoider i sjukdomsmodellering, läkemedelsscreening och regenerativ medicin är det därför nödvändigt att utforska nya strategier som minskar variationen i organoidutveckling, förbättrar tillgången till det luminala facket och införlivar saknade cell-cellinteraktioner.

Organ-on-a-Chip-tekniken har introducerat många tekniker för införlivande av mekaniska krafter och vätskeflöde till tarmcellkulturer in vitro. Men eftersom de flesta av de första proof-of-concept-studierna har använt cancer-härledda cellinjer som inte uppvisade tillräcklig cellulär mångfald, har relevansen av dessa system ifrågasatts. Nyligen har vi synergistiskt kombinerat tarmorganoider och organ-on-a-chip-teknik för att införliva de bästa funktionerna i varje tillvägagångssätt i ett in vitro-system 14,15,16. Det resulterande tarmchipet rekapitulerar den multicellulära arkitekturen i tarmepitelet, närvaron av epitel-endotelvävnadsgränssnitt och de mekaniska krafterna för vätskeflöde och stretch, vilket möjliggör emulering av organnivåfunktioner in vitro. Dessutom ökar användningen av primärvävnads-härledda organoider (som kan provtas från olika regioner i människans tarm) som utgångsmaterial denna modells mångsidighet, eftersom chips som representerar humant tolvfingertarmen, jejunum, ileum och kolon kan etableras efter liknande sådd- och odlingsförfaranden. Viktigt är att tarmchips möjliggör bedömning i realtid av: tarmbarriärens integritet; aktiviteten hos borstgränsen och läkemedelsmetabolismenzymer; produktion av muciner; utsöndring av cytokiner; och interaktion mellan tarmceller och patogena och kommensala mikroorganismer, vilket visats i de tidigare publicerade rapporterna. I synnerhet när tarmchips etablerades med hjälp av organoider genererade från olika individers vävnad, fångade dessa modeller den förväntade variationen mellan givare i de funktionella svaren på olika läkemedel och behandlingar. Sammantaget öppnar sammanslagning av organoider med Organ-on-a-Chip-teknik dörren till mer avancerade, personliga, in vivo-relevanta modeller som kan förbättra den fysiologiska relevansen och noggrannheten hos in vitro-fynden samt deras extrapolering till människor. Här presenteras ett detaljerat protokoll för att fastställa tarmchipet och dess tillämpning i studierna av fysiologiska funktioner hos de två tarmsegmenten: tolvfingertarmen och tjocktarmen. För det första beskrivs metoderna för att bedöma aktiviteten hos det läkemedelsmetaboliserande enzymet CYP3A4 i tolvfingertarmschipet, liksom dess induktion av prototypiska föreningar såsom rifampicin och vitamin D3. För det andra beskrivs de steg som krävs för att modellera "läckande tarm" i kolonchipet i protokollet, med störningen av epitelbarriären som utförs med hjälp av kännetecknande cytokiner som är inblandade i patogenesen av IBD. Kortfattat förökas organoider härledda från humana biopsier in vitro, utsätts för enzymatisk matsmältning och införs i chipets övre kanal. I närvaro av kontinuerlig perfusion med tillväxtfaktorberikade medier utvecklas de till ett sammanflytande epitelialt monolager med 3D-arkitektur och en lättillgänglig apikal cellyta. Botten, "vaskulärt" chipfack är utsäde med mikrovaskulära endotelceller isolerade från tunn- eller tjocktarmen. Epitelet och endotelet separeras av ett poröst töjbart membran, vilket underlättar de parakrina interaktionerna mellan de två vävnaderna och, när de utsätts för cykliska deformationer, emulerar peristaltikliknande rörelser i den mänskliga tarmen. Samodlingen upprätthålls under de dynamiska flödesförhållanden som genereras av luminal och vaskulär perfusion med lämpliga cellodlingsmedier. Slutligen beskriver vi många typer av analyser och slutpunktsanalyser som kan utföras direkt på chip eller från provtagna cellodlingsavlopp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla cellkulturer bör hanteras med en korrekt aseptisk teknik.

De mänskliga tarmorganoiderna som användes i denna studie erhölls från Johns Hopkins University och alla metoder utfördes i enlighet med godkända riktlinjer och föreskrifter. Alla experimentella protokoll godkändes av Johns Hopkins University Institutional Review Board (IRB #NA 00038329).

1. Beredning av cellodlingsreagenserna

  1. Förbered det humana organoida tillväxtmediet enligt tillverkarens instruktioner (materialtabell) och komplettera det med 100 μg / ml primocin.
  2. Förbered humant mikrovaskulärt endotelcellstillväxtmedium enligt tillverkarens instruktioner (materialtabell) och komplettera med 1:20 vol / vol FBS och 50 μg / ml istället 100 μg / ml primocin.
  3. Resuspend Y-27632 (Rho-kinashämmare) i steril 0,1% BSA i DPBS för att bereda en 10 mM stamlösning. Alikvotera till sterila mikrorör och förvara vid -20 °C i upp till 6 månader.
  4. Resuspend CHIR99021 (GSK-3-hämmare) i steril dimetylsulfoxid (DMSO) för att bereda en 5 mM stamlösning. Alikvotera till sterila mikrorör och förvara vid -20 °C i upp till 6 månader.
  5. Förbered den humana organoida matsmältningslösningen genom att blanda en 1: 1 vol / vol organoids dissociationslösning (materialtabell) med DPBS-lösning (materialtabell) och komplettera den med 10 μM stamlösning av Y-27632. Detta reagens måste göras färskt för varje användning.

2. Odling av humana tarmmikrovaskulära endotelceller (HIMEC)

  1. Starta HIMEC-kulturen (materialtabell) 7 dagar innan du sår den på chipet. Endast HIMEC vid passage 1-6 kan användas för chip sådd.
  2. Tillsätt 5 ml av fastsättningsfaktorlösningen (materialtabell) till en T150-kolv. inkubera vid 37 °C i 1 min och kassera lösningen.
  3. Tillsätt 19 ml endotelcellstillväxtmedium som förvärmts vid rumstemperatur (se steg 1.2) till kolven.
  4. Tina en fryst injektionsflaska med HIMEC (2 miljoner celler/injektionsflaska) i ett 37 °C vattenbad.
  5. Överför innehållet i injektionsflaskan till kolven och gunga försiktigt kolven för att fördela cellerna jämnt. Placera kolven i en 37 °C kuvös över natten så att endotelcellerna kan vidgas.
  6. Byt ut mediet mot 20 ml endotelcellstillväxtmedium förvärmt vid rumstemperatur nästa dag och därefter var 3: e dag. Kulturer bör nå 90% av sammanflödet på dagen för cellskörd för chipexperiment.

3. Mikrofabrikation och beredning av chipet

  1. Skaffa chips från en kommersiell leverantör (materialtabell). Packa upp chipsen och placera dem i spånvaggan placerad i en fyrkantig petriskål (materialtabell). Märk framsidan av varje spånbärare med de experimentella förhållandena (figur 1A).
    OBS: Medan det presenterade protokollet förlitar sig på användningen av ett specifikt kommersiellt tillgängligt chip och instrumentering, finns det flera mikrofluidiska enheter som erbjuds via olika leverantörer, som kan erbjuda alternativa fördelar men saknar förmågan att införliva stretch. Dessutom kan mikrofabrikation av Organs-on-Chips utföras "internt" enligt de procedurer som beskrivs i Huh et al.21.

4. Aktivering och ECM-beläggning av membranet

  1. Förberedelse av aktiveringslösningen
    1. Bringa ER-1- och ER-2-reagenserna (materialtabell) till rumstemperatur för att balansera före användning. ER-1 är ljuskänslig och måste hanteras i mörker.
    2. Rekonstituera ER-1 i 10 ml ER-2-reagens för att göra en slutlig koncentration på 0,5 mg / ml och bekräfta att ER-1 är helt upplöst.
  2. Aktivering av ytan
    1. Tryck försiktigt 50 μL av ER-1-lösningen genom båda kanalerna på chipet (figur 1A).
    2. Ta bort eventuellt överskott av ER-1-lösning från chipets yta med en aspirator.
    3. Inspektera chipsen för att se till att alla chips har fått ER-1-lösningen. Vid luftbubblor, introducera mer ER-1-lösning tills bubblorna är helt borttagna.
    4. Inkubera chipsen inuti UV-lampkammaren (materialtabell) i 15 minuter. Kontrollera att UV-lampan är inställd på inställningen Konsekvent.
    5. Ta tillbaka er-1-aktiverade chips till biosäkerhetsskåpet (BSC). Aspirera ER-1-lösningen från båda kanalerna. Tvätta eventuella rester av ER-1-lösningen med 200 μl ER-2.
    6. Tryck 200 μL steril Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DBPS) genom kanalerna (materialtabell) och lämna DBPS i kanalerna till nästa steg.
  3. Framställning av extracellulär matris (ECM) och membranbeläggning
    1. Beredning av lagerlösningar av ECM-komponenter
      1. Rekonstituera kollagen IV (materialtabell) och fibronektin (materialtabell) med användning av sterilt cellodlingsvatten (materialtabell) till en slutlig koncentration på 1 mg / ml. Förbered alikvoter och förvara dem vid -20 °C tills de används.
    2. Beredning av ECM-arbetslösning för membranbeläggning
      1. Förbered 1,5 ml av varje ECM-lösning för den övre och nedre kanalen för varje 12 chips som ska beläggas. ECM-lösningen ska alltid beredas strax före användning.
      2. För den övre kanalen, blanda kollagen IV och solubiliserad källarmembranmatris (BMM) (materialtabell) i steril kall DBPS vid 200 μg / ml respektive 100 μg / ml. För bottenkanalen, blanda kollagen IV och fibronektin i steril kall DPBS vid 200 μg / ml respektive 30 μg / ml.
    3. ECM-beläggning av flisen
      1. Aspirera DBPS från båda kanalerna i chipsen och ersätt med lämplig ECM-arbetslösning för varje kanal (figur 1A).
      2. Inspektera varje chip för att säkerställa att det har fått beläggningslösningen. Vid luftbubblor, tryck igenom mer beläggningslösning tills alla bubblor är helt borttagna.
      3. Tillsätt steril DPBS i spånvaggan och placera petriskålen som innehåller chipsen i en 37 °C inkubator. Inkubera över natten så att ECM-proteinerna kan bilda jonbindningar med det aktiverade PDMS-membranet. Om så önskas kan celler ynas när som helst mellan 2 h och 1 dag efter beläggning av flisen. Alternativt kan belagda chips lagras vid 4 ° C över natten, följt av inkubation över natten vid 37 ° C och spånsådd.

5. Sådd av tarmmikrovaskulära endotelceller (HIMEC) i chipets nedre kanal

OBS: Tunntarmen och kolon-HIMEC: erna är sådda i bottenkanalen i tolvfingertarmen respektive kolonchipet.

  1. Förbered chips
    1. Överför de ECM-belagda chipsen till BSC. Aspirera försiktigt ECM-beläggningen från båda kanalerna i flisen och tvätta sedan båda kanalerna med 200 μL organoidtillväxtmedium respektive endotelcellstillväxtmedium.
    2. Förvara de tvättade chipsen i en 37 ° C inkubator tills du fortsätter med sådd av endotelceller.
  2. Skörda endotelcellerna
    1. Ta HIMEC-odlingskolven till BSC och tvätta med steril DPBS.
    2. Tillsätt 3 ml dissociationslösning till kolven och placera den i inkubatorn vid 37 °C i 2 minuter för att möjliggöra fullständig cellavlossning.
    3. Samla cellerna i ett 15 ml koniskt rör och tillsätt endotelcellstillväxtmedier tills det når 10 ml. Prov 15-20 μL av cellsuspensionen för cellräkning. Centrifugera vid 150 x g i 5 min.
    4. Aspirera försiktigt supernatanten och suspendera HIMEC: erna till en densitet av 8-10 x 106 celler / ml i endotelcelltillväxtmedier.
  3. Frö endotelceller i chipets nedre kanal
    1. Ta med petriskålen som innehåller chipsen till BSC och ta försiktigt bort alla media från bottenkanalen med en 1 000 μL pipett.
    2. Introducera 10-15 μl av HIMEC-suspensionen i chipets nedre kanal. Inspektera chipet direkt efter sådd för att säkerställa optimal sådddensitet (80% -90% av täckningen) och homogen cellfördelning inom kanalen (figur 1D). Om sådddensiteten är högre eller lägre än förväntat eller ojämn, tvätta kanalen 2x med 200 μL endotelcellstillväxtmedier och upprepa såddproceduren.
    3. Invertera petriskålen omedelbart efter sådd av varje sats med sex chips för att möjliggöra endotelcellfästning på undersidan av PDMS-membranet. Placera petriskålarna i inkubatorn vid 37 °C i 30 minuter till 1 timme, eller tills HIMEC:erna i den nedre kanalen har fästs vid membranet (figur 1D).
  4. Tvätta chipsen
    1. Tryck försiktigt 200 μL endotelcelltillväxtmedier genom det nedre kanalinloppet för att ta bort eventuella obundna celler och fylla på näringsämnena i mediet.
    2. Tvätta bort cellerna som inte fästes i den övre kanalen med 200 μL organoidtillväxtmedium kompletterat med 5 μM CHIR99021 och 10 μM Y-27632.
    3. Placera chipsen i inkubatorn på 37 °C tills de fortsätter till epitelcellssådden.

6. Sådd av organoidfragment i chipets övre kanal

OBS: Organoider isolerade från biopsier i olika tarmregioner kan odlas i tarmchip7. Följ de procedurer som beskrivs i Fujii m.fl. för isolering av mänskliga tarmkrypter och etablering av organoidkulturer22. Här används duodenala och kolonorganoider för att generera tolvfingertarmen respektive kolonchipsen. Med tanke på den höga batch-till-batch- och donator-till-donatorvariationen i organoidbildning och tillväxt föreslås det att man utför en pilotutvärdering av celltätheten i organoidsuspensionskulturen (24-brunnsplattformat) för att uppnå optimal sådddensitet på 8 miljoner celler / ml.

  1. Pilotutvärdering av cellnummer/brunn i statisk organoidkultur.
    OBS: Följande procedur är endast för att bestämma antalet brunnar av organoid suspensionskultur som krävs för spånsådd. De resulterande enskilda cellerna bör inte användas för chip sådd.
    1. Aspirera försiktigt supernatanten från tre brunnar på organoidkulturplattan. Tillsätt 500 μL iskall BMM-dissociationslösning (materialtabell) till varje brunn och använd en plastskrapa för att lossa den lösliga BMM från plasten.
    2. Samla upp organoidsuspensionen i ett sterilt koniskt rör med låg proteinbindning med en iskall pipett på 1 000 μl. Inkubera på is i 60 min, blanda var 15: e minut genom att försiktigt skaka röret. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
    3. Aspirera supernatanten och tillsätt 2 ml trypsin. Inkubera vid 37 ° C i 30 minuter för att smälta organoiderna till encellsnivån och tillsätt 10 ml komplett organoidtillväxtmedium för att stoppa den enzymatiska reaktionen. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
    4. Resuspendera cellpelleten i 1 ml komplett organoidtillväxtmedium och räkna det totala antalet celler med hjälp av en hematocytometer enligt standardmetoder.
  2. Beredning av organoidfragment och deras sådd i chipet
    OBS: Följande procedurer kan användas för att fröa duodenala eller kolonorganoider i chipets övre kanal. Upprättandet av ett epitelialt monolager med en in vivo-relevant 3D-cytoarkitektur är beroende av närvaron av flöde15,23 och framgångsrik sådd av organoidfragment.
    1. Aspirera försiktigt mediet från antalet brunnar i den statiska organoidkulturen, vilket är tillräckligt, enligt vad som bestäms i steg 6.1, för att uppnå en slutlig sådddensitet på 8 miljoner celler/ml. Tillsätt 500 μl iskall BMM-dissociationslösning till varje brunn.
    2. Lossa den solubiliserade BMM från brunnarnas yta med en plastskrapa eller 1 000 μL pipett. Samla suspensionen i ett 15 ml lågproteinbindande koniskt rör.
    3. Förvara suspensionen på is i 60 min, blanda var 15: e minut genom att skaka röret försiktigt. Fortsätt till centrifugering vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C. En väldefinierad organoidpellets bör vara synlig efter centrifugeringen. Om ett transparent gelskikt observeras ovanför cellpelleten (rester av löslig BMM) (figur 1B), fortsätt med följande steg.
      1. Blanda supernatanten och cellpelleten och tillsätt en lika stor volym BMM-dissociationslösning i röret. Blanda försiktigt och förvara på is i ytterligare 10 minuter och fortsätt till centrifugering vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C.
      2. Upprepa vid behov steg 6.2.3.1 tills inga lösliga BMM-rester finns.
    4. Kassera supernatanten och återsuspendera organoidpelleten med organoid digestionslösning (se steg 1.5). Använd en tillräcklig volym organoid matsmältningslösning för att säkerställa fullständig nedsänkning av pelleten. 2 ml lösning är lämplig för cirka 2 400–12 000 medelstora organoider (figur 1D, postsådd). Inkubera vid 37°C i 1-3 min.
    5. Lägg till Advanced DMEM/F-12 i röret för att stoppa den enzymatiska reaktionen. Använd fyra gånger volymen av den använda matsmältningslösningen. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
    6. Aspirera supernatanten och återsuspendera organoidfragmenten pellets i ett komplett organoidtillväxtmedium kompletterat med 5 μM CHIR99021 och 10 μM Y-27632 för att uppnå 8 miljoner celler / ml. Bered 360 μL alikvoter av suspensionen i sterila 1,5 ml lågproteinbindande rör för att förhindra minskning av celltätheten på grund av fastsättning på väggarna.
    7. Ta bort mediet från den övre kanalen på de belagda chipsen. Tillsätt 30 μL cellsuspension i den övre kanalen på varje chip. Inkubera chipsen över natten i en 37 ° C inkubator så att organoidfragmenten kan fästa vid det ECM-belagda membranet (figur 1D).

7. Dynamisk odling av tarmchip - initiering och underhåll av flödes- och peristaltikliknande rörelser

  1. Förberedelse och avgasning av media
    1. För att upprätthålla konstant laminärt flöde genom chipet, låt medietemperaturen balansera till rumstemperatur och utsätt den sedan för vakuumdriven filtrering i 10 minuter med hjälp av en vakuumpump och PVDF-filter koniska rör (mediaavgasning).
  2. Grundning av bärbara moduler
    OBS: Bärbara moduler är reservoarer som fungerar som ett gränssnitt mellan chipsen och odlingsmodulen som möjliggör upprepad provtagning och dosering av media.
    1. Öppna de bärbara modulerna i BSC och placera dem på odlingsmodulbrickorna, som är specialbehållare för inriktning av de bärbara modulerna.
    2. Tillsätt 3 ml förjämförklart komplett organoidtillväxtmedium kompletterat med 5 μM CHIR99021 och 10 μM Y-27632 till den övre inloppsbehållaren och 3 ml pre-ekvilibrat endotelcellstillväxtmedium i den nedre inloppsbehållaren (figur 1C). Tillsätt 300 μL av samma media i respektive utloppsbehållare.
    3. För brickorna till inkubatorn vid 37 °C och skjut in dem i odlingsmodulen (figur 1C). Använd kontrollerna på kulturmodulens skärm för att köra "Prime Cycle" (1 min lång). När statusfältet indikerar "Klar" är Prime Cycle klar. Upprepa Prime Cycle för att säkerställa att tillräckliga droppar har bildats för att framgångsrikt ansluta chipsen.
    4. Se till att alla bärbara moduler är grundade och har synliga mediedroppar.
  3. Introduktion av flöde
    OBS: Flöde initieras vanligtvis 24 timmar efter sådd av organoidfragment för att låta tarmepitelcellerna fästa ordentligt vid membranet.
    1. Tvätta båda kanalerna i de sådda chipsen med 200 μL av respektive media för att ta bort eventuella bubblor eller cellskräp. Lämna små droppar media på portarna efter tvätten. Skjut in spånbäraren i den bärbara modulen (figur 1C).
    2. Placera de bärbara modulerna på brickorna och sedan in i kulturmodulen. Använd kontrollerna på skärmen på odlingsmodulen för att programmera lämpliga odlingsförhållanden för organchip (flödeshastighet och sträckning).
      OBS: För standardkulturförhållanden för tolvfingertarmen och kolonchip, ställ in flödeshastigheten till 30 μL / h15 respektive 60 μL / h16 , för både de övre och nedre kanalerna. Flödeshastigheterna för varje kanal styrs dock oberoende av varandra och kan ställas in mellan 0-1 000 μl/h. Sprut- eller peristaltiska pumpar kan användas, istället för odlingsmoduler som presenteras här, för att införa laminärt flöde till mikrofluidiska chips. Upprättandet av tillförlitliga vätskeanslutningar mellan chips och pumpar med slangar och kontakter kan dock vara tekniskt utmanande när samtidig perfusion av flera chips krävs.
    3. Starta "Reglera cykeln" (2 h lång) som trycksätter odlingsmediet i bärbar modul och chip för att förhindra kärnbildning av luftbubblorna. Programmerade förhållanden kommer att återupptas efter avslutad regleringscykel.
  4. Medieförändring
    1. Förbered färska medier för båda kanalerna och fyll på dem var 48: e timme genom att tillsätta 2 ml färskt medium till inloppsreservoarerna (figur 1C).
    2. Pausa kulturmodulerna och ta med brickorna till BSC. Aspirera media i alla reservoarer och fyll på med färska medier. Ta tillbaka brickorna och starta om flödet.
  5. Introduktion av stretch
    OBS: Låt cellerna växa till 100% sammanflöde före applicering av cyklisk stam. Stretch introduceras vanligtvis 3 dagar efter sådd eller 48 h efter initiering av fluidisk kultur. 2% cyklisk stam vid frekvensen 0,2 eller 0,15 Hz, för tolvfingertarmen11 respektive kolon24 tarmchip, appliceras för den initiala 24 h. Det ökas sedan ytterligare till 10% under den återstående varaktigheten av tarmchipkulturen för att likna den cykliska stammen som upplevs av tarmepitelceller in vivo (figur 1D)25. Odlingsmodulen kan stödja applicering av 2% -12% cyklisk stam och frekvens på upp till 0,4 Hz.
    1. För att introducera stretch till den pågående fluidiska kulturen, pausa kulturmodulen. Använd kontrollerna på skärmen och ändra sträckinställningarna till 2 % stretch, 0,2 eller 0,15 Hz frekvens och starta om kulturmodulen.
    2. Efter 24 timmar, upprepa steg 7.5.1 för att applicera en 10% stretch, 0,2 eller 0,15 Hz frekvens.

8. CYP450-induktion med prototypiska CYP-inducerare i tolvfingertarmschipet

OBS: Induktionsanalysen cytokrom P450 (CYP450) gör det möjligt att bedöma om testföreningen ökar mRNA-nivåerna och / eller katalytisk aktivitet hos specifika CYP450-enzymer. Här beskriver vi protokollet för utvärdering av CYP3A4-induktion av industristandarden och regulator rekommenderade in vitro CYP-inducerare , Rifampicin (RIF) och 1,2-dihydroxi vitamin D3 (VD3). Den presenterade metoden kan användas för att identifiera potentialen hos olika testföreningar att inducera olika isoformer av CYP450 i mänsklig tarmvävnad. Specifika uppsättningar primers och sondsubstrat måste väljas för varje enzymisoform som ska utvärderas.

  1. Exponering för CYP-inducerare
    1. Förbered lagerlösningar av 20 mM RIF, 100 mM VD3 och 200 mM testosteron (materialtabell) med steril DMSO.
      VARNING: Testosteron är ett schema III kontrollerat ämne. Följ regulatoriska rutiner vid hantering.
    2. Förbered doseringsmedia med CYP-inducerare genom att späda stamlösningarna i komplett organoidtillväxtmedium och endotelcellstillväxtmedium för att uppnå 20 μM RIF, 100 nmol / L VD3. Förbered fordonskontroll genom att späda dmso i respektive media för att uppnå 0,1% av DMSO.
    3. Pausa kulturmodulen och ta med brickorna till BSC. Byt ut mediet i alla inloppsbehållare mot 2 ml doseringsmedia med inducerare eller fordonskontroll. Sätt tillbaka de bärbara modulerna till kulturmodulen och starta om flödet vid 30 μl/h.
    4. Byt ut mediet mot inducerande lösning efter 24 timmar och upprepa steg 8.1.2-8.1.3. Inducerande lösningar bör beredas färska dagligen och fyllas på var 24: e timme under experimentets gång, vilket vanligtvis är 48-72 h långt.
  2. Inkubation med ett prototypiskt substrat (Testosteron)
    1. På skördedagen, förbered sondsubstratlösningen av testosteron tillsammans med motsvarande inducerare i Advanced DMEM / F12 för att ge en slutlig koncentration på 200 μM. Utelämna tillsatsen av serumet till media eftersom detta kan störa LCMS-analysen.
    2. Ta brickorna till BSC och aspirera doseringsmediet från alla reservoarer. Tvätta och byt ut de övre och nedre inloppsreservoarerna mot varmt Avancerat DMEM/F12 medium respektive endotelcellstillväxtmedium.
    3. Ta bort tvättmediet från behållarna och ersätt det med 1 ml sondsubstratlösning, beredd i steg 8.2.1. Perfuse chipsen med en hög flödeshastighet på 1 000 μL /h i 5 minuter och aspirera både övre och nedre utloppsbehållare. Sätt tillbaka chipsen i odlingsmodulen och inkubera i 1 timme under det konstanta flödet på 300 μl/h.
  3. Analys av data
    1. Provinsamling för LCMS-analys
      1. Alikvot 200 μL stopplösning innehållande acetonitril med 0,1% myrsyra i förmärkta 1,5 ml rör och lägg dem på is. Sammansättningen av LCMS-stopplösning kan variera beroende på substratet som behöver analyseras.
      2. När 1 h av behandlingen är klar, stoppa flödet och ta tillbaka brickorna till BSC. Samla upp 100 μL avloppsvatten från den övre utloppsbehållaren och tillsätt det till motsvarande rör som innehåller stopplösningen (figur 2A). Placera rören omedelbart på torris. Förvara proverna vid -80 °C innan du fortsätter till analys.
      3. Extrahera och analysera prover med hjälp av antingen HPLC- eller LC-MS / MS-tekniker, övervaka bildandet av metabolit-6β-hydroxitestosteron (6β-OH-T). CYP-enzymaktivitet kan uttryckas som pmol/min/mg protein där pmol avser mängden metabolit (6β-OH-T) som bildas under reaktionen. Det totala proteininnehållet per chip (protein; mg) bestäms genom att utföra en Bradford-analys som beskrivs i steg 8.3.2.
        Equation 1
        Vikinduktionsaktiviteten beräknas med: CYP-aktivitet (inducerad) / CYP-aktivitet (vehikel).
      4. Om du samlar in prover för mRNA-analys, se steg 8.3.3.
    2. Lys av cellerna för proteinuttrycksanalys
      OBS: Proteinutvinning från celler on-chip utförs med hjälp av en proteinlysbuffert, kompletterad med proteas- och fosfatashämmare (materialtabell). Extraherat protein kvantifieras sedan med hjälp av Bradford-analysen och används i nedströmsanalys.
      1. Ta bort chipsen från bärbara moduler och lägg dem i en petriskål. Tvätta båda kanalerna med 200 μL steril DPBS.
      2. Blockera det nedre kanalutloppet med en 200 μL filterpipettspets. Perfusera 50 μL av dissociationslösningen genom bottenkanalen och inkubera i 2 min vid rumstemperatur.
      3. Inspektera för att bekräfta fullständig lossning av endotelcellerna. Pipettera upp och ner 1-2 gånger och ta bort dissociationslösningen från kanalen. Upprepa tvätten.
      4. Blockera det övre kanalutloppet med en 200 μL filterpipettspets. Perfuse 75 μL proteinlysbuffert genom den övre kanalen. Låt pipettspetsen sättas in för att blockera det övre kanalinloppet och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. Pipettera upp och ner 5-10 gånger och samla celllysaterna i ett förmärkt 1,5 ml rör.
      5. Upprepa steg 8.3.2.4. tills fullständig avlägsnande av celler observeras. Samla celllysaterna i samma 1,5 ml rör och förvara dem vid -80 °C tills de analyseras.
      6. Extrahera proteinfraktionen enligt standardmetoder och kvantifiera totalt protein med hjälp av Bradford-analysen (materialtabell).
    3. Lys av cellerna för genuttrycksanalys
      OBS: On-chip celllys för RNA-extraktion kan uppnås med hjälp av en RNA-lysbuffert, kompletterad med 0,1% 2-merkaptoetanol (materialtabell). Alternativt kan en fenolbaserad RNA-lysbuffert användas om höga utbyten av högkvalitativt RNA som är lämpligt för NGS- och mikroarrayanalys krävs.
      1. Följ steg 8.3.2.1 till 8.3.2.2 för att förbereda tarmchip för lys.
      2. Blockera utloppet på den övre kanalen med en 200 μL filterpipettspets. Perfuse 150 μL RNA-lysbuffert genom den övre kanalen. Låt pipettspetsen vara isatt för att blockera inloppet till den övre kanalen. Inkubera i 2 min vid rumstemperatur. För lys med användning av en fenolbaserad RNA-lysbuffert, använd 350 μL av reagenset.
      3. Pipettera upp och ner 5-10 gånger och samla celllysaterna i ett förmärkt 1,5 ml rör. Upprepa steget med ytterligare 150 μL RNA-lysbuffert och samla in. Förvara celllysaterna vid -80 °C tills de analyserats. Vid efterföljande RNA-sekvenseringsanalys, fortsätt med analysen inom 1 månad efter lysning.
      4. Extrahera totalt RNA från celllysaten med hjälp av ett RNA-reningssats.
      5. Omvänd transkribering till cDNA med hjälp av ett omvänd transkriptaskit och utför PCR i realtid med en PCR-cykler i realtid och lämpliga primers och buffert. Kvantifiera resultaten med 2-ΔΔCt-metoden .

9. Störning av epitelbarriären med proinflammatoriska cytokiner i tjocktarmschip

OBS: Detta protokoll beskriver störning av tarmepitelbarriären av cytokininterferon gamma (IFNγ)26,27,28,29. Cytokinet doseras i den nedre kanalen av kolonchipet med tanke på det basolaterala uttrycket av IFNγ-receptorn på tarmepitelceller.  Den proinflammatoriska stimulansen introduceras i chipet på dag 5 i kulturen, så snartP-appen har stabiliserats under 0,5 x 10-6 cm / s. En liknande doseringsregim kan användas för andra proinflammatoriska cytokiner och barriärstörande medel.

  1. Stimulering med IFNγ
    1. Bered en stamlösning på 100 μg/ml av IFNγ (materialtabell) i sterilt cellodlingsvatten. Förvara stamlösningen vid -80 °C under experimentets gång. Använd alltid ett nytt lager IFNγ för varje experiment och undvik mer än tre frys- och upptiningscykler.
    2. Förbered IFNγ doseringslösning genom utspädning av stamlösning i avgasat endotelcellstillväxtmedium för att uppnå en slutlig koncentration på 10-100 ng / ml.
    3. Ta brickorna till BSC och ta bort mediet från bottenkanalens inloppsbehållare och byt ut det med 3 ml av IFNγ-mediet. Uppdatera IFNγ-doseringsmediet dagligen.
    4. Placera brickorna i odlingsmodulen och genomvattna flisen med en hög flödeshastighet på 1 000 μl/h i 5 minuter för att påbörja IFNγ-behandling. Växla tillbaka flödeshastigheten till 60 μl/h och fortsätt den fluidiska kulturen.
  2. Analys av data
    1. Bedömning av epitelbarriärfunktionen. Epitelial skenbar permeabilitet (P-app), eller barriärfunktion, kan mätas vid olika tidpunkter i kulturen efter behandling med IFNγ, i avloppsmediet i båda kanalernas inlopps- och utloppsreservoarer. Det fluorescerande spårämnet bör läggas till det översta kanalorganoidtillväxtmediet 4 timmar före bedömningen avP-appen. Vanligtvis används 3 kDa Dextran Cascade Blue som fluorescerande spårämne och tillsätts i mediet 24 timmar före.
      1. Pausa kulturmodulen och ta med brickorna till BSC.
      2. Märk och förbered en 96-brunnars svartväggig platta med 100 μL DPBS per brunn. Använd en 200 μL flerkanalspipett och samla upp och tillsätt 50 μL avloppsvatten från alla reservoarer till respektive brunnar (figur 2B).
      3. För att förbereda standardkurvan, späd mediet som innehåller 100 μg/ml 3 kDa dextran Cascade Blue 1:3 i DPBS. Därefter utföra seriella utspädningar med hjälp av en trefaldig utspädning av endotelcelltillväxtmedium i DPBS.
      4. Läs fluorescensen vid 375 nm excitation och 420 nm emission med hjälp av en plattläsare. Använd de uppmätta OD-värdena för att beräkna skenbar permeabilitet (P-app) enligt följande:
        Equation 2
    2. Immunofluorescensfärgning av celler på chip
      1. Tvätta med 200 μL DPBS för varje kanal, tre gånger.
      2. Perfuse 200 μL av fixeringslösningen (4% PFA i DPBS) i varje kanal. Inkubera i 15 min vid rumstemperatur.
      3. Upprepa tvättsteg 9.2.2.1. I detta skede kan tvättade chips förvaras i upp till 7 dagar vid 4 °C.
      4. Permeabilisera cellerna med 200 μL permeabiliseringslösning (0,1% Triton-X 100 i 10% normalt åsneserum (NDS) i DPBS) för varje kanal. Inkubera i 30 min vid rumstemperatur. Upprepa tvättsteg 9.2.2.1.
      5. Blockera cellerna på chipet genom att använda 200 μL blockerande lösning (10% NDS i DPBS) för varje kanal. Inkubera i 1 h vid rumstemperatur.
      6. Späd de primära antikropparna i antikroppslösning (5% NDS i DPBS) enligt följande: anti-Zonula Occludens 1 (ZO-1) (1:100, epiteltät korsningsmarkör), anti-Occludin (1:100, epiteltät korsningsmarkör), anti-Claudin 4 (1:100, epiteltät korsningsmarkör), anti-E-kadherin (1:100, epitelial vidhäftande korsningsmarkör (materialtabell). Perfusera 200 μL av den primära antikroppslösningen genom varje kanal och inkubera över natten vid 4 °C. Upprepa tvättsteg 9.2.2.1.
      7. Späd de sekundära antikropparna i antikroppslösning (1:300, 5% NDS i DPBS). Perfuse 200 μL av denna lösning genom varje kanal och inkubera i 2 timmar vid rumstemperatur. Upprepa tvättsteg 9.2.2.1. Om så önskas kan falloidin, en cytoskelettmarkör, tillsättas till den sekundära antikroppslösningen.
      8. Förbered en 50 μg/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindollösning (DAPI) i DPBS och använd den för att genomslå 200 μL genom varje kanal. Inkubera vid rumstemperatur i 15 min. Upprepa tvättsteget. Vid denna tidpunkt kan färgade marker förvaras i upp till 14 dagar vid 4 °C.
    3. Bedömning av Caspase 3-klyvning
      1. Isolera och kvantifiera den totala mängden protein i epitelceller enligt beskrivningen i steg 8.3.2. Utelämna tvättsteget 8.3.2.1. Späd proverna med DPBS till en slutlig koncentration på 400 μg/ml.
      2. Kvantifiera nivåerna av total och klyvd kaspas 3 med hjälp av caspase 3-detekteringssats enligt tillverkarens protokoll.
    4. Bedömning av proinflammatorisk cytokinsekretion
      1. Använd avloppsvatten som samlats in från utloppet från båda kanalerna i kolonchipet för att kvantifiera utsöndrade proinflammatoriska cytokiner i akut fas, enligt protokoll från tillverkaren. Utför en 5-faldig utspädning för V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit och en tvåfaldig utspädning för V-PLEX Human Proinflammatory Panel II.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1D sammanfattar tidslinjen för tarmchipkulturen och illustrerar tarmens endotelceller och organoider före och vid sådd på chipet. Dessutom visar den de distinkta morfologiska skillnaderna mellan tolvfingertarmen och kolonchipsen, framhävda av närvaron av de villi-liknande formationerna i tolvfingertarmschipet och representativa för tunntarmsarkitekturen.

Figur 3A,B visar de vikiga CYP3A4-induktionssvaren i tolvfingertarmschipet från tre olika organoiddonatorer. Chipsen exponerades för 20 μM RIF eller 100 nM VD3 i 48 timmar och användes för att bedöma mRNA-nivåerna (A) och/eller den vikkatalytiska aktiviteten (B) för CYP450-enzymet. Ökade nivåer av testosteronmetabolit, 6β-hydroxitestosteron (6β-OH-T), i överensstämmelse med det förhöjda CYP3A4 mRNA-genuttrycket observerades i tolvfingertarmschipet exponerat för RIF och VD3 vilket indikerar lämpliga induktionssvar hos alla tre testade givare. Medlen ± SEM av n = 3 biologiskt oberoende chips visas.

Figur 4 visar de representativa resultaten för modellering av det läckande tarmsyndromet i tjocktarmschipet, inklusive (A,C) förändringar i epitelcellsmorfologi och tät korsningsintegritet, (B) minskning av barriärfunktionen, (D) induktion av apoptos och (E) ökad cytokinsekretion som svar på IFNγ-behandlingen.

Figur 4A visar representativa ljusfältsbilder av kontroll- och IFNγ-behandlade (50 ng/ml, 48 h) epiteliala monolager av kolonchipet. Chipsen avlägsnades från odlingsmodulen och epitelmorfologin bedömdes dagligen under mikroskopet. Bilder förvärvades med hjälp av ett ljusfältmikroskop och ett 10x mål. Kolonchips behandlade med IFNγ visar en komprometterad cellmorfologi och förlust av det kolumna epitelet.

Figur 4B visar ett representativt resultat av den skenbara permeabilitetsanalysen som utförts på kolonchips odlade under baslinjeförhållanden eller vid stimulering med IFNγ. 3 kDa Dextran Cascade Blue tracer tillsattes till den övre kanalbehållaren till en slutlig koncentration av 100 μg / ml. IFNγ vid en slutlig koncentration på 50 ng/ml doserades i den nedre kanalen på dag 5 i kulturen. Flisen perfuserades vid 60 ml/h. Därefter samlades media dagligen (upp till dag 72 h efter exponering) från inlopps- och utloppsreservoarer i både topp- och bottenkanalerna. 50 μl av varje prov samlades in, bearbetades enligt beskrivningen i steg 9.2.1 i protokollet och undersöktes med avseende på fluorescens vid 375–420 nm med hjälp av en plattläsare. En signifikant ökning av epitelial paracellulär permeabilitet observerades efter 48 timmars IFNγ-stimulering.

Figur 4C visar representativa immunofluorescerande bilder av epitelialtäta (Zonula Occludens 1 - ZO-1, Occludin, Claudin-4) och adherens (E-cadherin) korsningar i kontroll och IFNγ-behandlade (50 ng / ml, 48 h) kolonchip. Chipsen fixerades med 4% paraformaldehyd (PFA) i 15 minuter vid rumstemperatur och bearbetades vidare enligt beskrivningen i steg 9.2.2 i protokollet. Bilder förvärvades med hjälp av ett konfokalmikroskop och 20x långdistansmål och bearbetades med Fiji version 2.0 enligt standardprotokoll. Behandling med IFNγ utlöser förskjutning av ZO-1 och Claudin-4 och internalisering av Occludin och E-cadherin, vilket framgår av den ökade cytoplasmatiska signalen.

Figur 4D representerar tidsförloppet för Caspase 3-klyvning i kolonchip som svar på 50 ng / ml IFNγ som indikerar apoptosaktivering. Epitelceller lyserades på chipsen och proteinprover renades enligt standardmetoder. Det intracellulära innehållet i den totala och klyvda Caspase 3 mättes enligt beskrivningen i steg 9.2.3 i protokollet. IFNγ inducerar aktivering av apoptos, som beskrivits tidigare29, i kolonepitelcellerna odlade på chipet, efter 48 timmars stimulering.

Figur 4E visar tidsförloppet för cytokinets utsöndring från tjocktarmschipet vid stimulering med 50 ng/ml IFNγ. 200 μL avloppsmedier samlades dagligen upp från utloppsreservoarerna i både topp- och bottenkanaler. Spillvattenprover lagrades vid -80 °C och 24 timmar innan analysen tinades över natten vid 4 °C. Cytokinnivåerna i chipodlingsmediet bedömdes med hjälp av Meso Scale Discovery-teknik enligt beskrivningen i steg 9.2.4 i protokollet. IFNγ inducerade en polariserad utsöndring av proinflammatoriska molekyler i kolonchipet, vilket framgår av den basolaterala utsöndringen av vaskulär celladhesionsprotein 1 (VCAM-1) och Interleukin 6 (IL-6) och den apikala utsöndringen av intercellulär vidhäftningsmolekyl 1 (ICAM-1) och serumamyloidprotein A (SAA). Serumnivåer av de lösliga formerna av VCAM-1, ICAM-1, IL-6 och SAA används i kliniska laboratorier som en indikator på inflammation30,31.

Figure 1
Figur 1: Etablering avtarmchipet 15,16. (A) Schematisk över chipaktivering och beläggning. Kortfattat placeras chipsen i en spånvagga, perfuseras med ER1-lösning och aktiveras under UV-ljus. Därefter tvättas chipsen med ER2 och DPBS. Slutligen beläggs chipsen med en iskall ECM-lösning, specifik för varje celltyp, och inkuberas över natten vid 37 ° C. (B) Schematisk som visar processen att införa organoider i chipet. Organoider överförs från 24-brunnsplattan till ett koniskt rör och inkuberas på is i närvaro av BMM-dissociationslösningen för att återvinna organoider från den solubiliserade BMM. Organoid suspension centrifugeras sedan och utvärderas med avseende på närvaron av lösliga BMM-rester. Om ett transparent lager av BMM fortfarande är synligt ovanför cellpelleten, bör processen upprepas. Om en väldefinierad pellet observeras utan synliga gelrester dissocieras organoider enzymatiskt och införs i chipets övre kanal (blå). Chipets bottenkanal (magenta) är sådd med vävnadsspecifika mikrovaskulära endotelceller. (C) Schematisk som visar anslutningen av chipsen till odlingsmodulen, som stöder medieflöde och cyklisk peristaltikliknande sträckning. Primingcykeln möjliggör generering av cellodlingsmediet droppar över chipportarna och i slutet av de bärbara modulmotstånden. Detta säkerställer skapandet av vätske-vätskegränssnittet mellan chipet och den bärbara modulen, vilket underlättar att chipet glider in i modulen och deras säkra anslutning. Slutligen placeras de bärbara modulerna i brickor och brickor sätts in i kulturmodulen. (D) Experimentell tidslinje som belyser de viktigaste stegen för etableringen av den biopsi-härledda tarmchipplattformen, inklusive tolvfingertarmen och tjocktarmschip. Brightfield-bilder illustrerar endotel- och organoid-härledda celler vid dag 0, före och efter sådd i chipet, liksom bildandet av sammanflödes- och 3D-epitelvävnad vid dag 8 av chipkulturen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Insamling av avloppsvatten från tarmchipet. Media samlas upp från utloppsreservoarerna i den övre och nedre kanalen och lagras vid -80 °C tills ytterligare ELISA- eller LC-MS / LC-MS / MS-analys. (B) Schematisk som visar insamlingen av avloppsvattenprover med hjälp av en flerkanalig pipett och deras överföring till en 96-brunnad svartväggig platta för nedströmsbedömning av epitelial skenbar permeabilitet (P-app). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: CYP3A4-induktion i tolvfingertarmschipet15. (A) Induktion av CYP3A4 mRNA-nivåer i tolvfingertarmschip med 48 timmars exponering för 20 μM RIF och 100 nM VD3. Genomsnittlig ± SEM, N = 3 chips /tillstånd / givare, tvåvägs ANOVA, Tukeys post hoc-test, **** p < 0,0001 (jämfört med DMSO-kontroller). (B) Induktion av CYP3A4-aktivitet i tolvfingertarmschipet exponerat för prototypiska inducerare enligt bedömning genom LC-MS / MS-kvantifiering av sondsubstratmetabolit: 6β-hydroxitestosteron. En signifikant ökning av CYP3A4-aktiviteten observerades i tolvfingertarmschipet behandlat med 20 μM RIF eller 100 nM VD3 i 48 timmar. Genomsnittlig ± SEM, N = 3 chips / tillstånd / givare, tvåvägs ANOVA, Tukeys post hoc-test, **** p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Störning av epitelbarriären i tjocktarmschipet med hjälp av IFNγ16. (A) Brightfield-bilder som visar epitelcellernas morfologi under baslinjeförhållanden och vid stimulering med 50 ng / ml IFNγ i 48 timmar. Skalstång: 100 μm. (B) Epitelbarriärens skenbara permeabilitet till 3 kDa Dextran under en 72-timmars stimulering med 50 ng/ml IFNγ. Genomsnittlig ± 95% CI, N = 5-9 chips / tillstånd, tvåvägs ANOVA, Tukeys post hoc-test, **** p < 0,0001. (C) Immunofluorescensbilder som visar störningen av epiteltäta och vidhäftande korsningar vid stimulering med 50 ng / ml IFNγ i 48 timmar. Zonula Occludens 1 (ZO-1) (röda) täta korsningar, E-cadherin (röd) vidhäftande korsningar, Occludin (röd) täta korsningar, Claudin-4 (röda) täta korsningar, 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (blå) kärnor. Skalstång: 50 μm. (D) Induktion av Caspase 3-klyvning i tjocktarmschip genom behandling med 50 ng/ ml IFNγ. Fyra olika tidpunkter bedömdes över 72 timmars exponering. Genomsnittlig ± 95% CI, N = 3-6 chips / tillstånd, tvåvägs ANOVA, Tukeys post hoc-test, **** p < 0,0001. (E) Ökad utsöndring av cytokiner: Vaskulär celladhesionsprotein 1 (VCAM-1) och Interleukin 6 (IL-6), i bottenkanalen, och Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) och Serum Amyloid protein A (SAA) i det övre kanalutflödet, under en 72 h stimulering av kolonchipet med 50 ng / ml IFNγ. Genomsnittlig ± 95% CI, N = 3 chips / tillstånd, tvåvägs ANOVA, Tukeys post hoc-test, *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001, ****p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kombinationen av organ-on-a-chip-teknik och tarmorganoider är lovande för noggrann modellering av människans tarmfysiologi och patofysiologi. Här tillhandahåller vi ett enkelt och robust steg-för-steg-protokoll (beskrivs i figur 1) för etablering av tarmchipet som innehåller biopsi-härledd tunntarms- eller kolonepitel och tarmmikrovaskulära endotelceller samodlade i en mikrofluidisk enhet. Denna chipbaserade simulering av människans tarm innehåller fysiologiska, luminala och vaskulära flödes- och peristaltikliknande rörelser. Dessutom beskriver vi procedurer för bedömning av kritiska tarmfunktioner, såsom läkemedelsmetabolism i tolvfingertarmschipet och barriärfunktion i tjocktarmschipet.

För att rekapitulera epitelial-endotelial cellulära interaktioner, som är väsentliga för upprätthållandet av tarmhomeostas och därför noggrann modellering av tarmvävnad på chip, är det viktigt att etablera funktionella och intakta cellmonolager på båda sidor av PDMS-membranet. Det första steget mot framgångsrik chipsådd är kemisk aktivering av PDMS-ytan som möjliggör utveckling av en stabil koppling mellan PDMS-ytan och ECM-proteiner. Felaktig aktivering kan hindra fastsättning av celler och resultera i bildandet av ofullständiga cellulära monolager. Aktiveringslösningen måste beredas färsk eftersom den är ljuskänslig och utsatt för nedbrytning. Under UV-aktivering och efterföljande ECM-beläggning är det viktigt att säkerställa en jämn fördelning av reagens inom varje kanal. Den specifika sammansättningen och koncentrationen av lösningar som används för att belägga de övre och nedre kanalerna har optimerats för att passa behoven hos epitel- respektive endotelcellerna. Om förändringar i tarmchipets cellulära sammansättning krävs kan ECM-förhållandena behöva optimeras igen för att uppnå optimala resultat.

Efter ECM-beläggning är det viktigt att så HIMEC vid hög cellsåddtäthet (8 x 106 celler / ml) för att erhålla ett komplett och homogent monolager på undersidan av PDMS-membranet. Om fullcellskonfluens inte uppnås, sammanflöde, rekommenderas det att ytterligare öka densiteten hos endotelcellsuspensionen under sådden eller att fördröja sådden av organoidfragment i chipets övre kanal tills HIMEC blir helt sammanflytande. Användning av fragmenterade organoider, snarare än suspension av enstaka celler erhållna genom enzymatisk matsmältning av organoider, visades tidigare förbättra framgången och reproducerbarheten av tarmmonolagerbildningen i tarmchip14. Därför rekommenderas det starkt att noggrant övervaka organoiduppslutningsprocessen för att säkerställa den optimala inkubationstiden med enzymet som resulterar i organoidfragment som består av cirka 10-30 celler (40-100 μm i storlek). Otillräcklig dissociation kan resultera i reformation av den cystiska organoidstrukturen i mikrofluidiska chips istället för det önskade monoskiktet. Dessutom är det viktigt att undvika överdriven organoid dissociation i enstaka celler som kan leda till minskad cellöverlevnad, återhämtning och misslyckande med att bilda sammanflytande monolager i chipet.

Införlivande av vätskeflöde (skjuvspänning) och cyklisk stam i tarmchipkulturen, som stöds med hjälp av odlingsmodulen, har visat sig förbättra bildandet av den funktionella tarmbarriären och främja den spontana utvecklingen av 3D-arkitekturen i epitelvävnaden13. Men när man utför mikrofluidiska experiment med användning av organs-on-chips är det viktigt att förvärma och avgasa cellodlingsmediet före användning för att undvika bildning av mikrobubblor i kanalerna som kan leda till cellulär stress eller till och med lossning från membranet.

Förutom de specifika applikationer som visas här kan tarmchipmodellen användas för att ta itu med en mängd olika vetenskapliga frågor, från grundläggande vetenskap till upptäckt och testning av nya läkemedel eller läkemedelsleveranstekniker. Det kan underlätta studier av mänsklig tarmutveckling, stamcellsmognad och epitelcellsfunktion; särskilt i samband med utvärdering av mekanikens roll i tarmvävnadens tillväxt och homeostas. Nya upptäckter avslöjade att dynamisk jämvikt i det friska tarmepitelet är beroende av dess förmåga att exakt samordna olika krafter som definierar krypt-villi-arkitektur, delar upp celltyper, direkt cellmigration och reglerar cellidentitet, proliferation och död i rymden och tiden32. Tarmchipet ger en möjlighet att bättre belysa samspelet mellan mekaniska krafter (t.ex. spänning eller skjuvspänning), cellöde och funktion för att svara på några av många fascinerande frågor som kvarstår inom det framväxande området tarmmekanobiologi. Dessutom kan det möjliggöra studier av avkännings- och tarmtransportprocesser tack vare närvaron av hormonutsöndrande enteroendokrina celler och korrekt lokalisering av olika näringstransportörer15,16. Tarmchipmodellen kan också modifieras för att införliva immunceller såväl som kommensala eller patogena mikroorganismer för studier av inflammatoriska tarmsjukdomar, värdpatogen och värd-mikrobiominteraktioner, samt för att exakt förutsäga toxiciteter utanför målet för immunonkologiska produkter, som tidigare visat 17,20,33,34,35.

Dessutom kan användningen av kliniska biopsiprover från individer med specifika genotypiska och fenotypiska egenskaper möjliggöra analys av patientspecifika sjukdomsmekanismer samt svar på terapier, vilket bidrar till att främja personlig medicin i framtiden.

Den största begränsningen med denna metod är att fragment från ett stort antal organoider (~ 60-80) krävs för att bilda ett sammanflytande tarmepitel på varje chip. Detta beror på att organoidfragment kräver sådd med hög densitet för att säkerställa att ett tillräckligt antal tarmstamceller är närvarande för att stödja den proliferativa expansionen av monolagret och upprättandet av en 3D-vävnadsarkitektur. Ett helt differentierat tarmepitel på ett chip har alla de viktigaste tarmepitelcelltyperna (absorberande enterocyter, Paneth-celler, bägareceller och enteroendokrina celler) och transkriptionsprofil som liknar in vivo-motsvarigheten . Den nuvarande modellen saknar dock fortfarande andra viktiga komponenter i den levande tarmen, inklusive tarmfibroblaster, bosatta immunceller (t.ex. makrofager, intraepiteliella lymfocyter och dendritiska celler) och det enteriska nervsystemet.

Även om detta är potentiella nackdelar har tidigare studier visat att kraften i Organ-on-a-Chip-tekniken ligger i dess förmåga att efterlikna den strukturella och funktionella komplexiteten hos mänskliga organ genom att gradvis integrera olika komponenter i in vivo-vävnader och deras mikromiljö en efter en36,37. Denna syntetiska biologiska metod för in vitro-vävnadsteknik ger ett sätt att studera bidraget från enskilda cellulära och molekylära komponenter till fysiologiska och patofysiologiska svar på organnivå på olika nivåer av systemkomplexitet. Dessutom möjliggör det att den biokemiska, genetiska och mikroskopiska analysen av de interagerande vävnaderna kan utföras individuellt och i realtid, vilket ger insikt i hur intercellulära signaler och vävnads-vävnadsinteraktioner bidrar till specifika beteenden på organnivå. En annan anmärkningsvärd egenskap hos tarmchipteknik är mångsidighet. Exakt kontroll över mikromiljöelement möjliggör finjustering av medieflödeshastigheter och töjningsparametrar för att reproducera naturliga krafter som upplevs av celler i människokroppen, såsom skjuvspänningen som känns av endotelcellerna som utsätts för blodflödet och de cykliska peristaltiska rörelserna i tarmvävnaden. Dessutom möjliggör synergistisk teknik av organoider och organ-på-chips skapandet av vaskulära organ-på-chips som representerar olika regioner i tarmvävnader som kan vara flytande kopplade till varandra för att studera fysiologiska interaktioner mellan tunn- och tjocktarmen. Således tror vi att tarmchipet representerar en överlägsen modell av tarmepitelet och kan hjälpa till att implementera 3R -principen (reduktion, förfining och ersättning) i grundvetenskap såväl som i den prekliniska och reglerande installationen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi och Magdalena Kasendra är nuvarande eller tidigare anställda i Emulate Inc. är det företag som tillverkar organchipanordningarna och har publicerat patent som är relevanta för det arbete som anges i denna artikel.

Acknowledgments

Vi tackar professor Mark Donowitz för att ha tillhandahållit de tarmbiopsi-härledda organoiderna och Brett Clair för att ha utformat de vetenskapliga illustrationerna av chip-, bärbar- och odlingsmodulen. Resten av de vetenskapliga illustrationerna genererades med hjälp av BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells AlphaBioRegen ALHE15 0.5 cells M/ml ; cryopreserved
colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells AlphaBioRegen ALHE16 0.5 cells M/ml ; cryopreserved
Biopsy-derived Human Duodenal Organoids John Hopkin's University - The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).
Biopsy-derived Human Colonic Organoids John Hopkin's University - The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).
Zoë CM-1™ Culture Module Emulate Inc. - Culture module
Orb-HM1™ Hub Module Emulate Inc. - 5% CO2, vacuum stretch, and power supply
Chip-S1™ Stretchable Chip Emulate Inc. - Organ-Chip
Pod™ Portable Modules Emulate Inc. - Portable module
UV Light Box Emulate Inc. - -
Chip Cradle Emulate Inc. - 1 per square culture dish
Steriflip®-HV Filters EMD Millipore SE1M003M00 0.45 μm PVDF filter
Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm) VWR 82051-068 -
Handheld vacuum aspirator Corning 4930  -
Aspirating pipettes Corning / Falcon 357558 2 mL, polystyrene, individually wrapped
Aspirating tips  - Sterile (autoclaved)
Serological pipettes  - 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile
Pipette P20, P200, P1000 and standard multichannel
Pipette tips  P20, P200, and P1000.
Conical tubes (Protein LoBind® Tubes) Eppendorf 0030122216; 0030122240 15 mL, 50 mL tubes
Eppendorf Tubes® lo-bind Eppendorf 022431081 1.5 mL tubes
96 wells black walled plate - - for epithelial permeability analysis
Microscope (with camera) - - For bright-field imaging
Water bath (or beads) - - Set to 37°C
Vacuum set-up  - - Minimum pressure: -70 kPa
Cell scrapers Biotium 220033
T75 flasks BD Falcon 353136 Cell culture flask
Emulate Reagent-1 (ER-1) Emulate Inc. - Chip coating solution
Emulate Reagent-2 (ER-2) Emulate Inc. - Chip coating solution
Dulbecco’s PBS (DPBS) Corning 21-031-CV 1X
Cell Culture Grade Water Corning MT25055CV
Trypan blue Sigma 93595 For cell counting
TryplE Express ThermoFisher Scientific 12604013 Organoids dissociation and endothelium cells detachment solution
Advanced DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 12634028 Medium
IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) Stem Cell technologies 06010 Organoid Growth Medium
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 Promocell C-22121 Endothelial medium
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F4135 Serum
Primocin™  InvivoGen ANT-PM-1 antimicrobial agent
Attachment Factor™ Cell Systems 4Z0-210 coating solution for flask
Matrigel - Growth Factor Reduced Corning 356231 Solubilized basement membrane matrix
Collagen IV Sigma C5533 ECM component
Fibronectin Corning 356008 ECM component
Y-27632 Stem Cell technologies 72304 organoid media supplement
CHIR99021 Reprocell 04-0004-10 organoid media supplement
Cell Recovery Solution Corning 354253 Basement mebrane matrix dissociationsolution
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9576 30%, Sterile
Cell Culture Grade Water Corning MT25055CV Sterile, Water
DMSO Sigma D2650 solvent
3KDa Dextran Cascade Blue Invitrogen D7132 10 mg powder
Rifampicin (RIF) Sigma Cat# R3501 CYP inducer
Testosterone hydrate Sigma T1500 CYP substrate
1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3) Sigma Cat# D1530 CYP inducer
Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid Sigma 159002 LCMS stop solution
IFNγ Peprotech 300-02
4% Paraformaldehyde (PFA) EMS 157-4 Fixative
Triton-X 100 Sigma T8787
Normal Donkey Serum (NDS) Sigma 566460
anti-Occludin ThermoFisher Scientific 33-1500 tight junctions marker
anti-Claudin 4 ThermoFisher Scientific 36-4800 tight junctions marker
anti-E-cadherin Abcam ab1416 epithelial adherens junctions marker
anti-VE-cadherin Abcam ab33168 endothelial adherent junctions marker
anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) Thermo Fischer 339194 tight junctions marker
DAPI ThermoFisher Scientific 62248 nuclear stain
2-mercaptoethanol Sigma M6250
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183020 RNA lysis, isolation and purification kit
SuperScript™ IV VILO™ Master Mix Invitrogen 11756050 reverse transcriptase kit
TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Applied Biosystems 4444557 qPCR reagent
QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System Applied Biosystems A28573 Real-time PCR cycler
18S primer ThermoFisher Scientific Hs99999901_s1 Eukaryotic 18S rRNA
CYP3A4 primer ThermoFisher Scientific Hs00604506_m1 Cytochrome  family 3 subfamily A member 4
Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit ThermoFisher Scientific 23236 Protein quantification kit
MSD Tris lysis buffer Meso Scale Diagnostics R60TX-3 Protein lysis buffer
Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit Meso Scale Diagnostics K15140D Caspase 3 detection kit
V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit Meso Scale Diagnostics K15198D
V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) Meso Scale Diagnostics K15053D
Zeiss LSM 880 Zeiss - Confocal microscope
Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 Zeiss - 20X long-distance objective lenses
Zeiss AXIOvert.A1 Zeiss - Brightfield microscope
Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 Zeiss - 10X objective lenses

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
  2. Okumura, R., Takeda, K. Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers. Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).
  3. Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. Cell death at the intestinal epithelial front line. FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).
  4. Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  5. Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).
  6. Yu, H., et al. The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology. Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  9. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).
  10. Durel, J. F., Nerurkar, N. L. Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis. Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).
  11. Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
  12. Xu, Y., et al. Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells. Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).
  13. Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation. PLoS One. 8 (7), 68761 (2013).
  14. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  15. Kasendra, M., et al. Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model. eLife. 9, 50135 (2020).
  16. Apostolou, A., et al. A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).
  17. Jalili-Firoozinezhad, S., et al. Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583 (2019).
  18. Yin, J., et al. Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).
  19. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  20. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43 (2019).
  21. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).
  22. Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation. Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).
  23. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  24. Sarna, S. K. Colonic motility: From bench side to bedside. Morgan & Claypool Life Sciences. , San Rafael (CA). (2010).
  25. Basson, M. D. Paradigms for mechanical signal transduction in the intestinal epithelium - category: Molecular, cell, and developmental biology. Digestion. 68 (4), 217-225 (2003).
  26. Wang, F., et al. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression. The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).
  27. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-Catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  28. Madara, J. L., Stafford, J. Interferon-γ directly affects barrier function of cultured intestinal epithelial monolayers. Journal of Clinical Investigation. 83 (2), 724-727 (1989).
  29. Bruewer, M., et al. Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent mechanisms. The Journal of Immunology. 171 (11), 6164-6172 (2003).
  30. Jones, S. C., et al. Adhesion molecules in inflammatory bowel disease. Gut. 36 (5), 724-730 (1995).
  31. Uhlar, C. M., Whitehead, A. S. Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant. European Journal of Biochemistry. 265 (2), 501-523 (1999).
  32. Pérez-González, C., Ceada, G., Matejčić, M., Trepat, X. Digesting the mechanobiology of the intestinal epithelium. Current Opinion in Genetics & Development. 72, 82-90 (2022).
  33. In, J., et al. Enterohemorrhagic escherichia coli reduces mucus and intermicrovillar bridges in human stem cell-derived colonoids. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (1), 48-62 (2016).
  34. Grassart, A., et al. Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection. Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).
  35. Kerns, S. J., et al. Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies. eLife. 10, 67106 (2021).
  36. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  37. Ingber, D. E. Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips. Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).

Tags

Bioteknik utgåva 183
Kombinera mänskliga organoider och organ-på-ett-chip-teknik för att modellera tarmregionspecifik funktionalitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kulkarni, G., Apostolou, A., Ewart,… More

Kulkarni, G., Apostolou, A., Ewart, L., Lucchesi, C., Kasendra, M. Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality. J. Vis. Exp. (183), e63724, doi:10.3791/63724 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter