Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Prøvepreparering for rask lipidanalyse i Drosophila Brain ved bruk av matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering massespektrometriavbildning

Published: July 14, 2022 doi: 10.3791/63930
Automatic Translation
*1,5,6, *1,2, *3, 1,4, 7, 1,4,5, 1,4,5, 8, 9,10, 2, 1
1Advanced Science Research Center, Neuroscience Initiative, the City University of New York, Graduate Center New York, 2Advanced Science Research Center, Structural Biology Initiative, the City University of New York, Graduate Center, 3National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 4The City College of New York, CUNY, 5Macaulay Honors College, CUNY, 6Graduate School of Public Health and Health Policy, The City University of New York, 7Princeton University, 8Ardrey Kell High School, 9The Borough of Manhattan Community College, CUNY, 10Gallatin School of Individualized Study, New York University
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne protokollen er å gi detaljert veiledning om riktig prøvepreparering for lipid- og metabolittanalyse i små vev, slik som Drosophila-hjernen , ved bruk av matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering (MALDI) massespektrometriavbildning.

Abstract

Lipidprofilering, eller lipidomikk, er en veletablert teknikk som brukes til å studere hele lipidinnholdet i en celle eller et vev. Informasjon ervervet fra lipidomikk er verdifull for å studere veiene som er involvert i utvikling, sykdom og cellulær metabolisme. Mange verktøy og instrumenteringer har hjulpet lipidomikkprosjekter, særlig ulike kombinasjoner av massespektrometri og væskekromatografiteknikker. Matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering massespektrometriavbildning (MALDI MSI) har nylig dukket opp som en kraftig bildebehandlingsteknikk som utfyller konvensjonelle tilnærminger. Denne nye teknikken gir unik informasjon om den romlige fordelingen av lipider i vevsrom, som tidligere var uoppnåelig uten bruk av overdreven modifikasjoner. Prøveprepareringen av MALDI MSI-tilnærmingen er kritisk og er derfor fokus for denne artikkelen. Dette papiret presenterer en rask lipidanalyse av et stort antall Drosophila-hjerner innebygd i optimal skjæretemperaturforbindelse (OCT) for å gi en detaljert protokoll for fremstilling av små vev for lipidanalyse eller metabolitt- og småmolekylanalyse gjennom MALDI MSI.

Introduction

Lipider er involvert i et bredt spekter av biologiske prosesser og kan grovt klassifiseres i fem kategorier basert på deres strukturelle mangfold: fettsyrer, triacylglyceroler (TAGs), fosfolipider, sterollipider og sfingolipider1. De grunnleggende funksjonene til lipider er å gi energikilder for biologiske prosesser (dvs. TAGs) og danne cellulære membraner (dvs. fosfolipider og kolesterol). Imidlertid har flere roller av lipider blitt notert i utvikling og sykdommer, og har blitt grundig studert i det biomedisinske feltet. For eksempel har rapporter vist at fettsyrer av forskjellig lengde kan ha unike terapeutiske roller. Korte fettsyrekjeder kan være involvert i forsvarsmekanismer mot autoimmune sykdommer, mellomlange fettsyrekjeder produserer metabolitter som kan redusere anfall, og lange fettsyrekjeder genererer metabolitter som kan brukes til å behandle metabolske forstyrrelser2. I nervesystemet har glia-avledet kolesterol og fosfolipider vist seg å være avgjørende for synaptogenese 3,4. Andre typer lipider har vist løfte i medisinske applikasjoner, inkludert sfingolipider som brukes i legemiddelleveringssystemer og sakkarolipider som brukes til å støtte immunsystemet 5,6. De mange rollene og potensielle terapeutiske anvendelser av lipider i det biomedisinske feltet har gjort lipidomikk - studiet av veier og interaksjoner av cellulære lipider - et kritisk og stadig viktigere felt.

Lipidomics bruker analytisk kjemi for å studere lipidomet i stor skala. De viktigste eksperimentelle metodene som brukes i lipidomikk er basert på massespektrometri (MS) kombinert med ulike kromatografi- og ionmobilitetsteknikker 7,8. Bruken av MS i området er fordelaktig på grunn av sin høye spesifisitet og følsomhet, anskaffelseshastighet og unike evner til å (1) oppdage lipider og lipidmetabolitter som forekommer selv ved lave og forbigående nivåer, (2) oppdage hundrevis av forskjellige lipidforbindelser i et enkelt eksperiment, (3) identifisere tidligere ukjente lipider, og (4) skille mellom lipidisomerer. Blant utviklingen innen MS, inkludert desorpsjonselektrosprayionisering (DESI), MALDI og sekundær ionmassespektrometri (SIMS), MALDI MSI har dukket opp som en kraftig avbildningsteknikk som utfyller konvensjonelle MS-baserte tilnærminger ved å gi unik informasjon om romlig fordeling av lipider i vevsrom 9,10.

Den typiske arbeidsflyten for lipidomikk består av prøvepreparering, datainnsamling ved hjelp av massespektrometriteknologi og dataanalyse11. Studien av lipider og metabolitter i prøver har ført til fremveksten av teknikker for å forstå de fysiologiske og patologiske forholdene i metabolske prosesser i organismer. Selv om det er viktig å forstå biologiske interaksjoner, gjør følsomheten til lipider og metabolitter dem vanskelige å avbilde og identifisere uten fargestoffer eller annen modifikasjon. Endringer i metabolittnivåer eller distribusjon kan føre til fenotypiske endringer. Et verktøy som brukes til metabolomisk profilering er MALDI MSI, en etikettfri, in situ avbildningsteknikk som er i stand til å oppdage hundrevis av molekyler samtidig. MALDI-avbildning muliggjør visualisering av metabolitter og lipider i prøver samtidig som de opprettholder deres integritet og romlige fordeling. Tidligere teknologi for lipidprofilering involverte bruk av radioaktive kjemikalier for å kartlegge lipider individuelt, mens MALDI-avbildning gir avkall på dette og muliggjør påvisning av en rekke lipider samtidig.

Lipidmetabolisme og homeostase spiller viktige funksjoner i cellefysiologi, for eksempel vedlikehold og utvikling av nervesystemet. Et viktig aspekt av nervesystemets lipidmetabolisme er lipidshuttlingen mellom nevroner og gliaceller, som er mediert av molekylære bærerlipoproteiner, inkludert svært lavt tetthet lipoprotein (VLDL), lavdensitetslipoproteiner (LDL) og høy tetthet lipoproteiner (HDL) 12. Lipoproteiner inneholder apolipoproteiner (Apo), som ApoB og ApoD, som fungerer som strukturelle blokker av lipidlast og som ligander for lipoproteinreseptorer. Neuron-glia crosstalk av lipider involverer flere spillere som glia-avledet ApoD, ApoE og ApoJ, og deres neuronale LDL-reseptorer (LDLR)13,14. I Drosophila er apolipophorin, medlem av ApoB-familien, en stor hemolymph lipidbærer15. Apolipophorin har to nært beslektede lipoforinreseptorer (LpRs), LpR1 og LpR2, som er homologer av pattedyr LDLR15,16. I tidligere studier ble det astrocyttutskilte lipocalin Glial Lazarillo (GLaz), en Drosophila-homolog av human ApoD, og dets nevronreseptor LpR1 oppdaget å kooperativt mediere neuron-glia lipid shuttling, og dermed regulere dendritmorfogenese17. Derfor ble det spekulert i at tapet av LpR1 ville føre til en reduksjon i det totale lipidinnholdet i Drosophila-hjernen. MALDI MSI vil være et egnet verktøy for å profilere lipidinnholdet i små vev av LpR1-/− mutante og villtype Drosophila-hjerner, som vist i denne studien.

Til tross for den økende populariteten til MALDI MSI, hindrer instrumentets høye kostnader og eksperimentelle kompleksitet ofte implementeringen i individuelle laboratorier. Dermed utføres de fleste MALDI MSI-studier ved hjelp av delte kjernefasiliteter. Som med andre anvendelser av MALDI MSI, er en forsiktig prøveprepareringsprosess for lipidomikk avgjørende for å oppnå pålitelige resultater. Men fordi prøvelysning vanligvis utføres i individuelle forskningslaboratorier, er det en mulighet for variasjon i MALDI MSI-oppkjøp. For å bekjempe dette, tar dette papiret sikte på å gi en detaljert protokoll for prøvepreparering av små biologiske prøver før MALDI MSI-måling ved hjelp av lipidanalyse av en stor gruppe voksne Drosophila-hjerner i positiv ionmodus som et eksempel11,17. Imidlertid er noen fosfolipidklasser og flertallet av små metabolitter gunstig detektert ved MALDI-avbildning i negativ ionmodus, som ble beskrevet tidligere11. Derfor, med disse to eksempelstudiene, håper vi å gi detaljerte prøveprepareringsprotokoller av forskjellige kombinasjoner: frittstående stort vev versus innebygd lite vev, tinemontering versus varmskyvmontering og positiv ionmodus versus negativ ionmodus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fly hodet embedding

MERK: Hele prosedyren tar ~ 45-60 min.

  1. Forbered det optimale skjæretemperaturmiddelstadiet (OCT-forbindelse) med en flat overflate.
    1. Tilsett OCT i et plastkryommol (15 mm x 15 mm x 5 mm) til halvparten av kryommens dybde og unngå bobledannelse. La formen stå på en flat overflate i flere minutter, og overfør den deretter til tørris.
    2. Hold kryommet flatt på tørrisen og la OCT danne en flat og jevn overflate. Vent til OCT er helt størknet i formen. Bruk de frosne OCT-trinnene umiddelbart eller oppbevar dem ved −80 °C.
  2. Bedøv voksne fluer ved hjelp av CO 2 (dvs. en CO2 pute).
    1. Forbered en petriskål som inneholder et stykke laboratorieserviett. Bruk vann til å fukte en del av servietten for å redusere statisk elektrisitet. Hold våtservietten halvt våt og halvt tørr.
    2. Under dissekering av omfang 1, bruk tang for å kutte fluehodet. Samle 4-5 hoder hver gang og legg dem på det tørre området på laboratorieservietten.
      MERK: Samlingen av 4-5 hoder tar ~ 2 minutter.
  3. Overfør OCT-stadiet fra tørris til disseksjonsomfanget.
    1. Ta OCT-stadiet fra tørris til mikroskop 2, overfør hodene umiddelbart til OCT-trinnet, og ordne dem raskt, noe som tar ~ 30 s for å unngå OCT-smelting. La ~ 1 mm tomt mellomrom rundt hver fluehjerne for å sikre tilstrekkelig støtte fra OCT og 4-5 mm tomt mellomrom fra kanten av blokken for å gi tilstrekkelig plass til å håndtere seksjonen. Hvis proboscis er for lang, fjern spissen; Hvis den ikke er for lang, hold den intakt. Sett OCT-stadiet tilbake på tørrisen og la det stå på i ~ 3 minutter for å sikre at OCT-stadiet forblir frosset og solid.
    2. Når OCT-stadiet er tilbake på tørrisen og venter på størkning, samle en ny runde med hoder. Gjenta trinn 1.2 og 1.3 for å overføre flere prøver til den gjenværende plassen på scenen.
      MERK: Åtte hoder er vanligvis forberedt for hver genotype, og fire genotyper brukes i ett OCT-stadium i dette laboratoriet.
    3. Bruk to disseksjonsmikroskoper, side om side, for å unngå å endre fokus og øke tiden det tar å overføre og ordne hodene på OCT-stadiet og for å redusere risikoen for at OCT-stadiet smelter.
  4. Etter at alle fluehodene er justert, la OCT-scenen sitte på tørrisen i ytterligere 5-10 min.
  5. Ta OCT-stadiet bort fra tørrisen, legg det på en flat overflate (benk), og tilsett deretter raskt en stor mengde OCT-forbindelse for å dekke alle prøvene og fyll hele kryommet, som tar ~ 3 s.
  6. Overfør kryommet umiddelbart tilbake til tørris og frys hele OCT-blokken som inneholder det innebygde vevet. La OCT-stadiet sitte på tørrisen i ytterligere 5-10 min. Merk prøvene i margen på cryomold.
  7. Oppbevar de frosne prøvene ved −80 °C til de er klare for porsjonering.

2. Kryoseksjonering av vevet

MERK: Når du håndterer indium tinnoksid (ITO) lysbilder, bruk hansker til enhver tid for å unngå vevsforurensning. Bruk av maske anbefales også for å unngå å puste direkte på lysbildet.

  1. Bekreft den ITO-belagte siden ved å teste ledningsevnen til ITO-lysbildene ved hjelp av et voltmeter satt til motstand. Merk siden med en motstandsmåling som den siden vevet skal festes til. Merk den og sett alltid en laboratorieserviett på bunnen av lysbildet for å unngå lysbildekontaminering.
  2. La vevet balansere i kryostatkammeret i 30-45 minutter.
    1. For å unngå smelting av OCT, plasser alle nødvendige verktøy som tang og en tynnspisset kunstnerbørste i kryostatkammeret på forhånd for å forkjøle dem.
  3. Rengjør kryostat, helst med 70% etanol. Tørk av rulleplaten og scenen og fjern brukte kniver. Bruk ekstra rene våtservietter for å sikre at etanolen har fordampet og at alle overflatene er tørre før seksjoneringen begynner.
  4. Juster temperaturen på kryostatkammeret og prøvehodet i henhold til vevstypen (f.eks. −14 °C for lever, −20 °C for muskler og −25 °C for hud10; −18 °C for fluehoder i denne protokollen).
  5. Monter vevet på prøveholderen ved hjelp av OCT. Vær forsiktig med å bruke nok OCT til å dekke bunnen av OCT-blokken og monter blokken så flatt som mulig.
  6. Plasser et rent blad i scenen og lås det. Plasser hodet på prøven mot trinnet etter behov for å oppnå ønsket skjærevinkel.
    1. Plasser prøveblokken i en retning der alle genotyper/behandlingsgrupper er plassert vertikalt mot bladet.
      MERK: Dette sikrer et konsekvent skjæreplan og unngår krysskontaminering fra forskjellige grupper. Hvis du kutter en annen blokk med vev, bytt til et nytt blad mellom prøvene for å forhindre krysskontaminering.
  7. Begynn å kutte i tykke seksjoner (50-100 μm) til interesseområdet (f.eks. Den ønskede regionen i hjernen) er funnet.
    1. Børst hele tiden av ekstra brikker med en forhåndskjølt artistbørste for å holde scenen ren.
  8. Endre tykkelsen på seksjonene til 10-12 μm når ønsket region er nådd.
    1. Juster kammertemperaturen litt etter behov. Still for eksempel inn en høyere temperatur hvis seksjonen har en tendens til å flasse eller falle fra hverandre lett.
      MERK: Den anbefalte temperaturen for OCT-blokker er -18 °C.
  9. Samle forsiktig den ønskede delen og fest den til ITO-lysbildet. Utfør denne operasjonen i kryostatkammeret.
    1. Ta et romtemperert ITO-lysbilde og plasser det over seksjonen, nærme deg seksjonen forsiktig og raskt for at seksjonen skal feste seg til lysbildet uten å etterlate spor på kryostatstadiet.
      MERK: OCT smelter og klamrer seg til lysbildet.
  10. Plasser lysbildet til side i et stativ eller laboratorieserviett utenfor kryostat mellom samlingene av flere seksjoner.
  11. Hvis sammenligning på tvers av forskjellige utvalg av samme kohort er ønsket, plasser seksjonene fra flere prøver på et enkelt lysbilde for samtidig analyse og minimal variasjon. Hvis det er nødvendig, skiller du dem fra to lysbilder, siden MALDI-målholderen har plass til to lysbilder i én kjøring.
  12. Transporter lysbildene i en vakuumboks til en tørkemiddel med tørkemiddel som bunnlag. Tørk lysbildene under et vakuum i 30-60 min.
    MERK: Alternativt, hvis laboratoriet ikke er utstyrt med en vakuumdesiccator, bør lysbildene holdes på -20 ° C gjennom hele prosessen til lagring ved -80 ° C innen 24 timer eller frakt på tørris for å unngå forringelse av lipider eller metabolitter.
  13. Fortsett til matriseavsetning. Bruk 2,5-dihydroksybenzoesyre (DHB) i metanol/vann (70/30, v/v) som matriks.
  14. Hvis lysbildene ikke kjøres umiddelbart, må du enten lagre lysbildene ved -80 °C (opptil 1 måned for fluehjerneseksjoner og 6 måneder for gnagerhjerneseksjoner), eller umiddelbart sende prøven til MALDI-kjerneanlegg med tilstrekkelig tørris. For optimal lagring og frakt, plasser lysbildene i en glidetransportør og forsegle åpningen sikkert med voksfilm. Forsegl med en glidelåspose, legg den i en annen glidelåspose som inneholder tørkemiddel, og merk utsiden.
    MERK: Se tidligere arbeid for de følgende trinnene i lysbildeskanning, matriseavsetning og MALDI-bildebehandlingsprosedyrer11.
  15. Utfør matriseavsetning ved hjelp av den automatiske HTX M5-matrikssprøyten og en 40 mg / ml løsning av DHB i metanol / vann (70/30, v / v). Spray matriksen med en tilpasset strømningshastighet på 0,12 ml/min og en dysetemperatur på 85 °C i 10 passeringer. Bruk et N2 gasstrykk på 10 psi.
    MERK: Hvis N2-gasstrykket i sprøyten senkes under 5 psi, vil en sikkerhetsmekanisme i sprøyten slå av varmeren umiddelbart for å unngå skade på sprøyten med en sprøytehastighet på 1,300 mm/min, 2 mm sporavstand, 3 l/min strømningshastighet og 40 mm dysehøyde.
  16. Bruk et MALDI time of flight (TOF) MS-instrument (se materialtabellen) i positiv ionemodus for å oppnå et massespektrum innenfor masseområdene fra m / z 50-1000.
    1. For å kalibrere instrumentet, spot 0,5 μL av rød fosforemulsjon i acetonitril på ITO-lysbildene og bruk spektrene til å kalibrere instrumentet i masseområdet 50-1000 m / z ved å bruke en kvadratisk kalibreringskurve2.
    2. Sett laserpunktdiametrene til Medium, da det er den modulerte stråleprofilen for 40 μm rasterbredde, og samle bildedata ved å summere 500 skudd med en laserrepetisjonshastighet på 1,000 Hz per matriseposisjon.
    3. Bruk programvare (se materialtabellen) til å registrere og behandle spektraldataene. Utfør bildedataanalyse ved hjelp av RMS-normalisering (root mean square) for å generere ionebilder ved en søppelbredde på ±0,10 Da. Juster spektrene til både OCT og hjernevev fra samme eksperiment ved hjelp av programvaren for å evaluere overlappende topper og ionundertrykkelsesforstyrrelsen til OCT (Supplemental Figure S1). Etter forsøket, behandle MALDI-lysbildene som inneholder vevsprøvene ved hematoksylin og eosin (H&E) farging, som tidligere beskrevet11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tapet av nevronreseptoren LpR1 av det astrocyttutskilte lipocalin Glial Lazarillo (GLaz), en Drosophila-homolog av human ApoD, ble antatt å kunne forårsake en reduksjon i det totale lipidinnholdet i Drosophila-hjernen. For å teste dette ble MALDI MSI brukt til å profilere lipidene i LpR1−/− mutante og villtype Drosophila-hjerner, som er utdypet nedenfor.

Forsøket ble utført i henhold til arbeidsflyten vist i figur 1. Voksne fluehjerner ble høstet som beskrevet ovenfor. De ble innebygd i OCT, og tørris ble brukt til å fryse OCT-blokken. OCT-vevsblokken ble kryoseksjon ved 12 μm tykkelse og ved −18 °C for både prøvehodet og kammeret. ITO-lysbilder med kryoseksjoner montert på dem ble uttørket i vakuum i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter ble matriseavsetning utført ved hjelp av den automatiske HTX M5-matrisesprøyten og en 40 mg / ml løsning av DHB i metanol / vann (70/30, v / v).

MALDI time of flight (TOF) MS Autoflex-instrumentet i positiv ionmodus oppnådde et massespektrum innenfor masseområdene fra 50-1000 m / z. Spekteret av både OCT og hjernevev fra samme eksperiment ble justert i SCiLS for å evaluere overlappende topper og ionundertrykkelsesinterferens av OCT (Supplemental Figure S1).

Resultatene i figur 2 viser utgangsbilder fra MALDI MSI dataanalyseprogramvare av utvalgte m / z-spektra der de valgte verdiene viste en signifikant forskjell i lipidfordeling mellom LpR1 knockout og villtype Drosophila. Skanningene viste en generell reduksjon i lipidinnholdet i LpR1−/−mutanten. Hvert spektrum ble analysert manuelt, og analyttidentifikasjon ble oppnådd ved kryssreferanse til METLIN-databaser og tidligere publiserte studier 3,4. Triacylglycerol (TAG) og fosfatidylglycerol (PG) ble sterkt uttrykt i kontrollhjerner sammenlignet med LpR1−/−mutanten (viser opptil 10 ganger endring i TAG). I tillegg ble diglyserol (DAG), fosfatidylkolin (PC) og fosfatidyl-etanolamin (PE) også minimalt uttrykt i LpR1−/− mutantgenotypen.

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt for MALDI-TOF massespektrometriavbildning. (A) Drosophila hjerner er justert i OCT plassert på toppen av tørris. (B-D) Vevsblokken kryoseksjoneres i 12 μm tykke seksjoner ved -15 °C. Seksjonen er flatet med en forkjølt børste og tinesmeltet på den ITO-belagte siden av et glassglass som holdes ved romtemperatur. (E) Lysbildet er merket med fiducial markører, belagt med matrise, og plassert i MALDI instrumentet. (F) MALDI-bildet av en Drosophila-hjerne oppnås ved 40 μm oppløsning ved bruk av DHB som matrise. Områdene med øyne (rød, m/z 370,2), hodevev (grønn, m/z 184,1) og hjerne (blå, m/z 788,6) vises i det overlagte flerkanalsbildet. (G) H&E-farging utføres på samme vevssnitt etter MALDI MSI. (H) Arbeidsflyten for prøvepreparering, lagring og transport. Skala barer = 500 μm (F, G). Forkortelser: MALDI-TOF = matriseassistert laserdesorpsjon/ioniseringstid for flyvning; OCT = optimal skjæretemperaturforbindelse; ITO = indium tinnoksid; DHB = 2,5,-dihydroksybenzoesyre; H&E = hematoksylin og eosin; MSI = massespektrometri bildebehandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Representative bilder fra MALDI MS-analyse som viser en generell reduksjon i lipidinnholdet i LpR1−/− mutanthjernen. Representative H&E-fargede voksne fluehjerneseksjoner vises (til venstre). Lipidartene, deres respektive m / z-verdier og skalaene til varmekartet er som angitt. Nederst vises den gjennomsnittlige reduksjonen i LpR1−/−mutanten sammenlignet med kontrollene fra minst fire biologiske replikasjoner som tall ved siden av pilene. Skala bar = 1 mm. Dette tallet er modifisert fra Yin et al.17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur S1: Massespektra av OCT og Drosophila hjernevev. Kryoseksjonene til Drosophila hjerne OCT-blokk fra figur 1 ble dekket jevnt med DHB-matrise før MALDI-avbildning. Massespekteret til den valgte blanke OCT-regionen og hjernevevsregionen fra både kontroll- og mutantfluer ble vist i området m/z 1-1000 og m/z 520-900 (lipidberiket). Forstyrrelsen av OCT er forbundet med både ionundertrykkelsesfenomener og overlappende signalproblemer. Forkortelser: OCT = optimal skjæretemperaturforbindelse; DHB = 2,5-dihydroksybenzoesyre; MALDI = matriseassistert laserdesorpsjon/ionisering. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som vist i studien om variasjonene i lipidsammensetningen i mutante og villtype Drosophila-hjerner, kan MALDI MSI være en verdifull etikettfri avbildningsteknikk for in situ-analyse av molekylære distribusjonsmønstre i organer av små insekter. Faktisk, fordi lipider fordeles i både hjernevev og fettlegemer i Drosophila-hoder, kan konvensjonelle lipidomikktilnærminger basert på væskekromatografi og massespektrometri (LC-MS) bare oppdage kombinerte signaler fra begge regioner når helhodeekstraksjon brukes. I stor grad er differensiell lipidomikkanalyse av underregioner i organer av et så lite insekt som Drosophila en svært arbeidskrevende og utfordrende oppgave for LC-MS-tilnærminger18. Det ville kreve disseksjon av disse regionene, noe som gir store utfordringer. I motsetning til dette gir MALDI MSI tilstrekkelig oppløsning for å skille forskjellige anatomiske strukturer, selv i den lille Drosophila-hjernen. Fordelen med et minimum av vevsbehov sammenlignet med konvensjonell LC-MS kan også brukes på dyrebare prøver som kliniske biopsier. Videre kan prøvelysbildene utarbeidet for MALDI MSI også undersøkes ved komplementære teknikker som TOF-SIMS og immunhistokjemi, noe som vil muliggjøre integrering av dataene hentet fra tverrfaglige tilnærminger19,20.

En av de viktigste trinnene i MALDI MSI er prøveprepareringen - den delen av eksperimentet som står for de fleste forskjellene i resultatene fra metabolomics-studier utført i forskjellige laboratorier21. Hovedmålet her er å gi en omfattende, men praktisk prøveprepareringsprotokoll for MALDI MSI-analyse av lipider og metabolitter i organismer så små som Drosophila-insekter i håp om å hjelpe forskere med implementering av MALDI MSI i sine studier fra grunnleggende biologi til translasjonsvitenskap.

I tillegg til forholdsregler for å minimere endringer i molekylære profiler (både overflod og romlig fordeling) som tidligere diskutert11, må flere andre praksiser tilpasses ved håndtering av små vev. For det første bør tiden mellom biologisk vevshøsting og frysing i OCT minimeres for å redusere sannsynligheten for postmortem iskemi21. For det andre bør man sørge for at et flatt stadium av OCT er forberedt før vevet legges inn i blokken, noe som er avgjørende for å ha seksjoner fra sammenlignbare plan over forskjellige vev under seksjonering. For det tredje trenger kutting av småskala biologisk vev eller dyrebare prøver tilstrekkelig praksis før forsøket. Mens OCT hjelper til med å kutte jevne seksjoner, kan det oppstå komplikasjoner når det gjelder vevkrølling eller flassing. For å bekjempe curling, bør man la seksjonen hvile på scenen i noen sekunder før du fjerner rulleplaten. Med to børster kan den ene brukes til å holde toppen av seksjonen fortsatt, mens den andre kan brukes til å brette ut seksjonen. Det må tas hensyn til å minimere kontakten med vevet ved primært å arbeide med kantene på blokkseksjonene. For det fjerde, selv om tinemonteringsmetoden kan brukes til færre fluehjerner (<10 hjerner), ville det være umulig å overføre en seksjon som inneholder et stort antall fluehjerner (>30 hjerner) til et kaldt ITO-lysbilde uten å miste et bemerkelsesverdig antall hjerner, som lett ville falle ut av blokkseksjonen når den ble løftet. Derfor, for rask analyse av et stort antall flyhjerner, må varmskyvemontering brukes. Spesielt vil temperaturforskjellen mellom OCT-delen og lysbildet føre til at seksjonen klamrer seg og fester seg til lysbildet veldig raskt. Derfor bør man ikke trykke det varme lysbildet mot seksjons- og kryostatstadiet; i stedet må man forsiktig og raskt nærme seg seksjonene for å la seksjonen feste seg til ITO-lysbildet uten å berøre kryostatstadiet. Vi observerte ingen merkbare spor av seksjonene som ble etterlatt på kryostatstadiet sammenlignet med tinemonteringsmetoden. For det femte er en jevn og fin avsetning av MALDI-matrise avgjørende for å oppnå sterk og nøyaktig romlig informasjon under oppkjøpet. Det anbefales å bruke et tomt lysbilde for å teste matriseavsetningen for riktig dekning før du fortsetter til lysbildet som inneholder prøven.

Med sin økende popularitet og fremskritt forventes MALDI MSI å nå en bredere base av brukere og bli et standardverktøy for molekylære massemålinger av analytter som aminosyrer, metabolitter, lipider, peptider og proteiner og andre små molekyler direkte ekstrahert fra biologiske vev10. Det har imidlertid sine egne begrensninger og utfordringer. Ved fremstilling av skjøre og småskala prøver for MALDI MSI, er innebyggingsmidler som OCT nødvendige for seksjonering. OCT inneholder imidlertid en kombinasjon av polymerer (poly (vinylalkohol), polyetylenglykerol og benzalkoniumklorid), som skaper et polymert bakgrunnssignal som kan forstyrre analyttsignalet22. Alternative innebyggingsforbindelser som gelatin og karboksymetylcellulose (CMC) har blitt rapportert å demonstrere mindre ionundertrykkelseseffekter. Gelatin viser mindre intense signaler som er mer spredt i lavmasseområdet 100-600 m / z20,23,24. CMC har også blitt brukt i MALDI MSI av Drosophila for å visualisere metabolitter som GABA, selv om det krever nedsenking av hodene i 70% etanol før innebygging for optimal vedheft25.

Til tross for OCTs tendens til signalundertrykkelse, fortsetter denne protokollen med bruk på grunn av OCTs overlegne evne til å gi pålitelig seksjonering av et stort antall prøver samtidig som hjernens morfologi bevares. Forskere har funnet ut at mens gelatin og CMC-seksjon godt ved høye tykkelser som 20 μm, er det bare OCT som er i stand til å produsere påfølgende 12 μm seksjoner pålitelig26. CMC og gelatin mangler den strukturelle integriteten og stramme grepet av vev som OCT gir, noe som setter grensen for antall små vev som fluehjerne som skal innkvarteres i en blokk26. Det har blitt rapportert at MS-signaler fra OCT-innebygde flyseksjoner er sammenlignbare med de som er innebygd i gelatin og CMC26. Våre upubliserte data indikerte også at varmmonterte, OCT-innebygde fluehjerneseksjoner genererte robuste lipidsignaler som kan sammenlignes med tinemontert gelatininnstøpt vev. Samlet sett, på grunn av OCTs overlegne evne til å bevare integriteten til vevsmorfologi og muliggjøre presis prøveseksjonering sammenlignet med andre innebyggingsforbindelser, er bruken med prøver av høy skjørhet, for eksempel arrays av Drosophila-hjerner , fortsatt et alternativ. I det scenariet bør bare den relative kvantifiseringen av å sammenligne prøver fra samme eksperiment, men ikke absolutt kvantifisering, gjøres. Med hensyn til vår rapporterte studie av Drosophila-modellen i lipidanalyse ble det konkludert med at fordelene med OCT oppveier begrensningene. I tillegg må forsøkseksperimenter utføres for å teste om MS-signalene til de målrettede analyttene vil bli maskert av OCT-signalene.

Videre må flere praksiser tilpasses for å minimere effekten av ioneundertrykkelse. For det første bør man behandle prøvene fra forskjellige grupper samtidig for å sikre samme grad av ioneundertrykkelse, hvis det er noen. For det andre, ved valg av interesseområde for MALDI-skanning, bør man unngå OCT-regionen og bare skissere vevsområdet. Til slutt bør et område med tom OCT velges for å bli skannet som den negative kontrollen for å ekskludere signalene fra OCT under dataanalyse.

Feltet lipidomikk dukket opp tidlig på 2000-tallet og har raskt avansert de siste årene, hovedsakelig på grunn av utviklingen innen massespektrometri, inkludert MALDI MSI27. Disse avanserte teknikkene har hjulpet til med å drive feltet mot biologiske og biomedisinske applikasjoner. For eksempel kan lipidomikk brukes i nevrologiske studier, da endringer i nivåer av hjernelipidhandel og sammensetning kan brukes som biomarkører for sykdom. I tillegg har lipidomikk ført til identifisering av nye signalmolekyler, utvikling av legemiddeleffekttester, oppdagelse av mekanismer som ligger til grunn for patofysiologiske forhold og mer28. Til tross for de bemerkelsesverdige prestasjonene som er gjort av feltet de siste årene, er det fortsatt områder som krever vekst. For eksempel er evnen til at et lipid skal kvantifiseres nøyaktig ved hjelp av dagens teknologi fortsatt under debatt29. I tillegg har den komplette kartleggingen av det cellulære lipidomet mye fremgang å gjøre. Det forventes at disse områdene, blant annet i feltet, vil oppleve betydelig vekst i årene som kommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.

Acknowledgments

Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy og Mayan Hein støttes av Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP). Jun Yin støttes av det intramurale forskningsprogrammet til National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137. Støtte til dette prosjektet ble gitt av en PSC-CUNY Award til Ye He og Rinat Abzalimov, finansiert av The Professional Staff Congress og The City University of New York.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) Millipore Sigma Aldrich 85707-1G-F
Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 Fisher Scientific NC9464347
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Fisher Scientific 14-373-65
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE Fisher Scientific 50-111-2302
autoflex speed MALDI-TOF MS system Bruker Daltonics Inc MALDI-TOF MS instrument
BD Syringe with Luer-Lok Tips Fisher Scientific 14-823-16E
BD Vacutainer General Use Syringe Needles Fisher Scientific 23-021-020
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG Fisher Scientific NC0380464
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics AC219095000
Epson Perfection V600 Photo Scanner Amazon Perfection V600
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer Fisher Scientific HS15986
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter Fisher Scientific 01-241-1
FlexImaging v3.0 Bruker Daltonics Inc Bruker MS imaging analysis software
HPLC Grade Methanol Fisher Scientific MMX04751
HPLC Grade Water Fisher Scientific W5-1
HTX M5 Sprayer HTX Technologies, LLC Automatic heated matrix sprayer
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
MSC Ziploc Freezer Bag Fisher Scientific 50-111-3769
SCiLS Lab (2015b) SCiLS Lab Advanced MALDI MSI data analysis software
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat Fisher Thermo Scientific 95-713-0
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator Fisher Scientific 08-642-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, J., et al. Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications. Biomolecules & Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).
  2. Augustin, K., et al. Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders. Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).
  3. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  4. Mauch, D. H., et al. Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol. Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).
  5. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).
  6. Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis. Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).
  7. Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).
  8. Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).
  9. Yang, K., Han, X. Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences. Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).
  10. Norris, J. L., Caprioli, R. M. Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research. Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).
  11. Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).
  12. Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).
  13. Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization. Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).
  14. Wang, H., Eckel, R. H. What are lipoproteins doing in the brain. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).
  15. Palm, W., et al. Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition. PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).
  16. Parra-Peralbo, E., Culi, J. Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism. PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).
  17. Yin, J., et al. Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling. Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).
  18. Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI. Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).
  19. Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining. Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).
  20. Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging. Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).
  21. Dienel, G. A. Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures. Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).
  22. Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation. Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).
  23. Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles. Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).
  24. Niehoff, A. C., et al. Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging. Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).
  25. Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head. Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).
  26. Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).
  27. Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).
  28. Han, X. Lipidomics for studying metabolism. Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).
  29. Wang, M., Wang, C., Han, X. Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why. Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).

Tags

Biologi utgave 185 MALDI MSI lipidprofilering Drosophila hjerne prøvepreparering massespektrometri
Prøvepreparering for rask lipidanalyse i <em>Drosophila</em> Brain ved bruk av matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering massespektrometriavbildning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y. X., Veerasammy, K., Yin,… More

Chen, Y. X., Veerasammy, K., Yin, J., Choetso, T., Zhong, T., Choudhury, M. A., Weng, C., Xu, E., Hein, M. A., Abzalimov, R., He, Y. Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging. J. Vis. Exp. (185), e63930, doi:10.3791/63930 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter