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Biology

Preparazione del campione per l'analisi rapida dei lipidi nel cervello della Drosophila utilizzando la spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice

Published: July 14, 2022 doi: 10.3791/63930
Automatic Translation
*1,5,6, *1,2, *3, 1,4, 7, 1,4,5, 1,4,5, 8, 9,10, 2, 1
1Advanced Science Research Center, Neuroscience Initiative, the City University of New York, Graduate Center New York, 2Advanced Science Research Center, Structural Biology Initiative, the City University of New York, Graduate Center, 3National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 4The City College of New York, CUNY, 5Macaulay Honors College, CUNY, 6Graduate School of Public Health and Health Policy, The City University of New York, 7Princeton University, 8Ardrey Kell High School, 9The Borough of Manhattan Community College, CUNY, 10Gallatin School of Individualized Study, New York University
* These authors contributed equally

Summary

Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire una guida dettagliata sulla corretta preparazione del campione per l'analisi dei lipidi e dei metaboliti in piccoli tessuti, come il cervello di Drosophila , utilizzando l'imaging con spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI).

Abstract

Il profilo lipidico, o lipidomica, è una tecnica consolidata utilizzata per studiare l'intero contenuto lipidico di una cellula o di un tessuto. Le informazioni acquisite dalla lipidomica sono preziose per studiare i percorsi coinvolti nello sviluppo, nella malattia e nel metabolismo cellulare. Molti strumenti e strumentazioni hanno aiutato i progetti di lipidomica, in particolare varie combinazioni di spettrometria di massa e tecniche di cromatografia liquida. L'imaging con desorbimento/spettrometria di massa a ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI MSI) è recentemente emerso come una potente tecnica di imaging che integra gli approcci convenzionali. Questa nuova tecnica fornisce informazioni uniche sulla distribuzione spaziale dei lipidi all'interno dei compartimenti tissutali, che in precedenza era irraggiungibile senza l'uso di modifiche eccessive. La preparazione del campione dell'approccio MALDI MSI è fondamentale e, pertanto, è al centro di questo articolo. Questo articolo presenta un'analisi lipidica rapida di un gran numero di cervelli di Drosophila incorporati in composti a temperatura di taglio ottimale (OCT) per fornire un protocollo dettagliato per la preparazione di piccoli tessuti per l'analisi dei lipidi o dei metaboliti e delle piccole molecole attraverso MALDI MSI.

Introduction

I lipidi sono coinvolti in una vasta gamma di processi biologici e possono essere classificati in cinque categorie in base alla loro diversità strutturale: acidi grassi, triacilgliceroli (TAG), fosfolipidi, lipidi sterolici e sfingolipidi1. Le funzioni fondamentali dei lipidi sono quelle di fornire fonti di energia per i processi biologici (cioè i TAG) e formare le membrane cellulari (cioè fosfolipidi e colesterolo). Tuttavia, ulteriori ruoli dei lipidi sono stati notati nello sviluppo e nelle malattie e sono stati ampiamente studiati in campo biomedico. Ad esempio, i rapporti hanno dimostrato che gli acidi grassi di diverse lunghezze possono avere ruoli terapeutici unici. Le catene corte di acidi grassi possono essere coinvolte nei meccanismi di difesa contro le malattie autoimmuni, le catene di acidi grassi di media lunghezza producono metaboliti che possono mitigare le convulsioni e le lunghe catene di acidi grassi generano metaboliti che possono essere usati per trattare i disturbi metabolici2. Nel sistema nervoso, il colesterolo e i fosfolipidi derivati dalla glia hanno dimostrato di essere vitali per la sinaptogenesi 3,4. Altri tipi di lipidi hanno mostrato risultati promettenti nelle applicazioni mediche, compresi gli sfingolipidi utilizzati nei sistemi di somministrazione di farmaci e i saccarolipidi utilizzati per supportare il sistema immunitario 5,6. I numerosi ruoli e le potenziali applicazioni terapeutiche dei lipidi in campo biomedico hanno reso la lipidomica, lo studio delle vie e delle interazioni dei lipidi cellulari, un campo critico e sempre più importante.

La lipidomica fa uso della chimica analitica per studiare il lipidoma su larga scala. I principali metodi sperimentali utilizzati in lipidomica si basano sulla spettrometria di massa (MS) accoppiata con varie tecniche cromatografiche e di mobilità ionica 7,8. L'uso della SM nell'area è vantaggioso grazie alla sua elevata specificità e sensibilità, velocità di acquisizione e capacità uniche di (1) rilevare lipidi e metaboliti lipidici che si verificano anche a livelli bassi e transitori, (2) rilevare centinaia di diversi composti lipidici in un singolo esperimento, (3) identificare lipidi precedentemente sconosciuti e (4) distinguere tra isomeri lipidici. Tra gli sviluppi della SM, tra cui la ionizzazione elettrospray di desorbimento (DESI), MALDI e la spettrometria di massa a ioni secondari (SIMS), MALDI MSI è emersa come una potente tecnica di imaging che integra gli approcci convenzionali basati sulla SM fornendo informazioni uniche sulla distribuzione spaziale dei lipidi all'interno dei compartimenti tissutali 9,10.

Il flusso di lavoro tipico della lipidomica consiste nella preparazione del campione, nell'acquisizione dei dati mediante la tecnologia della spettrometria di massa e nell'analisi dei dati11. Lo studio dei lipidi e dei metaboliti nei campioni ha portato alla nascita di tecniche per comprendere le condizioni fisiologiche e patologiche dei processi metabolici negli organismi. Mentre la comprensione delle interazioni biologiche è importante, la sensibilità dei lipidi e dei metaboliti li rende difficili da visualizzare e identificare senza coloranti o altre modifiche. Cambiamenti nei livelli o nella distribuzione dei metaboliti possono portare a cambiamenti fenotipici. Uno strumento utilizzato per la profilazione metabolomica è MALDI MSI, una tecnica di imaging in situ senza etichetta in grado di rilevare centinaia di molecole contemporaneamente. L'imaging MALDI consente la visualizzazione di metaboliti e lipidi nei campioni preservandone l'integrità e la distribuzione spaziale. La tecnologia precedente per la profilazione dei lipidi prevedeva l'uso di sostanze chimiche radioattive per mappare individualmente i lipidi, mentre l'imaging MALDI rinuncia a questo e consente il rilevamento simultaneo di una gamma di lipidi.

Il metabolismo lipidico e l'omeostasi svolgono importanti funzioni nella fisiologia cellulare, come il mantenimento e lo sviluppo del sistema nervoso. Un aspetto essenziale del metabolismo lipidico del sistema nervoso è la spola lipidica tra neuroni e cellule gliali, che è mediata da lipoproteine trasportatrici molecolari, tra cui lipoproteine a bassissima densità (VLDL), lipoproteine a bassa densità (LDL) e lipoproteine ad alta densità (HDL)12. Le lipoproteine contengono apolipoproteine (Apo), come ApoB e ApoD, che funzionano come blocchi strutturali del carico lipidico e come ligandi per i recettori delle lipoproteine. La diafonia neurone-glia dei lipidi coinvolge molteplici attori come ApoD, ApoE e ApoJ derivati dalla glia e i loro recettori LDL neuronali (LDLR)13,14. In Drosophila, l'apolipopforina, un membro della famiglia ApoB, è un importante vettore lipidico emolinfatico15. L'apolipophorina ha due recettori della lipoforina strettamente correlati (LpR), LpR1 e LpR2, che sono omologhi delle LDLR15,16 dei mammiferi. In studi precedenti, la lipocalina secreta da astrociti Glial Lazarillo (GLaz), un omologo di Drosophila di ApoD umano, e il suo recettore neuronale LpR1 sono stati scoperti per mediare in modo cooperativo lo shuttling lipidico neurone-glia, regolando così la morfogenesi dei dendriti17. Pertanto, è stato ipotizzato che la perdita di LpR1 avrebbe causato una diminuzione del contenuto lipidico complessivo nel cervello di Drosophila. MALDI MSI sarebbe uno strumento adatto per profilare il contenuto lipidico in piccoli tessuti di cervelli di Drosophila mutante e wild-type LpR1−/−, come dimostrato in questo studio.

Nonostante la crescente popolarità di MALDI MSI, l'alto costo e la complessità sperimentale dello strumento spesso ne impediscono l'implementazione nei singoli laboratori. Pertanto, la maggior parte degli studi MALDI MSI sono condotti utilizzando strutture di base condivise. Come per altre applicazioni di MALDI MSI, un attento processo di preparazione dei campioni per la lipidomica è fondamentale per ottenere risultati affidabili. Tuttavia, poiché la preparazione del vetrino del campione viene tipicamente eseguita in singoli laboratori di ricerca, esiste la possibilità di variazioni nell'acquisizione di MALDI MSI. Per combattere questo, questo articolo mira a fornire un protocollo dettagliato per la preparazione del campione di piccoli campioni biologici prima della misurazione di MALDI MSI utilizzando l'analisi lipidica di un ampio gruppo di cervelli adulti di Drosophila in modalità ionica positiva come esempio11,17. Tuttavia, alcune classi di fosfolipidi e la maggior parte dei piccoli metaboliti sono favorevolmente rilevati dall'imaging MALDI in modalità ioni negativi, che è stata descritta in precedenza11. Pertanto, con questi due studi di esempio, speriamo di fornire protocolli dettagliati di preparazione del campione di varie combinazioni: tessuto grande indipendente contro tessuto piccolo incorporato, montaggio a disgelo contro montaggio a slitta calda e modalità ioni positivi contro modalità ioni negativi.

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Protocol

1. Incorporamento della testa di mosca

NOTA: l'intera procedura richiede ~ 45-60 minuti.

  1. Preparare la fase ottimale del composto della temperatura di taglio (composto OCT) con una superficie piana.
    1. Aggiungere OCT in un criomold di plastica (15 mm x 15 mm x 5 mm) a metà della profondità del criomold ed evitare la formazione di bolle. Lasciare lo stampo su una superficie piana per diversi minuti, quindi trasferirlo su ghiaccio secco.
    2. Mantenere il criomold piatto sul ghiaccio secco e lasciare che l'OCT formi una superficie piatta e uniforme. Attendere che lo Strumento di personalizzazione di Office sia completamente solidificato nello stampo. Utilizzare immediatamente gli stadi OCT congelati o conservarli a -80 °C.
  2. Anestetizzare le mosche adulte usando CO 2 (cioè un tampone CO2 ).
    1. Preparare una capsula di Petri contenente un pezzo di salvietta da laboratorio. Utilizzare acqua per inumidire parte della salvietta per ridurre l'elettricità statica. Tenere la salvietta mezza bagnata e metà asciutta.
    2. Sotto l'ambito di dissezione 1, utilizzare una pinza per tagliare la testa della mosca. Raccogliere 4-5 teste ogni volta e metterle sulla zona asciutta della salvietta da laboratorio.
      NOTA: La raccolta di 4-5 teste richiede ~ 2 minuti.
  3. Trasferire lo stadio OCT dal ghiaccio secco all'oscilloscopio di dissezione.
    1. Prendi lo stadio OCT dal ghiaccio secco al microscopio 2, trasferisci immediatamente le testine allo stadio OCT e disponile rapidamente, il che richiede ~ 30 s per evitare la fusione dell'OCT. Lasciare ~ 1 mm di spazio vuoto intorno a ciascun cervello di mosca per garantire un supporto adeguato dall'OCT e 4-5 mm di spazio vuoto dal bordo del blocco per fornire spazio adeguato per gestire la sezione. Se la proboscide è troppo lunga, rimuovere la punta; Se non è troppo lungo, tienilo intatto. Rimetti lo stadio OCT sul ghiaccio secco e lascialo riposare per ~ 3 minuti per assicurarti che lo stadio OCT rimanga congelato e solido.
    2. Quando lo stadio OCT è tornato sul ghiaccio secco e in attesa di solidificazione, raccogliere un altro giro di teste. Ripetete i passaggi 1.2 e 1.3 per trasferire ulteriori campioni sullo spazio rimanente sullo stage.
      NOTA: Otto teste sono solitamente preparate per ogni genotipo e quattro genotipi sono utilizzati in una fase OCT in questo laboratorio.
    3. Utilizzare due microscopi a dissezione, affiancati, per evitare di cambiare messa a fuoco e aumentare il tempo necessario per trasferire e disporre le testine sullo stadio OCT e per ridurre il rischio di fusione dello stadio OCT.
  4. Dopo che tutte le teste di mosca sono allineate, lasciare che lo stadio OCT si sieda sul ghiaccio secco per altri 5-10 minuti.
  5. Prendere lo stadio OCT lontano dal ghiaccio secco, metterlo su una superficie piana (banco) e quindi, rapidamente, aggiungere una grande quantità di composto OCT per coprire tutti i campioni e riempire l'intero criostampo, che richiede ~ 3 s.
  6. Trasferire immediatamente il criomold nel ghiaccio secco e congelare l'intero blocco OCT contenente i tessuti incorporati. Lasciare riposare la fase OCT sul ghiaccio secco per altri 5-10 minuti. Etichettare i campioni sul margine del criostampo.
  7. Conservare i campioni congelati a -80 °C fino al momento del sezionamento.

2. Criosezionamento del tessuto

NOTA: Quando si maneggiano i vetrini di ossido di indio-stagno (ITO), indossare sempre i guanti per evitare la contaminazione dei tessuti. Si consiglia inoltre di indossare una maschera per evitare di respirare direttamente sul vetrino.

  1. Confermare il lato rivestito ITO testando la conduttività delle guide ITO utilizzando un voltmetro impostato sulla resistenza. Contrassegnare il lato con una misurazione della resistenza come lato a cui aderire il tessuto. Etichettarlo e impostare sempre una salvietta da laboratorio sul fondo del vetrino per evitare la contaminazione del vetrino.
  2. Lasciare che i tessuti si equilibrino nella camera del criostato per 30-45 minuti.
    1. Per evitare lo scioglimento dell'OCT, posizionare tutti gli strumenti necessari come una pinza e un pennello da artista a punta sottile nella camera del criostato in anticipo per preraffreddarli.
  3. Pulire il criostato, preferibilmente con etanolo al 70%. Pulire la piastra del rotolo e il palcoscenico e rimuovere le lame usate. Utilizzare salviette pulite aggiuntive per assicurarsi che l'etanolo sia evaporato e che tutte le superfici siano asciutte prima dell'inizio del sezionamento.
  4. Regolare la temperatura della camera del criostato e della testa del campione in base al tipo di tessuto (ad esempio, -14 °C per il fegato, -20 °C per il muscolo e -25 °C per la pelle10; -18 °C per le teste di mosca in questo protocollo).
  5. Montare il tessuto sul supporto del campione utilizzando OCT. Fare attenzione a utilizzare abbastanza OCT per coprire la base del blocco OCT e montare il blocco il più piatto possibile.
  6. Posiziona una lama pulita sul palco e bloccala. Posizionare la testa del provino verso il palcoscenico secondo necessità per ottenere l'angolo di taglio desiderato.
    1. Posizionare il blocco del campione in un orientamento in cui tutti i genotipi/gruppi di trattamento siano posizionati verticalmente rispetto alla lama.
      NOTA: Ciò garantisce un piano di taglio uniforme ed evita la contaminazione incrociata da diversi gruppi. Se si taglia un blocco diverso di tessuto, passare a una nuova lama tra i campioni per evitare la contaminazione incrociata.
  7. Iniziare a tagliare in sezioni spesse (50-100 μm) fino a trovare la regione di interesse (ad esempio, la regione desiderata del cervello).
    1. Spazzola costantemente i pezzi extra con un pennello d'artista preraffreddato per mantenere pulito il palcoscenico.
  8. Modificare lo spessore delle sezioni a 10-12 μm una volta raggiunta la regione desiderata.
    1. Regolare leggermente la temperatura della camera secondo necessità. Ad esempio, impostare una temperatura più elevata se la sezione tende a sfaldarsi o a sfaldarsi facilmente.
      NOTA: la temperatura consigliata per i blocchi OCT è -18 °C.
  9. Raccogliere con cura la sezione desiderata e aderirla alla diapositiva ITO. Eseguire questa operazione nella camera del criostato.
    1. Prendi un vetrino ITO a temperatura ambiente e posizionalo sopra la sezione, avvicinati alla sezione delicatamente e rapidamente affinché la sezione aderisca al vetrino senza lasciare tracce sullo stadio del criostato.
      NOTA: lo Strumento di personalizzazione di Office si scioglierà e si aggrappa alla diapositiva.
  10. Mettere da parte il vetrino in un rack o in una salvietta da laboratorio al di fuori del criostato tra le collezioni di più sezioni.
  11. Se si desidera il confronto tra diversi campioni della stessa coorte, posizionare le sezioni di più campioni su un singolo vetrino per l'analisi simultanea e la variazione minima. Se necessario, separare due vetrini, poiché il supporto del bersaglio MALDI può ospitare due vetrini in una singola corsa.
  12. Trasportare i vetrini in una scatola sottovuoto in un essiccatore con essiccante come strato inferiore. Asciugare i vetrini sotto vuoto per 30-60 minuti.
    NOTA: In alternativa, se il laboratorio non è dotato di un essiccatore sottovuoto, i vetrini devono essere mantenuti a -20 °C durante tutto il processo fino allo stoccaggio a -80 °C entro 24 ore o alla spedizione su ghiaccio secco per evitare il deterioramento dei lipidi o dei metaboliti.
  13. Procedere alla deposizione della matrice. Utilizzare acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB) in metanolo/acqua (70/30, v/v) come matrice.
  14. Se i vetrini non vengono eseguiti immediatamente, conservare i vetrini a -80 °C (fino a 1 mese per le sezioni cerebrali di mosca e 6 mesi per le sezioni di cervello di roditori), oppure spedire immediatamente il campione alle strutture principali MALDI con ghiaccio secco adeguato. Per uno stoccaggio e una spedizione ottimali, posizionare i vetrini in un trasportatore di vetrini e sigillare saldamente l'apertura con pellicola di cera. Sigillare con un sacchetto con cerniera, metterlo in un altro sacchetto con cerniera contenente essiccante ed etichettare l'esterno.
    NOTA: Fare riferimento al lavoro precedente per le fasi successive della scansione dei vetrini, della deposizione della matrice e delle procedure di imaging MALDI11.
  15. Eseguire la deposizione della matrice utilizzando lo spruzzatore automatico a matrice HTX M5 e una soluzione da 40 mg/ml di DHB in metanolo/acqua (70/30, v/v). Spruzzare la matrice con una portata personalizzata di 0,12 mL/min e una temperatura dell'ugello di 85 °C per 10 passaggi. Utilizzare una pressione del gas N2 di 10 psi.
    NOTA: Se la pressione del gas N2 nello spruzzatore viene abbassata al di sotto di 5 psi, un meccanismo di sicurezza nello spruzzatore spegnerà immediatamente il riscaldatore per evitare danni allo spruzzatore con una velocità di spruzzatura di 1.300 mm / min, una distanza tra i binari di 2 mm, una portata di 3 L / min e un'altezza dell'ugello di 40 mm.
  16. Utilizzare uno strumento MALDI time of flight (TOF) MS (vedere la Tabella dei materiali) in modalità ioni positivi per acquisire uno spettro di massa all'interno degli intervalli di massa da m / z 50-1.000.
    1. Per calibrare lo strumento, individuare 0,5 μL di emulsione di fosforo rosso in acetonitrile sui vetrini ITO e utilizzare i suoi spettri per calibrare lo strumento nell'intervallo di massa 50-1.000 m/z applicando una curva di calibrazione quadratica2.
    2. Impostare i diametri dello spot laser su Medio, poiché è il profilo del fascio modulato per una larghezza raster di 40 μm, e raccogliere i dati di imaging sommando 500 scatti a una frequenza di ripetizione laser di 1.000 Hz per posizione dell'array.
    3. Utilizzare un software (vedere la tabella dei materiali) per registrare ed elaborare i dati spettrali. Eseguire l'analisi dei dati di imaging utilizzando la normalizzazione del quadrato medio (RMS) per generare immagini ioniche con una larghezza del contenitore di ±0,10 Da. Allineare gli spettri sia dell'OCT che del tessuto cerebrale dallo stesso esperimento utilizzando il software per valutare i picchi sovrapposti e l'interferenza di soppressione ionica dell'OCT (Figura supplementare S1). Dopo l'esperimento, elaborare i vetrini MALDI contenenti i campioni di tessuto mediante colorazione con ematossilina ed eosina (H & E), come descritto in precedenza11.

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Representative Results

La perdita del recettore neuronale LpR1 della lipocalina secreta da astrociti Glial Lazarillo (GLaz), un omologo di Drosophila di ApoD umano, è stata ipotizzata per essere in grado di causare una diminuzione del contenuto lipidico complessivo nel cervello di Drosophila. Per testare questo, MALDI MSI è stato utilizzato per profilare i lipidi nel cervello di Drosophila mutante e wild-type LpR1-/−, che viene elaborato di seguito.

L'esperimento è stato eseguito in base al flusso di lavoro illustrato nella Figura 1. I cervelli di mosca adulti sono stati raccolti come descritto sopra. Sono stati incorporati nell'OCT e il ghiaccio secco è stato utilizzato per congelare il blocco OCT. Il blocco di tessuto OCT è stato criosezionato a 12 μm di spessore e a -18 °C sia per la testa del campione che per la camera. I vetrini ITO con criosezioni montate su di essi sono stati essiccati nel vuoto per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, la deposizione della matrice è stata effettuata utilizzando lo spruzzatore automatico a matrice HTX M5 e una soluzione di 40 mg/mL di DHB in metanolo/acqua (70/30, v/v).

Lo strumento MALDI time of flight (TOF) MS Autoflex in modalità ioni positivi ha acquisito uno spettro di massa all'interno degli intervalli di massa da 50-1.000 m/z. Lo spettro dell'OCT e del tessuto cerebrale dello stesso esperimento è stato allineato in SCiLS per valutare i picchi sovrapposti e l'interferenza di soppressione ionica dell'OCT (Figura supplementare S1).

I risultati nella Figura 2 mostrano le immagini di output dal software di analisi dei dati MALDI MSI di spettri m/z selezionati in cui i valori selezionati hanno mostrato una differenza significativa nella distribuzione dei lipidi tra il knockout di LpR1 e la Drosofila wild-type. Le scansioni hanno rivelato una riduzione generale del contenuto lipidico nel mutante LpR1−/−. Ogni spettro è stato analizzato manualmente e l'identificazione dell'analita è stata ottenuta incrociando i database METLIN e gli studi precedentemente pubblicati 3,4. Il triacilglicerolo (TAG) e il fosfatidilglicerolo (PG) erano altamente espressi nei cervelli di controllo rispetto al mutante LpR1−/− (mostrando fino a un cambiamento di 10 volte nel TAG). Inoltre, il diglicerolo (DAG), la fosfatidilcolina (PC) e la fosfatidil-etanolammina (PE) erano anche minimamente espressi nel genotipo mutante LpR1−/−.

Figure 1
Figura 1: Flusso di lavoro dell'imaging con spettrometria di massa MALDI-TOF. (A) I cervelli di Drosophila sono allineati in OCT posti sopra ghiaccio secco. (B-D) Il blocco di tessuto viene criosezionato in sezioni spesse 12 μm a -15 °C. La sezione viene appiattita utilizzando una spazzola preraffreddata e scongelata sul lato rivestito ITO di un vetrino mantenuto a temperatura ambiente. (E) La slitta è contrassegnata con marcatori fiduciali, rivestita con matrice e inserita nello strumento MALDI. (F) L'immagine MALDI di un cervello di Drosophila è ottenuta con una risoluzione di 40 μm usando DHB come matrice. Le regioni degli occhi (rosso, m/z 370.2), del tessuto cranico (verde, m/z 184.1) e del cervello (blu, m/z 788.6) sono mostrate nell'immagine multicanale sovrapposta. (G) La colorazione H&E viene eseguita sulla stessa sezione di tessuto dopo MALDI MSI. (H) Il flusso di lavoro di preparazione, conservazione e trasporto dei campioni. Barre della scala = 500 μm (F,G). Abbreviazioni: MALDI-TOF = matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight; OCT = mescola con temperatura di taglio ottimale; ITO = ossido di indio-stagno; DHB = acido 2,5,-diidrossibenzoico; H&E = ematossilina ed eosina; MSI = imaging con spettrometria di massa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagini rappresentative dell'analisi MALDI MS che rivelano una diminuzione generale del contenuto lipidico nel cervello mutante LpR1−/− . Sono mostrate sezioni rappresentative del cervello di moscerino adulto colorate con H & E (a sinistra). Le specie lipidiche, i rispettivi valori m/z e le scale della mappa di calore sono come indicato. In basso, la piega media della riduzione del mutante LpR1−/− rispetto ai controlli di almeno quattro repliche biologiche è mostrata come numeri accanto alle frecce. Barra di scala = 1 mm. Questa figura è stata modificata da Yin et al.17. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura supplementare S1: Spettri di massa del tessuto cerebrale OCT e Drosophila . Le criosezioni del blocco OCT cerebrale di Drosophila dalla Figura 1 sono state coperte uniformemente con la matrice DHB prima dell'imaging MALDI. Lo spettro di massa della regione OCT in bianco selezionata e della regione del tessuto cerebrale sia dai moscerini di controllo che da quelli mutanti è stato mostrato nell'intervallo di m / z 1-1.000 e m / z 520-900 (arricchito di lipidi), rispettivamente. L'interferenza dell'OCT è associata sia a fenomeni di soppressione ionica che a problemi di segnale sovrapposti. Abbreviazioni: OCT = composto con temperatura di taglio ottimale; DHB = acido 2,5-diidrossibenzoico; MALDI = desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice. Clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Come dimostrato nello studio sulle variazioni nella composizione lipidica nei cervelli mutanti e wild-type di Drosophila, MALDI MSI può essere una preziosa tecnica di imaging label-free per l'analisi in situ dei modelli di distribuzione molecolare all'interno degli organi di piccoli insetti. Infatti, poiché i lipidi sono distribuiti sia nel tessuto cerebrale che nei corpi grassi delle teste di Drosophila, gli approcci lipidomici convenzionali basati sulla cromatografia liquida e sulla spettrometria di massa (LC-MS) possono rilevare solo segnali combinati da entrambe le regioni quando viene utilizzata l'estrazione dell'intera testa. In generale, l'analisi lipidomica differenziale delle sottoregioni all'interno degli organi di un insetto così piccolo come la Drosophila è un compito molto laborioso e impegnativo per gli approcci LC-MS18. Richiederebbe la dissezione di quelle regioni, il che impone grandi sfide. Al contrario, MALDI MSI fornisce una risoluzione adeguata per distinguere diverse strutture anatomiche, anche all'interno del piccolo cervello di Drosophila. Il beneficio di una quantità minima di tessuto richiesto rispetto alla LC-MS convenzionale potrebbe essere applicato anche a campioni preziosi come le biopsie cliniche. Inoltre, i vetrini campione preparati per MALDI MSI potrebbero anche essere esaminati con tecniche complementari come TOF-SIMS e immunoistochimica, che consentirebbero l'integrazione dei dati ottenuti da approcci interdisciplinari19,20.

Uno dei passaggi più importanti di MALDI MSI è la preparazione del campione, la parte dell'esperimento che spiega la maggior parte delle differenze nei risultati degli studi di metabolomica condotti in diversi laboratori21. L'obiettivo principale qui è quello di fornire un protocollo di preparazione del campione completo ma pratico per l'analisi MALDI MSI di lipidi e metaboliti in organismi piccoli come gli insetti Drosophila , nella speranza di aiutare i ricercatori con l'implementazione di MALDI MSI nei loro studi dalla biologia di base alla scienza traslazionale.

Oltre alle precauzioni per ridurre al minimo i cambiamenti nei profili molecolari (sia abbondanza che distribuzione spaziale) come discusso in precedenza11, diverse altre pratiche devono essere adattate quando si maneggiano piccoli tessuti. In primo luogo, il tempo che intercorre tra la raccolta di tessuti biologici e il congelamento nell'OCT dovrebbe essere ridotto al minimo per ridurre la probabilità di ischemia post mortem21. In secondo luogo, si dovrebbe assicurarsi che venga preparato uno stadio piatto di OCT prima di posizionare il tessuto nel blocco, che è fondamentale per avere sezioni da piani comparabili attraverso diversi tessuti durante il sezionamento. In terzo luogo, il taglio di tessuti biologici su piccola scala o di campioni preziosi richiede un'adeguata pratica prima dell'esperimento. Mentre l'OCT aiuta a tagliare anche le sezioni, possono sorgere complicazioni in termini di arricciamento o desquamazione dei tessuti. Per combattere il curling, si dovrebbe lasciare riposare la sezione sul palco per alcuni secondi prima di rimuovere la piastra del rotolo. Con due pennelli, uno può essere utilizzato per tenere ferma la parte superiore della sezione, mentre l'altro può essere utilizzato per dispiegare la sezione. Prestare attenzione per ridurre al minimo il contatto con il tessuto lavorando principalmente con i bordi delle sezioni del blocco. In quarto luogo, sebbene il metodo di montaggio del disgelo possa essere utilizzato per un minor numero di cervelli di mosca (<10 cervelli), sarebbe impossibile trasferire una sezione contenente un gran numero di cervelli di mosca (>30 cervelli) in un vetrino ITO freddo senza perdere un numero notevole di cervelli, che cadrebbero facilmente dalla sezione del blocco una volta sollevati. Pertanto, per un'analisi rapida di un gran numero di cervelli di mosca, è necessario utilizzare il montaggio a slitta calda. In particolare, la differenza di temperatura tra la sezione OCT e la diapositiva farà sì che la sezione aderisca e aderisca alla diapositiva molto rapidamente. Quindi, non si dovrebbe premere il vetrino caldo contro la sezione e lo stadio del criostato; invece, è necessario avvicinarsi delicatamente e rapidamente alle sezioni per consentire alla sezione di attaccarsi al vetrino ITO senza toccare lo stadio del criostato. Non abbiamo osservato alcuna traccia evidente delle sezioni lasciate sullo stadio del criostato rispetto al metodo di montaggio a disgelo. In quinto luogo, una deposizione uniforme e fine della matrice MALDI è fondamentale per ottenere informazioni spaziali forti e accurate durante l'acquisizione. Si consiglia di utilizzare un vetrino vuoto per testare la deposizione della matrice per una corretta copertura prima di procedere alla diapositiva contenente il campione.

Con la sua crescente popolarità e i suoi progressi, MALDI MSI dovrebbe raggiungere una base più ampia di utenti e diventare uno strumento standard per le misurazioni della massa molecolare di analiti come amminoacidi, metaboliti, lipidi, peptidi e proteine e altre piccole molecole estratte direttamente dai tessuti biologici10. Tuttavia, ha i suoi limiti e le sue sfide. Quando si preparano campioni fragili e su piccola scala per MALDI MSI, sono necessari agenti incorporanti come l'OCT per il sezionamento. Tuttavia, OCT contiene una combinazione di polimeri (poli(alcool vinilico), polietilene glicerolo e benzalconio cloruro), che crea un segnale di fondo polimerico che può interferire con il segnale dell'analita22. È stato riportato che composti di incorporamento alternativi come la gelatina e la carbossimetilcellulosa (CMC) dimostrano meno effetti di soppressione ionica. La gelatina mostra segnali meno intensi che sono più sparsi nella gamma di massa bassa di 100-600 m / z20,23,24. Il CMC è stato utilizzato anche in MALDI MSI di Drosophila per visualizzare metaboliti come il GABA, sebbene richieda l'immersione delle teste in etanolo al 70% prima dell'incorporazione per un'adesione ottimale25.

Nonostante la tendenza dell'OCT alla soppressione del segnale, questo protocollo procede con il suo uso a causa della capacità superiore dell'OCT di fornire un sezionamento affidabile di un gran numero di campioni preservando la morfologia del cervello. I ricercatori hanno scoperto che, mentre la gelatina e la sezione CMC vanno bene a spessori elevati come 20 μm, solo l'OCT è in grado di produrre sezioni consecutive da 12 μm in modo affidabile26. CMC e gelatina mancano dell'integrità strutturale e della stretta tenuta del tessuto che l'OCT fornisce, il che stabilisce il limite del numero di piccoli tessuti come il cervello di mosca da ospitare in un blocco26. È stato riportato che i segnali MS provenienti da sezioni di mosca incorporate nell'OCT sono paragonabili a quelli incorporati nella gelatina e nella CMC26. I nostri dati non pubblicati hanno anche indicato che le sezioni cerebrali del moscerino montate a caldo, incorporate nell'OCT, hanno generato robusti segnali lipidici paragonabili al tessuto incorporato nella gelatina montato sul disgelo. Nel complesso, a causa della superiore capacità dell'OCT di preservare l'integrità della morfologia tissutale e consentire un sezionamento preciso del campione rispetto ad altri composti incorporati, il suo utilizzo con campioni ad alta fragilità, come array di cervelli di Drosophila , rimane un'opzione. In tale scenario, dovrebbe essere effettuata solo la quantificazione relativa dei campioni di confronto dello stesso esperimento, ma non la quantificazione assoluta. Per quanto riguarda il nostro studio riportato sul modello Drosophila nell'analisi dei lipidi, è stato concluso che i benefici dell'OCT superano i suoi limiti. Inoltre, devono essere eseguiti esperimenti di prova per verificare se i segnali MS degli analiti mirati sarebbero mascherati dai segnali OCT.

Inoltre, diverse pratiche devono essere adattate per ridurre al minimo gli effetti della soppressione ionica. In primo luogo, si dovrebbero elaborare i campioni di diversi gruppi allo stesso tempo per garantire la stessa estensione di soppressione ionica, se presente. In secondo luogo, nella scelta della regione di interesse per la scansione MALDI, si dovrebbe evitare la regione OCT e delineare solo la regione del tessuto. Infine, è necessario selezionare una regione di PTOM vuoto da sottoporre a scansione come controllo negativo per escludere i segnali dallo PTOM durante l'analisi dei dati.

Il campo della lipidomica è emerso nei primi anni 2000 ed è rapidamente avanzato negli ultimi anni, in gran parte a causa degli sviluppi della spettrometria di massa, incluso MALDI MSI27. Queste tecniche avanzate hanno contribuito a guidare il campo verso applicazioni biologiche e biomediche. Ad esempio, la lipidomica può essere impiegata negli studi neurologici poiché i cambiamenti nei livelli di traffico lipidico cerebrale e nella composizione possono essere utilizzati come biomarcatori della malattia. Inoltre, la lipidomica ha portato all'identificazione di nuove molecole di segnalazione, allo sviluppo di test di efficacia dei farmaci, alla scoperta di meccanismi alla base delle condizioni fisiopatologiche e altroancora 28. Nonostante i notevoli risultati raggiunti dal settore negli ultimi anni, ci sono ancora aree che richiedono crescita. Ad esempio, la capacità di quantificare con precisione un lipide utilizzando la tecnologia attuale rimane oggetto di dibattito29. Inoltre, la mappatura completa del lipidoma cellulare ha molti progressi da fare. Si prevede che queste aree, tra le altre nel settore, registreranno una crescita significativa nei prossimi anni.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgments

Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy e Mayan Hein sono supportati dal programma di ricerca estiva CUNY della Sloan Foundation (CSURP). Jun Yin è supportato dal programma di ricerca intramurale del National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137. Il supporto per questo progetto è stato fornito da un premio PSC-CUNY a Ye He e Rinat Abzalimov, finanziato congiuntamente da The Professional Staff Congress e The City University di New York.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) Millipore Sigma Aldrich 85707-1G-F
Andwin Scientific CRYOMOLD 15X15X5 Fisher Scientific NC9464347
Andwin Scientific Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Fisher Scientific 14-373-65
Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE Fisher Scientific 50-111-2302
autoflex speed MALDI-TOF MS system Bruker Daltonics Inc MALDI-TOF MS instrument
BD Syringe with Luer-Lok Tips Fisher Scientific 14-823-16E
BD Vacutainer General Use Syringe Needles Fisher Scientific 23-021-020
Bruker Daltonics GLASS SLIDES MALDI IMAGNG Fisher Scientific NC0380464
Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics AC219095000
Epson Perfection V600 Photo Scanner Amazon Perfection V600
Fisherbrand 5-Place Slide Mailer Fisher Scientific HS15986
Fisherbrand Digital Auto-Range Multimeter Fisher Scientific 01-241-1
FlexImaging v3.0 Bruker Daltonics Inc Bruker MS imaging analysis software
HPLC Grade Methanol Fisher Scientific MMX04751
HPLC Grade Water Fisher Scientific W5-1
HTX M5 Sprayer HTX Technologies, LLC Automatic heated matrix sprayer
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
MSC Ziploc Freezer Bag Fisher Scientific 50-111-3769
SCiLS Lab (2015b) SCiLS Lab Advanced MALDI MSI data analysis software
Thermo Scientific CryoStar NX50 Cryostat Fisher Thermo Scientific 95-713-0
Thermo Scientific Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator Fisher Scientific 08-642-7

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References

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Biologia Numero 185 MALDI MSI profilo lipidico Drosophila cervello preparazione del campione spettrometria di massa
Preparazione del campione per l'analisi rapida dei lipidi nel cervello <em>della Drosophila</em> utilizzando la spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice
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