Com base na família de cardiomiopatia hereditária familiar encontrada em nosso trabalho clínico, criamos um modelo de camundongo C57BL / 6N com uma mutação pontual (G823E) no locus MYH7 do camundongo através da engenharia genômica mediada por CRISPR / Cas9 para verificar essa mutação.
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Artigo de método
Investigando a patogênese da mutação MYH7 Gly823Glu em cardiomiopatia hipertrófica familiar usando um modelo de camundongo
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A cardiomiopatia hipertrófica familiar (CMH, OMIM: 613690) é a cardiomiopatia mais comum na China. No entanto, a etiologia genética subjacente da CMH permanece indescritível.
Identificamos anteriormente uma variante heterozigótica do gene da cadeia pesada 7 da miosina (MYH7), NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), em uma grande família Han chinesa com CMH. Nesta família, a variante G823E cosegrega com um distúrbio autossômico dominante. Esta variante está localizada no domínio do braço de alavanca da região do pescoço da proteína MYH7 e é altamente conservada entre miosinas homólogas e espécies. Para verificar a patogenicidade da variante G823E, produzimos um modelo de camundongo C57BL/6N com uma mutação pontual (G823E) no locus MYH7 do camundongo com engenharia genômica mediada por CRISPR/Cas9. Projetamos vetores de gRNA direcionados e oligonucleotídeos doadores (com sequências de segmentação ladeadas por 134 pb de homologia). O sítio p.G823E (GGG a GAG) no oligonucleotídeo doador foi introduzido no éxon 23 do MYH7 por reparo direcionado por homologia. Um p.R819 silenciado (AGG para CGA) também foi inserido para evitar a ligação do gRNA e a reclivagem da sequência após o reparo direcionado por homologia. O ecocardiograma revelou hipertrofia da parede posterior do ventrículo esquerdo (PCVE) com sístole em camundongos MYH7 G823E/- aos 2 meses de idade. Esses resultados também foram validados por análise histológica (Figura 3).
Estes resultados demonstram que a variante G823E desempenha um papel importante na patogênese da CMH. Nossos achados enriquecem o espectro de variantes do MYH7 ligadas à CMH familiar e podem fornecer orientação para aconselhamento genético e diagnóstico pré-natal nesta família chinesa.
Introdução
A cardiomiopatia hipertrófica (CMH, OMIM: 613690) é a cardiomiopatia mais comum na China, com incidência estimada em 0,2%, acometendo 150.000 pessoas 1,2.
A característica anatômica patológica que caracteriza a CMH é a hipertrofia ventricular assimétrica, que frequentemente envolve a via de saída ventricular e/ou septo interventricular3. A manifestação clínica é dispneia ao esforço, fadiga e dor torácica. O fenótipo individual da CMH tem variabilidade que varia de clinicamente insidiosa a insuficiência cardíaca grave. Pacientes com CMH necessitam de tratament....
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Protocolo
As histórias das famílias foram obtidas por meio de entrevistas com os familiares. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Guangdong (No. 2019074). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os membros da família. Todos os animais são tratados de acordo com as diretrizes éticas do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Guangdong (Guangzhou, China).
1. Sujeitos do estudo
NOTA: O probando III-3 procurou aconselhamento médico no Departamento de Cirurgia Cardiovascular do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Guangdong em julho de....
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Resultados
Perfil clínico das famílias
Os pedigrees familiares da CMH foram obtidos e são apresentados na Figura 2. Todos os membros da família documentados foram diagnosticados com CMH no momento da inscrição.
Na família (Figura 2A), o probando foi o paciente III-7, que foi diagnosticado com CMH e obstrução da via de saída do ventrículo esquerdo (VOTO) aos 46 anos e submetido a cirurgia cardíaca. O paciente III-3 tinha CMH menor que não nece.......
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Discussão
Neste estudo, descrevemos uma família Han chinesa com CMH. A análise genética revelou que uma mutação heterozigótica MYH6 p.G823E co-segrega com a doença em membros da família com herança autossômica dominante. Para validar a patogenicidade da mutação G823E e discutir os mecanismos subjacentes, criamos um modelo de camundongo C57BL/6N com G823E no locus Myh7 do camundongo por engenharia genômica mediada por CRISPR/Cas9.
As características fenotípicas de camundongos knockin C57BL/6N-Myh7em.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse financeiros a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo projeto do Fundo de Pesquisa Médica da Província de Guangdong (A2022363) e pelo grande projeto do Comitê de Ciência e Tecnologia de Guangdong, China (subvenção no.2022).
Gostaríamos de agradecer a Qingjian Chen, da Universidade de Maryland, College Park, pela ajuda durante a preparação deste manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,5 vezes; TBE | Shanghai Sangon | ||
| 2× Taq Master Mix (Dye Plus) | Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Agarose | Regu | ||
| para pequenos animais | Reward Life Technology Co., Ltd. | R500 | |
| BEDTools | 2.16.1 | ||
| Cas9 método de digestão in vitro para detectar o kit de eficiência alvo de gRNA | Viewsolid Biotechnology Co., Ltd. | VK007 | |
| Marcador de DNA | Thermo Fisher Scientific | ||
| DNA estabilizador | Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd. | DNAstable LD | evita a degradação do DNA |
| Micrótomo de parafina elétrica | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-S7220-B | |
| GATK | v3.5 | ||
| Gentra Puregene kit de sangue | Santa Clara | ||
| Lâmina de vidro, lamínula | Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd. | ||
| Solução de coloração de hematoxilina, solução de coloração de eosina | Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. | C0107-500ml, C0109 | |
| HiSeq X-ten plataforma | Illumina | realiza sequenciamento nas bibliotecas capturadas | |
| Injeção de gonadotrofina coriônica | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Injeção de gonadotrofina sérica de égua grávida | Livzon Pharmaceutical Group Inc. | ||
| Isoflurano | Fornecedores | anestesia inalatória | |
| microscópio de microinjeção | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| Máquina de incorporação de parafina | Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd. | HS-B7126-B | |
| Picard | (2.2.4) 20 | ||
| Proteinase K | Merck KGaA | ||
| samtools | 1.3 | ||
| Sequenciador | Applied Biosystems | ABI 3500 | |
| Estereomicroscópio | Nikon | SMZ745T | |
| SureSelect Humano Todos Exon V6 | Agilent Technology Co., Ltd. | sonda de exoma | |
| T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs, Inc. | NEB-E2065S | |
| Caixa de temperatura | BINDER GmbH | KBF-S Solid.Line | |
| Trizma Solução de cloridrato | Sigma, Merck KGaA | No. T2663 | |
| Sistema de ultrassom veterinário | Royal Philips | CX50 |
Referências
- Toepfer, C. N., et al. Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).
- Writing Committee Members et al.
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Reimpressões e permissões
