Investigando a patogênese da mutação MYH7 Gly823Glu em cardiomiopatia hipertrófica familiar usando um modelo de camundongo

A cardiomiopatia hipertrófica (CMH, OMIM: 613690) é a cardiomiopatia mais comum na China, com incidência estimada em 0,2%, acometendo 150.000 pessoas ^1,2.

A característica anatômica patológica que caracteriza a CMH é a hipertrofia ventricular assimétrica, que frequentemente envolve a via de saída ventricular e/ou septo interventricular³. A manifestação clínica é dispneia ao esforço, fadiga e dor torácica. O fenótipo individual da CMH tem variabilidade que varia de clinicamente insidiosa a insuficiência cardíaca grave. Pacientes com CMH necessitam de tratamento médico, transplante cardíaco, equipamentos de suporte à vida e acompanhamento multidisciplinar⁴.

No século passado, a tecnologia de PCR mudou a maneira como estudamos o DNA⁵. Um método de sequenciamento de DNA para diagnóstico clínico foi descoberto por Sanger e colegas⁶. A técnica de Sanger foi posteriormente aplicada ao Projeto Genoma Humano, mas essa abordagem foi dispendiosa e demorada⁷. O advento do sequenciamento do genoma completo (WGS) trouxe insights sobre doenças genéticas humanas a novos patamares, mas permaneceu proibitivo em termos de custo. A tecnologia de sequenciamento de exoma completo (WES) tem sido usada há muito tempo para detectar variantes da linha germinativa⁸ e tem sido bem-sucedida na identificação de mutações de drivers somáticos no exoma de vários tipos de câncer⁹. A detecção de éxons de DNA ou regiões codificadoras por WES pode ser usada para revelar variantes patogênicas na maioria das doenças mendelianas. Hoje, com a diminuição do custo do sequenciamento, espera-se que o WGS se torne uma ferramenta importante na pesquisa genômica e possa ser amplamente utilizado na detecção de variantes patogênicas no genoma.

A tecnologia WES também tem sido usada na cardiomiopatia hereditária para identificar variantes patogênicas para elucidar ainda mais a etiologia. Evidências emergentes implicaram que genes que codificam mutações genéticas de proteínas estruturais do sarcômero, como MYH7 10, MYH6¹¹, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3¹⁴, TNNT2 15, TNNI3 16, TNNC1 17 e^{TPM1 18} são responsáveis pela etiologia genética da CMH. O conhecimento de variantes patogênicas em genes causadores de doenças raras (por exemplo, obscurina, calmodulina citoesquelética e RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)¹⁹, agindo alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)²⁰ e proteína rica em cisteína e glicina 3 (CSRP3, OMIM: 600824)²¹) também tem sido associada à CMH. Estudos genéticos atuais identificaram múltiplas variantes patogênicas distintas no gene da proteína sarcomérica em aproximadamente 40%-60% dos pacientes com CMH, e testes genéticos em pacientes com CMH revelaram que a maioria das variantes patogênicas ocorre na cadeia pesada da miosina (MYH7) e na proteína C de ligação à miosina (MYBPC3). No entanto, a base genética para a CMH permanece indescritível. Explorar a patogenicidade dessas variações subjacentes aos pacientes humanos com CMH continua sendo um grande desafio²².

Neste estudo, relatamos uma variante patogênica no MYH7 em uma família Han chinesa com CMH por WES. Para verificar a patogenicidade dessa variante, estabelecemos um camundongo knockin C57BL/6N-Myh7^em1(G823E) utilizando o sistema CRISPR/Cas9. Também discutimos mecanismos plausíveis dessa variante.

As histórias das famílias foram obtidas por meio de entrevistas com os familiares. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Guangdong (No. 2019074). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os membros da família. Todos os animais são tratados de acordo com as diretrizes éticas do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Guangdong (Guangzhou, China).

1. Sujeitos do estudo

NOTA: O probando III-3 procurou aconselhamento médico no Departamento de Cirurgia Cardiovascular do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Guangdong em julho de 2019.

1. Obtenha uma história médica familiar detalhada do probando. Notifique e ligue para todos os membros da família do probando. Todos os membros da família foram submetidos a exames físicos meticulosos.
   1. Realizar uma revisão sistemática de todos os dados clínicos, incluindo registros médicos, ECGs, ecocardiogramas e relatórios de cateterismo cardíaco.
   2. Reconfirmar fenótipos cardíacos em todos os pacientes durante a intervenção ou cirurgia.
2. Selecione um total de 174 controles saudáveis de base populacional do banco de dados local. Coletar aproximadamente 4,0 mL de sangue venoso periférico de cada paciente.

2. Extração de DNA

NOTA: O ADN é extraído com um kit de sangue comercial de acordo com as instruções do fabricante.

1. Lise as células sanguíneas com um detergente aniônico na presença de um estabilizador de DNA seguindo o protocolo do fabricante.
2. Adicionar 10 μL de solução de RNase A ao lisado celular e misturar invertendo o tubo 25 vezes. Incubar a 37 °C durante 15 min a 1 h.
3. Remova as proteínas por precipitação de sal. Use solução de precipitação proteica (0,25 mg de albumina sérica bovina dissolvida em 25 mL de água destilada) e isopropanol a 100% para precipitar proteínas. Em seguida, use 200 μL de etanol a 70% e realize a centrifugação a 12.000 x g/min a 4 °C por 15 min para lavar o pellet de DNA.
4. Recuperar o DNA genômico por precipitação com 500 μL de etanol a 70%. Centrífuga a 12.000 x g por 30 s. Aspirar e depois dissolver o pellet em solução de hidratação (1 mM EDTA, 10 mM Tris· Cl, pH 7,5).
5. Use um espectrofotômetro (por exemplo, NanoDrop 2000) para determinar a pureza. O DNA purificado normalmente tem uma relação A260/A280 entre 1,7 e 1,9 e tem até 200 kb de tamanho.
6. Armazene o DNA por um longo prazo a 2-8, -20 ou -80 °C.

3. Sequenciamento completo do exoma e análise de variantes

NOTA: Para procurar sistematicamente mutações genéticas causadoras de doenças, foi realizado o sequenciamento do exoma em indivíduos afetados (II-5, II-7, III-3, III-7, III-8, III-9 e IV-3) e indivíduos não afetados (III-2, III-5, IV-4).

1. Use a sonda de exoma de acordo com as instruções do fabricante para realizar a captura do exoma.
2. Aplique as bibliotecas qualificadas a 2 × sequenciamento de extremidade emparelhada de 150 pb na plataforma HiSeq X-ten. Consulte o Arquivo Suplementar 1.
3. Alinhe os arquivos FASTQ ao genoma humano de referência (hg19/GRCh37) com BWA v0.7.1318,19. Classifique os arquivos alinhados (arquivos de formato sam/bam) com samtools e sinalize duplicatas usando Picard. Consulte o Arquivo Suplementar 1.
4. Use o GATK, realinhe as leituras localmente e recalibre as qualidades básicas. Consulte o Arquivo Suplementar 1.
5. Gere estatísticas de mapeamento que incluam cobertura e profundidade de arquivos recalibrados por BEDTools e scripts perl/python internos.
6. Variantes de genótipo (SNVs e indels) de arquivos BAM recalibrados usando o modo de processamento de várias amostras da ferramenta HaplotypeCaller do GATK.
7. Use VQSR (recalibração do índice de qualidade variante) para reduzir os falsos positivos da chamada variante.
8. Anote SNVs e indels usando o software ANNOVAR21 em vários bancos de dados, incluindo o Exome Aggregation Consortium (ExAC) (http://exac.broadinstitute.org), o Exome Sequencing Project (ESP) (https://esp.gs.washington.edu) e 1.000 G (http://www.1000genomes.org). Interpretar a patogenicidade das variantes de sequência de acordo com as diretrizes do ACMG.

4. Sequenciamento de Sanger

1. Realizar o sequenciamento de Sanger para confirmar possíveis variantes causativas e determinar a segregação de variantes na família usando um sequenciador ABI 3500²³.
2. Projetar sequências de iniciadores para a variante no gene MYH7 (NM_000257) da seguinte forma: 5'-TTCAAACACAGAGACCTGCAGG-3' e 5'- CGGACTTCTCTAGCGCCTCTT -3'.
3. Confirme uma variante, filtre todos os membros da família disponíveis para determinar a segregação da variante dentro da família²³.

5. Geração de ratos knockin C57BL/6N-MYH7^{em1 (G823E)}

1. Use o sistema CRISPR/Cas9 para gerar camundongos knockin C57BL/6N-Myh7^em1(G823E ). O gene Myh7 do rato (número de adesão do GenBank: NM_001361607.1; Ensembl: ENSMUSG00000053093) está localizado no cromossomo 14 do rato e tem 41 éxons. O códon de início ATG no éxon 4 e o códon de parada TAG no éxon 41, e o G823E está localizado no éxon 23. Selecione o éxon 23 como o site de destino.
2. Projetar a sequência do vetor de direcionamento de gRNA e do oligo doador (com sequência de segmentação, ladeada por sequências homólogas de 134 pb combinadas em ambos os lados).
   1. Faça login no site do NCBI e clique na função de design de primer online BLAST à direita.
   2. Clique na função Primer-BLAST na parte inferior da página para criar iniciadores.
   3. Cole o número de sequência de referência NCBI MYH7 NM_000257.4 na caixa de modelo de PCR.
   4. Amplifice o fragmento alvo (MYH7 cDNA exon 23 e seus éxons adjacentes) de modo a projetar o primer a montante no éxon 21 (2392-2528) e o primer a jusante no éxon 25 (3205-3350). Insira o número do éxon dos primers a montante e a jusante na caixa de intervalo correta.
   5. Clique no botão Obter Primers na parte inferior para gerar automaticamente vários pares de primers.
3. Insira o gene MYH7 no banco de dados ZFIN, introduza o local de mutação p.g823e (GGG para GAG) no oligonucleotídeo do doador e a mutação silenciosa p.r819 (AGG para CGA) no éxon 23. A mutação silenciosa impede a ligação e o recorte da sequência pelo gRNA após o reparo direcionado por homologia.
   1. Projete o gRNA de acordo com a sequência geral, as sequências em ambas as extremidades são TAATACGACTCACTATA- e -GTTTTAGAGCTA. O meio da sequência é o site de destino mencionado acima.
4. Co-injetar mRNA Cas9, gRNA gerado por transcrição in vitro e oligo doador em óvulos fertilizados para produção de camundongos KI.
   1. Use o kit de detecção de eficiência de alvo Cas9/gRNA para transcrever o alvo de gRNA projetado em gRNA in vitro e detectar a atividade do transcrito (consulte as instruções do kit VK007 para métodos de detecção específicos) de acordo com o protocolo do fabricante.
   2. Descongele os componentes do kit de mRNA T7 ARCA, misture e gire o pulso em uma microfuga para coletar soluções para o fundo dos tubos. Monte a reação à temperatura ambiente na seguinte ordem: 2x mistura ARCA/NTP a 10 μL, 1 μg de DNA modelo, 2 μL de mistura de RNA polimerase T7 e água livre de nuclease a 20 μL.
   3. Misture bem e pulse-spin em um microfuge. Incubar a 37 °C durante 30 min.
   4. Remova o DNA molde adicionando 2 μL de DNase I, misture bem e incube a 37 °C por 15 min para obter mRNA.
   5. Realizar injeção intraperitoneal de gonadotrofina sérica e gonadotrofina coriônica humana em camundongos fêmeas C57BL/6 pré-preparados com cerca de 4 semanas de idade com uma seringa de 0,5 mL na dose de aproximadamente 5 U por camundongo com um intervalo entre as duas injeções de 48 h.
   6. Dezoito horas após a administração, sacrificar camundongos fêmeas C57BL/6 e um camundongo macho C57BL/6 de 8-12 semanas de idade por luxação cervical após injeção hormonal. Colete os óvulos e espermatozoides separadamente.
   7. O esperma é capacitado no fluido de capacitação. Pegue e solte o espermatozoide na borda do fluido nos óvulos de curta duração para fertilização in vitro por 3-4 h.
   8. Diluir o gRNA e o mRNA Cas9 transcritos com sucesso in vitro com água livre de RNase para 25 ng/μL e 50 ng/μL. Introduzir no citoplasma de ovos fertilizados de camundongos por microinjeção. Transplante de ovos fertilizados em boas condições para o oviduto aumentado das fêmeas de camundongos. Co-gaiola com ratos machos ligados.
5. Genótipo dos filhotes por PCR. Utilizar as seguintes condições de PCR: 94 °C durante 3 min, 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 60 °C durante 35 s e 72 °C durante 35 s; 72 °C durante 5 min. Siga com a análise de sequência.
   1. Corte as caudas de ratos de 4 meses de idade com uma tesoura e coloque-as em um tubo EP de 1,5 mL. Adicionar 180 μL de tampão GL, 20 μL de proteinase K e 10 μL de RNase A por peça de cauda (2-5 mm) em um tubo de microcentrífuga. Tenha cuidado para não cortar muito rabo.
   2. Incubar o tubo a 56 °C durante a noite.
   3. Gire em um tubo de microcentrífuga a 1.000 x g por 2 min para remover as impurezas.
   4. Adicionar 200 μL de Buffer GB e 200 μL de álcool etílico absoluto com mistura suficiente.
   5. Coloque a coluna de rotação em um tubo de coleta. Aplicar a amostra no spin e na centrífuga a 1.000 x g durante 2 minutos. Descarte o fluxo.
   6. Adicionar 500 μL de Buffer WA à coluna de rotação e centrifugar a 1.000 x g durante 1 min. Descarte o fluxo.
   7. Adicionar 700 μL de Buffer WB à coluna de rotação e centrifugar a 1.000 x g durante 1 min. Descarte o fluxo.
      NOTA: Certifique-se de que o buffer WB foi pré-misturado com etanol a 100%. Ao adicionar Buffer WB, adicione à parede do tubo para lavar o sal residual.
   8. Repita a etapa 5.5.7.
   9. Coloque a coluna de rotação em um tubo de coleta e centrifugar a 1.000 x g por 2 min.
   10. Coloque a coluna de rotação em um novo tubo de 1,5 mL. Adicione 50-200 μL de água esterilizada ou tampão de eluição ao centro da membrana da coluna e deixe a coluna repousar por 5 min.
       NOTA: O aquecimento de água esterilizada ou tampão de eluição até 65 °C pode aumentar o rendimento da eluição.
   11. Para eluír o DNA, centrifugar a coluna a 1.000 x g por 2 min. Para aumentar o rendimento de DNA, adicione o fluxo através e / ou 50-200 μL de água esterilizada ou tampão de eluição ao centro da membrana da coluna de spin e deixe a coluna repousar por 5 min. Centrífuga a 1.000 x g por 2 min.
   12. Quantificar o DNA genômico eluído por eletroforese.

6. Avaliação da morfologia e função cardíaca

NOTA: Aplicar ecocardiografia em modo M para avaliar a morfologia cardíaca e a função de camundongos knockin C57BL/6N-Myh7^em1(G823E ).

1. Coloque os ratos knockin em uma caixa de acrílico fechada conectada à máquina de anestesia e ajuste a interface de três vias para permitir que o isoflurano (concentração: 3%) flua para a caixa de acrílico. Depois que os ratos knockin pararem de se mover de forma autônoma, remova os ratos knockin.
2. Coloque os camundongos knockin na plataforma de monitoramento da vida útil da máquina de anestesia de pequenos animais e a anestesia inalatória contínua misturada com oxigênio (fluxo: 0,8 L/min) e isoflurano (concentração: 3%). Aplique lubrificante ocular nos ratos anestesiados para evitar a secagem da córnea.
3. Fixe os mouses knockin horizontalmente na plataforma. Incline a plataforma 30° caudal para o rato knockin. Remova o cabelo na parede torácica anterior do rato que bate usando um creme depilatório.
4. Posicione a sonda verticalmente com a protuberância voltada para a cabeça do animal. Em seguida, gire a sonda no sentido anti-horário, aproximadamente 45°.
5. Na visão paraesternal de eixo longo, gire a sonda 90° no sentido horário para observar a visão paraesternal de eixo curto. Depois de girar a sonda 90°, ajuste o deslocamento do eixo y para obter a fatia correta.
6. Observe a imagem de eixo longo do coração (Figura 1C) e selecione os dados de medição do modo M.
7. Adquirir dados de ultrassonografia de vistas paraesternais de eixo longo de camundongos (Figura 1). A frequência cardíaca (FC), a fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE), o débito cardíaco (CO), a dimensão diastólica final do ventrículo esquerdo (DSVE), a dimensão diastólica final do ventrículo esquerdo (DSVE), o septo interventricular (IVS) e a parede posterior do ventrículo esquerdo (PCVE) são medidos.
8. Após a medição, forneça oxigênio aos ratos e coloque-os de volta em suas respectivas gaiolas quando recuperarem a atividade autônoma.

Perfil clínico das famílias
Os pedigrees familiares da CMH foram obtidos e são apresentados na Figura 2. Todos os membros da família documentados foram diagnosticados com CMH no momento da inscrição.

Na família (Figura 2A), o probando foi o paciente III-7, que foi diagnosticado com CMH e obstrução da via de saída do ventrículo esquerdo (VOTO) aos 46 anos e submetido a cirurgia cardíaca. O paciente III-3 tinha CMH menor que não necessitou de tratamento cirúrgico. O paciente IV-3 também tinha CMH menor, que era semelhante ao seu pai, o paciente III-3. O paciente II-5 era portador de CMH e foi submetido à cirurgia para correção do defeito aos 51 anos de idade devido à OVVE. O paciente I-1 e o paciente II-2 faleceram devido a acidentes cardíacos aos 57 e 46 anos de idade, respectivamente. A história médica do paciente I-1 não estava disponível. O paciente II-7 e o paciente III-9 apresentaram dispneia e foram diagnosticados com CMH.

Análise da sequência do exoma e segregação de variantes
Nessa família, o sequenciamento do exoma dos cinco indivíduos gerou uma média de um total de 19.978.731 pares de leituras sequenciadas com um comprimento médio de leitura de 125 pb. No total, 98,72% das leituras sequenciadas passaram na avaliação de qualidade e foram mapeadas para 98,66% do genoma humano de referência. Mesmo após a filtragem, mais de 42 variantes (incluindo substituições de nucleotídeos únicos e indels) foram compartilhadas por esses quatro pacientes. Destes, 27 eram SNVs incorretos, 15 foram previstos para alterar o splicing. Finalmente, de acordo com as diretrizes de classificação ACMG, um c.G2468A heterozigoto; A variante p.G823E do MYH7 (NM_0002571) foi observada no probando III-7, bem como nos outros três pacientes.

Identificação de uma mutação patogénica
O sequenciamento de Sanger confirmou a mesma variante MYH7 p.G823E em todos os pacientes, mas não nos indivíduos saudáveis das famílias e 174 controles (Figura 2B). O heterozigoto MYH7 p.G823E completamente co-segregado nesta família. Nesta família, os pacientes IV-3 que abrigavam essa variante a herdaram do paciente III-3. Os pacientes III-7 e III-8 carregavam a mesma variante, que foi herdada de seu pai. As informações para o paciente III-9 não estavam disponíveis.

Esta variante, previamente descrita na CMH por um paciente esporádico24, não foi relatada nas bases de dados 1000 G, ESP6500, ExAC, HGMD, ClinVar ou indivíduos controle. O resíduo de glicina no códon 823 na região do domínio cervical de MYH7 é altamente conservado em todas as sequências de miosina de vertebrados disponíveis (Figura 2C). O MYH7 é um gene causador de CMH conhecido e desempenha um papel importante no desenvolvimento cardíaco ou na estrutura/função. Com base nos padrões e diretrizes do ACMG, a variante MYH7 p.G823E foi prevista como uma variante patogênica (PVS1 + PS3 + PS4 + PM2). Tomados em conjunto, esses resultados sustentam que essa variante é prejudicial e contribui para a patogênese da CMH nessas famílias.

Camundongos knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E) desenvolveram hipertrofia cardíaca grave
Para verificar ainda mais a patogênese do MYH7 p.G823E, geramos camundongos knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E). Os camundongos knockin C57BL/6N-MYH7em1(G823E) desenvolveram hipertrofia cardíaca dependente da idade após o nascimento (Figura 2A,B). A ecocardiografia revelou que a SIV e a PVVE se desenvolveram com aumento da FC em camundongos knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E) (Tabela 1). Esses resultados também foram validados por análise histológica (Figura 3). Não houve diferenças óbvias em DDVE, DDVE, FE ou CO entre camundongos do tipo selvagem e heterozigotos (Tabela 1).

Figura 1: Aquisição de dados de ultrassom . (A) A sonda está localizada no eixo longo do esterno. (B) A sonda está localizada no eixo curto do esterno. (C) Imagem ultrassonográfica em modo M da visão de eixo longo do esterno. A seta amarela indica a localização do septo interventricular. A seta vermelha indica a válvula flutuante. (D) Imagem ultrassonográfica em modo M da visão de eixo curto do esterno. A seta amarela indica a localização do músculo papilar anterior, e a protuberância abaixo é o músculo papilar posterior. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: A grande família portadora da variante heterozigótica MYH7 G823E . (A) O probando é marcado por uma seta. Círculos e quadrados cheios e abertos indicam indivíduos afetados e normais, respectivamente. (B) A variante G823E no MYH7 confirmada pelo sequenciamento de Sanger. (C) Conservação do sítio MYH7 G823E em diferentes espécies. A seta amarela representa o local de G823E na sequência de aminoácidos de diferentes espécies, que é altamente conservada. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Alterações patológicas do tecido miocárdico. (A) As fibras miocárdicas estão dispostas de forma ordenada, não havendo diferença significativa entre cada parte. (B) A hipertrofia das fibras musculares ventriculares, o arranjo desordenado e as lesões concentram-se principalmente na parede posterior do ventrículo esquerdo e no septo interventricular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Morfologia e análise de função para p.G823E e tipo selvagem. Os dados foram analisados por meio do programa SPSS. As variáveis contínuas são expressas como média ± desvio padrão (DP). Os testes de soma de postos t de Student ou Wilcoxon para variáveis contínuas. Valores de p abaixo de 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Arquivo Suplementar 1. Clique aqui para baixar este arquivo.

Os autores não têm conflitos de interesse financeiros a declarar.