Summary
Unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) produzierten wir lentivirale Partikel für die stabile Expression von shRNAs in H9-humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und transienten H9-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) mit hoher Effizienz.
Abstract
Das aktuelle Protokoll beschreibt die Verwendung von lentiviralen Partikeln für die Abgabe von Kurzhaarnadel-RNAs (shRNAs) sowohl an humane embryonale Stammzellen (hESCs) als auch an neurale Vorläuferzellen (NPCs), die von hESCs mit hoher Effizienz gewonnen werden. Lentivirale Partikel wurden durch Co-Transfizierung von HEK293T-Zellen unter Verwendung von Eintrittsvektoren (mit shRNAs) zusammen mit Verpackungsplasmiden (pAX und pMD2.G) unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) erzeugt. Viruspartikel wurden mittels Ultrazentrifugation konzentriert, was zu durchschnittlichen Titern über 5 x 107 führte. Sowohl hESCs als auch NPCs konnten mit diesen lentiviralen Partikeln mit hoher Effizienz infiziert werden, wie die Puromycin-Selektion und die stabile Expression in hES-Zellen sowie die vorübergehende GFP-Expression in NPCs zeigen. Darüber hinaus zeigte die Western-Blot-Analyse eine signifikante Verringerung der Expression von Genen, auf die shRNAs abzielen. Darüber hinaus behielten die Zellen ihre Pluripotenz sowie ihr Differenzierungspotenzial bei, was durch ihre anschließende Differenzierung in verschiedene ZNS-Linien belegt wird. Das aktuelle Protokoll befasst sich mit der Abgabe von shRNAs; Der gleiche Ansatz könnte jedoch für die ektopische Expression von cDNAs für Überexpressionsstudien verwendet werden.
Introduction
Humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen), die aus der inneren Zellmasse der Blastozyste gewonnen werden, sind pluripotent und können unter In-vitro-Bedingungen in Abhängigkeit von äußeren Faktoren in verschiedene Zelltypen differenziert werden 1,2. Um das Potenzial von hES-Zellen voll auszuschöpfen, ist es unerlässlich, schnelle und zuverlässige Genabgabemethoden für diese Zellen zu haben. Herkömmlicherweise können die verwendeten Techniken grob in zwei Arten eingeteilt werden: nichtvirale und virale Gen-Delivery-Systeme 3,4. Die am häufigsten verwendeten nichtviralen Genabgabesysteme sind Lipofektion, Elektroporation und Nukleofektion. Nichtvirale Verabreichungssysteme sind vorteilhaft wegen weniger Insertionsmutationen und einer Gesamtabnahme der Immunogenität 5,6. Diese Methoden führen jedoch zu einer geringen Transfektionseffizienz und einer kurzen Dauer der transienten Genexpression, was eine große Einschränkung für Langzeitdifferenzierungsstudien darstellt7. Elektroporation führt zu besseren Transfektionseffizienzen im Vergleich zur Lipofektion; Es führt jedoch zu mehr als 50% Zelltod 8,9,10. Mit Hilfe der Nukleofektion können das Zellüberleben und die Transfektionseffizienz durch die Kombination von Lipofektion und Elektroporation verbessert werden, aber der Ansatz erfordert zellspezifische Puffer und spezielle Ausrüstung und wird daher für skalierte Anwendungen ziemlich kostspielig11,12.
Im Gegensatz dazu haben virale Vektoren verbesserte Transfektionseffizienzen sowie eine insgesamt geringe Zytotoxizität nach der Transduktion gezeigt. Darüber hinaus werden die gelieferten Gene stabil exprimiert und machen diese Methode daher ideal für Langzeitstudien13. Zu den am häufigsten verwendeten viralen Vektoren für die Genabgabe in hES-Zellen gehören lentivirale Vektoren (LVS), die eine Transduktionseffizienz von mehr als 80% unter Verwendung von Viruspartikeln mit hohem Titerergeben können 14,15. Lipofektion und CaPO4-Fällung gehören zu den am häufigsten verwendeten Methoden, um HEK293T-Zellen oder seine Derivate mit Gentransfervektoren zusammen mit Verpackungsplasmiden vorübergehend zu transfektieren, um lentivirale Partikelzu erhalten 16. Obwohl die Lipofektion zu einer guten Transfektionseffizienz und einer geringen Zytotoxizität führt, wird die Technik durch ihre Kosten behindert, und eine Skalierung auf lentivirale Partikel mit hohem Titer wäre sehr kostspielig. Die CaPO4-Fällung führt zu relativ ähnlichen Transfektionseffizienzen wie bei der Lipofektion. Obwohl kostengünstig, führt die CaPO 4-Fällung zu einem signifikanten Zelltod nach Transfektionen, was es schwierig macht, Batch-to-Batch-Variationen zu standardisieren undzu vermeiden 17. In diesem Szenario ist die Entwicklung einer Methode, die eine hohe Transfektionseffizienz, eine geringe Zytotoxizität und Kosteneffizienz bietet, entscheidend für die Herstellung von lentiviralen Partikeln mit hohem Titer, die in hES-Zellen verwendet werden sollen.
Polyethylenimin (PEI) ist ein kationisches Polymer, das HEK293T-Zellen mit hoher Effizienz ohne viel Zytotoxizität transfizieren kann und im Vergleich zu lipofektionsbasierten Methoden vernachlässigbare Kosten verursacht18. In dieser Situation kann PEI für skalierte Anwendungen der LVS-Produktion mit hohem Titer durch die Konzentration von lentiviralen Partikeln aus Kulturüberständen unter Verwendung verschiedener Techniken verwendet werden. Der vorgestellte Artikel beschreibt die Verwendung von PEI zur Transfizierung von HEK293T-Zellen und die lentivirale Vektorkonzentration mittels Ultrazentrifugation durch ein Saccharosekissen. Mit dieser Methode erhalten wir regelmäßig Titer weit über 5 x 107 IE / ml mit geringen Variationen. Die Methode ist einfach, unkompliziert und kostengünstig für skalierte Anwendungen zur Genabgabe an hES-Zellen und von hESCs abgeleitete Zellen.
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Protocol
1. Transfektion von HEK293T-Zellen mit PEI- oder Lipofectamine 3000-Reagenz
- Kultur HEK293T-Zellen in DMEM + 10% FBS + 1x Penicillin/Streptomycin bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO2 und 21% O2, bis sie zu 90% konfluent sind, bevor sie zur Transfektion ausgesät werden. Verwenden Sie eine relativ niedrige Passageanzahl von Zellen für eine Virusproduktion mit hohem Titer (idealerweise weniger als P30).
- Samen Sie 4 x 106 Zellen in 10 ml vollständigem Wachstumsmedium in einer 100 mm Gewebekulturplatte und wachsen Sie über Nacht in einem befeuchteten Gewebekulturinkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 und 21%O2.
- Verdünnen Sie für jede Transfektion die Plasmid-DNA (1 mg/ml Vorräte) in 1 ml serumfreiem DMEM-Medium in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen unter Verwendung des folgenden Verhältnisses von Eintritts- und Verpackungsplasmiden:
Eintrittsvektor = 10 μg
psPAX2,0 = 7,5 μg
pMD2.G = 5 μg - Wirbeln Sie für 10 s und drehen Sie das Rohr bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um es zu sammeln.
- Geben Sie 70 μL (1 mg/ml Stammlösung) PEI in die Röhre und wirbeln und drehen Sie sie kurz wie oben beschrieben, um sie zu sammeln. Das verwendete PEI-Volumen basiert auf einem Verhältnis von 1:3 aus Gesamt-DNA (μg):P EI (μg).
- Für die Lipofectamin-basierte Transfektion verdünnen Sie die oben genannten Vektoren in 500 μL serumfreier DMEM-Medien, die 45 μL Reagenz P enthalten, das im Kit enthalten ist, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min.
- Verdünnen Sie 70 μL Reagenz L, das im Kit enthalten ist, mit 500 μL serumfreien DMEM-Medien und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min.
- Kombinieren Sie den Inhalt beider Rohre und inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 20 Minuten, um eine komplexe Bildung zu ermöglichen.
- Tropfenweise 1 ml DNA/PEI oder 1 ml DNA/Lipofectamin-Komplexe in die Platte gebende Zellen geben und 6 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO2 und 21%O2 inkubieren.
- Nach 6 h auf frische, vollständige Wachstumsmedien (10 ml) umstellen und die Zellen mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 und 21% O 2 in den befeuchteten Inkubator zurückbringen.
2. LVS-Sammlung und Ultrazentrifugation
- Nach 2 Tagen Transfektion sammeln Sie die virushaltigen Medien und überlagern die Zellen erneut mit 10 ml frischen, vollständigen Wachstumsmedien.
- Sammeln Sie nach 3 Tagen Transfektion die virushaltigen Medien und kombinieren Sie sie mit den virushaltigen Medien, die zum Zeitpunkt von 2 Tagen gesammelt wurden.
- Zentrifugieren Sie den viralen Überstand bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C, um Zelltrümmer zu pelletieren.
- Filtern Sie den Überstand mit einem 0,45 μm porengroßen Filter mit niedriger Proteinbindung (entweder PES oder SFCA) und lagern Sie ihn bei 4 °C, bis er für die Ultrazentrifugation bereit ist. Der filtrierte Überstand, der lentivirale Partikel enthält, kann 5 Tage lang bei 4 °C gelagert werden, ohne dass es zu einem signifikanten Verlust an viralen Titern kommt.
- Sterilisieren Sie die Ultrazentrifugenröhrchen, die Becher halten, indem Sie sie 10 min lang mit 70% Ethanol waschen, an der Luft trocknen, schließen und bei 4 ° C aufbewahren.
- 36 ml filtrierte Medien, die lentivirale Partikel enthalten, in ein steriles Ultrazentrifugenröhrchen geben.
- Füllen Sie 5 ml einer sterilen Stripette mit 4 ml steriler 20%iger Saccharoselösung (hergestellt in PBS) und dosieren Sie sie direkt auf den Boden des Ultrazentrifugenröhrchens (UC), das LVS enthält. Es ist wichtig, dass die Saccharoselösung nicht mit dem Medium vermischt wird und einen Gradienten am Boden des Röhrchens bildet.
- Balancieren Sie alle Ultrazentrifugenröhrchen mit serumfreien DMEM-Medien, legen Sie sie in die kalten Ultrazentrifugenröhrchen-Haltebecher und schließen Sie die Deckel.
- Drehen Sie die Röhrchen bei 125.000 x g für 2 h bei 4 °C.
- Nach dem Spin entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, indem Sie den Inhalt des Röhrchens in einem Behälter mit Bleichmittel umkehren, ohne das Pellet zu stören. Markieren Sie das Pellet, falls sichtbar.
- Legen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen in ein 50 ml steriles Röhrchen und fügen Sie 200 μL sterile DPBS genau an der Oberseite des Pellets hinzu. Über Nacht ungestört bei 4 °C aufbewahren.
- Am nächsten Tag vorsichtig mischen, indem Sie 40x auf und ab pipettieren.
- In einer Tischzentrifuge kurz mit 13.000 x g drehen, um Ablagerungen zu pelletieren.
- Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre und aliquotieren Sie das Viruspräparat als 20 μL Aliquote. Bei −80 °C lagern.
- 5 μL des Präparats für virale Titermessungen beiseite legen.
3. LVS-Titermessung für pLKO.1-basierte Vektoren
- Bestimmen Sie den Titer von lentiviralen Partikeln mittels einer qPCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers.
- Für eine Standardkurve bereiten Sie fünf 10-fache serielle Verdünnungen von Standardkontroll-DNA (im Kit enthalten) vor, indem Sie in jedem Schritt 5 μL DNA in 45 μL nukleasefreiesH2Overdünnen. Verwenden Sie Verdünnungen von 1:100 bis 1:100.000, um eine Standardkurve zu erzeugen.
- Richten Sie Reaktionen auf Eis wie folgt in Duplikaten ein:
2x qPCR Master Mix 10 μL
Primermischung 2 μL
Probe oder Standard-DNA 2 μL
NukleasefreiH2 O6 μL - Führen Sie die qPCR unter Verwendung der im Handbuch des Kits genannten Zyklusbedingungen für insgesamt 35 Zyklen durch.
- Zeichnen Sie Zyklusschwellenwerte (Ct) auf der Y-Achse im Vergleich zum Virustiter auf der X-Achse auf.
- Generieren Sie eine logarithmische Regression unter Verwendung von vier Standard-Kontroll-DNA-Verdünnungen (1:100 bis 1:100.000), um den unbekannten Virusprobentiter mithilfe einer Trendliniengleichung zu bestimmen.
4. LVS-Titermessung für pll3.7-basierte Vektoren
- Samen Sie 1 x 105 HEK293T-Zellen in jeder Vertiefung einer P12-Well-Platte in 1 ml vollständiger Wachstumsmedien 24 h vor Infektionen.
- Ergänzen Sie das Medium mit 8 μg/ml Polybren und geben Sie 1 ml in jedes sterile 1,5 ml Röhrchen.
- Verdünnen Sie die viralen Partikel mit 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0,5 μL und 0,1 μL konzentrierten lentiviralen Partikeln in jedem der 1 ml polybrenenhaltigen Medien.
- Ersetzen Sie die Medien aus HEK293T-Zellen durch die Medien, die die angegebenen Mengen an lentiviralenPartikeln zusammen mit 8 μg/ml Polybren enthalten, und inkubieren Sie für 24 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 und 21%O2.
- Am nächsten Tag wechseln Sie zu frischen Medien und setzen die Kultur für 72 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 und 21% O2 fort.
- Nach 72 h die Zellen mit PBS waschen, bei 37 °C gemäß dem Protokoll des Herstellers trypsinisieren und in 1 ml PBS resuspendieren.
- Führen Sie die FACS-Zellsortierung mit einem Zellsortierer gemäß den Empfehlungen des Herstellers durch. Setzen Sie das Gate auf 0% GFP-positive Zellen mit nicht infizierten HEK293T-Zellen und zählen Sie 50.000 Ereignisse für jede Probe, um den Prozentsatz der positiven Zellen für jede virale Verdünnung zu bestimmen.
- Verwenden Sie nur die Volumina lentiviraler Partikel, die %GFP-positive Zellen im Bereich von 2% -20% ergeben, um den Titer der lentiviralen Partikel zu berechnen.
5. Infektion von hES-Zellen und stabile Selektion
- Waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS, die in jeder Vertiefung einer 6-Well-Zellkultur-Multiwell-Platte wachsen.
- Lösen Sie die Zellen von der Zellkulturplatte mit 1 ml 1x Zelldissoziationsreagenz durch Inkubation bei 37 °C für 5 min.
- Sammeln Sie die Zellen in DMEM/F12-Medien und zentrifugieren Sie bei 1.500 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um das Zellpellet zu sammeln.
- Aspirieren, resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml und zählen Sie mit einem Hämozytometer.
- Machen Sie eine Zellsuspension mit 2 x 105 Zellen / ml vollständiger Wachstumsmedien, die mTeSR1 enthalten, ergänzt mit 10 ng / ml basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), Penicillin / Streptomycin (P / S) und 10 μM ROCK-Inhibitor (RI).
- Samen Sie 1 x 10 5 Zellen auf 50x verdünnten kompletten Basalmembran-matrixbeschichteten P24-Well-Platten in 500 μL kompletten Wachstumsmedien und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von5% CO 2 und 21%O2.
- Am folgenden Tag hES-Zellen bei einer Multiplizität von Infektionen (MOI) von 10 mit 8 μg/ml Polybren infizieren und bei 37 °C für 8 h inkubieren.
- Ersetzen Sie nach 8 h die virushaltigen Medien durch frische Wachstumsmedien (-RI) und setzen Sie die Kultur fort, bis die Zellen zu 90% konfluent sind.
- Beginnen Sie mit der Puromycin-Selektion (0,8 μg / ml), wenn die Zellen eine Konfluenz von 90% erreichen, was normalerweise 48-72 h nach der Infektion entspricht.
- Nachdem die Selektion abgeschlossen ist (normalerweise 4-6 Tage), teilen Sie die stabilen Zellen (1: 4) auf und erweitern Sie die Zellen für die Kryokonservierung und weitere Analyse.
6. Transduktion von H9-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs)
HINWEIS: NPCs wurden von H9-Zellen unter Verwendung eines Dual-Smad-Hemmungsprotokolls abgeleitet, wie zuvorbeschrieben 19.
- Kurz gesagt, behandeln Sie H9-Zellen mit Zelldissoziationsreagenz bei 37 ° C für 5 Minuten, um einzelne Zellen zu erzeugen und in vollständigen Wachstumsmedien zu resuspendieren, die mTeSR1 enthalten, ergänzt mit 10 ng / ml basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), Penicillin / Streptomycin (P / S) und 10 μM ROCK-Inhibitor (RI). Samen auf 1:50 verdünnten Matrigel-beschichteten 6-Well-Zellkulturschalen bei einer Dichte von 60.000 Zellen/cm2 (Tag 0).
- Initiieren Sie die Differenzierung, wenn die Zellen eine Konfluenz von 95% -100% erreichen, indem Sie zu 100% KSR-Medien wechseln, die LDN193189 (200 nM) und SB431542 (10 μM) (Tag 1) enthalten.
- Wechseln Sie am Tag 2 erneut das Medium mit 100% KSR, ergänzt mit LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) und XAV939 (5 μM).
- Wechseln Sie am Tag 4 der Differenzierung zu einer Mischung aus KSR-Medium (75%) und N2-Medium (25%) mit LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) und XAV939 (5 μM).
- Wechseln Sie von Tag 6 bis Tag 12 schrittweise auf 100% N2, ergänzt mit LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) und XAV939 (5 μM), indem Sie das N2-Medium täglich um 25% erhöhen und das Medium alle 2 Tage wechseln.
- Kulturtag 12 NPCs in N2:B27 Medien ergänzt um 20 ng/ml bFGF.
- Samen Sie 2 x 10 5 Zellen in jeder Vertiefung einer 1:50 verdünnten vollständigen Basalmembranmatrix-beschichteten P6-Platte in 2 ml NPCs-Kulturmedien und inkubieren Sie, damit sich die Zellenanheften können.
- Am nächsten Tag infizieren Sie die Zellen mit lentiviralen Partikeln bei einem MOI 6 in Gegenwart von 8 μg/ml Polybren.
- Ersetzen Sie nach 8 h die virushaltigen Medien durch frische NPC-Wachstumsmedien.
- Wiederholen Sie am nächsten Tag die Infektionen und wechseln Sie das Medium um 8 Uhr.
- Bewahren Sie die Zellen vor der Ernte zur weiteren Analyse 72 Stunden lang in Kultur auf.
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Representative Results
Nach dem Gentransfer ist unweigerlich eine hohe Lebensfähigkeit von hES-Zellen erforderlich. Trotz der Bemühungen und der Optimierung von Protokollen zur Reduzierung des Zelltods nach der Elektroporation von hES-Zellen wird nach der Elektroporation dieser Zellen immer noch ein Zelltod von mehr als 50% beobachtet, zusammen mit einer niedrigen Transfektionseffizienz20. Der lentiviral vermittelte Gentransfer führt nicht nur zu einer hohen Effizienz des Gentransfers, sondern zeigt auch eine hohe Zelllebensfähigkeit nach der Transduktion. Die folgenden Ergebnisse stellen zwei Ansätze vor: einen mit GFP als Reporter und transiente Expression in hESCs-abgeleiteten NPCs und den anderen mit Puromycin für die stabile Selektion von hESCs für langfristige Differenzierungsexperimente.
In der ersten Reihe von Experimenten wurden lentivirale Partikel durch Co-Transfektion von shRNAs hergestellt, die den pll3.7-Vektor mit GFP als Reporter zusammen mit den lentiviralen Verpackungsplasmiden der zweiten Generation psPAX2.0 und pMD2.G trugen. Lentivirale Partikel wurden nach 48 h und 72 h nach der Transfektion gesammelt und mittels Ultrazentrifugation konzentriert. Abbildung 1A zeigt die reichliche GFP-Expression in HEK293T-Zellen nach 72 h Transfektion. Die Expression viraler Proteine führte auch zur Synzytiabildung von HEK293T-Zellen, in denen einzelne Zellen miteinander verschmolzen sind, wie die Pfeile in Abbildung 1A zeigen. Die Titer wurden mittels FACS-Analyse bestimmt. Wir verglichen auch die lentiviralen Titer mit kostengünstigem PEI- und Lipofectamine 3000-Reagenz und fanden keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden in Bezug auf virale Titer (Abbildung 2A). Als nächstes wurden H9 hESCs-abgeleitete NPCs zweimal mit diesen GFP-haltigen lentiviralen Partikeln bei einem MOI von 6 infiziert und für die Analyse nach 72 h geerntet. Abbildung 1B zeigt eine deutliche Expression von GFP in NPCs nach der Infektion. Wie oben diskutiert, ist es für langfristige Differenzierungsexperimente unerlässlich, hESCs zu haben, die stabil shRNAs exprimieren. In einem Versuch, stabile Zelllinien zu schaffen, die shRNA für verschiedene Gene exprimieren, verwendeten wir plKO.1-basierte Vektoren und klonierte shRNAs gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Als nächstes wurden lentivirale Partikel wie oben beschrieben hergestellt, und Titer wurden mit einem kommerziellen lentiviralen Titer-Messkit unter Verwendung von qPCR-basierten Methoden bestimmt (Abbildung 2B). hES-Zellen wurden mit lentiviralen Partikeln bei einem MOI von 10 infiziert und mittels Puromycin-Selektion ausgewählt. Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse einer stabilen Selektion von hES-Zellen nach der Transduktion. Nach 5 Tagen Selektion mit 0,8 μg/ml Puromycin zeigten lentivirale transfizierte Zellen eine Zelllebensfähigkeit von mehr als 80% im Vergleich zu nicht transduzierten Zellen, bei denen keine Zellen die Behandlung überlebten. Nach der Selektion wurden die stabil transduzierten H9-Zellen weiter expandiert, kryokonserviert und mit Western Blot analysiert, um einen effizienten Gen-Knockdown zu untersuchen.
In unserem Labor haben wir mehrere stabile Zelllinien von H9-hES-Zellen erstellt, die shRNAs für verschiedene Gene mit dem oben genannten Ansatz exprimieren. Hier haben wir die Ergebnisse eines davon vorgestellt, nämlich das L-2-Hydroxyglutarat-Dehydrogenase (L2HGDH) -Gen unter Verwendung der Western-Blot-Analyse. Eine reichliche Expression von L2HGDH wird in Zellen beobachtet, die mit leerem Vektorrückgrat transduziert wurden. Es wird jedoch keine Expression von L2HGDH in Zellen beobachtet, die mit einem Vektor transduziert wurden, der shRNAs für L2HGDH trägt, was die Wirksamkeit der stabilen Erzeugung einer H9 hESC-Zelllinie mit reduzierter Expression von L2HGDH zeigt, die für weitere Differenzierungsstudien verwendet werden kann (Abbildung 4).
Abbildung 1: Expression von GFP in HEK293T-Zellen und viral-infizierten NPCs . (A) shRNAs wurden zu einem pll3.7-Vektor mit GFP als Reporter kloniert und mit Verpackungsplasmiden in HEK293T-Zellen unter Verwendung von PEI co-transfiziert. Die hohe GFP-Expression zeigt eine effiziente Transfektionseffizienz nach 72 h Transfektion. Pfeile weisen auf die Synzytienbildung in den HEK293T-Zellen hin, wo Gruppen einzelner HEK293T-Zellen aufgrund der Expression viraler Proteine miteinander verschmolzen sind. (B) H9-abgeleitete NPCs wurden zweimal bei einem MOI von 6 mit lentiviralen Partikeln infiziert, die GFP als Reporter enthielten, und die GFP-Expression wurde bei 72 h nach der Infektion beobachtet. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: LVS-Titermessungen. (A) Virale Titer für pll3.7-basierte Vektoren wurden mittels FACS-Analyse gemessen, indem die %GFP-positiven Zellen für jene viralen Verdünnungen quantifiziert wurden, die 2%-20% GFP-positive Zellen ergaben. (B) Virale Titer für pLKO.1-basierte Vektoren wurden unter Verwendung eines kommerziellen qPCR-Lentivirus-Titer-Kits gemäß den Empfehlungen des Herstellers bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Etablierung stabiler shRNA-exprimierender H9-hESC-Linien. shRNAs wurden in pLKO.1-basierte lentivirale Vektoren kloniert, die das Puromycin-Selektionsgen tragen. H9-hES-Zellen wurden mit lentiviralen Partikeln bei einem MOI von 10 infiziert und mit Puromycin ausgewählt. Unter Verwendung von 0,8 μg / ml Puromycin für 5 Tage wurden 100% der nicht infizierten Zellen getötet, während die meisten Zellen die Behandlung in der viral infizierten Gruppe überlebten. Diese Zellen wurden ohne klonale Selektion zur Kryokonservierung und weiteren Analyse expandiert. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Eine repräsentative Western-Blot-Analyse für einen stabilen Knockdown des L2HGDH-Gens in H9-hES-Zentren. Die Gesamtzelllysate von Negativkontrollzellen (H9, puro uncut) sowie Zellen, die stabil shRNAs gegen L2HGDH (H9, sh-L2HGDH) exprimieren, wurden mit dem Anti-L2HGDH-Antikörper einem Western Blot unterzogen. Wie in der Abbildung gezeigt, wurde keine Expression von L2HGDH in H9 hESCs beobachtet, die stabil shRNAs für L2HGDH exprimieren. Eine unspezifische Bande wurde knapp über der spezifischen Bande beobachtet, die dem korrekten Molekulargewicht von 46-48 kDa (angezeigt durch ein Dreieck) für den L2HGDH-Antikörper entspricht. Anti-GAPDH wurde als Ladekontrolle verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Fähigkeit, Stammzellen für Studien- oder klinische Zwecke genetisch zu verändern, ist sowohl durch die Technologie als auch durch das grundlegende Verständnis der Biologie von hES-Zellen begrenzt. Techniken, die ein signifikantes Potenzial in Maus-ES-Zellen gezeigt haben, wie Liofektion und Elektroporation, sind für hES-Zellen nicht sehr effizient, die für die Genlieferung mit herkömmlichen Methoden notorisch schwierig sind20. Dieser Gedanke hat nicht nur zur Optimierung bestehender Techniken geführt, sondern auch zur Entwicklung neuartiger Methoden zur Steigerung der Transfektionseffizienz in hES-Systemen. Der Schwerpunkt dieser neuen Entwicklungen lag auf einer effizienten und stabilen Genabgabe an hES-Zellen bei gleichzeitiger minimaler Auswirkung auf das Wachstum, die Pluripotenz und das Differenzierungspotenzial von hES-Zellen über längere Zeiträume. Zu den verschiedenen Neuentwicklungen, die diese strengen Kriterien erfüllen, gehört der lentiviral vermittelte Gentransfer zuhES-Zellen 21,22. Für die Produktion von lentiviralen Partikeln, die ein bestimmtes Gen exprimieren, wird das gewünschte Gen in einem der Transfervektoren kloniert und in HEK293T-Zellen zusammen mit Verpackungsplasmiden transfiziert, um einen Zellkulturüberstand zu ernten, der lentivirale Partikel enthält. Für die Verwendung in hES-Zellen ist es wichtig, diese Viruspartikel mit verschiedenen Techniken zu konzentrieren, um hohe Titer von Viren mindestens im Bereich von 1 x 107-1 x 108 IE / ml zu erhalten. Im Allgemeinen werden große Mengen von LVS von 200x-500x dem ursprünglichen Volumen konzentriert, um diese Titer zu erreichen. Dies bedeutet, dass die Verwendung einer äußerst kostengünstigen Methode ohne Beeinträchtigung der Transfektionseffizienz in HEK293T-Zellen eine Voraussetzung dafür ist, dass diese Methoden routinemäßig im Labor eingesetzt werden können. Das vorliegende Verfahren beschreibt die Verwendung des kationischen Polymers PEI als kostengünstiges Verfahren zur Herstellung großer Mengen von LVS mit einer Transfektionseffizienz ähnlich wie bei lipofektionsbasierten Methoden, die als Goldstandard gelten. Mit der vorgestellten Methode können wir durchschnittliche LVS-Titer weit über 5 x 107 IE / ml nach einem Konzentrationsfaktor von 200x dem ursprünglichen Volumen erhalten. Mit diesen LVS-Partikeln konnten wir mehrere stabile Zelllinien von H9-hES-Zellen etablieren, die shRNAs für mehrere Gene exprimieren, indem wir die Zellen bei hohen MOIs infizierten. Die hier vorgestellte Methode umgeht die Verwendung langwieriger und zeitaufwendiger Methoden der klonalen Selektion und Expansion, während sie immer noch Knockdown-Wirkungsgrade von nahezu 100% erreicht, wie eines der repräsentativen Western-Blot-Ergebnisse für L2HGDH-Gen-Knockdown in Abbildung 4 zeigt. Im Folgenden finden Sie einige der Empfehlungen für einen erfolgreichen Ansatz.
Die Verwendung einer niedrigen Passagezahl von HEK293T-Zellen ist erforderlich (idealerweise unter 30) für hohe virale Titer. Der Zusammenfluss von HEK293T-Zellen ist in dieser Hinsicht ein weiterer wichtiger Faktor. HEK293T-Zellen müssen vor der Transfektion zu mindestens 80% konfluent sein, da der Zell-Zell-Kontakt die Zytotoxizität stark reduziert und die Virusproduktion verbessert. Die verwendeten Vektoren müssen unter Verwendung von endotoxinfreien Plasmid-Isolationskits mit anschließender Ethanolfällung hergestellt und vor der Verwendung zur Transfektion in einer Mindestkonzentration von 1 mg/ml rekonstituiert werden. Es könnte Batch-to-Batch-Variationen von PEI-Lösungen geben, die zu unterschiedlichen Terminen vorbereitet werden. Aus diesem Grund muss jede Charge der PEI-Lösung zunächst unter Verwendung von GFP-Vektoren auf ihre Leistung getestet werden, und die Lösung muss bei −20 °C in Einweg-Aliquots gelagert werden, um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden. Bei hohen Titern wird die Sammlung von LVS-Überständen nach 72 h Transfektion von HEK293T-Zellen nur empfohlen, sofern die Zellen gesund und gebunden sind. Die Filtration des LVS-haltigen Überstands erhöht die Löslichkeit von LVS nach der Ultrazentrifugation erheblich. Es wird nicht empfohlen, den LVS-Überstand länger als 5 Tage bei 4 °C zu lagern, da dies zu einer signifikanten Verringerung der Virustiter führt. Für optimale Titer ist ein Saccharosegradient während der Ultrazentrifugation erforderlich. Die Temperaturen müssen während aller Schritte der Ultrazentrifugation in der Nähe von 4 ° C gehalten werden. Für eine vollständige Resuspension ist eine Inkubation von konzentrierten LVS-Partikeln in DPBS über Nacht erforderlich. Die Zentrifugation nach der Resuspension von LVS entfernt Zelltrümmer (falls vorhanden), da sie bei der Anwendung auf Zielzellen Zytotoxizität verursachen können. Nach der Infektion von H9-Zellen ist es wichtig, die virushaltigen Medien nach 8 h durch frische Wachstumsmedien zu ersetzen, da eine längere Inkubation mit dem Virus zu einem signifikanten Zelltod der H9-hES-Zellen führen würde. Die Puromycin-Auswahl sollte nur gestartet werden, wenn die Konfluenz mehr als 80% beträgt.
Die oben beschriebene Methode wurde ursprünglich für die Expression von shRNAs angepasst. Ein ähnlicher Ansatz könnte für die ektopische Expression von cDNAs verwendet werden, die in Expressionsvektoren geklont werden sollen. Eine wesentliche Einschränkung der lentiviral vermittelten Genabgabe ist jedoch die Größenbeschränkung. Mit zunehmender Größe ist die Verpackung von lentiviralen Vektoren nicht optimal, was zu reduzierten viralen Titernführt 23. Zukünftige Forschung sollte darauf ausgerichtet sein, das Protokoll zu optimieren, um diese Einschränkungen zu überwinden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt vorliegt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien der United Arab Emirates University (UAEU), Grant # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) und # 12R010 (UAEU-AUA Grant) unterstützt. Wir danken Prof. Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) für die Unterstützung bei der Bearbeitung des Manuskripts für Stil und Grammatik.
Alle Daten sind auf Anfrage erhältlich.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
| Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
- Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
- Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).
- Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
- Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
- Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
- Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
- Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
- Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
- Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).
- Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C.
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).
- Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
- Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
- Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
- Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).
