Summary
低コストのカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いて、H9ヒト胚性幹細胞(hESC)およびH9由来神経前駆細胞(NPC)においてshRNAを安定的に発現させるレンチウイルス粒子を高効率で製造しました。
Abstract
現在のプロトコルは、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびhESCに由来する神経前駆細胞(NPC)の両方に短いヘアピンRNA(shRNA)を高効率で送達するためのレンチウイルス粒子の使用を記載している。レンチウイルス粒子は、低コストのカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を使用してパッケージングプラスミド(pAXおよびpMD2.G)とともに、エントリーベクター(shRNAを担持)を使用してHEK293T細胞を同時トランスフェクトすることによって生成されました。ウイルス粒子を超遠心分離を用いて濃縮し、平均力価が5 x107を超える結果となった。hESCsおよびNPCsは、ピューロマイシン選択およびhESCにおける安定発現、ならびにNPCにおける一過性GFP発現によって示されるように、これらのレンチウイルス粒子を使用して高効率で感染することができる。さらに、ウェスタンブロット解析は、shRNAによって標的とされる遺伝子の発現の有意な減少を示した。さらに、細胞は、CNSの異なる系統へのその後の分化によって証明されるように、それらの多能性ならびに分化能を保持した。現在のプロトコルはshRNAの送達を扱っている。しかし、過剰発現研究のためのcDNAの異所性発現にも同じアプローチが使用できる。
Introduction
胚盤胞内部細胞塊に由来するヒト胚性幹細胞(hESC)は多能性であり、in vitro条件下で外的要因に応じて異なる細胞型に分化することができる1,2。hESCの可能性を最大限に引き出すためには、これらの細胞に対して迅速かつ信頼性の高い遺伝子送達方法が不可欠です。従来、使用される技術は、大きく2つのタイプに分類することができる:非ウイルスおよびウイルス遺伝子送達系3、4。より頻繁に使用される非ウイルス遺伝子送達系は、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびヌクレオフェクションである。非ウイルス送達系は、挿入変異が少なく、免疫原性の全体的な低下のために有利である5,6。しかしながら、これらの方法は、低いトランスフェクション効率および短い一過性遺伝子発現の持続時間をもたらし、これは長期分化研究のための主要な制限である7。エレクトロポレーションは、リポフェクションと比較してより良いトランスフェクション効率をもたらす。しかしながら、それは50%以上の細胞死をもたらす8、9、10。ヌクレオフェクションを使用すると、リポフェクションとエレクトロポレーションを組み合わせることで細胞の生存率とトランスフェクション効率を向上させることができますが、このアプローチには細胞固有のバッファーと特殊な機器が必要であり、したがって、スケールアップされたアプリケーションにとっては非常にコストがかかります11,12。
対照的に、ウイルスベクターは、形質導入後、改善されたトランスフェクション効率、ならびに全体的な低い細胞毒性を示している。さらに、送達された遺伝子は安定に発現しているため、この方法は長期的な研究に理想的です13。hESCへの遺伝子送達に最も一般的に使用されるウイルスベクターの中には、レンチウイルスベクター(LVS)があり、これは高力価のウイルス粒子14、15を使用して80%以上の形質導入効率を与えることができる。リポフェクションおよびCaPO4 沈殿は、HEK293T細胞またはその誘導体をパッケージングプラスミドとともに遺伝子導入ベクターで一過性にトランスフェクトしてレンチウイルス粒子を作製するために最も一般的に使用される方法の1つである16。リポフェクションは良好なトランスフェクション効率と低い細胞毒性をもたらすが、この技術はそのコストによって妨げられており、高力価のレンチウイルス粒子を得るためにスケールアップすることは非常にコストがかかるであろう。CaPO4 沈殿は、リポフェクションを用いて得られたものと比較的類似したトランスフェクション効率をもたらす。費用対効果は高いものの、CaPO4 沈殿はトランスフェクション後に著しい細胞死をもたらし、標準化を困難にし、バッチ間の変動を回避することを困難にしています17。このシナリオでは、高いトランスフェクション効率、低い細胞毒性、および費用対効果を提供する方法を開発することは、hESCに使用される高力価レンチウイルス粒子の製造にとって極めて重要である。
ポリエチレンイミン(PEI)は、細胞毒性をあまり持たずに高効率でHEK293T細胞をトランスフェクトできるカチオン性ポリマーであり、リポフェクションベースの方法と比較して無視できるコストを有する18。このような状況では、PEIは、様々な技術を用いて培養上清からのレンチウイルス粒子の濃縮を通じて、高力価LVS産生のスケールアップされた用途に使用することができる。提示された論文では、PEIを使用してHEK293T細胞をトランスフェクトし、スクロースクッションを介して超遠心分離を使用してレンチウイルスベクター濃度をトランスフェクトする方法について説明します。この方法を使用して、バッチ間の変動が少ない5 x107 IU/mLをはるかに超える力価を定期的に取得します。この方法は、hESCおよびhESC由来細胞への遺伝子送達のためのスケールアップされたアプリケーションに対して、シンプルで簡単で費用対効果が高い。
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Protocol
1. PEIまたはリポフェクタミン3000試薬のいずれかを使用したHEK293T細胞のトランスフェクション
- HEK293T細胞をDMEM + 10% FBS + 1xペニシリン/ストレプトマイシン中で、5%CO2および21%O2 の雰囲気の加湿インキュベーター内で37°Cで培養し、トランスフェクションのために播種する前に90%コンフルエントになるまで培養 します。高力価ウイルス産生には比較的低い継代細胞数を使用する(理想的にはP30未満)。
- 種子4 x106 細胞を100mm組織培養プレート中の10mLの完全な増殖培地中で、5%CO2および21%O2 の雰囲気を有する加湿組織培養インキュベーター中で一晩増殖させる。
- トランスフェクションごとに、プラスミドDNA(1 mg/mLストック)を1.5 mL遠沈管内の無血清DMEM培地1 mLに希釈し、以下の比率のエントリープラスミドとパッケージングプラスミドを使用します。
エントリベクトル = 10 μg
psPAX2.0 = 7.5 μg
pMD2.G = 5 μg - 渦を10秒間、チューブを10,000 x gで回転させ、室温で30秒間回転させて収集します。
- チューブに70 μL(1 mg/mLのストック溶液)のPEIを加え、上記のようにボルテックスとスピンを短時間かけて回収します。使用されるPEIの体積は、全DNA(μg):P EI(μg)の1:3の比率に基づいています。
- リポフェクタミンベースのトランスフェクションの場合、キットに供給された45 μLの試薬Pを含む500 μLの無血清DMEM培地に上記のベクターを希釈し、室温で5分間インキュベートします。
- キットに供給された試薬Lの70 μLを500 μLの無血清DMEM培地を用いて希釈し、室温で5分間インキュベートする。
- 両方のチューブの内容物を結合し、複合体形成を可能にするために室温で20分間チューブをインキュベートする。
- 細胞を含むプレートにDNA/PEI1mLまたはDNA/リポフェクタミン複合体1mLを滴下し、5%CO2および21%O2 の雰囲気の加湿インキュベーター内で37°Cで6時間インキュベートする。
- 6時間後、新鮮な完全増殖培地(10mL)に交換し、細胞を5%CO2および21%O2 の雰囲気で加湿したインキュベーターに戻す。
2. LVS収集と超遠心分離
- トランスフェクションの2日後、ウイルス含有培地を収集し、10mLの新鮮な完全増殖培地で細胞を再びオーバーレイする。
- トランスフェクションの3日後、ウイルス含有培地を収集し、2日の時点で収集されたウイルス含有培地と組み合わせる。
- ウイルス上清を2,000 x gで4°Cで10分間遠心分離し、細胞破片をペレット化する。
- 0.45 μmの孔径の低いタンパク質結合フィルター(PESまたはSFCAのいずれか)を使用して上清をろ過し、超遠心分離の準備ができるまで4°Cで保存します。レンチウイルス粒子を含む濾過された上清は、ウイルス力価を有意に低下させることなく、4°Cで5日間保存することができる。
- カップを保持する超遠心管を70%エタノールで10分間洗浄して滅菌し、風乾、閉じ、4°Cに保ちます。
- レンチウイルス粒子を含む濾過培地36mLを滅菌超遠心チューブに加える。
- 滅菌ストリペット5 mLを滅菌20%スクロース溶液(PBSで調製)4 mLで満たし、LVSを含む超遠心管(UC)の底部に直接分注します。スクロース溶液が媒体と混合されず、チューブの底に勾配を作ることが重要です。
- 無血清DMEM培地を使用してすべての超遠心チューブのバランスを取り、冷たい超遠心チューブ保持カップに入れ、蓋を閉めます。
- チューブを125,000 x gで4°Cで2時間回転させます。
- スピン後、ペレットを乱すことなく漂白剤を入れた容器にチューブの内容物を反転させて上清を慎重に捨てる。ペレットが表示されている場合はマークを付けます。
- 超遠心チューブを50 mL滅菌チューブに入れ、ペレットの上部に200 μLの滅菌DPBSを正確に加えます。4°Cで一晩邪魔されずに保管してください。
- 翌日、上下40倍のピペッティングで穏やかに混ぜる。
- 卓上遠心分離機で13,000 x gで短時間回転させ、破片をペレット化します。
- 上清を新しいチューブに移し、ウイルス調製物を20 μLアリコートとしてアリコートします。-80°Cで保存してください。
- ウイルス力価測定のために5μLの調製物を脇に置いておきます。
3. pLKO.1ベースのベクターのLVS力価測定
- レンチウイルス粒子の力価は、製造元の推奨に従ってqPCRを使用して決定します。
- 標準曲線の場合、各ステップで5 μLのDNAを45 μLのヌクレアーゼフリーH2Oに希釈することによって、標準対照DNA(キットに付属)の5つの10倍段階希釈液を調製する。標準曲線を生成するには、1:100 ~ 1:100,000 の希釈を使用します。
- 氷上での反応を次のように重複して設定します。
2x qPCR マスターミックス 10 μL
プライマーミックス 2 μL
サンプルまたは標準 DNA 2 μL
ヌクレアーゼフリーH2O6μL - キットのマニュアルに記載されているサイクリング条件を使用して、合計 35 サイクルで qPCR を実行します。
- サイクルしきい値 (Ct) 値を Y 軸にプロットし、ウイルス力価を X 軸にプロットします。
- 4 つの標準対照 DNA 希釈液 (1:100 ~ 1:100,000) を使用して対数回帰を生成し、トレンドライン方程式を使用して未知のウイルスサンプル力価を決定します。
4. pll3.7ベースのベクターのLVS力価測定
- 感染の24時間前に、P12ウェルプレートの各ウェル中の種子1 x105 個のHEK293T細胞を1mLの完全な増殖培地に入れた。
- 培地に8 μg/mLのポリブレンを加え、滅菌した各1.5 mLチューブに1 mLを加えます。
- 4 μL、2 μL、1 μL、0.5 μL、および 0.1 μL の濃縮レンチウイルス粒子をそれぞれ 1 mL のポリブレン含有培地中で使用して、ウイルス粒子を希釈します。
- HEK293T細胞由来の培地を、8μg/mLのポリブレンとともに指示量のレンチウイルス粒子を含む培地と交換し、5%CO2および21%O2の雰囲気の加湿インキュベーター内で37°Cで24時間インキュベートする。
- 翌日、新鮮な培地に変更し、5%CO2および21%O2の雰囲気を有する加湿インキュベーター内で37°Cで72時間培養を続けた。
- 72時間後、細胞をPBSで洗浄し、製造業者のプロトコールに従って37°Cでトリプシン処理し、1mLのPBSに再懸濁した。
- メーカーの推奨に従って、セルソーターを使用してFACSセルソーティングを実行します。非感染HEK293T細胞を用いてゲートを0%GFP陽性細胞に設定し、各サンプルについて50,000イベントをカウントして、各ウイルス希釈に対する陽性細胞の割合を決定する。
- レンチウイルス粒子の力価を計算するには、%GFP陽性細胞を2%〜20%の範囲で与えるレンチウイルス粒子の体積のみを使用します。
5. hESCの感染と安定した選択
- 6ウェル細胞培養マルチウェルプレートの各ウェルで増殖する2mLのPBSで細胞を洗浄する。
- 1mLの1x細胞解離試薬を用いて細胞培養プレートから細胞を剥離し、37°Cで5分間インキュベートした。
- DMEM/F12培地で細胞を回収し、室温で1,500 x gで5分間遠心分離して細胞ペレットを回収します。
- 吸引し、細胞を1mLに再懸濁し、血球計数器を用いて計数した。
- 10 ng/mL 塩基性線維芽細胞増殖因子 (bFGF)、ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)、および 10 μM ROCK 阻害剤 (RI) を添加した mTeSR1 を含む 2 x105 cells/mL の完全な増殖培地で細胞懸濁液を作ります。
- 種子1 x 105個の細胞を50x 完全基底膜マトリックスコーティングP24ウェルプレート上で500μLの完全増殖培地で希釈し、5%CO2および21%O2 の雰囲気の加湿インキュベーター中で37°Cで細胞を培養した。
- 翌日、hESCを感染多重度(MOI)10で8μg/mLのポリブレンで感染させ、37°Cで8時間インキュベートする。
- 8時間後、ウイルス含有培地を新鮮な増殖培地(-RI)と交換し、細胞が90%コンフルエントになるまで培養を続けます。
- ピューロマイシンの選択(0.8 μg/mL)は、細胞が90%のコンフルエント(通常、感染後48〜72時間)に達したときに開始します。
- 選択が完了したら(通常4〜6日)、安定細胞を分割し(1:4)、凍結保存およびさらなる分析のために細胞を拡張する。
6. H9由来神経前駆細胞(NPC)の形質導入
注:NPCは、前述のように、デュアルSmad阻害プロトコルを使用してH9細胞から誘導された19。
- 簡単に説明すると、H9細胞を37°Cで5分間細胞解離試薬で処理して単一細胞を生成し、10ng/mL塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、および10μM ROCK阻害剤(RI)を添加したmTeSR1を含む完全な増殖培地に再懸濁します。60,000細胞/cm2 の密度で1:50希釈したマトリゲルコーティング6ウェル細胞培養皿上の種子(0日目)。
- LDN193189(200 nM)およびSB431542(10 μM)を含む100%KSR培地に変更することにより、細胞が95%-100%コンフルエントに達したときに分化を開始します(day1)。
- 2日目に、LDN193189(200 nM)、SB431542(10 μM)、およびXAV939(5 μM)を添加した100%KSRでメディアを再度交換します。
- 分化の4日目に、LDN193189(200nM)、SB431542(10μM)、およびXAV939(5μM)を有するKSR培地(75%)およびN2培地(25%)の混合物に切り替える。
- 6日目から12日目まで、N2培地を毎日25%増やし、2日ごとに培地を交換することにより、LDN193189(200nM)、SB431542(10μM)、およびXAV939(5μM)を添加した100%N2に培地を徐々に切り替えます。
- 培養12日目のNPCは、20ng/mL bFGFを添加したN2:B27培地中で行った。
- 2 mLのNPCs培養培地で1:50希釈した完全基底膜マトリックスコーティングP6プレートの各ウェルに2 x 105個の細胞 をシードし、細胞が付着できるようにインキュベートする。
- 翌日、8μg/mLポリブレンの存在下でMOI 6でレンチウイルス粒子で細胞を感染させる。
- 8時間後、ウイルス含有培地を新鮮なNPC増殖培地と交換する。
- 翌日、感染を繰り返し、8時間で培地を交換します。
- さらなる分析のために回収する前に、細胞を72時間培養に保持する。
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Representative Results
遺伝子導入後、hESCの高い生存率が必然的に要求される。hESCのエレクトロポレーション後の細胞死を減らすためのプロトコルの努力と最適化にもかかわらず、これらの細胞のエレクトロポレーション後には50%以上の細胞死が依然として観察され、トランスフェクション効率は低い20。レンチウイルス媒介遺伝子導入は、遺伝子導入の高効率をもたらすだけでなく、形質導入後の高レベルの細胞生存率も示す。以下の結果は、hESC由来NPCにおけるレポーターおよび一過性発現としてGFPを使用するアプローチと、長期分化実験のためのhESCの安定選択のためにピューロマイシンを使用するアプローチの2つのアプローチを提示する。
第1の実験セットでは、pll3.7ベクターをレポーターとしてGFPを保有するshRNAを、第2世代のレンチウイルスパッケージングプラスミドpsPAX2.0およびpMD2.Gとともに同時トランスフェクトすることによって、レンチウイルス粒子を作製した。レンチウイルス粒子をトランスフェクション後48時間および72時間後に回収し、超遠心分離を用いて濃縮した。図1Aは、トランスフェクションの72時間後のHEK293T細胞における豊富なGFP発現を示す。ウイルスタンパク質の発現はまた、図1Aの矢印で示すように、単一細胞が融合したHEK293T細胞の合胞体形成をもたらした。力価は、FACS分析を用いて決定した。また、低コストのPEI試薬とリポフェクタミン3000試薬を使用してレンチウイルス力価を比較しましたが、ウイルス力価の点で両者の間に有意差は見られませんでした(図2A)。次に、H9 hESCs由来NPCを、これらのGFP含有レンチウイルス粒子にMOI6で2回感染させ、72時間後の分析のために採取した。 上述したように、長期の分化実験のためには、shRNAを安定に発現するhESCが不可欠である。様々な遺伝子に対してshRNAを発現する安定な細胞株を作製するために、我々はplKO.1ベースのベクターを使用し、メーカーの推奨に従ってshRNAをクローニングした。次に、上記のようにしてレンチウイルス粒子を作製し、qPCRベースの方法を用いて市販のレンチウイルス力価測定キットを用いて力価を測定した(図2B)。hESCsを10のMOIでレンチウイルス粒子に感染させ、ピューロマイシン選択を用いて選択した。図3は、形質導入後のhESCの安定した選択の結果を示す。0.8 μg/mL ピューロマイシンによる選択の 5 日後、レンチウイルス形質移入細胞は、非形質導入細胞と比較して 80% 以上の細胞生存率を示しました。選択後、安定に形質導入されたH9細胞をさらに拡大し、凍結保存し、ウェスタンブロットを用いて分析し、効率的な遺伝子ノックダウンをアッセイした。
私たちの研究室では、上記のアプローチを用いて、異なる遺伝子のshRNAを発現するH9 hESCの複数の安定な細胞株を作成しました。ここでは、そのうちの1つであるL-2-ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ(L2HGDH)遺伝子をウェスタンブロット解析を用いて発表した。L2HGDHの豊富な発現は、空のベクター骨格で形質導入された細胞において観察される。しかしながら、L2HGDHのshRNAを担持したベクターを導入した細胞ではL2HGDHの発現は認められず、L2HGDHの発現が低下したH9 hESCs細胞株の安定生成の有効性を示しており、さらなる分化研究に用いることができる(図4)。
(A)shRNAをレポーターとしてGFPを保有するpll3.7ベクターにクローニングし、PEIを用いてHEK293T細胞にパッケージングプラスミドを同時トランスフェクトした。高いGFP発現は、トランスフェクションの72時間後に効率的なトランスフェクション効率を示す。矢印は、HEK293T細胞における合胞体形成を示し、個々のHEK293T細胞の群は、ウイルスタンパク質の発現のために互いに融合している。(b)H9由来NPCをレポーターとしてGFPを含むレンチウイルス粒子を用いてMOI6で2回感染させ、感染後72時間でGFP発現を観察した。スケール バー = 50 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)pll3.7ベースのベクターのウイルス力価は、2%〜20%のGFP陽性細胞を与えたウイルス希釈液の%GFP陽性細胞を定量することによって、FACS分析を使用して測定されました。(B)pLKO.1ベースのベクターのウイルス力価は、製造元の推奨に従って、市販のqPCRレンチウイルス力価キットを使用して決定した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:安定なshRNA発現H9 hESC株の確立。shRNA をピューロマイシン選択遺伝子を有するpLKO.1ベースのレンチウイルスベクターにクローニングした。H9 hESCsを10のMOIでレンチウイルス粒子に感染させ、ピューロマイシンを用いて選択した。0.8 μg/mLのピューロマイシンを5日間使用して、非感染細胞の100%が死滅したが、ほとんどの細胞はウイルス感染群で治療を生き延びた。これらの細胞は、凍結保存およびさらなる分析のためにクローン選択なしで拡大した。スケール バー = 50 μm 。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:H9 hESCにおけるL2HGDH遺伝子の安定したノックダウンのための代表的なウェスタンブロット解析。 陰性対照(H9、ピューロアンカット)細胞からの全細胞溶解物、ならびにL2HGDHに対してshRNAを安定に発現する細胞(H9、sh-L2HGDH)を、抗L2HGDH抗体を用いたウェスタンブロットに供した。同図に示すように、L2HGDHに対してshRNAを安定に発現するH9 hESCではL2HGDHの発現は認められなかった。L2HGDH抗体の正しい分子量46〜48kDa(三角形で示す)に対応する特異的バンドのすぐ上に非特異的バンドが観察された。抗GAPDHをローディングコントロールとして用いた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
研究または臨床目的のために幹細胞を遺伝子改変する能力は、技術およびhESCの生物学の基本的な理解の両方によって制限される。リポフェクションやエレクトロポレーションなど、マウスESCにおいて大きな可能性を示している技術は、従来の方法では遺伝子送達が困難であることで悪名高いhESCにとって非常に効率的ではない20。この概念は、既存の技術の最適化だけでなく、hESCにおけるトランスフェクション効率を高めるための新しい方法の開発にもつながっています。これらの新しい開発の焦点は、hESCsの成長、多能性、および分化可能性への影響を長期間にわたって最小限に抑えながら、hESCへの効率的で安定した遺伝子送達であった。これらの厳格な基準を満たす様々な新しい開発の中には、hESCへのレンチウイルス媒介遺伝子導入があります21,22。特定の遺伝子を発現するレンチウイルス粒子を製造するために、所望の遺伝子を転写ベクターの1つにクローニングし、パッケージングプラスミドと共にHEK293T細胞にトランスフェクトして、レンチウイルス粒子を含む細胞培養上清を回収する。hESCで使用するには、これらのウイルス粒子を様々な技術を用いて濃縮し、少なくとも1 x 107-1 x108IU/mLの範囲のウイルスの高力価を得ることが不可欠である。一般に、大量のLVSは、これらの力価を達成するために、元の体積の200x〜500倍から濃縮される。これは、HEK293T細胞におけるトランスフェクション効率を損なうことなく、費用対効果の高い方法を使用することが、これらの方法が実験室で日常的に使用されるための前提条件であることを意味します。本方法は、カチオン性ポリマーPEIの使用を、ゴールドスタンダードと考えられているリポフェクションベースの方法と同様のトランスフェクション効率で大量のLVSを製造するための費用対効果の高い方法として記載している。提示された方法を使用すると、元の体積の200倍の濃度係数の後に、5 x107 IU / mLをはるかに上回る平均LVS力価を得ることができます。これらのLVS粒子を用いて、我々は、高いMOIで細胞に感染させることによって、いくつかの遺伝子のshRNAを発現するH9 hESCのいくつかの安定した細胞株を確立することができた。ここで紹介する方法は、図4のL2HGDH遺伝子ノックダウンの代表的なウェスタンブロット結果の1つに示すように、ノックダウン効率を100%に近づけながら、クローンの選択と拡張の退屈で時間のかかる方法の使用をバイパスします。次に、アプローチを成功させるための推奨事項の一部を示します。
高いウイルス力価のためには、低い継代数のHEK293T細胞の使用(理想的には30未満)が必要である。HEK293T細胞のコンフルエンシーは、この点に関してもう一つの重要な要素である。HEK293T細胞は、細胞間接触が細胞毒性を大幅に低下させ、ウイルス産生を改善するため、トランスフェクション前に少なくとも80%コンフルエントでなければならない。使用するベクターは、エンドトキシンフリープラスミド単離キットを使用して調製し、その後エタノール沈殿を行い、トランスフェクションに使用する前に最小濃度1mg/mLで再構成する必要があります。異なる日付に調製されたPEI溶液のバッチ間のバリエーションがあるかもしれません。そのため、PEI溶液の各バッチは、最初にGFPベクターを使用して性能をテストし、溶液を使い捨てアリコートで−20°Cで保存して、凍結融解サイクルの繰り返しを回避する必要があります。高力価の場合、HEK293T細胞のトランスフェクションの72時間後のLVS上清の収集は、細胞が健康で付着している場合にのみ推奨されます。LVS含有上清の濾過は、超遠心後のLVSの溶解度を大幅に増加させる。LVS上清を4°Cで5日間以上保存することは、ウイルス力価の大幅な低下をもたらすため、推奨されません。超遠心分離中のスクロース勾配は、最適な力価を得るために必要である。超遠心分離のすべてのステップの間、温度を4°C近くに維持する必要があります。DPBS中の濃縮LVS粒子の一晩インキュベーションは、完全な再懸濁に必要である。LVSの再懸濁後の遠心分離は、標的細胞に使用すると細胞傷害を引き起こす可能性があるため、細胞破片(もしあれば)を除去します。H9細胞の感染後、ウイルスとの長期インキュベーションはH9 hESCの有意な細胞死をもたらすため、8時間後にウイルス含有培地を新鮮な増殖培地と交換することが重要です。ピューロマイシンの選択は、コンフルエンシーが80%を超える場合にのみ開始されるべきである。
上記の方法は、もともとshRNAの発現に適応していた。同様のアプローチは、発現ベクターにクローニングされるcDNAの異所性発現にも使用できる。しかしながら、レンチウイルス媒介遺伝子送達の主な制限は、サイズ制約である。サイズが増加するにつれて、レンチウイルスベクターのパッケージングは最適ではなく、その結果、ウイルス力価が低下する23。将来の研究は、これらの制約を克服するためにプロトコルを最適化するように指示されるべきである。
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Disclosures
著者らは、利益相反は存在しないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、アラブ首長国連邦大学(UAEU)からの研究助成金、助成金#31R170(ザイード健康科学センター)および#12R010(UAEU-AUA助成金)によって支援されました。ランドール・モース教授(ニューヨーク州オールバニーのワズワース・センター)が、スタイルと文法の原稿の編集を手伝ってくれたことに感謝します。
すべてのデータは要求に応じて利用可能です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
| Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
- Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
- Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).
- Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
- Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
- Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
- Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
- Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
- Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
- Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).
- Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C.
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).
- Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
- Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
- Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
- Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).
