Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lentiviral מתווך אספקה של shRNA ל- hESCs ו- NPCs באמצעות פולימר קטיוני בעלות נמוכה Polyethylenimine (PEI)

Published: May 24, 2022 doi: 10.3791/63953
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, 2Zayed Center for Health Sciences, United Arab Emirates University

Summary

באמצעות שימוש בפולימר קטיוני פולימרי זול פוליאתילן (PEI), ייצרנו חלקיקים לנטי-ויראליים לביטוי יציב של shRNA בתאי גזע עובריים אנושיים H9 (hESCs) ותאי אב עצביים שמקורם ב-H9 (NPCs) שעברו התמרה חולפת ביעילות גבוהה.

Abstract

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בחלקיקים לנטי-ויראליים להעברת רנ"א קצרים (shRNA) הן לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) והן לתאי אב עצביים (NPCs) המופקים מ-hESCs ביעילות גבוהה. חלקיקים לנטי-ויראליים נוצרו על-ידי טרנספקציה משותפת של תאי HEK293T באמצעות וקטורים של כניסה (הנושאים shRNA) יחד עם פלסמידי אריזה (pAX ו-pMD2.G) תוך שימוש בפולימר קטיוני בעלות נמוכה של פוליאתילן פולימרי קטיוני (PEI). חלקיקים נגיפיים התרכזו באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה, מה שהביא לממוצע טיטרים מעל 5 x 107. גם hESCs וגם NPCs יכולים להיות נגועים ביעילות גבוהה באמצעות חלקיקים לנטי-ויראליים אלה, כפי שמוצג על ידי בחירת פורומיצין וביטוי יציב ב- hESCs, כמו גם ביטוי GFP חולף ב- NPCs. יתר על כן, ניתוח כתמים מערבי הראה ירידה משמעותית בביטוי של גנים הממוקדים על ידי shRNA. בנוסף, התאים שמרו על הפלוריפוטנטיות שלהם כמו גם על פוטנציאל ההתמיינות שלהם, כפי שמעידה ההתמיינות שלהם לאחר מכן לשושלות שונות של מערכת העצבים המרכזית. הפרוטוקול הנוכחי עוסק במסירת shRNA; עם זאת, אותה גישה יכולה לשמש לביטוי חוץ רחמי של cDNAs למחקרי ביטוי יתר.

Introduction

תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) שמקורם במסת התאים הפנימיים של הבלסטוציסט הם פלוריפוטנטיים וניתן להתמיין ביניהם לסוגי תאים שונים בהתאם לגורמים חיצוניים בתנאים חוץ גופיים 1,2. על מנת לרתום באופן מלא את הפוטנציאל של hESCs, חובה על שיטות אספקת גנים מהירות ואמינות עבור תאים אלה. באופן קונבנציונלי, ניתן לסווג את הטכניקות המשמשות באופן נרחב לשני סוגים: מערכות העברת גנים לא ויראליות ונגיפיות 3,4. מערכות העברת הגנים הלא-ויראליות הנפוצות יותר הן שאיבת שומן, אלקטרופורציה וגרעין. מערכות אספקה לא ויראליות הן יתרון בגלל פחות מוטציות בהחדרה וירידה כוללת באימונוגניות 5,6. עם זאת, שיטות אלה גורמות ליעילות טרנספקציה נמוכה ולמשך זמן קצר של ביטוי גנים חולף, המהווה מגבלה עיקרית למחקרי התמיינות ארוכי טווח7. אלקטרופורציה מביאה ליעילות טרנספקציה טובה יותר בהשוואה לשומן שומן; עם זאת, הוא גורם ליותר מ-50% מוות תאישל 8,9,10. באמצעות נוקליאופקציה, ניתן לשפר את הישרדות התאים ואת יעילות הטרנספקציה על ידי שילוב של שאירופדיקציה ואלקטרופורציה, אך הגישה זקוקה למאגרים ספציפיים לתא ולציוד מיוחד, ולכן היא הופכת ליקרה למדי עבור יישומים מוגדלים11,12.

לעומת זאת, וקטורים ויראליים הראו יעילות טרנספקציה משופרת, כמו גם ציטוטוקסיות נמוכה באופן כללי, בעקבות התמרה. בנוסף, הגנים המועברים באים לידי ביטוי יציב, ולכן הופכים את השיטה הזו לאידיאלית למחקרים ארוכי טווח13. בין הווקטורים הנגיפיים הנפוצים ביותר להעברת גנים ל-hESCs הם וקטורים לנטי-ויראליים (LVS), שיכולים לתת יותר מ-80% יעילות בהתמרה באמצעות חלקיקים נגיפיים בעלי טיטר גבוה14,15. שומן ו- CaPO4 משקעים הם בין השיטות הנפוצות ביותר להעברה חולפת של תאי HEK293T או נגזרותיהם עם וקטורים להעברת גנים יחד עם אריזת פלסמידים להפקת חלקיקים לנטיוויראליים16. אף על פי שמניעת שומן גורמת ליעילות טרנספקציה טובה ולציטוטוקסיות נמוכה, הטכניקה נפגעת על ידי עלותה, והתרחבות כדי לקבל חלקיקים גבוהים של טיטר לנטי-ויראלי תהיה יקרה מאוד. משקעי CaPO4 גורמים ליעילות טרנספקציה דומה יחסית לזו המתקבלת באמצעות שאיבת שומן. למרות שהם חסכוניים, משקעי CaPO4 גורמים למוות תאי משמעותי בעקבות טרנספקציות, מה שמקשה על סטנדרטיזציה ולהימנע משינוייםמאצווה לאצווה 17. בתרחיש זה, פיתוח שיטה המעניקה יעילות טרנספקציה גבוהה, ציטוטוקסיות נמוכה וחסכוניות הוא חיוני לייצור חלקיקים לנטי-ויראליים גבוהים שישמשו ב-hESCs.

Polyethylenimine (PEI) הוא פולימר קטיוני שיכול לבצע טרנספקטציה של תאי HEK293T ביעילות גבוהה ללא ציטוטוקסיות רבה ובעלות זניחה בהשוואה לשיטות מבוססות שאיבת שומן18. במצב זה, PEI יכול לשמש ליישומים מוגדלים של ייצור LVS טיטר גבוה באמצעות ריכוז של חלקיקים lentiviral מסופרנאטים של תרבית באמצעות טכניקות שונות. המאמר המוצג מתאר את השימוש ב-PEI כדי לבצע טרנספקטציה של תאי HEK293T וריכוז וקטורים לנטי-ויראליים באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה דרך כרית סוכרוז. באמצעות שיטה זו, אנו מקבלים באופן קבוע titers הרבה מעל 5 x 107 IU / mL עם וריאציות נמוכות של אצווה לאצווה. השיטה היא פשוטה, ישרה וחסכונית עבור יישומים מוגדלים להעברת גנים ל-hESCs ולתאים שמקורם ב-hESCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. טרנספקציה של תאי HEK293T באמצעות PEI או ריאגנט ליפופקטמין 3000

  1. תאי HEK293T בתרבית ב-DMEM + 10% FBS + 1x פניצילין/סטרפטומיצין ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם אטמוספירה של 5% CO2 ו-21% O2 עד שהם נפגשים ב-90% לפני הזריעה לטרנספקציה. השתמש במספר נמוך יחסית של תאים במעבר לייצור נגיפי טיטר גבוה (באופן אידיאלי פחות מ-P30).
  2. זרע 4 x 106 תאים ב-10 מ"ל של מדיום גדילה מלא בצלחת תרבית רקמה של 100 מ"מ וגדלים בן לילה באינקובטור תרבית רקמה לח עם אטמוספירה של 5% CO2 ו-21% O2.
  3. עבור כל טרנספקציה, דיללו את הדנ"א של פלסמיד (1 מ"ג/מ"ל) ב-1 מ"ל של מדיית DMEM נטולת סרום בצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל באמצעות היחס הבא של פלסמידי כניסה ואריזה:
    וקטור כניסה = 10 מיקרוגרם
    psPAX2.0 = 7.5 מיקרוגרם
    pMD2.G = 5 מיקרוגרם
  4. סובבו מערבולת במשך 10 שניות וסובבו את הצינור ב-10,000 x g במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף.
  5. הוסף 70 μL של (תמיסת מלאי 1 מ"ג / מ"ל) PEI לצינור, ומערבולת וסובב בקצרה כמתואר לעיל כדי לאסוף. נפח ה-PEI שבו נעשה שימוש מבוסס על יחס של 1:3 של סך הדנ"א (מיקרוגרם):P EI (מיקרוגרם).
  6. עבור טרנספקציה מבוססת ליפופקטאמין, דיללו את הווקטורים הנ"ל ב-500 μL של מדיית DMEM ללא סרום המכילה 45 μL של ריאגנט P המסופק בערכה ודגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  7. דיללו 70 μL של ריאגנט L המסופקים בערכה באמצעות 500 μL של מדיית DMEM ללא סרום ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  8. שלבו את תכולת שני הצינורות ודגרו את הצינורות בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לאפשר היווצרות מורכבת.
  9. הוסיפו לצלחת את ה-1 מ"ל של דנ"א/PEI או 1 מ"ל של קומפלקסים של דנ"א/ליפופקטאמין לצלחת המכילה תאים המכילים דגירה במשך 6 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם אטמוספירה של 5% CO2 ו-21% O2.
  10. לאחר 6 שעות, החליפו למדיית גדילה מלאה ורעננה (10 מ"ל) והחזירו את התאים לאינקובטור הלח עם אטמוספירה של 5% CO2 ו-21% O2.

2. קולקציית LVS ואולטרה-סנטריפוגציה

  1. לאחר יומיים של טרנספקציה, אספו את המדיה המכילה את הנגיף והוסיפו שוב את התאים ל-10 מ"ל של מדיית גדילה מלאה ורעננה.
  2. לאחר 3 ימים של טרנספקציה, אספו את המדיה המכילה את הנגיף ושלבו אותה עם המדיה המכילה את הנגיף שנאספה בנקודת הזמן של יומיים.
  3. צנטריפוגה את ה-supernatant הנגיפי ב-2,000 x g למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לכדור פסולת סלולרית.
  4. סנן את ה-supernatant באמצעות מסנן קשירת חלבון נמוך בגודל נקבובית של 0.45 מיקרומטר (PES או SFCA) ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן ל-ultracentrifugation. ניתן לאחסן את הסופרנאטנט המסונן המכיל חלקיקים לנטי-ויראליים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 ימים ללא אובדן משמעותי של טיטרים נגיפיים.
  5. עיקרו את צינורות האולטרה-צנטריפוג המחזיקים כוסות על ידי שטיפתם ב-70% אתנול למשך 10 דקות, ייבשו את האוויר, נסגרו ושמרו על 4 מעלות צלזיוס.
  6. הוסיפו 36 מ"ל של מדיה מסוננת המכילה חלקיקים לנטי-ויראליים לצינור אולטרה-צנטריפוג' סטרילי.
  7. ממלאים 5 מ"ל של חשפנית סטרילית ב-4 מ"ל של תמיסת סוכרוז סטרילית של 20% (מוכנה ב-PBS) ומחלקים אותה היישר לתחתית צינור האולטרה-צנטריפוג' (UC) המכיל LVS. חשוב כי הפתרון סוכרוז אינו מעורבב עם המדיה ועושה שיפוע בתחתית הצינור.
  8. אזנו את כל צינורות האולטרה-צנטריפוג' באמצעות מדיית DMEM ללא סרום, הניחו בצינור האולטרה-צנטריפוג הקר המחזיק כוסות וסגרו את המכסים.
  9. סובב את הצינורות ב 125,000 x g במשך 2 שעות ב 4 ° C.
  10. לאחר הסיבוב, יש להשליך בזהירות את ה-supernatant על-ידי היפוך תכולת הצינור במיכל המכיל אקונומיקה מבלי להפריע לכדור. סמן את הכדור אם הוא גלוי לעין.
  11. מניחים את צינור האולטרה-סנטריפוג' בצינור סטרילי של 50 מ"ל ומוסיפים 200 μL של DPBS סטרילי בדיוק בחלק העליון של הכדור. יש לשמור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ללא הפרעה.
  12. למחרת, ערבבו בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה פי 40.
  13. סובבו לזמן קצר ברזולוציה של 13,000 x g בצנטריפוגה שולחנית כדי לכדור כל פסולת.
  14. מעבירים את ה-supernatant לצינור חדש ומעבירים את ההכנה לנגיף כ-20 μL aliquots. יש לאחסן בטמפרטורה של −80 °C (80 °F).
  15. הניחו בצד 5 μL של ההכנה למדידות טיטר ויראליות.

3. מדידת טיטר LVS עבור וקטורים מבוססי pLKO.1

  1. קבע את הטיטר של חלקיקים לנטי-ויראליים באמצעות qPCR בהתאם להמלצות היצרן.
  2. עבור עקומה סטנדרטית, הכינו חמישה דילולים סדרתיים פי 10 של דנ"א בקרה סטנדרטית (המסופקים בערכה) על ידי דילול 5 μL של DNA ל-45 μL של H2O ללא נוקלאז בכל שלב. השתמש בדילולים של 1:100 עד 1:100,000 כדי ליצור עקומה סטנדרטית.
  3. הגדר תגובות על קרח בכפילויות באופן הבא:
    2x qPCR תערובת מאסטר 10 μL
    תערובת פריימר 2 μL
    דגימה או DNA סטנדרטי 2 μL
    H ללא נוקלאז2O 6 μL
  4. בצע qPCR באמצעות תנאי הרכיבה המוזכרים במדריך של הערכה במשך 35 מחזורים בסך הכל.
  5. ערכי סף מחזור ההתווה (Ct) על ציר ה-Y לעומת טיטר הווירוסים בציר ה-X.
  6. צור רגרסיה לוגריתמית באמצעות ארבעה דילולים סטנדרטיים של דנ"א בקרה (1:100 עד 1:100,000) כדי לקבוע את טיטר דגימת הנגיף הלא ידוע באמצעות משוואת קו מגמה.

4. מדידת טיטר LVS עבור וקטורים מבוססי pll3.7

  1. זרע 1 x 105 HEK293T תאים בכל באר של צלחת P12-באר ב 1 מ"ל של מדיית גדילה מלאה 24 שעות לפני זיהומים.
  2. הוסיפו את המדיה לפוליברן של 8 מיקרוגרם/מ"ל והוסיפו 1 מ"ל לכל צינור סטרילי של 1.5 מ"ל.
  3. דיללו את החלקיקים הנגיפיים על ידי שימוש ב-4 μL, 2 μL, 1 μL, 0.5 μL ו-0.1 μL של חלקיקים לנטי-ויראליים מרוכזים בכל אחד מ-1 מ"ל של המדיה המכילה פוליברן.
  4. החלף את המדיה מתאי HEK293T במדיה המכילה כמויות מסומנות של חלקיקים לנטי-ויראליים יחד עם פוליברן של 8 מיקרוגרם/מ"ל ודגירה במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם אטמוספירה של 5% CO2 ו-21% O2.
  5. למחרת, החליפו למדיה טרייה והמשיכו את התרבות במשך 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם אווירה של 5% CO2 ו-21% O2.
  6. לאחר 72 שעות, לשטוף את התאים עם PBS, trypsinize ב 37 °C על פי פרוטוקול היצרן, ו resuspend ב 1 מ"ל של PBS.
  7. בצע מיון תאי FACS באמצעות סדרן תאים, בהתאם להמלצות היצרן. הגדר את השער ל- 0% תאים חיוביים ל- GFP באמצעות תאי HEK293T שאינם נגועים וספור 50,000 אירועים עבור כל דגימה כדי לקבוע את אחוז התאים החיוביים עבור כל דילול נגיפי.
  8. השתמש רק בנפחים של חלקיקים לנטי-ויראליים שנותנים %GFP תאים חיוביים בטווח של 2%-20% כדי לחשב את הטיטר של חלקיקים לנטי-ויראליים.

5. זיהום של hESCs ובחירה יציבה

  1. שטפו את התאים ב-2 מ"ל של PBS הגדלים בכל באר של צלחת מולטיוול של תרבית תאים בת 6 בארות.
  2. נתקו את התאים מלוח תרבית התאים באמצעות 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאים 1x על ידי דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  3. אסוף את התאים במדיה DMEM/F12 ובצנטריפוגה ברזולוציה של 1,500 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את גלולת התא.
  4. לשאוף, להחיות את התאים ב 1 מ"ל, ולספור באמצעות המוציטומטר.
  5. בצעו תרחיף של תא עם 2 x 105 תאים/מ"ל של מדיית גדילה מלאה המכילה mTeSR1 בתוספת גורם גדילה פיברובלסט בסיסי של 10 ננוגרם/מ"ל (bFGF), פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) ומעכב ROCK של 10 μM (RI).
  6. זרע 1 x 105 תאים על 50x מדולל שלם קרום מרתף מצופה מטריצה לוחות P24-באר ב 500 μL של מדיית גדילה מלאה ותרבית את התאים ב 37 °C בחממה לחה עם אטמוספירה של 5% CO2 ו 21% O2.
  7. למחרת, הדביקו hESCs בריבוי של זיהום (MOI) של 10 עם פוליברן של 8 מיקרוגרם/מ"ל ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 8 שעות.
  8. לאחר 8 שעות, החליפו את המדיה המכילה את הנגיף במדיית גדילה טרייה (-RI) והמשיכו את התרבית עד שהתאים נפגשים ב-90%.
  9. התחל את בחירת הפורומיצין (0.8 מיקרוגרם/מ"ל) כאשר התאים מגיעים ל-90% מפגש, שהוא בדרך כלל 48-72 שעות לאחר ההדבקה.
  10. לאחר השלמת הברירה (בדרך כלל 4-6 ימים), פיצלו את התאים היציבים (1:4) והרחיבו את התאים לצורך שימור בהקפאה וניתוח נוסף.

6. התמרה של תאי אב עצביים שמקורם ב-H9 (NPCs)

הערה: NPCs נגזרו מתאי H9 באמצעות פרוטוקול עיכוב דו-סמאד, כפי שתואר קודם לכן19.

  1. בקצרה, יש לטפל בתאי H9 עם מגיב דיסוציאציה של תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי ליצור תאים בודדים ולהחייאות במדיית גדילה מלאה המכילה mTeSR1 בתוספת גורם גדילה פיברובלסט בסיסי של 10 ננוגרם/מ"ל (bFGF), פניצילין/סטרפטומיצין (P/S) ומעכב רוק של 10 μM (RI). זרעים ב-1:50 מנות מדולל של תרביות תאים בציפוי מטריגל 6 בארות בצפיפות של 60,000 תאים/ס"מ2 (יום 0).
  2. התחל התמיינות כאשר התאים מגיעים ל-95%-100% מפגש על-ידי שינוי למדיית KSR של 100% המכילה LDN193189 (200 ננומטר) ו-SB431542 (10 μM) (יום 1).
  3. ביום השני, שנה שוב את המדיה עם 100% KSR בתוספת LDN193189 (200 ננומטר), SB431542 (10 μM) ו- XAV939 (5 μM).
  4. ביום הרביעי של ההתמיינות, עברו לתערובת של מדיום KSR (75%) ובינוני N2 (25%) עם LDN193189 (200 ננומטר), SB431542 (10 μM) ו-XAV939 (5 μM).
  5. מהיום ה-6 ועד היום ה-12, החליפו בהדרגה את המדיה ל-100% N2 בתוספת LDN193189 (200 ננומטר), SB431542 (10 μM) ו-XAV939 (5 μM) על ידי הגדלת מדיית N2 ב-25% בכל יום ושינוי המדיה לאחר כל יומיים.
  6. יום התרבות 12 NPCs במדיה N2:B27 בתוספת 20 ng/mL bFGF.
  7. זרע 2 x 105 תאים בכל באר של 1:50 מדולל שלם של קרום מרתף מצופה מטריצה מצופה מטריצה P6-לוח ב 2 מ"ל של NPCs תרבית מדיה ודגירה כדי לאפשר לתאים להתחבר.
  8. למחרת, הדביקו את התאים בחלקיקים לנטי-ויראליים ב-MOI 6 בנוכחות פוליברן של 8 מיקרוגרם/מ"ל.
  9. לאחר 8 שעות, החלף את המדיה המכילה את הנגיף במדיית צמיחה חדשה של NPC.
  10. למחרת, חזרו על ההדבקות והחליפו את התקשורת בשעה 8 שעות.
  11. שמור את התאים בתרבית במשך 72 שעות לפני הקטיף לניתוח נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

לאחר העברת גנים, נדרשת בהכרח כדאיות גבוהה של hESCs. למרות המאמצים והאופטימיזציה של פרוטוקולים להפחתת מוות תאי בעקבות אלקטרופורציה של hESCs, יותר מ -50% מוות תאי עדיין נצפה לאחר אלקטרופורציה של תאים אלה, יחד עם יעילות טרנספקציה נמוכה20. העברת גנים בתיווך Lentiviral לא רק גורמת ליעילות גבוהה של העברת גנים, אלא גם מדגימה רמות גבוהות של כדאיות תאים לאחר התמרה. התוצאות שלהלן מציגות שתי גישות: האחת משתמשת ב-GFP ככתב ובביטוי חולף ב-NPCs שמקורם ב-HESCs והשנייה משתמשת בפורומיצין לבחירה יציבה של hESCs לניסויים ארוכי טווח בהבחנה.

בקבוצת הניסויים הראשונה, חלקיקים לנטי-ויראליים הופקו על ידי תעתיק משותף של shRNAs הנושאים את וקטור pll3.7 עם GFP ככתב יחד עם הדור השני של פלסמידי האריזה הלנטי-ויראליים psPAX2.0 ו-pMD2.G. חלקיקים לנטי-ויראליים נאספו לאחר 48 שעות ו-72 שעות לאחר הטרנספקציה והתרכזו באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה. איור 1A מראה את ביטוי ה-GFP השופע בתאי HEK293T לאחר 72 שעות של טרנספקציה. הביטוי של חלבונים נגיפיים הביא גם להיווצרות סינסיטיה של תאי HEK293T שבהם תאים בודדים מתמזגים יחד, כפי שמוצג על ידי חצים באיור 1A. הטיטרים נקבעו באמצעות ניתוח FACS. השווינו גם את הטייטרים ה-lentiviral באמצעות ריאגנט PEI ו-Lipofectamine 3000 בעלות נמוכה, ולא מצאנו הבדל משמעותי בין השניים במונחים של טיטרים נגיפיים (איור 2A). לאחר מכן, NPCs שמקורם ב-H9 hESCs נדבקו פעמיים בחלקיקים לנטי-ויראליים אלה המכילים GFP במזכרי הבנות של 6 ונקטפו לצורך ניתוח לאחר 72 שעות. איור 1B מראה ביטוי מסומן של GFP ב-NPCs לאחר ההדבקה. כפי שפורט לעיל, עבור ניסויי הבחנה ארוכי טווח, זה הכרחי שיהיו hESCs שמבטאים ביציבות shRNA. בניסיון ליצור קווי תאים יציבים המבטאים shRNA עבור גנים שונים, השתמשנו בווקטורים מבוססי plKO.1 וב-shRNA משובטים בהתאם להמלצות היצרן. לאחר מכן, חלקיקים לנטי-ויראליים יוצרו כמתואר לעיל, והטיטרים נקבעו באמצעות ערכת מדידה מסחרית של טיטר לנטי-ויראלי באמצעות שיטות מבוססות qPCR (איור 2B). hESCs הודבקו בחלקיקים לנטי-ויראליים ב-MOI של 10 ונבחרו באמצעות בחירת פורומיצין. איור 3 מציג את התוצאות של בחירה יציבה של hESCs לאחר התמרה. לאחר 5 ימים של סלקציה עם 0.8 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין, תאים טרנספקטים לנטי-ויראליים הראו יותר מ-80% כדאיות תאים בהשוואה לתאים שאינם מותמרים, שבהם אף תא לא שרד את הטיפול. לאחר הברירה, תאי H9 שעברו התמרה יציבה הורחבו עוד יותר, הוקפאו ונותחו באמצעות כתם מערבי כדי לבחון פגיעה יעילה בגנים.

במעבדה שלנו, יצרנו מספר קווי תאים יציבים של H9 hESCs המבטאים shRNA עבור גנים שונים באמצעות הגישה לעיל. כאן, הצגנו את התוצאות של אחד מאלה, שהוא הגן L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (L2HGDH) באמצעות ניתוח כתמים מערבי. ביטוי שופע של L2HGDH נצפה בתאים המתומרים עם עמוד שדרה וקטורי ריק. עם זאת, לא נצפה ביטוי של L2HGDH בתאים שעברו התמרה עם וקטור הנושא shRNA עבור L2HGDH, מה שמראה את היעילות של הדור היציב של קו תאים H9 hESCs עם ביטוי מופחת של L2HGDH, שניתן להשתמש בו למחקרי התמיינות נוספים (איור 4).

Figure 1
איור 1: ביטוי של GFP בתאי HEK293T וב-NPCs נגועים בנגיף. (A) shRNA שוכפלו לווקטור pll3.7 הנושא GFP ככתב והועתקו יחד עם פלסמידי אריזה בתאי HEK293T באמצעות PEI. ביטוי ה-GFP הגבוה מראה יעילות טרנספקציה יעילה לאחר 72 שעות של טרנספקציה. חצים מצביעים על היווצרות סינקטיה בתאי HEK293T, שם קבוצות של תאי HEK293T בודדים התמזגו יחד עקב ביטוי של חלבונים נגיפיים. (B) NPCs שמקורם ב-H9 הודבקו פעמיים ב-MOI של 6 עם חלקיקים לנטי-ויראליים המכילים GFP ככתב, וביטוי GFP נצפה ב-72 שעות לאחר ההדבקה. סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מדידות טיטר LVS. (A) טיטרים נגיפיים עבור וקטורים מבוססי pll3.7 נמדדו באמצעות ניתוח FACS על ידי כימות התאים החיוביים של %GFP עבור אותם דילולים נגיפיים שנתנו 2%-20% תאים חיוביים ל-GFP. (B) טיטרים ויראליים עבור וקטורים מבוססי pLKO.1 נקבעו באמצעות ערכת titer מסחרית של qPCR lentivirus, בהתאם להמלצות היצרן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הקמת קווי H9 hESC יציבים המבטאים shRNA. shRNA שוכפלו לווקטורים לנטי-ויראליים מבוססי pLKO.1 הנושאים את הגן לבחירת פורומיצין. H9 hESCs הודבקו בחלקיקים לנטי-ויראליים ב-MOI של 10 ונבחרו באמצעות פורומיצין. באמצעות 0.8 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין במשך 5 ימים, 100% מהתאים שאינם נגועים נהרגו, בעוד שרוב התאים שרדו את הטיפול בקבוצה הנגועה בנגיף. תאים אלה הורחבו ללא ברירה קלונלית לצורך שימור בהקפאה וניתוח נוסף. סרגל קנה מידה = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח כתם מערבי מייצג להפלה יציבה של הגן L2HGDH ב-HESCs H9. סך כל התאים ליזטים מתאי בקרה שלילית (H9, puro uncut), כמו גם תאים המבטאים ביציבות shRNA נגד L2HGDH (H9, sh-L2HGDH) היו נתונים לכתם מערבי באמצעות הנוגדן נגד L2HGDH. כפי שניתן לראות באיור, לא נצפה ביטוי של L2HGDH ב-H9 hESCs המבטאים ביציבות shRNA עבור L2HGDH. רצועה לא ספציפית נצפתה ממש מעל הפס הספציפי המתאים למשקל המולקולרי הנכון של 46-48 kDa (מסומן על ידי משולש) עבור הנוגדן L2HGDH. Anti-GAPDH שימש כבקרת טעינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היכולת לשנות גנטית תאי גזע למטרות מחקר או קליניות מוגבלת הן על ידי הטכנולוגיה והן על ידי ההבנה הבסיסית של הביולוגיה של hESCs. טכניקות שהראו פוטנציאל משמעותי ב-ESCs של עכברים, כמו דלקת שומן ואלקטרופורציה, אינן יעילות במיוחד עבור hESCs, אשר ידועים לשמצה כקשים להעברת גנים בשיטות קונבנציונליות20. רעיון זה הוביל לא רק לאופטימיזציה של טכניקות קיימות, אלא גם לפיתוח שיטות חדשניות ליעילות טרנספקציה מוגברת ב- hESCs. המוקד של פיתוחים חדשים אלה היה העברת גנים יעילה ויציבה ל-hESCs תוך שמירה על השפעה מינימלית על הצמיחה, הפלוריפוטנטיות ופוטנציאל ההבחנה של hESCs לאורך תקופות ממושכות. בין ההתפתחויות החדשות השונות העומדות בקריטריונים מחמירים אלה נמצאת העברת גנים בתיווך לנטי-ויראלי ל-hESCs21,22. לצורך ייצור חלקיקים לנטי-ויראליים המבטאים גן מסוים, הגן הרצוי משובט באחד מווקטורים של ההעברה והוא עובר טרנספקטציה בתאי HEK293T יחד עם פלסמידי אריזה כדי לקצור סופרנאטנט תרבית תאים המכיל חלקיקים לנטי-ויראליים. כדי לשמש hESCs, חיוני לרכז את החלקיקים הנגיפיים האלה באמצעות טכניקות שונות כדי להניב titers גבוה של וירוסים לפחות בטווח של 1 x 107-1 x 108 IU / mL. באופן כללי, נפחים גדולים של LVS מרוכזים מ 200x-500x את הנפח המקורי כדי להשיג titers אלה. משמעות הדבר היא ששימוש בשיטה חסכונית ביותר מבלי להתפשר על יעילות הטרנספקציה בתאי HEK293T הוא תנאי מוקדם לשימוש שגרתי בשיטות אלה במעבדה. השיטה הנוכחית מתארת את השימוש בפולימר הקטיוני PEI כשיטה חסכונית לייצור כמויות גדולות של LVS עם יעילות טרנספקציה בדומה לשיטות מבוססות שאיבת שומן, הנחשבות לתקן זהב. באמצעות השיטה המוצגת, אנו יכולים לקבל טיטרים ממוצעים של LVS הרבה מעל 5 x 107 IU/mL לאחר מקדם ריכוז של פי 200 מהנפח המקורי. באמצעות חלקיקי LVS אלה, הצלחנו ליצור מספר קווי תאים יציבים של H9 hESCs המבטאים shRNA עבור מספר גנים על ידי הדבקת התאים ב- MOIs גבוהים. השיטה המוצגת כאן עוקפת את השימוש בשיטות מייגעות וגוזלות זמן רב של בחירה והרחבה של קלונלים, תוך שהיא עדיין משיגה יעילות נוק-דאון קרובה ל-100%, כפי שמוצג על ידי אחת מתוצאות הכתם המערביות הייצוגיות עבור פגיעה בגנים L2HGDH באיור 4. להלן חלק מההמלצות לגישה מוצלחת.

השימוש במספר מעבר נמוך של תאי HEK293T נדרש (באופן אידיאלי מתחת ל-30) עבור טיטרים נגיפיים גבוהים. המפגש של תאי HEK293T הוא גורם חשוב נוסף בהקשר זה. תאי HEK293T חייבים להיות לפחות 80% מפגש לפני הטרנספקציה, שכן מגע בין תאים לתאים מפחית מאוד את הציטוטוקסיות ומשפר את ייצור הנגיף. את הווקטורים המשמשים יש להכין באמצעות ערכות בידוד פלסמיד ללא אנדוטוקסין ולאחר מכן משקעי אתנול, ולשחזר אותם בריכוז מינימלי של 1 מ"ג/מ"ל לפני השימוש בטרנספקציה. יכולות להיות וריאציות מאצווה לאצווה של פתרונות PEI שהוכנו בתאריכים שונים. מסיבה זו, כל אצווה של פתרון PEI חייבת להיבדק תחילה לביצועים באמצעות וקטורים של GFP, ויש לאחסן את הפתרון ב-−20 °C ב-aliquots חד-פעמיים כדי למנוע מחזורי הפשרה חוזרים ונשנים של הקפאה. עבור טיטרים גבוהים, האיסוף של LVS supernatant לאחר 72 שעות של טרנספקציה של תאי HEK293T מומלץ רק בתנאי שהתאים בריאים ומחוברים. סינון של ה-supernatant המכיל LVS מגביר מאוד את המסיסות של LVS לאחר אולטרה-צנטריפוגציה. לא מומלץ לאחסן את ה- LVS supernatant בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במשך יותר מ -5 ימים מכיוון שהוא יביא להפחתה משמעותית של טיטרים וירוסים. גרדיאנט סוכרוז במהלך אולטרה-צנטריפוגציה נדרש עבור טיטרים אופטימליים. הטמפרטורות חייבות להישמר קרוב ל -4 מעלות צלזיוס במהלך כל השלבים של ultracentrifugation. דגירה לילית של חלקיקי LVS מרוכזים ב-DPBS נדרשת להחייאה מלאה. צנטריפוגה בעקבות החייאה של LVS מסירה פסולת תאית (אם בכלל) מכיוון שהיא עלולה לגרום לציטוטוקסיות כאשר משתמשים בה על תאי המטרה. לאחר ההדבקה של תאי H9, חשוב להחליף את המדיה המכילה את הנגיף במדיית גדילה טרייה לאחר 8 שעות, שכן דגירה ממושכת עם הנגיף תגרום למוות תאי משמעותי של H9 hESCs. יש להתחיל את בחירת הפורומיצין רק כאשר המפגש הוא יותר מ -80%.

השיטה שתוארה לעיל הותאמה במקור לביטוי של shRNA. גישה דומה יכולה לשמש לשיבוט הביטוי האקטופי של cDNAs לווקטורים של ביטוי. עם זאת, מגבלה עיקרית של העברת גנים בתיווך לנטי-ויראלי היא מגבלת הגודל. ככל שהגודל גדל, האריזה של וקטורים לנטיוויראליים אינה אופטימלית, מה שמביא לירידה בטיטרים נגיפיים23. יש לכוון מחקר עתידי כדי לייעל את הפרוטוקול כדי להתגבר על אילוצים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מאוניברסיטת איחוד האמירויות הערביות (UAEU), מענק # 31R170 (מרכז זאיד למדעי הבריאות) ו # 12R010 (מענק UAEU-AUA). אנו מודים לפרופ' רנדל מורס (מרכז וודסוורת', אולבני, ניו יורק) על שעזר לנו לערוך את כתב היד לסגנון ולדקדוק.

כל הנתונים זמינים על פי בקשה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Invitrogen 31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes Beckman Coulter C14292
Accutase Stem Cell Technologies 7920
bFGF Recombinant human Invitrogen PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V Invitrogen 15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free Corning 354234
Cyclopamine Stem Cell Technologies 72074
DMEM media Invitrogen 11995073
DMEM Nutrient mix F12  Invitrogen 11320033
DPBS w/o: Ca and Mg PAN Biotech P04-36500
Fetal bovie serum Invitrogen 10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody CST 2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution GE healthcare SH30238.01
L Glutamine, 100X  Invitrogen 2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody Proteintech 15707-1-AP
L2HGDH shRNA Macrogen Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit Thermo Fisher L3000001
mTesR1 complete media Stem Cell Technologies 85850
Neurobasal medium 1X CTS Invitrogen A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x PAN Biotech P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x PAN Biotech P07-07200
Penicillin streptomycin SOL Invitrogen 15140122
pLKO.1 TRC vector Addgene 10878
pLL3.7 vector  Addgene 11795
pMD2.G Addgene 12259
Polybrene infection reagent Sigma TR1003- G
Polyethylenimine, branched Sigma 408727
psPAX2.0 Addgene 12260
Purmorphamine Tocris 4551/10
Puromycin Invitrogen A1113802
ROCK inhibitor Y-27632
dihydrochloride 		 Tocris 1254
SB 431542 Tocris 1614/10
Trypsin .05% EDTA  Invitrogen 25300062
XAV 939 Tocris 3748/10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
  3. Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
  4. Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).
  5. Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
  6. Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
  7. Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
  8. Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
  9. Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
  10. Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
  11. Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
  12. Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
  13. Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
  14. Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
  15. Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
  16. Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).
  17. Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. Production of lentiviral vectors. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 3, 16017 (2016).
  18. Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
  19. Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).
  20. Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
  21. Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
  22. Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
  23. Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).

Tags

ביולוגיה גיליון 183 לנטי-וירוסים shRNA hESCs NPCs פוליאתילנימין תאי HEK293T
Lentiviral מתווך אספקה של shRNA ל- hESCs ו- NPCs באמצעות פולימר קטיוני בעלות נמוכה Polyethylenimine (PEI)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sheikh, M. A., Ansari, S. A.… More

Sheikh, M. A., Ansari, S. A. Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI). J. Vis. Exp. (183), e63953, doi:10.3791/63953 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter