Summary
De vervanging van gezond spierweefsel door intramusculair vet is een prominent kenmerk van menselijke ziekten en aandoeningen. Dit protocol schetst hoe intramusculair vet kan worden gevisualiseerd, afgebeeld en gekwantificeerd, waardoor de mechanismen die ten grondslag liggen aan intramusculaire vetvorming kunnen worden bestudeerd.
Abstract
Fibro-adipogene voorlopers (FAPs) zijn mesenchymale stromale cellen die een cruciale rol spelen tijdens skeletspierhomeostase en regeneratie. FAPs bouwen en onderhouden de extracellulaire matrix die fungeert als een moleculaire myofibersteiger. Bovendien zijn FAPs onmisbaar voor myofiberregeneratie, omdat ze een groot aantal gunstige factoren afscheiden die door de spierstamcellen (MuSC's) worden waargenomen. In zieke staten zijn FAPs echter de cellulaire oorsprong van intramusculair vet en fibrotisch littekenweefsel. Deze vette fibrose is een kenmerk van sarcopenie en neuromusculaire ziekten, zoals Duchenne Spierdystrofie. Een belangrijke barrière bij het bepalen waarom en hoe FAPs differentiëren in intramusculair vet is effectieve conservering en daaropvolgende visualisatie van adipocyten, vooral in bevroren weefselsecties. Conventionele methoden voor de verwerking van skeletspierweefsel, zoals snap-freezing, behouden de morfologie van individuele adipocyten niet goed, waardoor nauwkeurige visualisatie en kwantificering worden voorkomen. Om deze hindernis te overwinnen, werd een rigoureus protocol ontwikkeld dat de morfologie van adipocyten in skeletspiersecties behoudt, waardoor visualisatie, beeldvorming en kwantificering van intramusculair vet mogelijk is. Het protocol schetst ook hoe een deel van het spierweefsel kan worden verwerkt voor RT-qPCR, waardoor gebruikers waargenomen veranderingen in vetvorming kunnen bevestigen door verschillen in de expressie van adipogene genen te bekijken. Bovendien kan het worden aangepast om adipocyten te visualiseren door immunofluorescentie van spiermonsters met volledige mount. Ten slotte schetst dit protocol hoe genetische afstammingstracering van Pdgfrα-expressing FAPs kan worden uitgevoerd om de adipogene conversie van FAPs te bestuderen. Dit protocol levert consequent hoge resolutie en morfologisch nauwkeurige immunofluorescente beelden van adipocyten, samen met bevestiging door RT-qPCR, waardoor robuuste, rigoureuze en reproduceerbare visualisatie en kwantificering van intramusculair vet mogelijk is. Samen is de hier beschreven analysepijplijn de eerste stap naar het verbeteren van ons begrip van hoe FAPs differentiëren in intramusculair vet en biedt het een kader om nieuwe interventies te valideren om vetvorming te voorkomen.
Introduction
De infiltratie van gezond spierweefsel met vetfibrose is een prominent kenmerk van Duchenne Spierdystrofie (DMD) en andere neuromusculaire ziekten, evenals sarcopenie, obesitas en diabetes 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Hoewel verhoogde vetinfiltratie bij deze aandoeningen sterk geassocieerd is met een verminderde spierfunctie, is onze kennis van waarom en hoe intramusculaire vetvormen nog steeds beperkt. FAPs zijn een multipotente mesenchymale stromale celpopulatie die aanwezig is in de meeste volwassen organen, waaronder skeletspieren11,12. Met de leeftijd en bij chronische ziekten produceren FAPs echter fibrotisch littekenweefsel en differentiëren ze in adipocyten, die zich tussen individuele myofiberen bevinden en intramusculair vet vormen 13,14,15,16,17,18,19,20.
Om intramusculaire vetvorming te bestrijden, moeten de mechanismen worden gedefinieerd van hoe FAPs in adipocyten veranderen. PDGFRα is de "gouden standaard" marker in het veld om FAPs te identificeren in de spier van meerdere soorten 13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27. Als gevolg hiervan zijn verschillende murine tamoxifen-induceerbare Cre-lijnen, onder controle van de Pdgfrα-promotor, gegenereerd, waardoor FAPs in vivo genetisch kunnen worden gemanipuleerd met behulp van het Cre-LoxP-systeem 27,28,29. Door deze induceerbare Cre-lijn bijvoorbeeld te combineren met een genetische reporter, kan afstammingstracering van FAPs worden uitgevoerd, een strategie die we met succes hebben toegepast op fate map FAPs in spier- en wit vetweefsel20,30. Naast het traceren van afstamming bieden deze Cre-lijnen waardevolle hulpmiddelen om de FAP-naar-vetconversie te bestuderen.
Een belangrijk obstakel bij het definiëren van het mechanisme van de adipogene omzetting van FAPs in intramusculair vet is het vermogen om de hoeveelheid intramusculair vet die zich onder verschillende omstandigheden heeft gevormd rigoureus en reproduceerbaar te kwantificeren. De sleutel is om het behoud van spier- en vetweefsel in evenwicht te brengen en dit te matchen met de beschikbare kleuringsmethoden om adipocyten te visualiseren. De skeletspieren worden bijvoorbeeld vaak vastgevroren zonder voorafgaande fixatie, waardoor myofiberen behouden blijven maar de morfologie van adipocyten wordt verstoord (figuur 1). Daarentegen verwijdert fixatie gevolgd door paraffine-inbedding, terwijl de beste weefselhistologie wordt weergegeven, inclusief adipocyten, alle lipiden, waardoor de meeste lipofiele kleurstoffen, zoals de veelgebruikte kleurstof Oil Red O, onbruikbaar worden.
Figuur 1: Representatieve beelden van intramusculair vet in snap-bevroren versus vaste spierweefsels. (A) Schematisch overzicht van de experimentele opstelling. Immunofluorescente beelden met adipocyten (geel), myofiberen (grijs) en kernen (cyaan) in zowel (B) snap-frozen als (C) vaste TA's 21 dagen na glycerolletsel. Schaalbalken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het hier beschreven protocol behoudt de myofiber- en adipocytmorfologie en maakt visualisatie en analyse van meerdere celtypen mogelijk. Deze aanpak is gebaseerd op immunofluorescentiekleuring van adipocyten in paraformaldehyde (PFA)-gefixeerd spierweefsel, wat co-kleuring met meerdere antilichamen mogelijk maakt. Het kan ook gemakkelijk worden aangepast om intramusculair vet in intact weefsel ruimtelijk weer te geven met behulp van beeldvorming over de hele montage, waardoor informatie wordt verstrekt over de cellulaire micro-omgeving van vet in de spier. Bovendien kan dit protocol worden gecombineerd met onze onlangs gepubliceerde aanpak om het dwarsdoorsnedegebied van myofiberen in vaste spierweefsels te bepalen31, een belangrijke meting om de gezondheid van de spieren te beoordelen. Het combineren van deze aanpak met genetische afstammingstracering om het lot in kaart te brengen, wordt hier ook de differentiatie van FAPs in adipocyten geschetst. Het veelzijdige protocol dat hier wordt beschreven, maakt dus een rigoureuze en reproduceerbare beoordeling van FAP's en hun differentiatie in intramusculair vet in weefselsecties en intacte weefsels mogelijk.
Figuur 2: Schematisch protocoloverzicht. Schematisch overzicht van weefselverwerking waarbij een derde van de TA wordt verwijderd, vastgevroren en gehomogeniseerd voor daaropvolgende RNA-isolatie en transcriptieanalyse via RT-qPCR. De andere tweederde van de TA is PFA-gefixeerd en verwerkt voor immunostaining op bevroren secties of hele vezels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Protocol
Alle dierprotocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Florida.
1. Genetische afstamming van FAP's
OPMERKING: Als genetische afstamming van FAPs niet gewenst is, kan stap 1 worden overgeslagen.
- Om afstammingstracering van FAPs uit te voeren, moet u de benodigde muisallelen verkrijgen.
OPMERKING: Verschillende tamoxifen-induceerbare Cre-lijnen, onder controle van de Pdgfrα-promotor , zijn gegenereerd om met succes FAP's te targeten, waaronder van de Hogan29, Rando27 en Bergles32 laboratoria. Als genetisch verslaggever van Cre-activiteit zijn er talloze Rosa26-verslaggever-allelen beschikbaar, zoals Rosa26EYFP33. Hoewel het voor elk laboratorium wordt voorgesteld om te bepalen welke Cre-Reporter-combinatie het meest effectief is, door PdgfrαCreERT2-muizen (29 en Jax # 032770) te kruisen met de Rosa26EYFP (33 en Jax # 006148) -verslaggever, de resulterende PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFP-muizenkunnen worden gebruikt om FAPs20 efficiënt en specifiek te markeren. Om het lot van volwassen FAPs te traceren, wordt aanbevolen om te wachten tot muizen ten minste ~ 10 weken oud zijn voordat tamoxifen wordt toegediend. Afstammingstraceringsexperimenten kunnen worden uitgevoerd op zowel mannen als vrouwen. - Toediening van tamoxifen door orale gavaging
- Bereid 40 mg / ml tamoxifen in maïsolie en vortex goed om 1 dag voor het gavagen te mengen. Incubeer O/N bij 37 °C in een roterende hybridisatieoven.
LET OP: Tamoxifen is een carcinogeen en moet zorgvuldig worden behandeld. Draag altijd handschoenen bij het hanteren en draag een masker bij het wegen als poeder, omdat er gevaar is voor inademing. - Reinig het gebied volgens protocol en bevestig een gavaging naald aan een spuit van 1 ml. Zuig 200 μL tamoxifen in de spuit.
- Nekvel PdgfrαCreERT2 ; Rosa26EYFP-muizen (10 weken oud; beide geslachten gebruikt) door ze op een plat oppervlak te plaatsen en de basis van de staart stevig vast te pakken. Gebruik een vrije hand om het midden van de muis vast te pakken met de duim en wijsvinger en schuif vervolgens voorzichtig en met lichte druk de grip tot net voorbij de schouders.
- Knijp de huid terug met de duim en wijsvinger, pak de muis op en draai de hand zodat de muis naar de gebruiker is gericht en stop de staart tussen de pink en ringvinger van de hand die de muis vasthoudt.
- Zorg er op dit punt voor dat de muis goed geïmmobiliseerd is en zijn hoofd of armen niet kan bewegen. Steek de gavaging naald in de mond en gebruik deze om het hoofd van de muis iets naar achteren te kantelen; hierdoor kan de slokdarm beter toegankelijk zijn.
- Steek de naald voorzichtig en langzaam in de slokdarm. Forceer de naald niet als aan enige weerstand wordt voldaan; de naald moet gemakkelijk naar beneden glijden. Injecteer de tamoxifen langzaam. Controleer de muizen gedurende 15-20 minuten om ervoor te zorgen dat er geen problemen optreden tijdens het broeden.
OPMERKING: Toediening van tamoxifen op 2 opeenvolgende dagen resulteert meestal in ~ 75% -85% recombinatie-efficiëntie van FAPs zonder nadelige effecten te veroorzaken. Het wordt aanbevolen dat de gebruiker 1-2 weken wacht voordat het letsel veroorzaakt, waardoor de resterende tamoxifen uit het systeem kunnen worden verwijderd en het resterende eiwit kan worden omgedraaid.
- Bereid 40 mg / ml tamoxifen in maïsolie en vortex goed om 1 dag voor het gavagen te mengen. Incubeer O/N bij 37 °C in een roterende hybridisatieoven.
2. Letsel van tibialis anterieure (TA) spier
OPMERKING: Om intramusculair vet te bestuderen, wordt aanbevolen om een op glycerol gebaseerd verwondingsmodel te gebruiken (50% glycerol in steriele zoutoplossing), wat resulteert in massale intramusculaire vetvorming 34,35,36,37.
- Bereid de verdovingsmachine voor door isofluraan toe te voegen en ervoor te zorgen dat de buizen naar zowel de muizenkamer als de neuskegel open zijn. Reinig de kamer en het werkgebied met 70% ethanol of peroxide-oplossing (afhankelijk van protocollen).
- Stel het zuurstofdebiet in op 2,5 l/min en de isofluraanconcentratie op 2,5%. Plaats een muis in de anesthesiekamer en wacht ~ 5 minuten totdat deze is verdoofd.
- Plaats de muis in rugligging op een schoon verwarmingskussen en steek de neus in de neuskegel. Breng voorzichtig vet oogheelkundige zalf aan op de ogen met een katoenen applicator om uitdroging te voorkomen terwijl u onder narcose bent. Controleer voortdurend de anesthesie en voer voorafgaand aan het letsel een teenknijper uit op de muis om ervoor te zorgen dat de muis volledig verdoofd is.
- Reinig het te injecteren been met een vers alcoholdoekje om te desinfecteren.
- Zuig 30-50 μL 50% glycerol (afhankelijk van de grootte van de muizen) op in de insulinespuit. Borstel voorzichtig het haar op het scheenbeen om de locatie van de TA bloot te leggen.
OPMERKING: Het is gemakkelijker om het haar te bewegen en een betere visualisatie te bereiken wanneer het nog nat is van het alcoholdoekje. - Na het lokaliseren van de TA (net lateraal aan het scheenbeen, steekt het lichtjes door de huid en kan het met zachte palpatie worden gevoeld), steek de naald distaal in de TA, in de buurt van de enkel. Steek de naald volledig in de spier en injecteer langzaam glycerol terwijl de naald geleidelijk wordt teruggetrokken, wat helpt om het grootste deel van de spier te verwonden.
OPMERKING: Het is het beste om de naald parallel aan het been in te brengen, met slechts een iets verhoogde hoek. Een goede blessure veroorzaakt meestal dorsiflexie omdat de TA samentrekt na het terugtrekken van de naald. Als de tenen van de muis zich uitspreiden, is het waarschijnlijk dat de extensor digitorum longus (EDL) spier is geïnjecteerd. - Plaats de muis terug in de kooi en controleer gedurende ongeveer 15-20 minuten om herstel van de anesthesie te garanderen.
- Gooi de naald weg in een naaldencontainer. Vat nooit een naald samen.
OPMERKING: Analgesie na glycerolinjectie moet worden verstrekt zoals goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee. Adipocyten kunnen worden waargenomen zodra 5 dagen na het letsel (dpi). Door 7 dpi hebben alle adipocyten zich gevormd en met 21 dpi zijn ze volledig gerijpt.
3. Weefseloogst
- Bereid 4% PFA in 1x PBS en plaats op ijs voordat u begint met oogsten.
- Plaats alle platen (12- of 24-well) die worden gebruikt voor spierfixatie op ijs en voeg 4% PFA toe aan elke put, zorg ervoor dat elke put 10-20 keer meer volume PFA heeft dan het weefsel dat wordt gefixeerd.
- Tussen 7 en 21 dagen na glycerolletsel, euthanaseer de muis volgens institutionele richtlijnen (d.w.z. overdosering van isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie).
- Begin met het oogsten van alle weefsels die moeten worden gebruikt voor histologie of RNA-isolatie.
OPMERKING: Weefsels moeten binnen 10-15 minuten na het opofferen worden vastgevroren of in PFA worden geplaatst (figuur 2). - Besproei royaal alle delen van de muis die moeten worden gesneden met 70% ethanol om het haar van het ontledende gebied en instrumenten te houden.
- Gebruik een schaar om de huid rond de bovenkant van het been te knippen, in de buurt van het bekken (figuur 3A).
- Trek de huid van het been voorzichtig van de bovenkant naar beneden naar de enkel (figuur 3B).
OPMERKING: De TA is een druppelvormige spier met een duidelijk gedefinieerde distale pees die zich hecht aan het mediale spijkerschrift en het eerste middenvoetsbeentje. Het is lateraal aan het scheenbeen en strekt zich uit tot aan de onderste knie. - Verwijder eerst de buitenste bindweefsellaag (epimysium) met een scherp pincet voordat u de TA oogst (figuur 3C). Gebruik een ontleedmicroscoop om het epimysium beter te visualiseren.
- Schuif het pincet onder de TA vanaf de onderkant van de spier, beginnend bij de distale pees, en trek voorzichtig omhoog naar de knie (figuur 3D). Stop aan het einde van de spier; duw niet voorbij de weerstand die bij de onderste knie wordt gevoeld.
- Als er aanzienlijke weerstand is voordat u de onderste knie bereikt, stop dan en ga door met het verwijderen van overgebleven lagen bindweefsel.
OPMERKING: Er is nog een distale pees net lateraal aan de TA-pees die zich hecht aan de EDL, wat een slanke spier lateraal aan de TA is. Voorzichtig zijn om het pincet alleen onder de TA-pees te schuiven voorkomt onbedoeld oogsten van de EDL, maar het kan ook gemakkelijk worden verwijderd na fixatie. - Zodra de TA gedeeltelijk van het been is opgetild met het pincet, gebruikt u dezelfde beweging met een scalpel om de verbinding van de TA met de onderste knie te verbreken (figuur 3E). Knip de pees bij de enkel met een schaar om de TA volledig te verwijderen. Behandel alleen de spier bij de pees om beschadiging van de vezels te voorkomen.
- Snijd 1/3 van de TA aan het einde tegenover de pees (figuur 3F), plaats deze in een microcentrifugebuis en bevries door deze in vloeibare stikstof te laten vallen (figuur 3H).
- Dompel de andere 2/3 van het weefsel onder in een gelabelde put met 4% PFA voor histologie (figuur 3I). Zorg ervoor dat u bijhoudt wanneer het eerste en laatste weefsel in fixatief is geplaatst. Plaats op een shaker gedurende 2-2,5 uur bij 4 °C.
- De duur van de fixatie is afhankelijk van het weefsel en de grootte ervan. Bepaal de duur die nodig is voor het fixeren van de weefsels. Het fixeren van TA's gedurende 2-2,5 uur bij 4 °C behoudt doorgaans de morfologie van adipocyten goed zonder overfixatie van het weefsel te veroorzaken.
OPMERKING: Als u van plan bent TA te gebruiken voor immunofluorescente kleuring in de hele montage, slaat u de rest van dit protocol over totdat u sectie 7 bereikt: "Whole Mount Immunofluorescent Staining". - Verwijder na fixatie PFA uit de putjes, spoel de weefsels 2-3 keer koud 1x PBS en was vervolgens 2-3 keer met koud 1x PBS gedurende 5 minuten per wasbeurt.
- Verwijder de PBS uit de putjes en voeg voldoende 30% sucrose toe in 1x PBS om het weefsel te laten zweven. Zet op de shaker bij 4 °C een nacht.
Figuur 3: Samenvatting van de weefseloogst. (A) De huid wordt aan de basis van het been gesneden en (B) de spieren van de achterpoten worden blootgelegd. (C) Zodra het epimysium uit de TA is verwijderd, wordt (D) een tang gebruikt om de spier gedeeltelijk te scheiden en ervoor te zorgen dat het epimysium volledig is verwijderd. (E) De TA wordt met een scalpel uit het been gesneden en verwijderd na het doorsnijden van de pees. (G) Na het snijden van de TA in een derde en een tweederde stuk, (H) wordt een derde vastgevroren in vloeibare stikstof voor RT-qPCR-analyse en (I) wordt de andere twee derde gefixeerd in 4% PFA voor histologie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Inbedding
- Bereid de specimenvormen voor om te worden gebruikt voor inbedding door te labelen en te vullen met voldoende insluitmedium om de weefsels volledig onder te dompelen.
- Verwijder tissues uit de putjes, droog overtollige sucrose af op een papieren handdoek en ga naar de ijskoude medium gevulde monstervormen.
OPMERKING: Het is handig om te weten in welke richting de mal op de cryostaat wordt gesneden. Op deze manier kan de gebruiker de weefsels in de mal zo oriënteren dat het interessegebied gemakkelijk toegankelijk is. Voor de TA zou dit worden bereikt door het dikste uiteinde (tegenovergesteld aan de peeszijde) naar het oppervlak te plaatsen dat zal worden doorsneden. Hierdoor kan de TA gemakkelijk worden doorsneden op het dikste deel (buik) en kan de spiervezels door de dwarsdoorsnede worden gesneden. - Bereid een isopentaanbrij door een container met isopentaan gedeeltelijk onder te dompelen in vloeibare stikstof. Zorg ervoor dat er voldoende vloeibare isopentaan in de container zit om ongeveer de helft van de specimenvorm onder te dompelen om te worden gebruikt om de weefsels in te bedden.
- Begin met het invriezen van de mallen door ze voorzichtig in de isopentaan slurry te doen en ervoor te zorgen dat ongeveer de helft van de schimmel wordt ondergedompeld. Zorg er ook voor dat de schimmel van alle vier de kanten gelijk bevriest.
- Haal de mal uit de isopentaan net voordat de hele mal zichtbaar is ingevroren vanaf de bovenkant. De hoeveelheid tijd die dit kost, is afhankelijk van de mallen die worden gebruikt.
- Bewaar de bevroren mallen in een container met droogijs terwijl je de rest van de blokken invriest en bewaar ze vervolgens bij -80 °C.
OPMERKING: Isopentaan voor het invriezen kan worden hergebruikt. Doe in een glazen fles, maar draai het deksel niet aan totdat isopentane kamertemperatuur (RT) bereikt. Anders zou de verandering in druk de fles kunnen verbrijzelen.
5. Secties
- Stel de cryostaat in op -22 tot -24 °C, voeg mallen met TA's toe aan de cryostaat en wacht minimaal 30 minuten op temperatuuraclimatisatie. Label in de tussentijd een reeks positief geladen microscoopglaasjes.
- Plaats een antirolplaat en lijn uit op de cryostaat, zodat er minimale inkepingen in de plaat zijn waar deze contact maakt met het monsterblok. Veilig op zijn plaats.
- Steek een vers cryostaatmes in de meshouder en zet het op zijn plaats.
LET OP: Het lemmet is scherp. Bedek het mes bij het manipuleren van andere delen van de cryostaat of bevroren mallen. - Verwijder het bevroren blok uit de vorm. Voeg een uniforme laag insluitmedium toe aan de cryostaathouder en plaats het blok in het medium. Laat het 1-3 minuten zitten totdat het insluitmedium volledig bevroren is (ondoorzichtig wit).
OPMERKING: Voor TA's moet het dikste gebied (buik) zichtbaar zijn wanneer het op de klauwplaat zit. - Plaats de cryostaathouder met het weefselblok in de cryostaat. Ontdek het mes en breng de cryostaat naar voren totdat het net in contact komt met het blad. Snijd door het blok bij secties van 25 μm totdat het weefsel niet langer wordt verduisterd door het insluitmedium.
OPMERKING: Pas tijdens het snijden de hoek van de cryostaat en/of de positie van het podium zodanig aan dat de secties een uniforme dikte hebben. Het kan nuttig zijn om een paar secties te verzamelen om uniformiteit in sectiedikte te garanderen. Het wordt aanbevolen dat de gebruiker de juiste antirolplaatpositie vindt voordat hij doorsnijdt naar het interessante gebied binnen de TA (buik), omdat dit de gebruiker in staat stelt om verschillende posities van de antirolplaat te proberen totdat de secties recht afkomen zonder weefsel te verspillen. - Verander de sectiedikte in 10-12 μm en verzamel de secties op gelabelde microscoopglaasjes. Seriële secties worden aanbevolen door aangrenzende secties op 6-10 dia's (gelabeld 1-x) te verzamelen, waardoor kleuring voor meerdere markeringen mogelijk is. Gebruik indien nodig een dun penseel om secties los te maken voordat u ze op de dia verzamelt.
OPMERKING: Als secties krullen, controleer dan of de temperatuur stabiel blijft binnen het bereik van -22 tot -24 °C. Als er verticale strepen in secties zijn, kan dit te wijten zijn aan een inkeping in de antirolplaat of het mes; dit kan worden verholpen door de positie van de antirolplaat aan te passen en/of over te schakelen naar een nieuw blad. - Nadat u aangrenzende secties van hetzelfde sectievlak op elke dia hebt verzameld, past u de dikte terug naar 25 μm om 150-200 μm door het blok te gaan, past u de dikte vervolgens weer aan op 10-12 μm en begint u opnieuw met snijden.
OPMERKING: Met deze seriële sectie kan de gebruiker op verschillende diepten visualiseren, beeld geven en kwantificeren via de TA; drie tot vier seriële secties per dia is voldoende. - Bewaar de dia's en weefselblokken bij -80 °C.
6. Immunofluorescente (IF) kleuring van weefselsecties
OPMERKING: Aangezien antilichaamconcentraties kunnen variëren tussen partijen en fabrikanten, wordt optimalisatie aanbevolen door verschillende concentraties van de antilichamen op testglaasjes te evalueren voordat de interessante dia's worden gekleurd.
- Ontdooien/droge glijden op RT of op een warme plaat bij 37 °C gedurende 10-20 min.
- Gebruik een hydrofobe pen om een lijn te tekenen aan de rand van het papieroppervlak van de dia, waar deze het glas ontmoet.
- Doe de dia's in een Coplin pot en was met 1x PBS + 0,1% Tween20 (PBST) 3-5x op een shaker gedurende ten minste 5 minuten per wasbeurt om de weefselsecties te hydrateren.
OPMERKING: Op dit punt is het belangrijk om de dia's niet te laten zitten zonder ondergedompeld te worden in PBST (tot aan de hydrofobe lijn), anders zullen de weefselsecties uitdrogen. - Plaats de dia's op het rooster van een bevochtigingskamer en leg de dia's met 310-350 μL blokkerende oplossing (5% ezelserum en 0,3% Triton X-100 in 1x PBS) gedurende 1-2 uur bij RT.
OPMERKING: Er is geen extra permeabilisatiestap nodig, omdat de blokkerende oplossing 0,3% Triton X-100 bevat, waardoor voldoende permeabilisatie van de weefselsecties mogelijk is. Bij gebruik van primaire antilichamen afgeleid van muizen (d.w.z. PAX7 en MYOD1 hieronder vermeld), wordt aanbevolen om een muis-op-muis blokkerende stap met behulp van Fab-fragmenten (1:50) op te nemen in de blokkerende oplossing voor de blokkerende stap. Dit zal helpen de achtergrond te verminderen als gevolg van niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam van de muis aan andere antilichamen dan het primaire. - Verdun de primaire antilichamen die in de blokkerende oplossing moeten worden gebruikt kort voordat u doorgaat naar de volgende stap als volgt:
- Primaire antilichamen voor adipocytkleuring en beeldvorming van de hele sectie: Verdun konijn anti-perilipin bij een verdunningsverhouding van 1:1000.
- Primaire antilichamen voor het traceren van afstamming van adipocyten: Verdun kip anti-GFP in een verhouding van 1:1000 en konijn anti-perilipin op 1:1000.
- Primaire antilichamen voor het traceren van afstamming van FAPs: Verdun kip anti-GFP in een verhouding van 1:1000 en geiten anti-PDGFRα op 1:250.
- Primaire antilichamen voor myogene markers: Verdun muis anti-PAX7 in een verhouding van 1:25 of muis anti-MYOD1 op 1:250, en konijn anti-LAMININ op 1:1000.
OPMERKING: Hoewel de hierboven genoemde antilichamen met succes zijn beoordeeld met dit protocol, is het waarschijnlijk dat andere markers en antilichamen om FAPs, adipocyten en / of andere celtypen te labelen ook compatibel zijn met dit protocol. Het wordt sterk aanbevolen om bij het eerste gebruik van primaire antilichamen dat de gebruiker een negatieve controledia opneemt, waarin primaire antilichamen worden weggelaten. Dit zal controleren op de specificiteit van de antilichamen. Alle andere stappen in het protocol worden gevolgd, inclusief de toevoeging van secundaire antilichamen, maar de blokkerende oplossing wordt alleen gebruikt in de volgende stap in plaats van het primaire antilichaam in de blokkerende oplossing.
- Dump de blokkeeroplossing van de dia's en leg met 310-350 μL blokkeringsoplossing met primaire antilichamen en incubeer 's nachts bij 4 °C in de bevochtigingskamer.
- Dump de volgende dag de blokkerende oplossing /primaire antilichamen van de dia's en plaats ze in een Coplin-pot. Spoel de dia's 2-3 keer af met PBST en was 3-5x met PBST op een shaker gedurende ten minste 5 minuten per wasbeurt.
- Bereid tijdens de laatste wasbeurt de secundaire antilichamen of eventuele directe conjugaten voor gebruik in de blokkerende oplossing. Minimaliseer de hoeveelheid tijd die deze antilichamen in het licht doorbrengen om fotobleaching te voorkomen.
- Verdunde secundaire antilichamen/directe conjugaten: 488 nm ezel anti-kip (1:1000) of anti-konijn (1:1000) of anti-muis (1:1000), 568 nm ezel anti-geit (1:1000) of anti-konijn (1:1000) of Falloidine (myofibers; 1:100), DAPI-kleur (kernen; 1:500).
- Bedek de dia's met 310-350 μL van de blokkerende oplossing met secundaire antilichamen en/of directe conjugaten in de bevochtigingskamer. Incubeer bij RT gedurende 1-2 uur. Bescherm monsters vanaf nu tegen licht.
- Dump de blokkerende oplossing/secundaire antilichamen en plaats ze in een Coplin-pot. Spoel één keer met PBST en was 3-5x met PBST op een shaker gedurende ten minste 5 minuten per wasbeurt. Houd de Coplin-pot afgedekt om blootstelling aan licht te voorkomen.
- Droog de dia's zo goed mogelijk door op de randen te tikken en de rug tegen een papieren handdoek af te vegen, maar laat de weefselsecties niet uitdrogen.
- Voeg drie of vier druppels waterig montagemedium toe aan de bovenste horizontale rand van de dia en voeg voorzichtig een coverslip toe. Druk niet naar beneden of beweeg niet als zich luchtbellen vormen onder de deklip; elke druk of beweging kan de fragiele cellulaire architectuur van adipocyten verstoren.
- Laat het montagemedium 's nachts in het donker instellen voordat u gaat fotograferen.
7. Immunofluorescente kleuring met volledige montage
- Gebruik na ~1 uur fixatie (zie stap 3.14) een scherp pincet om myofibers van de vaste TA af te pellen.
- Doe de gescheiden vezels in een 24-well plaat en was 3x gedurende 3 minuten elk met PBST. Zorg er voor alle volgende incubaties voor dat u het deksel toevoegt om verdamping te voorkomen.
- Incubeer gedurende 1 uur in 1% Triton X-100 in 1x PBS bij RT (200-300 μL) op een shaker om een betere penetratie van antilichamen mogelijk te maken.
- Na een paar keer spoelen met PBST, overlay met blokkerende oplossing (200-300 μL) en blok op een nutator of shaker 's nachts bij 4 °C.
- Verdun de primaire antilichamen op de gewenste concentratie (verdubbeling van de concentratie is meestal een goed startpunt) in de blokkerende oplossing. Incubeer de monsters (200-300 μL) op een notenmaker of shaker gedurende een nacht bij 4 °C.
- Was de monsters rigoureus met PBST gedurende de dag met frequente veranderingen bij RT op de shaker, ongeveer 4-6x gedurende 30-60 minuten per wasbeurt.
- Verdun de secundaire antilichamen in de blokkerende oplossing in de gewenste concentratie (1:500 heeft de neiging om goed te werken) plus nucleaire kleuring en incubeer de monsters (200-300 μL) op een nutator of shaker 's nachts bij 4 °C.
- Was monsters rigoureus met PBST gedurende de dag met frequente veranderingen bij RT op de shaker, ongeveer 4-6x keer gedurende 30-60 minuten elke wasbeurt of was 's nachts op 4 °C.
- Om te monteren, droogt u het overtollige PBST voorzichtig af en plaatst u de vezels vervolgens in een of twee druppels montagemedium op een glazen schuif (figuur 4A). Om de deklip (18 mm x 18 mm) op te tillen, voegt u kleine kleivoetjes toe; dit voorkomt dat de vezels worden geplet en bevestigt de coverslip aan de glijbaan. Modelleringsverbindingen werken hiervoor goed. Zodra de coverslip is bevestigd, voegt u meer medium toe aan de rand totdat het gebied onder de coverslip vol is.
OPMERKING: In plaats van een montagemedium te gebruiken dat anti-fadingmiddelen bevat, kan het weefsel ook worden verplaatst door een oplopende reeks glycerol (30% tot 80% glycerol in PBS). - Wacht 1-2 dagen voordat u het montagemedium in beeld brengt om uitharding van het montagemedium mogelijk te maken.
8. Beeldvorming van intramusculair vet
- Schakel de microscoop in en start de beeldbewerkingssoftware. Zet de dia op het podium vast.
OPMERKING: Voor het afbeelden van adipocyten in spiersecties is een 5x of 10x objectief in combinatie met widefield microscopie vaak voldoende. Voor het visualiseren van WM-IF is een confocale microscoop vereist. - Gebruik een willekeurig kanaal om het gebied te identificeren dat moet worden afgebeeld.
- Pas in de beeldvormingssoftware de versterking en belichtingstijd voor elk kanaal aan.
- Maak foto's van het hele weefsel in elk kanaal (automatisch of handmatig volgens de gebruikte microscoop en software) en voeg individuele tegels samen tot een samenstelling van de volledige TA-doorsnede.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om foto's te maken van twee of drie verschillende secties van dezelfde TA op verschillende diepten. Door de adipocyten in elke sectie te kwantificeren en vervolgens de gemiddelde, gelokaliseerde verschillen in de hoeveelheid intramusculair vet als gevolg van bijvoorbeeld injectiefouten te rapporteren, worden vermeden.
9. Adipocyten kwantificeren
- Als u deze nog niet eerder hebt geïnstalleerd, voegt u de cell counter-plug-in toe aan ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
- Importeer de afbeeldingen in ImageJ als TIF-bestanden of originele microscoopbestanden. Bekijk elk kanaal in ImageJ als een afzonderlijk TIF-bestand.
OPMERKING: Als u LIF of vergelijkbare microscoopbestandstypen gebruikt, kiest u onder Opties voor importeren van bio-indelingen de optie Hyperstack voor Stapel weergeven met en vinkt u het selectievakje voor Gesplitste kanalen in. Klik op OK om het bestand te openen. Zorg er ook voor dat het selectievakje Automatisch schalen is uitgeschakeld. - Zorg ervoor dat afbeeldingen voor elk kanaal de 8-bits indeling (en grijs) hebben: afbeelding > Type > 8-bits.
- DAPI-afbeeldingen (blauw), GFP (groen), PERILIPIN (rood) en PHALLOIDIN (grijs) samenvoegen: Afbeelding > Kleur > Kanalen samenvoegen.
- Controleer of de schaal (Analyseren > Schaal instellen) in micron is. Gebruik de selectietool uit de vrije hand om het gewonde en niet-gewonde deel van elke doorsnede te schetsen, vervolgens te meten (analyseren > meten) en het gewonde versus niet-gewonde gebied in een spreadsheet vast te leggen.
OPMERKING: Gewonde spieren kunnen worden geïdentificeerd als gebieden zonder myofibers of gebieden bevolkt door myofibers die centraal gelegen kernen bevatten. - Cell Counter starten: Plug-ins > CellCounter > initialiseren.
- Selecteer een tellertype en tel vervolgens elke adipocyt. Noteer het totale aantal adipocyten in een spreadsheet en bereken vervolgens het aantal adipocyten per 1 mm2 van het gewonde gebied.
10. Adipogene genexpressie analyse met behulp van RT-qPCR
- RNA-isolatie
- Verwarm voor aanvang RNase-vrij water voor op 45 °C en bereid verse 70% EtOH (350 μL per monster).
- Voeg 1.000 μL guanidiumthiocyanaat toe aan elke buis die het monster bevat (zie stap 3.12). Het is belangrijk dat er door kraalkloppers goedgekeurde buizen worden gebruikt.
LET OP: Guanidium thiocyanaat is giftig. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en handvat in een zuurkast. - Voeg drie middelgrote kralen of een grote en een kleine kraal toe aan elke buis.
- Homogeniseer het weefsel op 50 Hz gedurende 2-4 minuten met behulp van een kraalklopper. Afhankelijk van het weefseltype en de monstergrootte kan het tot 10 minuten duren.
- Voeg 200 μL chloroform toe.
LET OP: Chloroform is giftig. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen en handvat in een zuurkast. - Schud de monsters gedurende 15 s. Incubeer gedurende 2-3 minuten bij RT.
- Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 x g. Pipetteer 350 μL van het heldere supernatant (bovenste laag met het RNA) en voeg toe aan een nieuwe microcentrifugebuis met 350 μL 70% ethanol. Pas op dat u de onderste eiwit- en/of DNA-lagen niet aspirateert
- Breng tot 700 μL van het mengsel over naar een mini-spinkolom in een opvangbuis van 2 ml. Ga verder met RNA-isolatie volgens de instructies van de fabrikant.
- Eluteer met 30-50 μL RNase-vrij water, afhankelijk van de verwachte opbrengst. Houd RNA op ijs en meet de opbrengst met behulp van een spectrofotometer. Bewaar het RNA bij -80 °C
OPMERKING: Het is mogelijk om de DNase-behandelingsstap weg te laten, omdat het zorgvuldig verwijderen van alleen de bovenste 350 μL van de RNA-laag voldoende is om DNA-besmetting te voorkomen. Naast RT-qPCR-analyse kan het geïsoleerde RNA ook worden gebruikt voor RNA-sequencing, in welk geval een DNase-behandelingsstap ten zeerste wordt aanbevolen.
- cDNA synthese
- Gebruik tot 1 μg RNA om cDNA te synthetiseren met een cDNA-synthesekit, volgens de instructies van de fabrikant.
- Nadat de run is voltooid, voegt u 80 μL RNase-vrij water toe. Bewaar de monsters bij -20 °C.
- RT-qPCR van adipocyt-selectieve genen.
- Gebruik een 384-well formaat en voeg 1 μL primer (~ 1 μM eindconcentratie) toe aan de bodem van elke put. Voordrogende primers resulteren in strakkere technische replica's. Laat afgedekt totdat de primers volledig zijn verdampt (de plaat kan op een verwarmingsblok worden geplaatst dat is ingesteld op 37 °C om de verdamping te versnellen).
- Stel monsterreacties met vier tot acht technische replicaties als volgt in: 2,5 μL rt-pcr-mastermix op basis van kleurstof, 2,1 μl rnasevrij water en 0,4 μl cDNA (~1 ng) met een totaal volume van 5 μL per putje. De volgende thermische cyclusomstandigheden werden gebruikt: denaturatie bij 95 °C gedurende 15 s en gloeien/uitschuiven bij 60 °C gedurende 25 s gedurende 40 cycli.
- Normaliseer ruwe CT-waarden (cyclusdrempel) naar huishoudgenen (d.w.z. Hprt en Pde12) niveaus door ΔΔCT te berekenen zoals hier beschreven38. Zie20 voor primersequenties.
OPMERKING: Standaardpraktijk voor RT-qPCR-analyse moet worden gevolgd, zoals het gebruik van een minus Reverse Transcription (-RT) -controle, PCR-reactie en primervalidatie.
Representative Results
Immunofluorescente visualisatie van intramusculair vet
Door de bovenstaande stappen te volgen en figuur 1A te bekijken, werden TA-weefselsecties verzameld uit een 21-daagse post-glycerolbeschadiging die ofwel direct na het oogsten in LN2-gekoeld isopentaan werden ingevroren of gedurende 2,5 uur in 4% PFA werden gefixeerd. Na cryosectie en kleuring van beide monsters, werden beelden gemaakt in het midden van de buik, het grootste gebied van de TA. PERILIPIN+ adipocyten van de niet-gefixeerde TA's (figuur 1B) hebben de morfologie aanzienlijk veranderd in vergelijking met vaste secties (figuur 1C), waardoor hun identificatie, visualisatie en daaropvolgende kwantificering veel moeilijker en mogelijk onnauwkeuriger is. Om op te merken, werden de eerste PERILIPIN + lipidedruppels gedetecteerd rond 5 dagen na het letsel, waarbij de meeste adipocyten zich op dag 7 hadden gevormd. 21 dagen na het letsel waren adipocyten volledig gerijpt.
Aangezien de hoeveelheid vet per TA sterk correleert met de ernst van het geïnduceerde letsel, moeten de TA's aanzienlijk worden verwond om de intramusculaire vetvorming effectief te observeren en te bestuderen. Het oefenen van injecties met inkt in kadaver-TA's is een geweldige manier om de ernst van het letsel te verbeteren. Succesvolle blessures hebben de neiging om boven de 50% van de spier te liggen. Om op te merken, gewonde delen van de spier vertegenwoordigen gebieden zonder spiervezels of gebieden die worden bevolkt door spiervezels die ten minste één centraal gelegen kern bevatten, een bekend kenmerk van een regenererende spiervezel.
Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan vlekken voor FAPs en vet in 3D. Hiervoor werden meerdere myofiberen van de TA-postfixatie zorgvuldig gescheiden, gevolgd door immunofluorescentie met hele mount. De sleutel is om de vezels goed aan de glasschuif te bevestigen en tegelijkertijd overcompressie van het weefsel te voorkomen. Door kneedbare kleivoeten te gebruiken, kan de gebruiker de vereiste dikte aanpassen en de coverslip aan de dia bevestigen, zelfs door het gebruik van een omgekeerde microscoop mogelijk te maken (figuur 4A). Deze methode werd met succes gebruikt om PDGFRα+ FAPs, Phalloidin+ myofibers en PERILIPIN-expresserende adipocyten te labelen (Figuur 4B, Aanvullende Video 1 en Aanvullende Video 2). Na het verkrijgen van beelden op meerdere z-vlakken met een dikte tot 150 μm, werd de 3D-renderingmodule in de microscoopsoftware gebruikt om een 3D-reconstructie te maken.
Figuur 4: Immunofluorescente kleuring van de hele montage. (A) Boven- en zijaanzicht van hoe het monster te monteren en coverslip toe te voegen voor kleuring van de hele montage. (B) Representatieve 3D-reconstructies van FAPs (groen; links) en adipocyten (rood; rechts) samen met myofibers (grijs) en kernen (blauw). Schaalbalken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Kwantificering van intramusculair vet
Nadat beelden van intramusculair vet zijn gemaakt, werd de celtellerfunctie in ImageJ/FIJI gebruikt om handmatig het aantal PERLIPIN+ adipocyten te tellen (figuur 5A). Vervolgens werd het totale gebied van het spiergedeelte en het gewonde gebied, gedefinieerd door centraal gelegen kernen in myofibers, bepaald. Om de ernst van het letsel te controleren, werd het totale aantal adipocyten gedeeld door het gewonde gebied, wat resulteerde in het aantal vetcellen per 1 mm2 van de gewonde spier. Meestal worden TA's met <30% letsel uitgesloten van de kwantificeringen. Om op te merken, hoewel adipocyten zeldzaam zijn zonder letsel, variërend van nul tot acht per doorsnedegebied, is het totale aantal adipocyten nog steeds genormaliseerd door het totale gebied. Zoals aangegeven in figuur 5B, veroorzaakt een glycerolletsel enorme hoeveelheden intramusculair vet in vergelijking met een niet-gewonde TA-spier. Als alternatief, omdat perilipinkleuring zeer schoon is met een hoge signaal-ruisverhouding, is het ook mogelijk om de functie Deeltjes analyseren te gebruiken om het totale gebied te bepalen dat door Perilipin wordt ingenomen. Deze methode zal echter geen onderscheid kunnen maken tussen kleinere versus minder adipocyten. Tot drie secties van minimaal vier individuele dieren werden in beeld gebracht en gekwantificeerd, en het gemiddelde aantal aanwezige vetcellen per muis werd gerapporteerd.
Figuur 5: Kwantificeringen van intramusculair vet. (A) Representatief beeld van het tellen van PERILIPIN+ adipocyten (wit) met behulp van de celtellerfunctie in ImageJ. Schaalbalk: 50 μm. (B) Hele TA-adipocytenkwantificeringen 21 dagen na glycerolinjectie genormaliseerd tot 1 mm2 van het gewonde gebied. Elke stip vertegenwoordigt het gemiddelde van één muis. Foutbalken weergegeven als SEM. **** = p < 0,0001. (C) RNA-laag na homogenisatie en daaropvolgende fasescheiding door chloroform wordt gebruikt voor RT-qPCR-analyse. (D) Vouw veranderingen in expressieniveaus van Pparg en Cepbα, vroege adipogene genen en Plin1 en Adipoq, twee volwassen adipocytmarkers, op verschillende tijdstippen na glycerolletsel. Elke stip vertegenwoordigt het gemiddelde van één muis. Foutbalken weergegeven als SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om onafhankelijk de hoeveelheid aanwezig intramusculair vet te bevestigen, kunnen genexpressieniveaus van verschillende adipogene markers worden bepaald. Hiervoor kan RNA worden geïsoleerd uit een deel van dezelfde TA-spier die wordt gebruikt voor immunofluorescentie (zie stappen hierboven) op verschillende punten na het letsel. Een kraalklopper werd gebruikt in combinatie met guanidiumthiocyanaat om het weefsel te homogeniseren. Na toevoeging van chloroform gevolgd door centrifugatie, werd de bovenste RNA-bevattende laag zorgvuldig geëxtraheerd en werden mini-spinkolommen gebruikt voor RNA-opschoning (figuur 5C). Deze methode produceert routinematig hoge kwaliteit en kwantiteit van RNA dat geschikt is voor alle downstream analyses zoals RT-qPCR en RNAseq. Voor RT-qPCR werden de relatieve expressieniveaus van adipogene tot huishoudgenen bepaald en werden eventuele relatieve veranderingen beoordeeld volgens de ΔΔCT-methode38. Zoals beschreven in figuur 5D, in vergelijking met niet-gewonde TA-spier, induceert glycerolletsel expressie van vroege adipogene markers zoals Pparg en Cebpα zodra 3 dagen na het letsel. Rijpe markers, zoals Adiponectine (Adipoq) en Perilipin (Plin1), kunnen al 5 dagen na glycerolletsel worden gedetecteerd.
Genetische afstammingstracering van adipocyten
Het hier gepresenteerde adipocytenkleuringsprotocol kan eenvoudig worden aangepast om genetische afstammingstracering van FAPs op te nemen om hun lot in adipocyten in kaart te brengen en te volgen. We hebben bijvoorbeeld eerder aangetoond dat recombinatie kan worden geïnduceerd via toediening van tamoxifen in PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFP-muizen 2 weken voorafgaand aan het letsel, effectief verwijderen van de floxed stopcodering en onuitwisbaar activeren van EYFP-expressie in FAPs (figuur 6A). We bereikten een hoge recombinatie-efficiëntie met het hier gepresenteerde tamoxifenregime, waarbij ~ 75% van de PDGFRα + FAPs EYFP20 uitdrukte, vergelijkbaar met wat andere laboratoria 27,39,40 hebben gemeld. Om aan te tonen dat FAPs inderdaad de cellulaire oorsprong van intramusculair vet zijn, zijn de meeste FAPs 7 dagen na glycerolletsel veranderd in EYFP + PERILIPIN-expresserende adipocyten (figuur 6B).
Figuur 6: Lineage tracing van FAPs. (A) Schematisch overzicht van de experimentele opstelling. (B) Representatieve immunofluorescente beelden die succesvolle recombinatie en activering van EYFP (geel) laten zien binnen PDGFRα+ FAPs (rood, pijlpunten) en PERILIPIN+ adipocyten (rood, asterisken). Schaalbalken: 25 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Detectie van meerdere celtypen
Dit protocol kan ook worden gebruikt om het myogene compartiment te visualiseren. Met behulp van antilichamen tegen PAX7 en MYOD1 kunnen respectievelijk spierstamcellen (MuSC's) en myoblasten gemakkelijk worden gedetecteerd 5 dagen na glycerolletsel, zelfs in PFA-gefixeerde spierweefselsectie (figuur 7). Het gepresenteerde protocol is dus veelzijdig en aanpasbaar aan niet alleen label- en beeldadipocyten en FAPs, maar ook andere celtypen van de myogene afstamming.
Figuur 7: Spierstamcel en myoblast immunofluorescente kleuring. (A) Schematisch overzicht van de experimentele opstelling. (B) Representatieve immunofluorescente beelden die succesvolle kleuring van spierstamcellen (MuSC) (geel, links) met PAX7 en myoblasten (geel, rechts) met MYOD1 laten zien. LAMININ schetst de myofiberen (wit) en kernen zijn in cyaan. Schaalbalken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende video 1: 3D-rendering van FAPs. Driedimensionale reconstructie van myofiberen, FAPs en kernen gekleurd voor respectievelijk PHALLOIDIN (grijs), PDGFRα (groen) en DAPI (blauw), 21 dagen na het letsel. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullende video 2: 3D-weergave van intramusculair vet. Volumetrische weergave van myofiberbundels (grijs, PHALLOIDIN) en intramusculair vet (rood, PERILIPIN), die een myofiber 21 dagen na glycerolletsel heeft vervangen. Klik hier om deze video te downloaden.
Discussion
Dit protocol schetst een uitgebreid en gedetailleerd protocol dat efficiënte visualisatie en rigoureuze kwantificering van intramusculair vet mogelijk maakt. Door dezelfde spier in twee delen te splitsen, waarvan de ene wordt gebruikt voor immunofluorescentie en de andere voor RT-qPCR-analyse, is dit protocol ook zeer veelzijdig. Het kan ook worden gecombineerd met genetische afstammingstracering van FAPs om hun omzetting in adipocyten onder bepaalde omstandigheden te bestuderen en is zeer aanpasbaar om meerdere extra celtypen te labelen en af te beelden.
De meest gebruikte manieren om intramusculair vet te visualiseren zijn paraffinesecties gevolgd door hematoxyline- en eosinekleuring of bevroren secties gekleurd voor lipofiele kleurstoffen zoals Oil Red O (ORO). Hoewel paraffine-verwerkte weefsels de beste histologie behouden, extraheert hetzelfde proces ook alle lipiden die het gebruik van lipofiele kleurstoffen voorkomen. Hoewel lipofiele kleuringsmethoden zullen werken op zowel PFA-vaste als niet-gefixeerde weefselsecties, worden lipidedruppels gemakkelijk verplaatst door druk uit te oefenen op de coverslip, waardoor de ruimtelijke verdeling van intramusculair vet wordt verstoord. Om dit te omzeilen, heeft een recente studie een rigoureus protocol opgesteld om ORO + adipocyten te visualiseren met behulp van een whole-mount benadering. Hiervoor hebben de auteurs de TA gedecellulariseerd om de ruimtelijke verdeling van intramusculair vet over de hele TA41 te visualiseren. Hoe krachtig deze techniek ook is, het voorkomt ook het gebruik van andere co-vlekken om extra cellulaire structuren te markeren. De hier gepresenteerde immunofluorescentiebenadering voor de hele mount kan worden gebruikt om adipocyten te co-kleuren met een verscheidenheid aan markers, waardoor de cellulaire omgeving fijn in kaart kan worden gebracht. Een grote uitdaging is echter de weefselpenetratie van de antilichamen. Hoe meer vezels bij elkaar worden gehouden, hoe moeilijker het voor de antilichamen zal zijn om alle beschikbare antigenen gelijkelijk te penetreren en te binden. Deze methode is dus het meest effectief bij het kijken naar kleine groepen vezels. Tegelijkertijd is dit ook een beperking omdat de algehele anatomische locatie van intramusculair vet verloren gaat wanneer het zich concentreert op slechts kleine, afgepelde vezelbundels. Met de huidige ontwikkeling van nieuwe weefselzuiveringsmethoden plus nieuwe beeldvormingstechnologie zal in de toekomst echter een grotere weefselpenetratie en visualisatie mogelijk zijn 42,43,44.
Hoewel voorafgaande fixatie van spierweefsel de morfologie van adipocyten behoudt, creëert het ook een uitdaging om de grootte van myofibers te beoordelen, een belangrijke meting van de spiergezondheid. De grootte van de Myofiber wordt bepaald door het meten van de dwarsdoorsnede van myofibers. We hebben eerder gemeld dat voorafgaande fixatie van spierweefsel ervoor zal zorgen dat de meeste markers die beschikbaar zijn om myofibers te schetsen, falen 31. Om deze hindernis te overwinnen, hebben we een nieuwe beeldsegmentatiepijplijn ontwikkeld, waarmee de myofibergrootte zelfs in vaste spiersecties31 kan worden gemeten. Zo hebben we een robuuste en efficiënte weefselverwerkingspijplijn opgezet die, in combinatie met dit protocol, de meeste nadelen overwint die worden veroorzaakt door voorafgaande fixatie van spierweefsel.
Een ander groot voordeel van deze aanpak is veelzijdigheid. Door de TA in twee delen op te splitsen, wordt de hoeveelheid informatie die uit één spier kan worden verkregen, gemaximaliseerd. Dit vermindert niet alleen het aantal dieren, maar voegt ook een extra controlelaag toe door histologie te bevestigen door genexpressie en vice versa. Daarnaast kunnen veel verschillende genen worden onderzocht naast adipogene genen. Het geïsoleerde RNA kan ook worden gebruikt voor een RNAseq-experiment met hele spieren. Ten slotte kan het snap-frozen spierstuk ook worden gebruikt voor eiwitwerk. Een beperking van dit protocol is de mogelijkheid dat het letsel niet consistent is over de volledige lengte van de TA. Dit zou kunnen leiden tot een scenario waarin de twee spierdelen divergeren in de hoeveelheid intramusculair vet die ze bevatten en kan rechtvaardigen dat een dergelijk monster wordt uitgesloten van elke downstream-analyse. Het wordt daarom aanbevolen om niet alleen op RT-qPCR te vertrouwen om belangrijke conclusies te trekken over de hoeveelheid intramusculair vet, maar eerder als ondersteunende gegevens voor de histologische kwantificeringen.
Samen schetst dit protocol een robuuste, efficiënte en rigoureuze weefselverwerkingspijplijn die visualisatie en kwantificering van intramusculair vet mogelijk maakt, de eerste stap in het ontwikkelen van nieuwe behandelingsopties om vetfibrose te bestrijden. Tegelijkertijd is het veelzijdig en kan het worden aangepast aan veel verschillende celtypen in de spier en adipocyten in andere weefsels.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
We bedanken de leden van het Kopinke laboratorium voor hun hulp bij het verzamelen van gegevens en het kritisch lezen van het manuscript. We bedanken ook de leden van het Myology Institute aan de Universiteit van Florida voor hun waardevolle input over het manuscript. Het werk werd ondersteund door de NIH-subsidie 1R01AR079449. Figuur 2 is gemaakt met Biorender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% PFA (Pack of 12, 10 mL bottles) | Electron Miscroscopy Sciences | 15710 | |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-138 | microcentrifuge tubes for snapfreezing/bead beating |
| 2-Methylbutane (4 L) | Fisher Chemical | O3551-4 | isopentane |
| Absolute Ethanol (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818100 | |
| AffiniPure Fab fragment donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | mouse-on-mouse blocking |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A21206 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-goat secondary antibody | Invitrogen | A11057 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin antibody | Invitrogen | A12380 | Dissolved in 1.5 mL methanol (~66 µM working solution) |
| BioLite 24-well Multidishes | ThermoFisher Scientific | 930186 | 24 well plate for PFA tissue incubation |
| Biometra TOne | analytikjena | 8462070301 | Thermal cycler |
| Chicken anti-GFP antibody | Aves Labs | GFP-1020 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol 24:1(v/v) for molecular biology, DNAse, RNAse, and Protease free | ThermoFisher Scientific | AC327155000 | |
| Corn oil | Sigma Aldrich | C8267 | |
| DAPI stain | Invitrogen | D1306 | 150 µM working solution in dH2O |
| Donkey Serum (100 mL) | Millipore Sigma | 5058837 | for blocking solution |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | sharp-tipped tweezers |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | mounting medium |
| Glycerol, 99.5%, for molecular biology (500 mL) | Acros Organics | 327255000 | |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D | AF1062 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | for Tamoxifen incubation |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | hydrophobic pen |
| Insulin Syringe with Micro-Fine IV needle (28 G) | BD | 329461 | |
| Insulin Syringe with Slip Tip, 1 mL | BD | 329654 | Insulin syringe without needle, for oral gavaging |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 78938441 | |
| Leica DMi8 inverted microscope | Leica | micrscope used for widefield IF and confocal imaging | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | positively charged microscope slides |
| mouse anti-MYOD antibody | Invitrogen | MA1-41017 | |
| mouse anti-PAX7 antibody (supernatant) | DSHB | AB 428528 | |
| MX35 Premier+ Microtome blades | ThermoFisher Scientific | 3052835 | microtome blades |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND2000 | spectrophotometer for RNA yield |
| Play-Doh | Hasbro | modeling compound | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher Scientific | A25742 | green dye PCR master mix |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | 17033-211-38 | vet ophthalmic ointment |
| QuantStudi 6 Flex Real-Time 384-well PCR System | Applied Biosystems | 4485694 | qPCR machine |
| Rabbit anti-perilipin antibody | Cell Signaling Technology | 9349S | |
| Red-Rotor Shaker | Hoefer Scientific | PR70-115V | shaker for IF staining |
| Richard-Allan Scientific Slip-Rite Cover Glass | ThermoFisher Scientific | 152460 | coverslips |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | contains mini spin columns |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml, natural | Eppendorf | 22363204 | |
| Sample Tubes RB (2 mL) | QIAGEN | 990381 | |
| Sodium azide | Alfa Aesar | 14314 | |
| Stainless Steel Beads, 2.8 mm | Precellys | KT03961-1-101.BK | small beads |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | QIAGEN | 69989 | medium beads |
| Stainless Steel Beads, 7 mm | QIAGEN | 69990 | large beads |
| Stainless Steel Disposable Scalpels | Miltex | 327-4102 | scalpel |
| Stainless steel feeding tube, 20 G x 38 mm, straight | Instech Laboratories | FTSS-20S-3 | gavage needle |
| Tamoxifen | Toronto Research Chemicals | T006000 | |
| Tissue Plus O.C.T. Compound | Fisher HealthCare | 4585 | embedding medium |
| TissueLyser LT | QIAGEN | 85600 | bead beater |
| TissueLyser LT Adapter, 12-Tube | QIAGEN | 69980 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura | 4566 | specimen molds |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | guanidium thiocyanate |
| Tween20 (500 mL) | Fisher BioReagents | BP337-500 | |
| VWR Micro Slides - Superfrost Plus | VWR | 48311703 | |
| Wheaton Coplin staining jars | Millipore Sigma | S6016 | Coplin jar |
References
- Milad, N., et al. Increased plasma lipid levels exacerbate muscle pathology in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Skeletal Muscle. 7 (1), 19 (2017).
- Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
- Goodpaster, B. H., et al. Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men and women. Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).
- Goodpaster, B. H., et al. The loss of skeletal muscle strength, mass, and quality in older adults: the health, aging and body composition study. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (10), 1059-1064 (2006).
- Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
- Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
- Burakiewicz, J., et al. Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy. Journal of Neurology. 264 (10), 2053-2067 (2017).
- Murphy, W. A., Totty, W. G., Carroll, J. E. MRI of normal and pathologic skeletal muscle. American Journal of Roentgenology. 146 (3), 565-574 (1986).
- Willcocks, R. J., et al. Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large duchenne muscular dystrophy cohort. Annals of Neurology. 79 (4), 535-547 (2016).
- Wokke, B. H., et al. Quantitative MRI and strength measurements in the assessment of muscle quality in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (5), 409-416 (2014).
- Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions. Skeletal Muscle. 11 (1), 16 (2021).
- El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
- Joe, A. W., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
- Scott, R. W., Arostegui, M., Schweitzer, R., Rossi, F. M. V., Underhill, T. M. Hic1 defines quiescent mesenchymal progenitor subpopulations with distinct functions and fates in skeletal muscle regeneration. Cell Stem Cell. 25 (6), 797-813 (2019).
- Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124, Pt 21 3654-3664 (2011).
- Hogarth, M. W., et al. Fibroadipogenic progenitors are responsible for muscle loss in limb girdle muscular dystrophy 2B. Nature Communications. 10 (1), 2430 (2019).
- Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Stumm, J., et al. Odd skipped-related 1 (Osr1) identifies muscle-interstitial fibro-adipogenic progenitors (FAPs) activated by acute injury. Stem Cell Research. 32, 8-16 (2018).
- Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary Hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
- Huang, Y., Das, A. K., Yang, Q. Y., Zhu, M. J., Du, M. Zfp423 promotes adipogenic differentiation of bovine stromal vascular cells. PLoS One. 7 (10), 47496 (2012).
- Sun, Y. -M., et al. PDGFRα regulated by miR-34a and FoxO1 promotes adipogenesis in porcine intramuscular preadipocytes through Erk signaling pathway. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2424 (2017).
- Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) in skeletal muscle in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e61750 (2021).
- Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).
- Santini, M. P., et al. Tissue-resident PDGFRalpha(+) progenitor cells contribute to fibrosis versus healing in a context- and spatiotemporally dependent manner. Cell Reports. 30 (2), 555-570 (2020).
- Uezumi, A., et al. Identification and characterization of PDGFRalpha+ mesenchymal progenitors in human skeletal muscle. Cell Death & Disease. 5, 1186 (2014).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Soliman, H., et al. Pathogenic potential of Hic1-expressing cardiac stromal progenitors. Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).
- Chung, M. I., Bujnis, M., Barkauskas, C. E., Kobayashi, Y., Hogan, B. L. M. Niche-mediated BMP/SMAD signaling regulates lung alveolar stem cell proliferation and differentiation. Development. 145 (9), Cambridge, England. (2018).
- Hilgendorf, K. I., et al. Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis. Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).
- Waisman, A., Norris, A. M., Elías Costa, M., Kopinke, D. Automatic and unbiased segmentation and quantification of myofibers in skeletal muscle. Scientific Reports. 11 (1), 11793 (2021).
- Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
- Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), 71084 (2013).
- Mahdy, M. A., Lei, H. Y., Wakamatsu, J., Hosaka, Y. Z., Nishimura, T. Comparative study of muscle regeneration following cardiotoxin and glycerol injury. Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger: Official Organ of the Anatomische Gesellscaft. 202, 18-27 (2015).
- Pisani, D. F., Bottema, C. D., Butori, C., Dani, C., Dechesne, C. A. Mouse model of skeletal muscle adiposity: a glycerol treatment approach. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (3), 767-773 (2010).
- Kawai, H., et al. Experimental glycerol myopathy: a histological study. Acta Neuropathologica. 80 (2), 192-197 (1990).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Uezumi, A., et al. Mesenchymal Bmp3b expression maintains skeletal muscle integrity and decreases in age-related sarcopenia. The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139617 (2021).
- Biferali, B., et al. Prdm16-mediated H3K9 methylation controls fibro-adipogenic progenitors identity during skeletal muscle repair. Science Advances. 7 (23), 9371 (2021).
- Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), (2017).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), Cambridge, England. (2021).
- Gómez-Gaviro, M. V., Sanderson, D., Ripoll, J., Desco, M. Biomedical applications of tissue clearing and three-dimensional imaging in health and disease. iScience. 23 (8), 101432 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
