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Developmental Biology

कंकाल की मांसपेशियों में इंट्रामस्क्युलर वसा गठन और इसके सेलुलर मूल की जांच करने के लिए एक गाइड

Published: May 26, 2022 doi: 10.3791/63996
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Myology Institute, University of Florida College of Medicine

Summary

इंट्रामस्क्युलर वसा के साथ स्वस्थ मांसपेशियों के ऊतकों का प्रतिस्थापन मानव रोगों और स्थितियों की एक प्रमुख विशेषता है। यह प्रोटोकॉल इंट्रामस्क्युलर वसा की कल्पना, छवि और मात्रा निर्धारित करने के तरीके को रेखांकित करता है, जिससे इंट्रामस्क्युलर वसा गठन अंतर्निहित तंत्र के कठोर अध्ययन की अनुमति मिलती है।

Abstract

फाइब्रो-एडिपोजेनिक पूर्वज (एफएपी) मेसेनकाइमल स्ट्रोमल कोशिकाएं हैं जो कंकाल की मांसपेशी होमियोस्टेसिस और पुनर्जनन के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। एफएपी बाह्य मैट्रिक्स का निर्माण और रखरखाव करते हैं जो आणविक मायोफाइबर मचान के रूप में कार्य करता है। इसके अलावा, एफएपी मायोफाइबर पुनर्जनन के लिए अपरिहार्य हैं क्योंकि वे मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं (एमयूएससी) द्वारा महसूस किए गए लाभकारी कारकों की एक भीड़ का स्राव करते हैं। रोगग्रस्त राज्यों में, हालांकि, एफएपी इंट्रामस्क्युलर वसा और फाइब्रोटिक निशान ऊतक की सेलुलर उत्पत्ति है। यह फैटी फाइब्रोसिस सरकोपेनिया और न्यूरोमस्कुलर बीमारियों की पहचान है, जैसे कि डचेन मस्कुलर डिस्ट्रॉफी। यह निर्धारित करने में एक महत्वपूर्ण बाधा कि क्यों और कैसे एफएपी इंट्रामस्क्युलर वसा में अंतर करते हैं, प्रभावी संरक्षण और बाद में एडिपोसाइट्स का दृश्य है, खासकर जमे हुए ऊतक वर्गों में। कंकाल की मांसपेशी ऊतक प्रसंस्करण के पारंपरिक तरीके, जैसे कि स्नैप-फ्रीजिंग, व्यक्तिगत एडिपोसाइट्स की आकृति विज्ञान को ठीक से संरक्षित नहीं करते हैं, जिससे सटीक दृश्य और मात्रा का ठहराव रोका जा सकता है। इस बाधा को दूर करने के लिए, एक कठोर प्रोटोकॉल विकसित किया गया था जो कंकाल की मांसपेशी वर्गों में एडिपोसाइट आकृति विज्ञान को संरक्षित करता है जो इंट्रामस्क्युलर वसा के दृश्य, इमेजिंग और मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल यह भी रेखांकित करता है कि आरटी-क्यूपीसीआर के लिए मांसपेशियों के ऊतकों के एक हिस्से को कैसे संसाधित किया जाए, जिससे उपयोगकर्ताओं को एडिपोजेनिक जीन की अभिव्यक्ति में अंतर देखकर वसा गठन में देखे गए परिवर्तनों की पुष्टि करने में सक्षम बनाया जा सके। इसके अतिरिक्त, इसे मांसपेशियों के नमूनों के पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा एडिपोसाइट्स की कल्पना करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। अंत में, यह प्रोटोकॉल एफएपी के एडिपोजेनिक रूपांतरण का अध्ययन करने के लिए पीडीजीएफआर-व्यक्त एफएपी के आनुवंशिक वंश अनुरेखण को कैसे निष्पादित करता है, इसकी रूपरेखा तैयार करता है। यह प्रोटोकॉल लगातार आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा पुष्टि के साथ एडिपोसाइट्स की उच्च-रिज़ॉल्यूशन और रूपात्मक रूप से सटीक इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियों का उत्पादन करता है, जिससे इंट्रामस्क्युलर वसा के मजबूत, कठोर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दृश्य और मात्रा का ठहराव होता है। साथ में, यहां वर्णित विश्लेषण पाइपलाइन हमारी समझ में सुधार करने के लिए पहला कदम है कि एफएपी इंट्रामस्क्युलर वसा में अंतर कैसे करते हैं, और वसा गठन को रोकने के लिए उपन्यास हस्तक्षेप को मान्य करने के लिए एक रूपरेखा प्रदान करता है।

Introduction

फैटी फाइब्रोसिस के साथ स्वस्थ मांसपेशियों के ऊतकों की घुसपैठ डचेन मस्कुलर डिस्ट्रॉफी (डीएमडी) और अन्य न्यूरोमस्कुलर बीमारियों के साथ-साथ सार्कोपेनिया, मोटापा और मधुमेह 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 की एक प्रमुख विशेषता है . यद्यपि इन स्थितियों में वसा घुसपैठ में वृद्धि मांसपेशियों के कार्य में कमी के साथ दृढ़ता से जुड़ी हुई है, लेकिन इंट्रामस्क्युलर वसा रूपों के बारे में हमारा ज्ञान अभी भी सीमित है। एफएपी कंकाल की मांसपेशी11,12 सहित अधिकांश वयस्क अंगों में मौजूद एक मल्टीपोटेंट मेसेनकाइमल स्ट्रोमल सेल आबादी है। उम्र के साथ और पुरानी बीमारियों में, हालांकि, एफएपी फाइब्रोटिक निशान ऊतक का उत्पादन करते हैं और एडिपोसाइट्स में अंतर करते हैं, जो व्यक्तिगत मायोफाइबर के बीच स्थित होते हैं और इंट्रामस्क्युलर वसा 13,14,15,16,17,18,19,20 बनाते हैं।

इंट्रामस्क्युलर वसा गठन का मुकाबला शुरू करने के लिए, एफएपी एडिपोसाइट्स में कैसे बदल जाते हैं, इसके तंत्र को परिभाषित करने की आवश्यकता है। पीडीजीएफआरα कई प्रजातियों 13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27 की मांसपेशियों के भीतर एफएपी की पहचान करने के लिए क्षेत्र में "स्वर्ण-मानक" मार्कर है। नतीजतन, पीडीजीएफआरयू प्रमोटर के नियंत्रण में कई म्यूरिन टैमोक्सीफेन-इंड्यूसिबल क्रे लाइनें उत्पन्न की गई हैं, जो क्रे-लॉक्सपी सिस्टम27,28,29 का उपयोग करके विवो में एफएपी में आनुवंशिक रूप से हेरफेर करने की अनुमति देती हैं। उदाहरण के लिए, एक आनुवंशिक रिपोर्टर के साथ इस प्रेरक क्रे लाइन के संयोजन से, एफएपी के वंश अनुरेखण का प्रदर्शन किया जा सकता है, एक रणनीति जिसे हमने मांसपेशियों और सफेद वसा ऊतक20,30 में भाग्य मानचित्र एफएपी पर सफलतापूर्वक लागू किया है। वंश अनुरेखण के अलावा, ये क्रे लाइनें एफएपी-टू-वसा रूपांतरण का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान उपकरण प्रदान करती हैं।

इंट्रामस्क्युलर वसा में एफएपी के एडिपोजेनिक रूपांतरण के तंत्र को परिभाषित करने में एक बड़ी बाधा विभिन्न परिस्थितियों में गठित इंट्रामस्क्युलर वसा की मात्रा को कड़ाई से और पुनरुत्पादन करने की क्षमता है। कुंजी मांसपेशियों और वसा ऊतक के संरक्षण को संतुलित करना है और एडिपोसाइट्स की कल्पना करने के लिए उपलब्ध धुंधला तरीकों के साथ इसका मिलान करना है। उदाहरण के लिए, कंकाल की मांसपेशी अक्सर पूर्व निर्धारण के बिना स्नैप-जमे हुए होती है, मायोफाइबर को संरक्षित करती है लेकिन एडिपोसाइट आकृति विज्ञान (चित्रा 1) को बाधित करती है। इसके विपरीत, पैराफिन एम्बेडिंग के बाद निर्धारण, एडिपोसाइट्स सहित सर्वोत्तम ऊतक ऊतक ऊतक विज्ञान प्रदर्शित करते हुए, सभी लिपिड को हटा देता है, जिससे अधिकांश लिपोफिलिक रंग, जैसे कि आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले डाई ऑयल रेड ओ, अनुपयोगी होते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: स्नैप-जमे हुए बनाम निश्चित मांसपेशियों के ऊतकों में इंट्रामस्क्युलर वसा की प्रतिनिधि छवियां ( ए) प्रयोगात्मक सेटअप का योजनाबद्ध अवलोकन। ग्लिसरॉल की चोट के बाद 21 दिनों में (बी) स्नैप-फ्रोजन और (सी) फिक्स्ड टीए दोनों के भीतर एडिपोसाइट्स (पीला), मायोफाइबर (ग्रे), और नाभिक (सियान) दिखाने वाली इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियां। स्केल सलाखों: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यहां वर्णित प्रोटोकॉल मायोफाइबर और एडिपोसाइट आकृति विज्ञान को संरक्षित करता है और कई सेल प्रकारों के दृश्य, और विश्लेषण की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) -निश्चित मांसपेशी ऊतक में एडिपोसाइट्स के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने पर आधारित है, जो कई एंटीबॉडी के साथ सह-धुंधला होने की अनुमति देता है। इसे पूरे माउंट इमेजिंग का उपयोग करके बरकरार ऊतक में इंट्रामस्क्युलर वसा को स्थानिक रूप से प्रदर्शित करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है, जिससे मांसपेशियों के भीतर वसा के सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट के बारे में जानकारी मिलती है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को निश्चित मांसपेशियों के ऊतकों31 में मायोफाइबर के क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए हमारे हाल ही में प्रकाशित दृष्टिकोण के साथ जोड़ा जा सकता है, मांसपेशियों के स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण माप। एडिपोसाइट्स में एफएपी के भेदभाव को भाग्य-मानचित्रित करने के लिए आनुवंशिक वंश अनुरेखण के साथ इस दृष्टिकोण को जोड़ना भी यहां उल्लिखित है। इस प्रकार, यहां वर्णित बहुमुखी प्रोटोकॉल एफएपी के कठोर और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मूल्यांकन और ऊतक वर्गों और बरकरार ऊतकों में इंट्रामस्क्युलर वसा में उनके भेदभाव को सक्षम बनाता है।

Figure 2
चित्रा 2: योजनाबद्ध प्रोटोकॉल अवलोकन। ऊतक प्रसंस्करण का योजनाबद्ध अवलोकन जिसमें आरटी-क्यूपीसीआर के माध्यम से बाद के आरएनए अलगाव और प्रतिलेखन विश्लेषण के लिए टीए का एक तिहाई हटा दिया जाता है, स्नैप-जमे हुए और समरूप किया जाता है। टीए का अन्य दो-तिहाई पीएफए-फिक्स्ड है और जमे हुए वर्गों या पूरे माउंट फाइबर पर इम्यूनोस्टेनिंग के लिए संसाधित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल फ्लोरिडा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किए गए थे।

1. एफएपी के आनुवंशिक वंश अनुरेखण

नोट: यदि एफएपी के आनुवंशिक वंश अनुरेखण वांछित नहीं है, तो चरण 1 को छोड़ दिया जा सकता है।

  1. एफएपी के वंश अनुरेखण करने के लिए, आवश्यक माउस एलील प्राप्त करें।
    नोट: पीडीजीएफआरयू प्रमोटर के नियंत्रण में कई टैमोक्सीफेन-इंड्यूसिबल क्रे लाइनें, एफएपी को सफलतापूर्वक लक्षित करने के लिए उत्पन्न की गई हैं, जिसमें होगन29, रैंडो27 और बर्गल्स32 प्रयोगशालाएं शामिल हैं। क्रे गतिविधि के आनुवंशिक रिपोर्टर के रूप में, कई रोजा 26 रिपोर्टर एलील उपलब्ध हैं जैसे कि रोजा 26ईवाईएफपी33। हालांकि प्रत्येक प्रयोगशाला के लिए यह निर्धारित करने का सुझाव दिया जाता है कि कौन सा क्रे-रिपोर्टर संयोजन सबसे प्रभावी है, पीडीजीएफआरईटी2 चूहों (29 और जैक्स # 032770) को रोजा 26ईवाईएफपी (33 और जैक्स # 006148) रिपोर्टर को पार करके, जिसके परिणामस्वरूप पीडीजीएफआरईटी2; रोजा 26ईवाईएफपीचूहों का उपयोग कुशलतापूर्वक और विशेष रूप से एफएपी20 को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। परिपक्व एफएपी के भाग्य का पता लगाने के लिए, टैमोक्सीफेन को प्रशासित करने से पहले चूहों की उम्र कम से कम ~ 10 सप्ताह तक पहुंचने तक इंतजार करने की सिफारिश की जाती है। वंश अनुरेखण प्रयोग पुरुषों और महिलाओं दोनों पर किए जा सकते हैं।
  2. मौखिक गैवेजिंग के माध्यम से टैमोक्सीफेन प्रशासन
    1. मकई के तेल और भंवर में 40 मिलीग्राम / एमएल टैमोक्सीफेन अच्छी तरह से तैयार करें ताकि गैविंग से 1 दिन पहले मिश्रण किया जा सके। एक घूर्णन संकरण ओवन में 37 डिग्री सेल्सियस पर ओ /
      सावधानी: टैमोक्सीफेन एक कार्सिनोजेन है और इसे सावधानी से संभाला जाना चाहिए। हैंडलिंग करते समय हमेशा दस्ताने पहनें और पाउडर के रूप में तौलते समय मास्क पहनें, क्योंकि साँस लेने का खतरा होता है।
    2. प्रोटोकॉल के अनुसार क्षेत्र को साफ करें और 1 एमएल सिरिंज में एक गैविंग सुई संलग्न करें। सिरिंज में टैमोक्सीफेन के 200 μL ड्रा।
    3. क्रीट 2 ; रोजा 26ईवाईएफपी चूहों (10 सप्ताह पुराना; दोनों लिंगों का उपयोग किया जाता है) उन्हें एक सपाट सतह पर रखकर और पूंछ के आधार को दृढ़ता से पकड़कर। अंगूठे और तर्जनी के साथ माउस के बीच को समझने के लिए एक मुक्त हाथ का उपयोग करें, फिर धीरे-धीरे और मामूली दबाव के साथ कंधों के ठीक पिछले तक पकड़ को स्लाइड करें।
    4. अंगूठे और तर्जनी उंगली के साथ त्वचा को वापस चुटकी लें, माउस उठाएं और हाथ फ्लिप करें ताकि माउस उपयोगकर्ता का सामना कर रहा हो, और माउस को पकड़ने वाले हाथ की पिंकी और अनामिका उंगली के बीच पूंछ को टक करें।
    5. इस बिंदु पर, सुनिश्चित करें कि माउस अच्छी तरह से स्थिर है और अपने सिर या बाहों को स्थानांतरित करने में असमर्थ है। मुंह में गैविंग सुई डालें और माउस के सिर को थोड़ा झुकाव करने के लिए इसका उपयोग करें; यह अन्नप्रणाली को बेहतर सुलभ होने की अनुमति देता है।
    6. ध्यान से और धीरे-धीरे सुई को अन्नप्रणाली में डालें। यदि कोई प्रतिरोध पूरा हो जाता है तो सुई को मजबूर न करें; सुई आसानी से नीचे स्लाइड करना चाहिए। धीरे-धीरे टैमोक्सीफेन इंजेक्ट करें। 15-20 मिनट के लिए चूहों की निगरानी सुनिश्चित करने के लिए कोई समस्या नहीं होती है जबकि गैविंग।
      नोट: लगातार 2 दिनों में टैमोक्सीफेन का प्रशासन आमतौर पर किसी भी प्रतिकूल प्रभाव के बिना एफएपी की ~ 75% -85% पुनर्संयोजन दक्षता का परिणाम देता है। यह अनुशंसा की जाती है कि उपयोगकर्ता चोट को प्रेरित करने से पहले 1-2 सप्ताह तक इंतजार करता है, जो शेष टैमोक्सीफेन को सिस्टम से हटाने और किसी भी शेष प्रोटीन को चालू करने की अनुमति देगा।

2. टिबियलिस पूर्वकाल (टीए) मांसपेशियों की चोट

नोट: इंट्रामस्क्युलर वसा का अध्ययन करने के लिए, ग्लिसरॉल-आधारित चोट मॉडल (बाँझ खारा में 50% ग्लिसरॉल) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जिसके परिणामस्वरूप बड़े पैमाने पर इंट्रामस्क्युलर वसा गठन 34,35,36,37 होता है।

  1. आइसोफ्लूरेन जोड़कर संवेदनाहारी मशीन तैयार करें और माउस कक्ष और नाक शंकु दोनों के लिए ट्यूबों को सुनिश्चित करें। 70% इथेनॉल या पेरोक्साइड समाधान (प्रोटोकॉल के आधार पर) के साथ कक्ष और कार्य क्षेत्र को साफ करें।
  2. मिनट और आइसोफ्लूरेन एकाग्रता 2.5% करने के लिए ऑक्सीजन प्रवाह दर सेट करें। संज्ञाहरण कक्ष में एक माउस प्लेस और यह संज्ञाहरण किया जा करने के लिए ~ 5 मिनट प्रतीक्षा करें।
  3. माउस को एक साफ हीटिंग पैड पर लापरवाह रखें और नाक शंकु में नाक डालें। संज्ञाहरण के तहत सूखापन को रोकने के लिए धीरे-धीरे कपास-इत्तला दे दी आवेदक के साथ आंखों पर पशु चिकित्सक नेत्र मरहम लागू करें। लगातार संज्ञाहरण की निगरानी और माउस पूरी तरह से संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए चोट से पहले माउस पर एक पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन करते हैं।
  4. कीटाणुरहित करने के लिए एक ताजा अल्कोहल वाइप के साथ इंजेक्शन लगाने के लिए पैर को साफ करें।
  5. इंसुलिन सिरिंज में 50% ग्लिसरॉल (चूहों के आकार के आधार पर) के 30-50 μL खींचें। टीए के स्थान को उजागर करने के लिए पिंडली पर बालों को धीरे से ब्रश करें।
    नोट: बालों को स्थानांतरित करना और बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन प्राप्त करना आसान है जब यह अभी भी अल्कोहल वाइप से गीला है।
  6. टीए का पता लगाने के बाद (टिबिया के लिए सिर्फ पार्श्व, यह त्वचा के माध्यम से थोड़ा फैला हुआ है और कोमल तालमेल के साथ महसूस किया जा सकता है), टखने के पास, टीए में सुई डालें। पूरी तरह से सुई को मांसपेशियों में डालें और धीरे-धीरे सुई को वापस लेते हुए धीरे-धीरे ग्लिसरॉल इंजेक्ट करें, जो अधिकांश मांसपेशियों को घायल करने में मदद करता है।
    नोट: पैर के समानांतर सुई डालना सबसे अच्छा है, बस थोड़ा ऊंचा कोण के साथ। एक अच्छी चोट आमतौर पर सुई वापस लेने के बाद टीए अनुबंध के रूप में डोरसिफ्लेक्सियन का कारण बनती है। यदि माउस की उंगलियां फैल जाती हैं, तो यह संभावना है कि एक्सटेंसर डिजिटोरम लॉन्गस (ईडीएल) मांसपेशी को इंजेक्ट किया गया था।
  7. माउस पिंजरे में वापस प्लेस और संज्ञाहरण वसूली सुनिश्चित करने के लिए के बारे में 15-20 मिनट के लिए निगरानी।
  8. एक शार्प कंटेनर में सुई को त्यागें। कभी भी सुई को रिकैप न करें।
    नोट: एनाल्जेसिया पोस्ट ग्लिसरॉल इंजेक्शन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित के रूप में प्रदान किया जाना चाहिए। एडिपोसाइट्स को चोट लगने के 5 दिनों के बाद (डीपीआई) के रूप में देखा जा सकता है। 7 डीपीआई तक, सभी एडिपोसाइट्स बन गए हैं, और 21 डीपीआई तक, वे पूरी तरह से परिपक्व हो गए हैं।

3. ऊतक फसल

  1. 1x पीबीएस में 4% पीएफए तैयार करें और कटाई शुरू करने से पहले बर्फ पर रखें।
  2. बर्फ पर मांसपेशियों के निर्धारण के लिए उपयोग की जाने वाली किसी भी प्लेट (12- या 24-अच्छी तरह से) को रखें और प्रत्येक कुएं में 4% पीएफए जोड़ें, यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक कुएं में ऊतक की तुलना में पीएफए की 10-20 गुना अधिक मात्रा है।
  3. ग्लिसरॉल की चोट के बाद 7 से 21 दिनों के बीच, संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुसार माउस को इच्छामृत्यु दें (यानी, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद आइसोफ्लूरेन ओवरडोज)।
  4. ऊतक विज्ञान या आरएनए अलगाव के लिए उपयोग किए जाने वाले किसी भी ऊतक की कटाई शुरू करें।
    नोट: ऊतकों को स्नैप-जमे हुए या बलिदान (चित्रा 2) के 10-15 मिनट के भीतर पीएफए में रखा जाना चाहिए।
  5. उदारतापूर्वक माउस के किसी भी क्षेत्र को 70% इथेनॉल के साथ काटने के लिए स्प्रे करने के लिए बालों को विदारक क्षेत्र और उपकरणों से दूर रखने में मदद करने के लिए।
  6. श्रोणि (चित्रा 3 ए) के पास, पैर के शीर्ष के चारों ओर त्वचा को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें।
  7. धीरे से पैर की त्वचा को ऊपर से टखने तक खींचें (चित्रा 3 बी)।
    नोट: टीए एक अश्रु के आकार की मांसपेशी है जिसमें एक स्पष्ट रूप से परिभाषित डिस्टल कण्डरा औसत दर्जे का क्यूनिफॉर्म और पहली मेटाटार्सल हड्डी से जुड़ा होता है। यह टिबिया के लिए पार्श्व है और निचले घुटने तक फैला हुआ है।
  8. सबसे पहले, टीए (चित्रा 3 सी) की कटाई से पहले तेज इत्तला दे दी चिमटी का उपयोग कर बाहरी संयोजी ऊतक परत (एपिमिसियम) को हटा दें। एपिमिसियम को बेहतर ढंग से कल्पना करने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  9. मांसपेशियों के नीचे से टीए के नीचे चिमटी स्लाइड, डिस्टल कण्डरा से शुरू, और धीरे घुटने (चित्रा 3 डी) की ओर ऊपर की ओर खींचें। मांसपेशियों के अंत में रुकें; निचले घुटने पर महसूस किए गए प्रतिरोध को धक्का न दें।
  10. यदि निचले घुटने तक पहुंचने से पहले महत्वपूर्ण प्रतिरोध है, तो रोकें और संयोजी ऊतक की बची हुई परतों को हटाना जारी रखें।
    नोट: टीए कण्डरा के लिए एक और डिस्टल कण्डरा सिर्फ पार्श्व है जो ईडीएल से जुड़ता है, जो टीए के लिए एक पतला मांसपेशी पार्श्व है। टीए कण्डरा के तहत केवल चिमटी को स्लाइड करने के लिए सावधान रहना ईडीएल की आकस्मिक कटाई को रोकता है, लेकिन निर्धारण के बाद इसे आसानी से हटाया जा सकता है।
  11. एक बार टीए को चिमटी के साथ पैर से आंशिक रूप से उठाया गया है, निचले घुटने (चित्रा 3 ई) के लिए टीए के कनेक्शन को तोड़ने के लिए स्केलपेल के साथ एक ही गति का उपयोग करें। टीए को पूरी तरह से हटाने के लिए कैंची के साथ टखने पर कण्डरा काटें। तंतुओं को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए केवल कण्डरा पर मांसपेशियों को संभालें।
  12. कण्डरा (चित्रा 3 एफ) के विपरीत अंत में टीए के 1/3 काट, इसे एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में डाल दिया, और तरल नाइट्रोजन (चित्रा 3 एच) में छोड़कर स्नैप-फ्रीज करें।
  13. ऊतक विज्ञान (चित्रा 3 आई) के लिए 4% पीएफए के साथ एक लेबल अच्छी तरह से में ऊतक के अन्य 2/3 जलमग्न। पहले और अंतिम ऊतक को फिक्सेटिव में कब रखा गया था, इसका ट्रैक रखना सुनिश्चित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-2.5 घंटे के लिए एक प्रकार के बरतन पर रखें।
  14. निर्धारण की अवधि ऊतक और उसके आकार पर निर्भर है। ऊतकों को ठीक करने के लिए आवश्यक अवधि निर्धारित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2-2.5 घंटे के लिए टीए को ठीक करना आमतौर पर ऊतक के अति-निर्धारण के बिना एडिपोसाइट आकृति विज्ञान को अच्छी तरह से संरक्षित करता है।
    नोट: यदि पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला के लिए टीए का उपयोग करने की योजना बना रहे हैं, तो धारा 7 तक पहुंचने तक इस प्रोटोकॉल के बाकी हिस्सों को छोड़ दें: "पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला"।
  15. निर्धारण के बाद, कुओं से पीएफए को हटा दें, ठंडे 1 एक्स पीबीएस के साथ ऊतकों को 2-3 बार कुल्लाएं, और फिर प्रति धोने 5 मिनट के लिए ठंडे 1 एक्स पीबीएस के साथ 2-3 बार धोएं।
  16. कुओं से पीबीएस निकालें और ऊतक को तैरने की अनुमति देने के लिए 1x पीबीएस में पर्याप्त 30% सुक्रोज जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर शेकर पर रखें।

Figure 3
चित्रा 3: ऊतक फसल सारांश (ए) त्वचा को पैर के आधार पर काटा जाता है और (बी) हिंद अंग की मांसपेशियों को उजागर किया जाता है। (सी) एक बार एपिमिसियम को टीए से हटा दिया जाता है, (डी) संदंश का उपयोग मांसपेशियों को आंशिक रूप से अलग करने और यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि एपिमिसियम को पूरी तरह से हटा दिया गया है। (ई) टीए को स्केलपेल के साथ पैर से काटा जाता है और कण्डरा काटने के बाद हटा दिया जाता है। (जी) टीए को एक तिहाई और दो-तिहाई टुकड़े में काटने के बाद, (एच) एक तिहाई आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्नैप-जमे हुए है और (आई) अन्य दो-तिहाई हिस्टोलॉजी के लिए 4% पीएफए में तय किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. एम्बेडिंग

  1. ऊतकों को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए पर्याप्त एम्बेडिंग माध्यम के साथ लेबलिंग और भरने के द्वारा एम्बेडिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूना मोल्ड तैयार करें।
  2. कुओं से ऊतकों को निकालें, एक पेपर तौलिया पर अतिरिक्त सुक्रोज को सुखाएं, और ठंडे मध्यम से भरे नमूना मोल्डों में जाएं।
    नोट: यह जानना उपयोगी है कि क्रायोस्टैट पर मोल्ड को किस अभिविन्यास में विभाजित किया जाना चाहिए। इस तरह, उपयोगकर्ता मोल्ड में ऊतकों को इस तरह से उन्मुख कर सकता है जो ब्याज के क्षेत्र को आसानी से सुलभ होने की अनुमति देता है। टीए के लिए, यह सबसे मोटा अंत (कण्डरा की तरफ से विपरीत) सतह का सामना करके प्राप्त किया जाएगा जिसे खंडित किया जाएगा। यह टीए को आसानी से अपने सबसे मोटे हिस्से (पेट) पर विभाजित करने की अनुमति देता है और मांसपेशियों के तंतुओं के क्रॉस-सेक्शनल काटने की अनुमति देता है।
  3. तरल नाइट्रोजन में आइसोपेंटेन रखने वाले कंटेनर को आंशिक रूप से डुबोकर एक आइसोपेंटेन घोल तैयार करें। सुनिश्चित करें कि ऊतकों को एम्बेड करने के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूना मोल्ड के लगभग आधे हिस्से को डुबोने के लिए कंटेनर में पर्याप्त तरल आइसोपेंटेन है।
  4. मोल्डों को सावधानीपूर्वक आइसोपेंटेन घोल में डालकर ठंडा करना शुरू करें और सुनिश्चित करें कि मोल्ड का लगभग आधा हिस्सा डूबा हुआ है। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि मोल्ड चारों तरफ से समान रूप से ठंडा हो रहा है।
  5. पूरे मोल्ड को ऊपर से जमे हुए होने से ठीक पहले आइसोपेंटेन से मोल्ड को बाहर निकालें। इसमें लगने वाला समय उपयोग किए जा रहे सांचों पर निर्भर करता है।
  6. बाकी ब्लॉकों को ठंडा करते समय सूखी बर्फ के साथ एक कंटेनर में जमे हुए मोल्ड रखें, फिर उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: ठंड के लिए आइसोपेंटेन का पुन: उपयोग किया जा सकता है। एक कांच की बोतल में रखो लेकिन ढक्कन को तब तक न कसें जब तक कि आइसोपेंटेन कमरे के तापमान (आरटी) तक न पहुंच जाए। अन्यथा, दबाव में परिवर्तन बोतल को चकनाचूर कर सकता है।

5. सेक्शनिंग

  1. क्रायोस्टैट को -22 से -24 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, क्रायोस्टैट में टीए युक्त मोल्ड जोड़ें, और तापमान अनुकूलन के लिए न्यूनतम 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें। इस बीच, सकारात्मक चार्ज माइक्रोस्कोप स्लाइड की एक श्रृंखला लेबल करें।
  2. एक एंटी-रोल प्लेट डालें और क्रायोस्टैट को संरेखित करें जैसे कि प्लेट में न्यूनतम निक होते हैं जहां यह नमूना ब्लॉक के साथ संपर्क बनाता है। जगह में सुरक्षित।
  3. ब्लेड धारक में एक ताजा क्रायोस्टैट ब्लेड डालें और इसे जगह में सुरक्षित करें।
    सावधानी: ब्लेड तेज है। क्रायोस्टैट या जमे हुए सांचों के अन्य हिस्सों में हेरफेर करते समय ब्लेड को कवर करें।
  4. मोल्ड से जमे हुए ब्लॉक को हटा दें। क्रायोस्टैट चक में एम्बेडिंग माध्यम की एक समान परत जोड़ें और ब्लॉक को माध्यम में रखें। एम्बेडिंग माध्यम पूरी तरह से जमे हुए (अपारदर्शी सफेद) होने तक इसे 1-3 मिनट तक बैठने दें।
    नोट: टीए के लिए, चक पर सबसे मोटा क्षेत्र (पेट) दिखाई देना चाहिए।
  5. क्रायोस्टैट चक को ऊतक ब्लॉक के साथ क्रायोस्टैट में रखें। ब्लेड को उजागर करें और ब्लेड के संपर्क में आने तक क्रायोस्टैट को आगे बढ़ाएं। 25 μm वर्गों पर ब्लॉक के माध्यम से अनुभाग जब तक ऊतक अब एम्बेडिंग माध्यम से अस्पष्ट नहीं है।
    नोट: सेक्शनिंग करते समय, क्रायोस्टैट के कोण और / या चरण की स्थिति को समायोजित करें जैसे कि अनुभाग समान मोटाई के हैं। अनुभाग मोटाई में एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए कुछ वर्गों को इकट्ठा करना सहायक हो सकता है। यह अनुशंसा की जाती है कि उपयोगकर्ता टीए (पेट) के भीतर ब्याज के क्षेत्र के माध्यम से सेक्शनिंग से पहले उचित एंटी-रोल प्लेट की स्थिति पाता है, क्योंकि यह उपयोगकर्ता को एंटी-रोल प्लेट के कई पदों को आज़माने की अनुमति देता है जब तक कि अनुभाग ऊतक को बर्बाद किए बिना सीधे नहीं आ रहे हैं।
  6. 10-12 μm करने के लिए अनुभाग मोटाई बदलें और लेबल माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों को इकट्ठा। सीरियल सेक्शनिंग को 6-10 स्लाइड्स (लेबल 1-एक्स) पर आसन्न अनुभागों को इकट्ठा करके अनुशंसित किया जाता है, जो कई मार्करों के लिए धुंधला होने की अनुमति देता है। यदि आवश्यक हो, तो स्लाइड पर एकत्र करने से पहले अनुभागों को अनकरल करने के लिए एक पतले ब्रश का उपयोग करें।
    नोट: यदि अनुभाग कर्लिंग कर रहे हैं, तो जांचें कि तापमान -22 से -24 डिग्री सेल्सियस रेंज के भीतर स्थिर है। यदि वर्गों में ऊर्ध्वाधर धारियाँ हैं, तो यह एंटी-रोल प्लेट या ब्लेड में निक के कारण हो सकता है; यह एंटी-रोल प्लेट की स्थिति को समायोजित करके और / या एक नए ब्लेड पर स्विच करके तय किया जा सकता है।
  7. प्रत्येक स्लाइड पर एक ही सेक्शनिंग विमान के आसन्न वर्गों को इकट्ठा करने के बाद, ब्लॉक के माध्यम से 150-200 μm अग्रिम करने के लिए मोटाई को 25 μm तक समायोजित करें, फिर मोटाई को 10-12 μm पर वापस समायोजित करें और फिर से सेक्शनिंग शुरू करें।
    नोट: यह धारावाहिक सेक्शनिंग उपयोगकर्ता को टीए के माध्यम से विभिन्न गहराई पर कल्पना, छवि और मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है; प्रति स्लाइड तीन से चार धारावाहिक अनुभाग पर्याप्त हैं।
  8. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड और ऊतक ब्लॉक स्टोर करें।

6. ऊतक वर्गों के इम्यूनोफ्लोरोसेंट (आईएफ) धुंधला होना

नोट: चूंकि एंटीबॉडी सांद्रता बहुत सारे और निर्माताओं के बीच भिन्न हो सकती है, इसलिए ब्याज की स्लाइड को धुंधला करने से पहले परीक्षण स्लाइड पर एंटीबॉडी की कई अलग-अलग सांद्रता का मूल्यांकन करके अनुकूलन की सिफारिश की जाती है।

  1. सूखी स्लाइड या तो आरटी पर या 10-20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर।
  2. स्लाइड की कागज की सतह के किनारे पर एक रेखा खींचने के लिए हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करें, जहां यह ग्लास से मिलता है।
  3. स्लाइड्स को कोप्लिन जार में रखें और ऊतक वर्गों को पुनर्जलीकृत करने के लिए प्रति धोने के लिए कम से कम 5 मिनट प्रति धोने के लिए एक प्रकार के बरतन पर 1x पीबीएस + 0.1% ट्वीन 20 (पीबीएसटी) 3-5x के साथ धो लें।
    नोट: इस बिंदु पर, पीबीएसटी (हाइड्रोफोबिक लाइन तक) में डूबे बिना स्लाइड्स को बैठने देना महत्वपूर्ण नहीं है, या ऊतक अनुभाग सूख जाएंगे।
  4. एक आर्द्रीकरण कक्ष के रैक पर स्लाइड रखें और आरटी पर 1-2 घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान (5% गधा सीरम और 1x पीबीएस में 0.3% ट्राइटन एक्स -100) के 310-350 μL के साथ स्लाइड्स को ओवरले करें।
    नोट: कोई अतिरिक्त पारगम्यता कदम की आवश्यकता नहीं है, क्योंकि अवरुद्ध समाधान में 0.3% ट्राइटन एक्स -100 होता है जो ऊतक वर्गों के पर्याप्त पारगम्यता के लिए अनुमति देता है। चूहों से प्राप्त प्राथमिक एंटीबॉडी (यानी, पैक्स 7 और एमवाईओडी 1 नीचे सूचीबद्ध) का उपयोग करते समय, अवरुद्ध चरण के लिए अवरुद्ध समाधान में फैब टुकड़े (1:50) का उपयोग करके माउस-ऑन-माउस अवरुद्ध चरण शामिल करने की सिफारिश की जाती है। यह प्राथमिक के अलावा अन्य एंटीबॉडी के लिए माउस माध्यमिक एंटीबॉडी के निरर्थक बंधन के कारण पृष्ठभूमि को कम करने में मदद करेगा।
  5. अगले चरण में आगे बढ़ने से कुछ समय पहले अवरुद्ध समाधान में उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी को निम्नानुसार पतला करें:
    1. "एडिपोसाइट धुंधला और पूरे अनुभाग इमेजिंग के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी: 1: 1000 के कमजोर पड़ने के अनुपात में खरगोश विरोधी पेरिलिपिन को पतला करें".
    2. एडिपोसाइट्स के वंश अनुरेखण के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी: 1: 1000 के अनुपात में चिकन एंटी-जीएफपी को पतला करें और 1: 1000 पर खरगोश एंटी-पेरिलिपिन।
    3. एफएपी के वंश अनुरेखण के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी: 1: 1000 के अनुपात में चिकन एंटी-जीएफपी को पतला करें और बकरी एंटी-पीडीजीएफआर 1: 250 पर।
    4. मायोजेनिक मार्करों के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी: 1:25 के अनुपात में माउस एंटी-पैक्स 7 को पतला करें या 1:250 पर माउस एंटी-एमवाईओडी 1, और 1:1000 पर खरगोश एंटी-लैमिनिन।
      नोट: जबकि ऊपर सूचीबद्ध एंटीबॉडी का इस प्रोटोकॉल के साथ सफलतापूर्वक मूल्यांकन किया गया है, यह संभावना है कि एफएपी, एडिपोसाइट्स और / या अन्य सेल प्रकारों को लेबल करने के लिए अन्य मार्कर और एंटीबॉडी भी इस प्रोटोकॉल के साथ संगत हैं। पहली बार प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते समय यह दृढ़ता से अनुशंसा की जाती है कि उपयोगकर्ता में एक नकारात्मक नियंत्रण स्लाइड शामिल हो, जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी को छोड़ दिया जाता है। यह एंटीबॉडी की विशिष्टता के लिए नियंत्रित करेगा। प्रोटोकॉल में अन्य सभी चरणों का पालन किया जाता है, जिसमें माध्यमिक एंटीबॉडी के अलावा शामिल है, लेकिन अवरुद्ध समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी के बजाय अगले चरण में अवरुद्ध समाधान का उपयोग अकेले किया जाता है।
  6. स्लाइड से अवरुद्ध समाधान डंप और प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ अवरुद्ध समाधान के 310-350 μL के साथ ओवरले और आर्द्रता कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
  7. अगले दिन, स्लाइड से अवरुद्ध समाधान / प्राथमिक एंटीबॉडी डंप करें और उन्हें कोप्लिन जार में रखें। पीबीएसटी के साथ स्लाइड्स को 2-3 बार कुल्लाएं और प्रति धोने के लिए कम से कम 5 मिनट के लिए एक शेकर पर पीबीएसटी के साथ 3-5x धो लें।
  8. अंतिम धोने के दौरान, अवरुद्ध समाधान में उपयोग किए जाने वाले माध्यमिक एंटीबॉडी या किसी भी प्रत्यक्ष संयुग्म को तैयार करें। फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए इन एंटीबॉडी द्वारा प्रकाश में बिताए गए समय को कम करें।
    1. प्रत्यक्ष संयुग्म: 488 एनएम गधा एंटी-चिकन (1: 1000) या एंटी-खरगोश (1: 1000) या एंटी-माउस (1: 1000), 568 एनएम गधा एंटी-बकरी (1: 1000) या एंटी-खरगोश (1: 1000) या फालोइडिन (मायोफाइबर; 1: 100), डीएपीआई दाग (नाभिक;
  9. या आर्द्रीकरण कक्ष में प्रत्यक्ष संयुग्मों के साथ अवरुद्ध समाधान के 310-350 μL के साथ स्लाइड को ओवरले करें। 1-2 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं। अब से प्रकाश से नमूनों की रक्षा करें।
  10. माध्यमिक एंटीबॉडी को डंप करें और उन्हें कोप्लिन जार में रखें। पीबीएसटी के साथ एक बार कुल्ला और धोने के प्रति कम से कम 5 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर पीबीएसटी के साथ 3-5x धो लें। प्रकाश जोखिम को रोकने के लिए कोप्लिन जार को कवर रखें।
  11. किनारों को टैप करके और पेपर तौलिया के खिलाफ पीठ को पोंछकर स्लाइड्स को जितना संभव हो उतना सुखाएं, लेकिन ऊतक वर्गों को सूखने न दें।
  12. स्लाइड के शीर्ष क्षैतिज किनारे पर जलीय बढ़ते माध्यम की तीन या चार बूंदें जोड़ें और धीरे से एक कवरस्लिप जोड़ें। कवरस्लिप के नीचे हवा के बुलबुले बनने पर नीचे दबाएं या स्थानांतरित न करें; कोई भी दबाव या आंदोलन एडिपोसाइट्स के नाजुक सेलुलर वास्तुकला को विकृत कर सकता है।
  13. बढ़ते माध्यम इमेजिंग से पहले रात भर अंधेरे में सेट करने की अनुमति दें।

7. पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला

  1. निर्धारण के ~ 1 घंटे के बाद (चरण 3.14 देखें), निश्चित टीए से मायोफाइबर को छीलने के लिए तेज-इत्तला दे दी चिमटी का उपयोग करें।
  2. अलग फाइबर को 24-अच्छी तरह से प्लेट में रखें और पीबीएसटी के साथ प्रत्येक 3 मिनट के लिए 3x धो लें। बाद के सभी ऊष्मायन के लिए, वाष्पीकरण को रोकने के लिए ढक्कन जोड़ना सुनिश्चित करें।
  3. एंटीबॉडी के बेहतर प्रवेश की अनुमति देने के लिए एक प्रकार के बरतन पर आरटी (200-300 μL) पर 1x पीबीएस में 1% ट्राइटन एक्स -100 में 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  4. पीबीएसटी के साथ कुछ बार कुल्ला करने के बाद, अवरुद्ध समाधान (200-300 μL) के साथ ओवरले करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक नटेटर या शेकर पर ब्लॉक करें।
  5. अवरुद्ध समाधान में वांछित एकाग्रता (एकाग्रता को दोगुना करना एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु होता है) पर प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक नटेटर या प्रकार के बरतन पर नमूने (200-300 μL) सेते हैं।
  6. प्रकार के बरतन पर आरटी पर लगातार परिवर्तन के साथ दिन भर पीबीएसटी के साथ सख्ती से नमूने धो लें, प्रत्येक धोने के लिए 30-60 मिनट के लिए लगभग 4-6x।
  7. वांछित एकाग्रता (1: 500 अच्छी तरह से काम करने के लिए जाता है) प्लस परमाणु धुंधला पर अवरुद्ध समाधान में माध्यमिक एंटीबॉडी पतला और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक नटेटर या प्रकार के बरतन पर नमूने (200-300 μL) सेते हैं।
  8. प्रकार के बरतन पर आरटी पर लगातार परिवर्तन के साथ दिन भर पीबीएसटी के साथ सख्ती से नमूने धोएं, 30-60 मिनट प्रत्येक धोने के लिए लगभग 4-6x बार या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर धोएं।
  9. माउंट करने के लिए, धीरे से अतिरिक्त पीबीएसटी को सूखा दें और फिर ग्लास स्लाइड (चित्रा 4 ए) पर बढ़ते माध्यम की एक या दो बूंदों में फाइबर रखें। कवरस्लिप (18 मिमी x 18 मिमी) को बढ़ाने के लिए, थोड़ा मिट्टी के पैर जोड़ें; यह फाइबर को स्क्वैश होने से रोक देगा और स्लाइड में कवरस्लिप को सुरक्षित करेगा। मॉडलिंग यौगिक इसके लिए अच्छी तरह से काम करते हैं। एक बार कवरस्लिप सुरक्षित हो जाने के बाद, कवरस्लिप के नीचे का क्षेत्र पूरा होने तक किनारे पर अधिक माध्यम जोड़ें।
    नोट: एंटी-लुप्त होती एजेंटों वाले बढ़ते माध्यम का उपयोग करने के बजाय, ऊतक को ग्लिसरॉल की आरोही श्रृंखला (पीबीएस में 30% से 80% ग्लिसरॉल) के माध्यम से भी ले जाया जा सकता है।
  10. बढ़ते माध्यम के इलाज की अनुमति देने के लिए इमेजिंग से पहले 1-2 दिनों तक प्रतीक्षा करें।

8. इंट्रामस्क्युलर वसा की इमेजिंग

  1. माइक्रोस्कोप चालू करें और इमेजिंग सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें। मंच पर स्लाइड सुरक्षित करें।
    नोट: मांसपेशियों के वर्गों में इमेजिंग एडिपोसाइट्स के लिए, वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त 5x या 10x उद्देश्य अक्सर पर्याप्त होता है। डब्ल्यूएम-आईएफ की कल्पना करने के लिए, एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है।
  2. इमेज किए जाने वाले क्षेत्र की पहचान करने के लिए किसी भी चैनल का उपयोग करें।
  3. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में, प्रत्येक चैनल के लिए लाभ और जोखिम समय समायोजित करें।
  4. प्रत्येक चैनल में पूरे ऊतक की छवियां लें (माइक्रोस्कोप और सॉफ्टवेयर के अनुसार स्वचालित या मैनुअल) और पूर्ण टीए क्रॉस-सेक्शन का मिश्रण बनाने के लिए व्यक्तिगत टाइल्स को मर्ज करें।
    नोट: अलग-अलग गहराई पर एक ही टीए के दो या तीन अलग-अलग वर्गों की छवियां लेने की सिफारिश की जाती है। प्रत्येक अनुभाग में एडिपोसाइट्स की मात्रा निर्धारित करके और फिर औसत की रिपोर्ट करके, उदाहरण के लिए, इंजेक्शन त्रुटियों से बचा जाएगा, इंट्रामस्क्युलर वसा की मात्रा में स्थानीयकृत अंतर।

9. एडिपोसाइट्स की मात्रा निर्धारित करना

  1. यदि पहले स्थापित नहीं है, तो छविJ (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html) करने के लिए कक्ष काउंटर प्लग-इन जोड़ें।
  2. छवियों को टीआईएफ फ़ाइलों या मूल माइक्रोस्कोप फ़ाइलों के रूप में इमेजजे में आयात करें। इमेजजे में प्रत्येक चैनल को एक अलग टीआईएफ फ़ाइल के रूप में देखें।
    नोट: यदि एलआईएफ या इसी तरह के माइक्रोस्कोप फ़ाइल प्रकारों का उपयोग कर रहे हैं, तो जैव-स्वरूप आयात विकल्पों के तहत, इसके साथ स्टैक देखें के लिए हाइपरस्टैक चुनें और स्प्लिट चैनल के लिए बॉक्स को चेक करें। फ़ाइल खोलने के लिए ठीक क्लिक करें. साथ ही, सुनिश्चित करें कि ऑटोस्केल बॉक्स अनियंत्रित है।
  3. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक चैनल के लिए छवियां 8-बिट प्रारूप (और ग्रे) में हैं: छवि > टाइप > 8-बिट।
  4. डीएपीआई (नीला), जीएफपी (हरा), पेरिलिपिन (लाल), और फालोइडिन (ग्रे) छवियों को मर्ज करें: छवि > रंग > मर्ज चैनल।
  5. जाँच करें कि स्केल (विश्लेषण > सेट स्केल) माइक्रोन में है। फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करके, प्रत्येक क्रॉस-सेक्शन के घायल और अप्रभावित हिस्से को रेखांकित करें, फिर मापें (माप > विश्लेषण करें) और स्प्रेडशीट में घायल बनाम अप्रभावित क्षेत्र को रिकॉर्ड करें।
    नोट: घायल मांसपेशियों को मायोफाइबर से रहित क्षेत्रों या मायोफाइबर द्वारा आबादी वाले क्षेत्रों के रूप में पहचाना जा सकता है जिनमें केंद्र स्थित नाभिक होते हैं।
  6. लॉन्च सेल काउंटर: प्लगइन्स > सेलकाउंटर प्रारंभ >।
  7. एक काउंटर प्रकार का चयन करें, फिर प्रत्येक एडिपोसाइट की गणना करें। स्प्रेडशीट में एडिपोसाइट्स की कुल संख्या रिकॉर्ड करें, फिर घायल क्षेत्र के प्रति 1 मिमी2 एडिपोसाइट्स की संख्या की गणना करें।

10. आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करके एडिपोजेनिक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण

  1. आरएनए अलगाव
    1. शुरू करने से पहले, 45 डिग्री सेल्सियस तक आरएनएएसई मुक्त पानी को पहले से गरम करें और ताजा 70% ईटीओएच (प्रति नमूना 350 μL) तैयार करें।
    2. नमूना युक्त प्रत्येक ट्यूब में गुआनिडियम थायोसाइनेट के 1,000 μL जोड़ें (चरण 3.12 देखें।)। यह महत्वपूर्ण है कि मनका बीटर-अनुमोदित ट्यूबों का उपयोग किया जा रहा है।
      सावधानी: गुआनिडियम थायोसाइनेट विषाक्त है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें और एक धूआं हुड में संभालें।
    3. प्रत्येक ट्यूब में तीन मध्यम मोती या एक बड़ा और एक छोटा मनका जोड़ें।
    4. एक मनका बीटर का उपयोग कर 2-4 मिनट के लिए 50 हर्ट्ज पर ऊतक समरूप। ऊतक प्रकार और नमूना आकार के आधार पर, इसमें 10 मिनट तक का समय लग सकता है।
    5. क्लोरोफॉर्म के 200 μL जोड़ें।
      सावधानी: क्लोरोफॉर्म विषाक्त है। व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें और एक धूआं हुड में संभालें।
    6. 15 एस के लिए नमूने हिलाओ। आरटी पर 2-3 मिनट के लिए सेते हैं।
    7. 12,000 एक्स जी पर 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला (आरएनए युक्त ऊपरी परत) के 350 μL से बाहर पिपेट और 70% इथेनॉल के 350 μL युक्त एक नए माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में जोड़ें। सावधान रहें कि कम प्रोटीन और / या डीएनए परतों की आकांक्षा न करें
    8. एक 2 एमएल संग्रह ट्यूब में रखा एक मिनी स्पिन कॉलम करने के लिए मिश्रण के 700 μL तक स्थानांतरण। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए आरएनए अलगाव के साथ जारी रखें।
    9. अपेक्षित उपज के आधार पर आरएनएएसई मुक्त पानी के 30-50 μL के साथ एल्यूट। बर्फ पर आरएनए रखें और स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके उपज को मापें। आरएनए को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत रखें
      नोट: डीएनए उपचार चरण को छोड़ना संभव है, क्योंकि ध्यान से आरएनए परत के ऊपरी 350 μL को बंद करना डीएनए संदूषण को रोकने में पर्याप्त है। आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के अलावा, पृथक आरएनए का उपयोग आरएनए-अनुक्रमण के लिए भी किया जा सकता है, इस स्थिति में डीएनए उपचार चरण की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।
  2. सीडीएनए संश्लेषण
    1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, सीडीएनए संश्लेषण किट के साथ सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए आरएनए के 1 μg तक का उपयोग करें।
    2. रन पूरा होने के बाद, आरएनएएसई मुक्त पानी के 80 μL जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें।
  3. "एडिपोसाइट-चयनात्मक जीन का आरटी-क्यूपीसीआर"।
    1. 384-अच्छी तरह से प्रारूप का उपयोग करके, प्रत्येक कुएं के नीचे प्राइमर (~ 1 μM अंतिम एकाग्रता) के 1 μL जोड़ें। प्री-सुखाने वाले प्राइमरों के परिणामस्वरूप तंग तकनीकी प्रतिकृतियां होती हैं। प्राइमरों के पूरी तरह से वाष्पित होने तक कवर छोड़ दें (प्लेट को वाष्पीकरण को गति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट हीटिंग ब्लॉक पर रखा जा सकता है)।
    2. निम्नानुसार चार से आठ तकनीकी प्रतिकृतियों के साथ नमूना प्रतिक्रियाएं सेट करें: डाई-आधारित आरटी-पीसीआर मास्टर मिश्रण के 2.5 μL, आरनेस-मुक्त पानी के 2.1 μL, और सीडीएनए के 0.4 μL (~ 1 एनजी) प्रति अच्छी तरह से 5 μL कुल मात्रा के साथ। निम्नलिखित थर्मल साइक्लिंग स्थितियों का उपयोग किया गया था: 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण और 40 चक्रों के लिए 25 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एनील /
    3. यहां वर्णित38 के रूप में ΔΔΔC की गणना करके हाउसकीपिंग जीन (यानी, एचपीआरटी और पीडीई 12) स्तरों के लिए कच्चे सीटी (चक्र थ्रेशोल्ड) मूल्यों को सामान्य करें। प्राइमर अनुक्रमों के लिए20 देखें।
      नोट: आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए मानक अभ्यास का पालन किया जाना चाहिए, जैसे कि माइनस रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (-आरटी) नियंत्रण, पीसीआर प्रतिक्रिया और प्राइमर सत्यापन का उपयोग।

Representative Results

इंट्रामस्क्युलर वसा का इम्यूनोफ्लोरोसेंट विज़ुअलाइज़ेशन
ऊपर दिए गए चरणों के बाद और चित्रा 1 ए को देखने के बाद, टीए ऊतक वर्गों को 21 दिन के बाद ग्लिसरॉल की चोट से इकट्ठा किया गया था जो या तो एलएन 2-कूल्ड आइसोपेंटेन में कटाई के तुरंत बाद स्नैप-जमे हुए थे या 2.5 घंटे के लिए 4% पीएफए में तय किए गए थे। क्रायोसेक्शनिंग और दोनों नमूनों को धुंधला करने के बाद, छवियों को मध्य-पेट में लिया गया था, जो टीए का सबसे बड़ा क्षेत्र था। अनिर्धारित टीए (चित्रा 1 बी) से पेरिलिपिन + एडिपोसाइट्स ने निश्चित वर्गों (चित्रा 1 सी) की तुलना में आकृति विज्ञान को काफी बदल दिया है, जिससे उनकी पहचान, विज़ुअलाइज़ेशन और बाद में मात्रा का ठहराव अधिक कठिन और संभावित रूप से गलत हो जाता है। ध्यान देने के लिए, चोट लगने के बाद लगभग 5 दिनों में पहली पेरिलिपिन + लिपिड बूंदों का पता चला था, जिसमें अधिकांश एडिपोसाइट्स 7 दिन तक बन गए थे। चोट लगने के 21 दिनों बाद तक, एडिपोसाइट्स पूरी तरह से परिपक्व हो गए थे।

चूंकि प्रति टीए वसा की मात्रा प्रेरित चोट की गंभीरता के साथ दृढ़ता से संबंधित है, इसलिए इंट्रामस्क्युलर वसा गठन का प्रभावी ढंग से निरीक्षण और अध्ययन करने के लिए टीए को काफी घायल होना चाहिए। कैडेवर टीए में स्याही का उपयोग करके इंजेक्शन का अभ्यास करना चोट की गंभीरता में सुधार करने का एक शानदार तरीका है। सफल चोटें मांसपेशियों के 50% से ऊपर होती हैं। ध्यान देने के लिए, मांसपेशियों के घायल क्षेत्र मांसपेशियों के तंतुओं या उन क्षेत्रों से रहित क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो मांसपेशियों के तंतुओं से आबाद होते हैं जिनमें कम से कम एक केंद्रीय रूप से स्थित नाभिक होता है, जो एक पुनर्जीवित मांसपेशी फाइबर की एक ज्ञात पहचान है।

इस प्रोटोकॉल को आसानी से 3 डी में एफएपी और वसा के लिए दाग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसके लिए, टीए पोस्ट-फिक्सेशन से कई मायोफाइबर को सावधानीपूर्वक अलग किया गया था, इसके बाद पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस थे। कुंजी ग्लास स्लाइड के लिए फाइबर को ठीक से सुरक्षित करना है और साथ ही, ऊतक के अति-संपीड़न से बचने के लिए। मोल्ड करने योग्य मिट्टी के पैरों का उपयोग करके, उपयोगकर्ता आवश्यक मोटाई को समायोजित कर सकता है और स्लाइड में कवरस्लिप को सुरक्षित कर सकता है, यहां तक कि एक उल्टे माइक्रोस्कोप (चित्रा 4 ए) के उपयोग की अनुमति भी दे सकता है। इस विधि का उपयोग पीडीजीएफआर + एफएपी, फालोइडिन + मायोफाइबर, और पेरिलिपिन-एक्सप्रेसिंग एडिपोसाइट्स (चित्रा 4 बी, पूरक वीडियो 1 और पूरक वीडियो 2) को लेबल करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया था। मोटाई में 150 μm तक फैले कई जेड-विमानों पर छवियां प्राप्त करने के बाद, माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर के भीतर 3 डी रेंडरिंग मॉड्यूल का उपयोग 3 डी पुनर्निर्माण बनाने के लिए किया गया था।

Figure 4
चित्रा 4: पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना (ए) नमूना माउंट करने और पूरे माउंट धुंधला के लिए कवरस्लिप जोड़ने के तरीके के शीर्ष और साइड दृश्य। (बी) मायोफाइबर (ग्रे) और नाभिक (नीले) के साथ एफएपी (हरा; बाएं) और एडिपोसाइट्स (लाल; दाएं) के प्रतिनिधि 3 डी पुनर्निर्माण। स्केल सलाखों: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इंट्रामस्क्युलर वसा का परिमाणीकरण
एक बार जब छवियों को इंट्रामस्क्युलर वसा की ली गई है, तो इमेजजे / फिजी में सेल काउंटर फ़ंक्शन का उपयोग मैन्युअल रूप से पर्लिपिन + एडिपोसाइट्स (चित्रा 5 ए) की संख्या की गणना करने के लिए किया गया था। अगला, मांसपेशी अनुभाग के कुल क्षेत्र के साथ-साथ घायल क्षेत्र, मायोफाइबर के भीतर केंद्रीय रूप से स्थित नाभिक द्वारा परिभाषित किया गया था, निर्धारित किया गया था। चोट की गंभीरता को नियंत्रित करने के लिए, एडिपोसाइट्स की कुल संख्या को घायल क्षेत्र से विभाजित किया गया था जिसके परिणामस्वरूप घायल मांसपेशियों के प्रति 1 मिमी2 वसा कोशिकाओं की संख्या थी। आमतौर पर, टीए जो <30% चोट प्रदर्शित करते हैं, उन्हें परिमाणीकरण से बाहर रखा जाता है। ध्यान देने के लिए, हालांकि एडिपोसाइट्स चोट के बिना दुर्लभ हैं, शून्य से लेकर आठ प्रति क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र तक, एडिपोसाइट्स की कुल संख्या अभी भी कुल क्षेत्र द्वारा सामान्यीकृत है। जैसा कि चित्रा 5 बी में हाइलाइट किया गया है, एक ग्लिसरॉल चोट एक अप्रभावित टीए मांसपेशियों की तुलना में इंट्रामस्क्युलर वसा की भारी मात्रा का कारण बनती है। वैकल्पिक रूप से, जैसा कि पेरिलिपिन धुंधला एक उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ बहुत साफ है, पेरिलिपिन द्वारा कब्जा किए गए कुल क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए विश्लेषण कण फ़ंक्शन का उपयोग करना भी संभव है। हालांकि, यह विधि छोटे बनाम कम एडिपोसाइट्स के बीच अंतर करने में सक्षम नहीं होगी। कम से कम चार अलग-अलग जानवरों से तीन वर्गों तक इमेज और मात्रा निर्धारित की गई थी, और प्रति माउस मौजूद वसा कोशिकाओं की औसत संख्या बताई गई थी।

Figure 5
चित्रा 5: इंट्रामस्क्युलर वसा की मात्रा का ठहराव (ए) इमेजजे में सेल काउंटर फ़ंक्शन का उपयोग करके पेरिलिपिन + एडिपोसाइट्स (सफेद) की गणना करने के तरीके की प्रतिनिधि छवि। स्केल बार: 50 μm. (बी) पूरे टीए एडिपोसाइट परिमाणीकरण 21 दिनों के बाद ग्लिसरॉल इंजेक्शन घायल क्षेत्र के 1 मिमी2 के लिए सामान्यीकृत। प्रत्येक बिंदु एक माउस के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। **** = पी < 0.0001 के रूप में दिखाया गया है। (सी) समरूपता के बाद आरएनए परत और क्लोरोफॉर्म द्वारा बाद के चरण पृथक्करण का उपयोग आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए किया जा रहा है। (डी) ग्लिसरॉल की चोट के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर पीपीएआरजी और सेपबो, प्रारंभिक एडिपोजेनिक जीन, और प्लिन 1 और एडिपोक, दो परिपक्व एडिपोसाइट मार्करों के अभिव्यक्ति स्तर में गुना परिवर्तन। प्रत्येक बिंदु एक माउस के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। एसईएम के रूप में दिखाए गए त्रुटि पट्टियाँ। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

स्वतंत्र रूप से मौजूद इंट्रामस्क्युलर वसा की मात्रा की पुष्टि करने के लिए, विभिन्न एडिपोजेनिक मार्करों के जीन अभिव्यक्ति स्तर निर्धारित किए जा सकते हैं। इसके लिए, आरएनए को चोट के बाद विभिन्न बिंदुओं पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस (ऊपर दिए गए चरण देखें) के लिए उपयोग की जाने वाली एक ही टीए मांसपेशियों के एक हिस्से से अलग किया जा सकता है। ऊतक को समरूप बनाने के लिए गुआनिडियम थायोसाइनेट के संयोजन में एक मनका बीटर का उपयोग किया गया था। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद क्लोरोफॉर्म जोड़ने के बाद, ऊपरी आरएनए युक्त परत को सावधानीपूर्वक निकाला गया था, और आरएनए सफाई (चित्रा 5 सी) के लिए मिनी स्पिन कॉलम का उपयोग किया गया था। यह विधि नियमित रूप से आरटी-क्यूपीसीआर और आरएनए जैसे सभी डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उपयुक्त आरएनए की उच्च गुणवत्ता और मात्रा का उत्पादन करती है। आरटी-क्यूपीसीआर के लिए, हाउसकीपिंग जीन के लिए एडिपोजेनिक के सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर निर्धारित किए गए थे, और ΔΔΔCT विधि38 के बाद किसी भी सापेक्ष परिवर्तन का मूल्यांकन किया गया था। जैसा कि चित्रा 5 डी में वर्णित है, अप्रभावित टीए मांसपेशियों की तुलना में, ग्लिसरॉल की चोट चोट के 3 दिनों के बाद के रूप में जल्द ही शुरुआती एडिपोजेनिक मार्करों जैसे कि पपरग और सेबपू की अभिव्यक्ति को प्रेरित करती है। परिपक्व मार्कर, जैसे कि एडिपोनेक्टिन (एडिपोक) और पेरिलिपिन (प्लिन 1), ग्लिसरॉल की चोट के 5 दिन बाद पता लगाया जा सकता है।

एडिपोसाइट्स के आनुवंशिक वंश अनुरेखण
यहां प्रस्तुत एडिपोसाइट धुंधला प्रोटोकॉल को आसानी से एडिपोसाइट्स में उनके भाग्य को मैप करने और उनका पालन करने के लिए एफएपी के आनुवंशिक वंश अनुरेखण को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमने पहले प्रदर्शित किया है कि पुनर्संयोजन को पीडीजीएफआरईटी 2 में टैमोक्सीफेन प्रशासनके माध्यम से प्रेरित किया जा सकता है; चोट से 2 सप्ताह पहले रोजा 26ईवाईएफपी चूहों, प्रभावी ढंग से फ्लॉक्स्ड स्टॉप कोडिंग को हटाने और एफएपी (चित्रा 6 ए) में ईवाईएफपी अभिव्यक्ति को अमिट रूप से सक्रिय करना। हमने यहां प्रस्तुत टैमोक्सीफेन आहार के साथ उच्च पुनर्संयोजन क्षमता हासिल की, जिसमें ~ 75% पीडीजीएफआर + एफएपी ईवाईएफपी20 व्यक्त करते हैं, जो अन्य प्रयोगशालाओं ने 27,39,40 की सूचना दी है। यह दर्शाते हुए कि एफएपी वास्तव में इंट्रामस्क्युलर वसा की सेलुलर उत्पत्ति है, अधिकांश एफएपी ग्लिसरॉल चोट (चित्रा 6 बी) के 7 दिनों बाद ईवाईएफपी + पेरिलिपिन-एक्सप्रेसिंग एडिपोसाइट्स में बदल गए हैं।

Figure 6
चित्रा 6: एफएपी के वंश अनुरेखण (ए) प्रयोगात्मक सेटअप का योजनाबद्ध अवलोकन। (बी) प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियां पीडीजीएफआरα + एफएपी (लाल, तीरहेड्स) और पेरिलिपिन + एडिपोसाइट्स (लाल, तारांकन) के भीतर ईवाईएफपी (पीला) के सफल पुनर्संयोजन और सक्रियण को दर्शाती हैं। स्केल सलाखों: 25 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एकाधिक कक्ष प्रकारों का पता लगाना
इस प्रोटोकॉल का उपयोग मायोजेनिक डिब्बे की कल्पना करने के लिए भी किया जा सकता है। पीएएक्स 7 और एमवाईओडी 1 के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, क्रमशः मांसपेशी स्टेम सेल (एमयूएससी) और मायोब्लास्ट्स को पीएफए-फिक्स्ड मांसपेशी ऊतक अनुभाग (चित्रा 7) में भी ग्लिसरॉल की चोट के 5 दिनों बाद आसानी से पता लगाया जा सकता है। इस प्रकार, प्रस्तुत प्रोटोकॉल बहुमुखी और न केवल लेबल और छवि एडिपोसाइट्स और एफएपी बल्कि मायोजेनिक वंश के अन्य सेल प्रकारों के लिए अनुकूलनीय है।

Figure 7
चित्रा 7: मांसपेशी स्टेम सेल और मायोब्लास्ट इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला हो जाना( ए) प्रयोगात्मक सेटअप का योजनाबद्ध अवलोकन। (बी) प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियां पीएएक्स 7 के साथ मांसपेशी स्टेम सेल (एमयूएससी) (पीला, बाएं) और एमवाईओडी 1 के साथ मायोब्लास्ट्स (पीला, दाएं) के सफल धुंधला दिखारही हैं। लैमिनिन मायोफाइबर (सफेद) को रेखांकित करता है, और नाभिक सियान में होते हैं। स्केल सलाखों: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 1: एफएपी का 3 डी प्रतिपादन। चोट लगने के 21 दिन बाद क्रमशः फालोइडिन (ग्रे), पीडीजीएफआर (हरा), और डीएपीआई (नीला) के लिए दाग वाले मायोफाइबर, एफएपी और नाभिक का त्रि-आयामी पुनर्निर्माण। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक वीडियो 2: इंट्रामस्क्युलर वसा का 3 डी प्रतिपादन। मायोफाइबर बंडलों (ग्रे, फालोइडिन) और इंट्रामस्क्युलर वसा (लाल, पेरिलिपिन) का वॉल्यूमेट्रिक प्रतिपादन, जिसने ग्लिसरॉल की चोट के 21 दिनों बाद मायोफाइबर को बदल दिया है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह प्रोटोकॉल एक व्यापक और विस्तृत प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करता है जो इंट्रामस्क्युलर वसा के कुशल दृश्य और कठोर मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। एक ही मांसपेशी को दो भागों में विभाजित करके, एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए उपयोग किया जा रहा है और दूसरा आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण के लिए, यह प्रोटोकॉल भी बहुत बहुमुखी है। इसे कुछ शर्तों के तहत एडिपोसाइट्स में उनके रूपांतरण का अध्ययन करने के लिए एफएपी के आनुवंशिक वंश अनुरेखण के साथ भी जोड़ा जा सकता है और कई अतिरिक्त सेल प्रकारों को लेबल और छवि देने के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय है।

इंट्रामस्क्युलर वसा की कल्पना करने के सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तरीके पैराफिन अनुभाग हैं, इसके बाद हेमटॉक्सिलिन और ईओसिन धुंधला या जमे हुए खंड हैं जो ऑयल रेड ओ (ओआरओ) जैसे लिपोफिलिक रंगों के लिए दाग होते हैं। हालांकि, जबकि पैराफिन-संसाधित ऊतक सबसे अच्छा ऊतक विज्ञान बनाए रखते हैं, वही प्रक्रिया लिपोफिलिक रंगों के उपयोग को रोकने वाले सभी लिपिड को भी निकालती है। यद्यपि लिपोफिलिक धुंधला तरीके पीएफए-फिक्स्ड और अनफिक्स्ड ऊतक वर्गों दोनों पर काम करेंगे, लिपिड बूंदों को कवरस्लिप पर दबाव डालकर आसानी से विस्थापित किया जाता है, जिससे इंट्रामस्क्युलर वसा के स्थानिक वितरण को विकृत किया जाता है। इसे दरकिनार करने के लिए, एक हालिया अध्ययन ने पूरे माउंट दृष्टिकोण का उपयोग करके ओआरओ + एडिपोसाइट्स की कल्पना करने के लिए एक कठोर प्रोटोकॉल स्थापित किया। इसके लिए, लेखकों ने पूरे टीए41 में इंट्रामस्क्युलर वसा के स्थानिक वितरण की कल्पना करने के लिए टीए को विकोशिकीय बनाया। इस तकनीक के रूप में शक्तिशाली है, यह अतिरिक्त सेलुलर संरचनाओं को चिह्नित करने के लिए अन्य सह-दाग के उपयोग को भी रोकता है। यहां प्रस्तुत पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृष्टिकोण का उपयोग सेलुलर पर्यावरण के ठीक मानचित्रण की अनुमति देने वाले विभिन्न मार्करों के साथ एडिपोसाइट्स को सह-दागने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, एक बड़ी चुनौती एंटीबॉडी के ऊतक प्रवेश है। जितना अधिक फाइबर को एक साथ रखा जाता है, उतना ही अधिक एंटीबॉडी के लिए सभी उपलब्ध एंटीजन में समान रूप से प्रवेश करना और बांधना मुश्किल होगा। इस प्रकार, फाइबर के छोटे समूहों को देखते समय यह विधि सबसे प्रभावी है। इसी समय, यह भी एक सीमा है क्योंकि केवल छोटे, छिलके वाले फाइबर बंडलों पर ध्यान केंद्रित करते समय इंट्रामस्क्युलर वसा का समग्र शारीरिक स्थान खो रहा है। हालांकि, उपन्यास ऊतक समाशोधन विधियों और नई इमेजिंग तकनीक के वर्तमान विकास के साथ, भविष्यमें 42,43,44 में अधिक ऊतक प्रवेश और दृश्य संभव होगा।

जबकि मांसपेशियों के ऊतकों का पूर्व निर्धारण एडिपोसाइट आकृति विज्ञान को संरक्षित करता है, यह मायोफाइबर के आकार का आकलन करने के लिए एक चुनौती भी बनाता है, जो मांसपेशियों के स्वास्थ्य का एक महत्वपूर्ण माप है। मायोफाइबर आकार मायोफाइबर के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र को मापकर निर्धारित किया जाता है। हमने पहले बताया है कि मांसपेशियों के ऊतकों के पूर्व निर्धारण से मायोफाइबर को रेखांकित करने के लिए उपलब्ध अधिकांश मार्कर31 विफल हो जाएंगे। इस बाधा को दूर करने के लिए, हमने एक उपन्यास छवि विभाजन पाइपलाइन विकसित की है, जो निश्चित मांसपेशी वर्गों 31 में भी मायोफाइबर आकार के माप की अनुमतिदेती है। इस प्रकार, हमने एक मजबूत और कुशल ऊतक प्रसंस्करण पाइपलाइन स्थापित की है, जो इस प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त है, मांसपेशियों के ऊतकों के पूर्व निर्धारण के कारण होने वाले अधिकांश नुकसानों को दूर करता है।

इस दृष्टिकोण का एक और प्रमुख लाभ बहुमुखी प्रतिभा है। टीए को दो भागों में विभाजित करके, एक मांसपेशी से प्राप्त की जा सकने वाली जानकारी की मात्रा को अधिकतम किया जाता है। यह न केवल जानवरों की संख्या को कम करता है, बल्कि जीन अभिव्यक्ति के माध्यम से ऊतक विज्ञान की पुष्टि करके नियंत्रण की एक अतिरिक्त परत भी जोड़ता है और इसके विपरीत। इसके अलावा, एडिपोजेनिक जीन से परे कई अलग-अलग जीनों की जांच की जा सकती है। पृथक आरएनए का उपयोग पूरी मांसपेशी आरएनएसेक प्रयोग के लिए भी किया जा सकता है। अंत में, स्नैप-जमे हुए मांसपेशियों के टुकड़े का उपयोग प्रोटीन के काम के लिए भी किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल की एक सीमा टीए की पूरी लंबाई में सुसंगत नहीं होने की संभावना है। इससे एक परिदृश्य हो सकता है जहां दो मांसपेशी भाग इंट्रामस्क्युलर वसा की मात्रा में भिन्न होते हैं और किसी भी डाउनस्ट्रीम विश्लेषण से इस तरह के नमूने के बहिष्कार का वारंट कर सकते हैं। इसलिए, इंट्रामस्क्युलर वसा की मात्रा के बारे में प्रमुख निष्कर्ष निकालने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर पर भरोसा नहीं करने की सिफारिश की जाती है, बल्कि हिस्टोलॉजिकल परिमाणीकरण के लिए सहायक डेटा के रूप में।

साथ में, यह प्रोटोकॉल एक मजबूत, कुशल और कठोर ऊतक प्रसंस्करण पाइपलाइन की रूपरेखा तैयार करता है जो इंट्रामस्क्युलर वसा के दृश्य और मात्रा का ठहराव की अनुमति देगा, फैटी फाइब्रोसिस का मुकाबला करने के लिए उपन्यास उपचार विकल्प विकसित करने में पहला कदम। इसी समय, यह बहुमुखी है और मांसपेशियों के भीतर कई अलग-अलग सेल प्रकारों के साथ-साथ अन्य ऊतकों में एडिपोसाइट्स के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम डेटा संग्रह और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने में मदद करने के लिए कोपिंके प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम पांडुलिपि पर उनके मूल्यवान इनपुट के लिए फ्लोरिडा विश्वविद्यालय में मायोलॉजी इंस्टीट्यूट के सदस्यों को भी धन्यवाद देते हैं। काम को एनआईएच अनुदान 1 आर 01 एआर 079449 द्वारा समर्थित किया गया था। चित्रा 2 बायोरेंडर के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% PFA (Pack of 12, 10 mL bottles) Electron Miscroscopy Sciences 15710
2.0 mL Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-138 microcentrifuge tubes for snapfreezing/bead beating
2-Methylbutane (4 L) Fisher Chemical O3551-4 isopentane
Absolute Ethanol (200 proof) ThermoFisher Scientific BP2818100
AffiniPure Fab fragment donkey anti-mouse Jackson ImmunoResearch 715-007-003 mouse-on-mouse blocking
Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken secondary antibody Jackson ImmunoResearch 703-545-155
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse secondary antibody Invitrogen A21202
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit secondary antibody Invitrogen A21206
Alexa Fluor 568 donkey anti-goat secondary antibody Invitrogen A11057
Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit secondary antibody Invitrogen A11037
Alexa Fluor 568 Phalloidin antibody Invitrogen A12380 Dissolved in 1.5 mL methanol (~66 µM working solution)
BioLite 24-well Multidishes ThermoFisher Scientific 930186 24 well plate for PFA tissue incubation
Biometra TOne analytikjena 8462070301 Thermal cycler
Chicken anti-GFP antibody Aves Labs GFP-1020
Chloroform/isoamyl alcohol 24:1(v/v) for molecular biology, DNAse, RNAse, and Protease free ThermoFisher Scientific AC327155000
Corn oil Sigma Aldrich C8267
DAPI stain Invitrogen D1306 150 µM working solution in dH2O
Donkey Serum (100 mL) Millipore Sigma 5058837 for blocking solution
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20 sharp-tipped tweezers
Fine Scissors Straight 9 cm Fine Science Tools 14060-09
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01 mounting medium
Glycerol, 99.5%, for molecular biology (500 mL) Acros Organics 327255000
Goat anti-PDGFRα antibody R&D AF1062
Hybridization Oven VWR 230301V for Tamoxifen incubation
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen Vector Laboratories H-4000 hydrophobic pen
Insulin Syringe with Micro-Fine IV needle (28 G) BD 329461
Insulin Syringe with Slip Tip, 1 mL BD 329654 Insulin syringe without needle, for oral gavaging
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
Isoflurane Patterson Veterinary 78938441
Leica DMi8 inverted microscope Leica micrscope used for widefield IF and confocal imaging
Micro Slides VWR 48311-703 positively charged microscope slides
mouse anti-MYOD antibody Invitrogen MA1-41017
mouse anti-PAX7 antibody (supernatant) DSHB AB 428528
MX35 Premier+ Microtome blades ThermoFisher Scientific 3052835 microtome blades
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND2000 spectrophotometer for RNA yield
Play-Doh Hasbro modeling compound
PowerUp SYBR Green Master Mix ThermoFisher Scientific A25742 green dye PCR master mix
Puralube Vet Ointment Puralube 17033-211-38 vet ophthalmic ointment
QuantStudi 6 Flex Real-Time 384-well PCR System Applied Biosystems 4485694 qPCR machine
Rabbit anti-perilipin antibody Cell Signaling Technology 9349S
Red-Rotor Shaker Hoefer Scientific PR70-115V shaker for IF staining
Richard-Allan Scientific Slip-Rite Cover Glass ThermoFisher Scientific 152460 coverslips
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74106 contains mini spin columns
Safe-Lock Tubes 1.5 ml, natural Eppendorf 22363204
Sample Tubes RB (2 mL) QIAGEN 990381
Sodium azide Alfa Aesar 14314
Stainless Steel Beads, 2.8 mm Precellys KT03961-1-101.BK small beads
Stainless Steel Beads, 5 mm QIAGEN 69989 medium beads
Stainless Steel Beads, 7 mm QIAGEN 69990 large beads
Stainless Steel Disposable Scalpels Miltex 327-4102 scalpel
Stainless steel feeding tube, 20 G x 38 mm, straight Instech Laboratories FTSS-20S-3 gavage needle
Tamoxifen Toronto Research Chemicals T006000
Tissue Plus O.C.T. Compound Fisher HealthCare 4585 embedding medium
TissueLyser LT QIAGEN 85600 bead beater
TissueLyser LT Adapter, 12-Tube QIAGEN 69980
Tissue-Tek Cryomold Sakura 4566 specimen molds
Triton X-100 Alfa Aesar A16046
TRIzol Reagent ThermoFisher Scientific 15596026 guanidium thiocyanate
Tween20 (500 mL) Fisher BioReagents BP337-500
VWR Micro Slides - Superfrost Plus VWR 48311703
Wheaton Coplin staining jars Millipore Sigma S6016 Coplin jar

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 183 कंकाल की मांसपेशी एफएपी वंश अनुरेखण इंट्रामस्क्युलर वसा इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला आरटी-क्यूपीसीआर
कंकाल की मांसपेशियों में इंट्रामस्क्युलर वसा गठन और इसके सेलुलर मूल की जांच करने के लिए एक गाइड
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Johnson, C. D., Zhou, L. Y., Kopinke, D. A Guide to Examining Intramuscular Fat Formation and its Cellular Origin in Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (183), e63996, doi:10.3791/63996 (2022).

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