Summary
Sağlıklı kas dokusunun kas içi yağ ile değiştirilmesi, insan hastalıklarının ve koşullarının belirgin bir özelliğidir. Bu protokol, kas içi yağın nasıl görselleştirileceğini, görüntüleneceğini ve ölçüleceğini ana hatlarıyla belirtir ve kas içi yağ oluşumunun altında yatan mekanizmaların titizlikle incelenmesine izin verir.
Abstract
Fibro-adipojenik progenitörler (FAP'ler), iskelet kası homeostazı ve rejenerasyonu sırasında çok önemli bir rol oynayan mezenkimal stromal hücrelerdir. FAP'lar, moleküler miyofiber iskelesi gibi davranan hücre dışı matrisi oluşturur ve korur. Ek olarak, FAP'lar miyofiber rejenerasyonu için vazgeçilmezdir, çünkü kas kök hücreleri (MuSC'ler) tarafından algılanan çok sayıda faydalı faktör salgılarlar. Bununla birlikte, hastalıklı durumlarda, FAP'lar kas içi yağ ve fibrotik skar dokusunun hücresel kökenidir. Bu yağlı fibrozis, sarkopeni ve Duchenne Musküler Distrofi gibi nöromüsküler hastalıkların bir işaretidir. FAP'ların kas içi yağa neden ve nasıl farklılaştığını belirlemede önemli bir engel, özellikle dondurulmuş doku kesitlerinde, adipositlerin etkili bir şekilde korunması ve daha sonra görselleştirilmesidir. Çırpınarak dondurma gibi geleneksel iskelet kası dokusu işleme yöntemleri, bireysel adipositlerin morfolojisini uygun şekilde korumaz, böylece doğru görselleştirme ve nicelleştirmeyi önler. Bu engelin üstesinden gelmek için, iskelet kası bölümlerinde adiposit morfolojisini koruyan, kas içi yağın görselleştirilmesine, görüntülenmesine ve nicelleştirilmesine izin veren titiz bir protokol geliştirilmiştir. Protokol ayrıca, RT-qPCR için kas dokusunun bir kısmının nasıl işleneceğini de özetleyerek, kullanıcıların adipojenik genlerin ekspresyonundaki farklılıkları görüntüleyerek yağ oluşumunda gözlenen değişiklikleri doğrulamalarını sağlar. Ek olarak, kas örneklerinin tamamen monte immünofloresansı ile adipositleri görselleştirmek için uyarlanabilir. Son olarak, bu protokol, FAP'ların adipojenik dönüşümünü incelemek için Pdgfrα eksprese eden FAP'ların genetik soy izlemesinin nasıl yapılacağını özetlemektedir. Bu protokol, RT-qPCR ile doğrulanması ile birlikte, adipositlerin yüksek çözünürlüklü ve morfolojik olarak doğru immünofloresan görüntülerini tutarlı bir şekilde verir ve kas içi yağın sağlam, titiz ve tekrarlanabilir görselleştirmesine ve miktarına izin verir. Birlikte, burada açıklanan analiz boru hattı, FAP'ların kas içi yağa nasıl farklılaştığına dair anlayışımızı geliştirmenin ilk adımıdır ve yağ oluşumunu önlemek için yeni müdahaleleri doğrulamak için bir çerçeve sağlar.
Introduction
Sağlıklı kas dokusunun yağlı fibrozis ile infiltrasyonu, Duchenne Kas Distrofisi (DMD) ve diğer nöromüsküler hastalıkların yanı sıra sarkopeni, obezite ve diyabetin belirgin bir özelliğidir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Bu koşullarda artan yağ infiltrasyonu, azalmış kas fonksiyonu ile güçlü bir şekilde ilişkili olmasına rağmen, kas içi yağ formlarının neden ve nasıl oluştuğuna dair bilgimiz hala sınırlıdır. FAP'lar, iskelet kası11,12 dahil olmak üzere çoğu yetişkin organda bulunan multipotent bir mezenkimal stromal hücre popülasyonudur. Bununla birlikte, yaşla birlikte ve kronik hastalıklarda, FAP'lar fibrotik skar dokusu üretir ve bireysel miyolifler arasında bulunan ve kas içi yağ 13,14,15,16,17,18,19,20 oluşturan adipositlere farklılaşır.
Kas içi yağ oluşumu ile mücadeleye başlamak için, FAP'ların adipositlere nasıl dönüştüğünün mekanizmalarının tanımlanması gerekir. PDGFRα, 13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27 numaralı birden fazla türün kasındaki FAP'ları tanımlamak için alandaki "altın standart" belirteçtir. Sonuç olarak, Pdgfrα promotorunun kontrolü altında birkaç murin tamoksifen ile indüklenebilir Cre hattı üretildi ve Cre-LoxP sistemi27,28,29 kullanılarak FAC'ların in vivo olarak genetik olarak manipüle edilmesine izin verildi. Örneğin, bu indüklenebilir Cre çizgisini genetik bir muhabirle birleştirerek, FAP'ların soy takibi yapılabilir, bu strateji kas ve beyaz yağ dokusundaki kader haritası FAP'larına başarıyla uyguladığımız bir strateji20,30. Soy çizgisi izlemenin yanı sıra, bu Cre çizgileri FAP'tan yağa dönüşümü incelemek için değerli araçlar sağlar.
FAP'ların kas içi yağa adipojenik dönüşüm mekanizmasını tanımlamadaki en büyük engellerden biri, farklı koşullar altında oluşan kas içi yağ miktarını titizlikle ve tekrar tekrar ölçme yeteneğidir. Anahtar, kas ve yağ dokusunun korunmasını dengelemek ve bunu adipositleri görselleştirmek için mevcut boyama yöntemleriyle eşleştirmektir. Örneğin, iskelet kası genellikle önceden fiksasyon yapılmadan dondurulur, miyolifleri korur ancak adiposit morfolojisini bozar (Şekil 1). Buna karşılık, fiksasyonun ardından parafin gömülmesi, adipositler de dahil olmak üzere en iyi doku histolojisini sergilerken, tüm lipitleri uzaklaştırır, böylece yaygın olarak kullanılan boya Yağı Kırmızı O gibi çoğu lipofilik boyayı kullanılamaz hale getirir.
Şekil 1: Anlık dondurulmuş ve sabit kas dokularındaki kas içi yağın temsili görüntüleri . (A) Deney düzeneğine şematik genel bakış. Hem (B) dondurulmuş hem de (C) gliserol hasarından sonraki 21 günde sabit TA'larda adipositleri (sarı), miyolifleri (gri) ve çekirdekleri (camgöbeği) gösteren immünofloresan görüntüler. Ölçek çubukları: 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Burada açıklanan protokol miyofiber ve adiposit morfolojisini korur ve çoklu hücre tiplerinin görselleştirilmesine ve analizine izin verir. Bu yaklaşım, paraformaldehit (PFA) ile sabitlenmiş kas dokusundaki adipositlerin immünofloresan boyamasına dayanır ve bu da çoklu antikorlarla birlikte boyanmaya izin verir. Ayrıca, tam montajlı görüntüleme kullanılarak sağlam dokudaki kas içi yağın mekansal olarak görüntülenmesi için kolayca uyarlanabilir, böylece kas içindeki yağın hücresel mikro ortamı hakkında bilgi sağlar. Ek olarak, bu protokol, kas sağlığını değerlendirmek için önemli bir ölçüm olan sabit kas dokularındaki miyoliflerin kesit alanını belirlemek için yakın zamanda yayınlanan yaklaşımımızla birleştirilebilir31. Bu yaklaşımı, FAP'ların adipositlere farklılaşmasını kader haritalamak için genetik soy izleme ile birleştirmek de burada özetlenmiştir. Bu nedenle, burada açıklanan çok yönlü protokol, FAP'ların titiz ve tekrarlanabilir bir şekilde değerlendirilmesini ve doku kesitlerinde ve bozulmamış dokularda kas içi yağa farklılaşmasını sağlar.
Şekil 2: Şematik protokole genel bakış. TA'nın üçte birinin çıkarıldığı, çırpıda dondurulduğu ve RT-qPCR aracılığıyla sonraki RNA izolasyonu ve transkripsiyon analizi için homojenize edildiği doku işlemeye şematik genel bakış. TA'nın diğer üçte ikisi PFA'ya sabitlenir ve dondurulmuş kesitler veya tam montajlı lifler üzerinde immün boyama için işlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Tüm hayvan protokolleri, Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. FAP'ların genetik soy takibi
NOT: FAP'ların genetik soy takibi istenmiyorsa, adım 1 atlanabilir.
- FAP'ların soy çizgisi izlemesini gerçekleştirmek için, gerekli fare alellerini edinin.
NOT: Pdgfrα promotorunun kontrolü altında, Hogan29, Rando27 ve Bergles32 laboratuvarları da dahil olmak üzere FAP'ları başarılı bir şekilde hedeflemek için çeşitli tamoksifen kaynaklı Cre hatları üretilmiştir. Cre aktivitesinin genetik bir muhabiri olarak, Rosa26 EYFP33 gibi çok sayıda Rosa26 muhabir aleli mevcuttur. Her laboratuvarın hangi Cre-Reporter kombinasyonunun en etkili olduğunu belirlemesi önerilse de, Pdgfrα CreERT2 farelerini (29 ve Jax # 032770) Rosa26EYFP (33 ve Jax # 006148) muhabirine geçerek, ortaya çıkan PdgfrαCreERT2; Rosa26EYFPfareleri, FAP20'yi verimli ve özel olarak işaretlemek için kullanılabilir. Olgun FAP'ların kaderini izlemek için, tamoksifen uygulamadan önce farelerin en az ~ 10 haftalık olana kadar beklemeniz önerilir. Soy izleme deneyleri hem erkekler hem de kadınlar üzerinde yapılabilir. - Oral gavaging yoluyla tamoksifen uygulaması
- Mısır yağında 40 mg / mL tamoksifen hazırlayın ve gavagingden 1 gün önce karıştırmak için iyice vorteks yapın. O/N'yi 37 °C'de döner hibridizasyon fırınında inkübe edin.
DİKKAT: Tamoksifen bir kanserojendir ve dikkatli kullanılmalıdır. Kullanırken daima eldiven giyin ve toz olarak tartarken maske takın, çünkü solunması tehlikesi vardır. - Alanı protokole göre temizleyin ve 1 mL'lik bir şırıngaya bir gavaging iğnesi takın. Şırıngaya 200 μL tamoksifen çekin.
- Scruff PdgfrαCreERT2 ; Rosa26EYFP fareleri (10 haftalık; her iki cinsiyet de kullanılır) düz bir yüzeye yerleştirerek ve kuyruğun tabanını sıkıca kavrayarak. Farenin ortasını başparmak ve işaret parmağıyla kavramak için serbest bir el kullanın, ardından hafifçe ve hafif bir basınçla omuzları geçene kadar tutuşu kaydırın.
- Cildi başparmak ve işaret parmağıyla geri sıkıştırın, fareyi alın ve eli fare kullanıcıya bakacak şekilde çevirin ve kuyruğu fareyi tutan elin pembemsi ve yüzük parmağı arasına sıkıştırın.
- Bu noktada, farenin iyi hareketsiz olduğundan ve başını veya kollarını hareket ettiremediğinden emin olun. Gavaging iğnesini ağzınıza yerleştirin ve farenin başını hafifçe geriye doğru eğmek için kullanın; bu, yemek borusunun daha iyi erişilebilir olmasını sağlar.
- İğneyi dikkatlice ve yavaşça yemek borusuna yerleştirin. Herhangi bir direnç karşılaşılırsa iğneyi zorlamayın; iğne kolayca aşağı kaymalıdır. Tamoksifeni yavaşça enjekte edin. Gavaging sırasında herhangi bir sorun oluşmadığından emin olmak için fareleri 15-20 dakika boyunca izleyin.
NOT: Tamoksifenin art arda 2 günde uygulanması tipik olarak herhangi bir olumsuz etkiye neden olmadan FAP'ların ~% 75 -% 85 rekombinasyon verimliliği ile sonuçlanır. Kullanıcının yaralanmaya neden olmadan önce 1-2 hafta beklemesi önerilir, bu da kalan tamoksifenin sistemden çıkarılmasına ve kalan proteinin döndürülmesine izin verecektir.
- Mısır yağında 40 mg / mL tamoksifen hazırlayın ve gavagingden 1 gün önce karıştırmak için iyice vorteks yapın. O/N'yi 37 °C'de döner hibridizasyon fırınında inkübe edin.
2. Tibialis anterior (TA) kas yaralanması
NOT: Kas içi yağları incelemek için, gliserol bazlı bir yaralanma modeli (steril salinde %50 gliserol) kullanılması önerilir, bu da masif kas içi yağ oluşumu34,35,36,37 ile sonuçlanır.
- İzofluran ekleyerek ve hem fare odasına hem de burun konisine tüplerin açık olduğundan emin olarak anestezi makinesini hazırlayın. Odayı ve çalışma alanını% 70 etanol veya peroksit çözeltisi ile temizleyin (protokollere bağlı olarak).
- Oksijen akış hızını 2,5 L/dak'ya ve izofluran konsantrasyonunu %2,5'e ayarlayın. Anestezi odasına bir fare yerleştirin ve anestezi altına alınması için ~ 5 dakika bekleyin.
- Fareyi sırtüstü yatarak temiz bir ısıtma yastığına yerleştirin ve burnu burun konisine yerleştirin. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için veteriner oftalmik merhemini pamuk uçlu bir aplikatör ile gözlere nazikçe uygulayın. Anesteziyi sürekli izleyin ve farenin tamamen anestezi altına alındığından emin olmak için yaralanmadan önce fareye ayak parmağınızı sıkıştırın.
- Dezenfekte etmek için enjekte edilecek bacağı taze bir alkollü mendille temizleyin.
- İnsülin şırıngasına 30-50 μL% 50 gliserol (farelerin boyutuna bağlı olarak) çekin. TA'nın yerini ortaya çıkarmak için saçları hafifçe fırçalayın.
NOT: Alkollü mendilden hala ıslakken saçı hareket ettirmek ve daha iyi görselleştirme elde etmek daha kolaydır. - TA'yı bulduktan sonra (tibiaya hemen yanal, deriden hafifçe çıkıntı yapar ve nazik palpasyonla hissedilebilir), iğneyi ayak bileğinin yakınında, distal olarak TA'ya yerleştirin. İğneyi kasın içine tamamen yerleştirin ve yavaşça gliserol enjekte ederken, iğneyi yavaş yavaş geri çekin, bu da kasın çoğuna zarar vermeye yardımcı olur.
NOT: İğneyi bacağa paralel olarak, sadece hafifçe yükseltilmiş bir açıyla yerleştirmek en iyisidir. İyi bir yaralanma tipik olarak dorsifleksiyona neden olur, çünkü TA iğneyi çektikten sonra büzülür. Farenin ayak parmakları yayılmışsa, ekstansör digitorum longus (EDL) kasının enjekte edilmiş olması muhtemeldir. - Fareyi tekrar kafese yerleştirin ve anestezi iyileşmesini sağlamak için yaklaşık 15-20 dakika boyunca izleyin.
- İğneyi keskin bir kaba atın. Asla bir iğneyi özetlemeyin.
NOT: Gliserol enjeksiyonu sonrası analjezi, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandığı şekilde sağlanmalıdır. Adipositler yaralanmadan 5 gün sonra (dpi) gözlenebilir. 7 dpi ile, tüm adipositler oluşmuş ve 21 dpi ile tamamen olgunlaşmışlardır.
3. Doku hasadı
- 1x PBS'de% 4 PFA hazırlayın ve hasada başlamadan önce buzun üzerine yerleştirin.
- Buz üzerine kas fiksasyonu için kullanılan herhangi bir plakayı (12 veya 24 kuyucuk) yerleştirin ve her bir kuyucuğa% 4 PFA ekleyin, böylece her bir kuyucuğun sabitlenen dokudan 10-20 kat daha fazla PFA hacmine sahip olduğundan emin olun.
- Gliserol hasarından 7 ila 21 gün sonra, fareyi Kurumsal kılavuzlara göre ötenazi yapın (yani, izofluran doz aşımı ve ardından servikal çıkık).
- Histoloji veya RNA izolasyonu için kullanılacak dokuları toplamaya başlayın.
NOT: Dokular fedakarlıktan sonraki 10-15 dakika içinde çıtçıtlı dondurulmalı veya PFA'ya yerleştirilmelidir (Şekil 2). - Saçları diseksiyon alanından ve aletlerden uzak tutmaya yardımcı olmak için farenin kesilecek herhangi bir alanına% 70 etanol ile serbestçe püskürtün.
- Pelvisin yakınında, bacağın üst kısmındaki cildi kesmek için makas kullanın (Şekil 3A).
- Bacağın derisini yukarıdan aşağıya doğru yavaşça ayak bileğine doğru çekin (Şekil 3B).
NOT: TA, medial çivi yazısı ve ilk metatarsal kemiğe bağlanan açıkça tanımlanmış bir distal tendona sahip gözyaşı damlası şeklinde bir kastır. Tibiaya yanaldır ve alt dize kadar uzanır. - İlk olarak, TA'yı hasat etmeden önce keskin uçlu cımbız kullanarak dış bağ dokusu tabakasını (epimisyum) çıkarın (Şekil 3C). Epimisyumu daha iyi görselleştirmek için diseksiyon mikroskobu kullanın.
- TA'nın altındaki cımbızı kasın altından distal tendondan başlayarak kaydırın ve yavaşça dize doğru yukarı doğru çekin (Şekil 3D). Kasın sonunda durun; alt dizde hissedilen direnci geçmeyin.
- Alt diz seviyesine ulaşmadan önce önemli bir direnç varsa, artık bağ dokusu katmanlarını durdurun ve çıkarmaya devam edin.
NOT: TA'ya yanal ince bir kas olan EDL'ye bağlanan TA tendonunun hemen yanında başka bir distal tendon vardır. Cımbızları sadece TA tendonunun altına kaydırmaya dikkat etmek, EDL'nin yanlışlıkla toplanmasını önler, ancak fiksasyondan sonra kolayca çıkarılabilir. - TA, cımbızla bacaktan kısmen kaldırıldıktan sonra, TA'nın alt dize bağlantısını kesmek için aynı hareketi bir neşterle kullanın (Şekil 3E). TA'yı tamamen çıkarmak için ayak bileğindeki tendonu makasla kesin. Liflere zarar vermemek için sadece tendondaki kası tutun.
- TA'nın 1/3'ünü tendonun karşısındaki uçta kesin (Şekil 3F), bir mikrosantrifüj tüpüne koyun ve sıvı azota düşürerek dondurun (Şekil 3H).
- Dokunun diğer 2 / 3'ünü histoloji için% 4 PFA ile etiketlenmiş bir kuyuya batırın (Şekil 3I). İlk ve son dokunun fiksatif olarak ne zaman yerleştirildiğini takip ettiğinizden emin olun. 4 °C'de 2-2,5 saat çalkalayıcıya yerleştirin.
- Fiksasyon süresi dokuya ve büyüklüğüne bağlıdır. Dokuları sabitlemek için gereken süreyi belirleyin. TA'ların 4 ° C'de 2-2.5 saat boyunca sabitlenmesi tipik olarak dokunun aşırı fiksasyonuna neden olmadan adiposit morfolojisini iyi korur.
NOT: TA'yı tam montajlı immünofloresan boyama için kullanmayı planlıyorsanız, Bölüm 7'ye ulaşana kadar bu protokolün geri kalanını atlayın: "Tüm Mount İmmünofloresan Boyama". - Fiksasyondan sonra, PFA'yı kuyucuklardan çıkarın, dokuları soğuk 1x PBS ile 2-3 kez durulayın ve ardından yıkama başına 5 dakika boyunca soğuk 1x PBS ile 2-3 kez yıkayın.
- PBS'yi kuyucuklardan çıkarın ve dokunun yüzmesine izin vermek için 1x PBS'ye yeteri kadar% 30 sakkaroz ekleyin. Çalkalayıcıya gece boyunca 4 ° C'de yerleştirin.
Şekil 3: Doku hasadı özeti . (A) Deri bacağın tabanında kesilir ve (B) arka ekstremite kasları açığa çıkar. (C) Epimisyum TA'dan çıkarıldıktan sonra, (D) forseps kası kısmen ayırmak ve epimisyumun tamamen çıkarılmasını sağlamak için kullanılır. (E) TA, bacaktan neşterle kesilir ve tendon kesildikten sonra çıkarılır. (G) TA'yı üçte bir ve üçte iki parçaya kestikten sonra, (H) üçte biri RT-qPCR analizi için sıvı azotta dondurulur ve (I) diğer üçte ikisi histoloji için% 4 PFA'da sabitlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Katıştırma
- Gömme için kullanılacak numune kalıplarını, dokuları tamamen suya batırmak için yeterli gömme ortamı ile etiketleyerek ve doldurarak hazırlayın.
- Kuyucuklardan mendilleri çıkarın, fazla sakarozu bir kağıt havlu üzerinde kurutun ve dondurucu orta dolgulu numune kalıplarına geçin.
NOT: Kalıbın kriyostat üzerinde hangi yönde bölümleneceğini bilmek yararlıdır. Bu sayede kullanıcı kalıptaki dokuları ilgi alanına kolayca ulaşılmasını sağlayacak şekilde yönlendirebilir. TA için bu, en kalın ucu (tendon tarafının karşısında) kesitlenecek yüzeye bakacak şekilde koyarak elde edilebilir. Bu, TA'nın en kalın kısmında (göbek) kolayca kesitlenebilmesini sağlar ve kas liflerinin kesitsel olarak kesilmesine izin verir. - İzopentan tutan bir kabı kısmen sıvı azota batırarak bir isopentan bulamacı hazırlayın. Kapta, dokuları gömmek için kullanılacak numune kalıbının yaklaşık yarısını batırmak için yeterli sıvı isopentan bulunduğundan emin olun.
- Kalıpları dikkatlice isopentan bulamacına koyarak ve kalıbın yaklaşık yarısının suya batırıldığından emin olarak dondurmaya başlayın. Ayrıca, kalıbın dört taraftan da eşit şekilde donduğundan emin olun.
- Tüm kalıp üstten gözle görülür şekilde dondurulmadan hemen önce kalıbı isopentandan çıkarın. Bunun ne kadar süreceği, kullanılan kalıplara bağlıdır.
- Dondurulmuş kalıpları, blokların geri kalanını dondururken kuru buzlu bir kapta saklayın, ardından -80 ° C'de saklayın.
NOT: Donma için isopentan tekrar kullanılabilir. Bir cam şişeye koyun, ancak isopentan oda sıcaklığına (RT) ulaşana kadar kapağı sıkmayın. Aksi takdirde, basınçtaki değişiklik şişeyi parçalayabilir.
5. Bölümleme
- Kriyostatı -22 ila -24 ° C'ye ayarlayın, kriyostata TA'lar içeren kalıplar ekleyin ve sıcaklık iklimlendirmesi için en az 30 dakika bekleyin. Bu arada, bir dizi pozitif yüklü mikroskop slaytını etiketleyin.
- Bir anti-roll plaka yerleştirin ve kriyostat'a, numune bloğuyla temas ettiği plakada minimum çentik olacak şekilde hizalayın. Yerinde emniyete alın.
- Bıçak tutucuya yeni bir kriyostat bıçağı yerleştirin ve yerine sabitleyin.
DİKKAT: Bıçak keskindir. Kriyostatın veya donmuş kalıpların diğer kısımlarını manipüle ederken bıçağı örtün. - Donmuş bloğu kalıptan çıkarın. Kriyostat mandrene düzgün bir gömme ortamı tabakası ekleyin ve bloğu ortama yerleştirin. Gömme ortamı tamamen donana kadar 1-3 dakika bekletin (opak beyaz).
NOT: TA'lar için, en kalın alan (göbek) mandren üzerindeyken görünür olmalıdır. - Kriyostat mandrenini doku bloğu ile kriyostatın içine yerleştirin. Bıçağı ortaya çıkarın ve kriyostatı bıçakla temas edene kadar ileri doğru ilerletin. Doku artık gömme ortamı tarafından gizlenmeyene kadar 25 μm kesitlerde blok boyunca kesitleyin.
NOT: Bölümleme sırasında, kriyostatın açısını ve / veya sahnenin konumunu, bölümler eşit kalınlıkta olacak şekilde ayarlayın. Kesit kalınlığında homojenliği sağlamak için birkaç bölüm toplamak yararlı olabilir. Kullanıcının, TA (göbek) içindeki ilgili bölgeye doğru bölümlemeden önce uygun yuvarlanma önleyici plaka konumunu bulması önerilir, çünkü bu, kullanıcının bölümler doku israf etmeden düz bir şekilde çıkana kadar yuvarlanma önleyici plakanın birkaç konumunu denemesine izin verir. - Bölüm kalınlığını 10-12 μm'ye değiştirin ve bölümleri etiketli mikroskop slaytlarında toplayın. Seri kesitleme, bitişik bölümlerin 6-10 slaytta (1-x etiketli) toplanmasıyla önerilir, bu da birden fazla işaretleyici için lekelenmeye izin verir. Gerekirse, bölümleri slaytta toplamadan önce açmak için ince bir fırça kullanın.
NOT: Kesitler kıvrılıyorsa, sıcaklığın -22 ila -24 °C aralığında sabit kaldığını kontrol edin. Bölümlerde dikey çizgiler varsa, bunun nedeni yuvarlanma önleyici plakadaki veya bıçaktaki bir çentik olabilir; bu, yuvarlanma önleyici plakanın konumunu ayarlayarak ve/veya yeni bir bıçağa geçerek düzeltilebilir. - Aynı kesit düzleminin bitişik bölümlerini her slaytta topladıktan sonra, blok boyunca 150-200 μm ilerlemek için kalınlığı tekrar 25 μm'ye ayarlayın, ardından kalınlığı tekrar 10-12 μm'ye ayarlayın ve tekrar bölümlemeye başlayın.
NOT: Bu seri bölümleme, kullanıcının TA aracılığıyla farklı derinliklerde görselleştirmesine, görüntülemesine ve ölçmesine olanak tanır; slayt başına üç ila dört seri bölüm yeterlidir. - Slaytları ve doku bloklarını -80 °C'de saklayın.
6. Doku kesitlerinin immünofloresan (IF) boyanması
NOT: Antikor konsantrasyonları lotlar ve üreticiler arasında değişebildiğinden, ilgili slaytları boyamadan önce test slaytlarındaki antikorların birkaç farklı konsantrasyonunun değerlendirilmesiyle optimizasyon önerilir.
- RT'de veya 37 °C'de sıcak bir plaka üzerinde 10-20 dakika boyunca çözülme/kuru kızaklar.
- Slaytın kağıt yüzeyinin kenarında, camla buluştuğu yerde bir çizgi çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın.
- Slaytları bir Coplin kavanozuna koyun ve doku bölümlerini yeniden sulandırmak için yıkama başına en az 5 dakika boyunca bir çalkalayıcıda 1x PBS +% 0.1 Tween20 (PBST) 3-5x ile yıkayın.
NOT: Bu noktada, slaytların PBST'ye batırılmadan (hidrofobik çizgiye kadar) oturmasına izin vermemek önemlidir, aksi takdirde doku bölümleri kurur. - Slaytları bir nemlendirme odasının rafına yerleştirin ve slaytları RT'de 1-2 saat boyunca 310-350 μL bloke çözeltisi (% 5 eşek serumu ve% 0.3 Triton X-100 1x PBS'de) ile örtün.
NOT: Ekstra geçirgenlik adımına gerek yoktur, çünkü bloke edici çözelti doku kesitlerinin yeterli geçirgenliğine izin veren% 0.3 Triton X-100 içerir. Farelerden türetilen birincil antikorları (yani, aşağıda listelenen PAX7 ve MYOD1) kullanırken, engelleme adımı için engelleme çözeltisine Fab parçaları (1:50) kullanarak fare üzerinde fare engelleme adımı eklemeniz önerilir. Bu, fare sekonder antikorunun primer dışındaki antikorlara spesifik olmayan bağlanması nedeniyle arka planın azaltılmasına yardımcı olacaktır. - Bir sonraki adıma geçmeden kısa bir süre önce bloke edici çözeltide kullanılacak birincil antikorları aşağıdaki gibi seyreltin:
- Adiposit boyama ve tüm kesit görüntüleme için birincil antikorlar: Tavşan anti-Perilipin'i 1:1000 seyreltme oranında seyreltin.
- Adipositlerin soy takibi için birincil antikorlar: Tavuk anti-GFP'sini 1:1000 oranında ve tavşan anti-Perilipin'i 1:1000 oranında seyreltin.
- FAP'ların soy takibi için birincil antikorlar: Tavuk anti-GFP'yi 1:1000 oranında ve keçi anti-PDGFRα'yı 1:250 oranında seyreltin.
- Miyojenik belirteçler için birincil antikorlar: Fare anti-PAX7'yi 1:25 oranında veya fare anti-MYOD1'i 1:250'de ve tavşan anti-LAMININ'i 1:1000'de seyreltin.
NOT: Yukarıda listelenen antikorlar bu protokolle başarılı bir şekilde değerlendirilmiş olsa da, FAP'ları, adipositleri ve / veya diğer hücre tiplerini etiketleyen diğer belirteçlerin ve antikorların da bu protokolle uyumlu olması muhtemeldir. Birincil antikorları ilk kez kullanırken, kullanıcının birincil antikorların atlandığı negatif bir kontrol slaytı içermesi şiddetle tavsiye edilir. Bu, antikorların özgüllüğünü kontrol edecektir. Sekonder antikorların eklenmesi de dahil olmak üzere protokoldeki diğer tüm adımlar izlenir, ancak bloke edici çözeltideki birincil antikor yerine bir sonraki adımda bloke edici çözelti tek başına kullanılır.
- Blokaj çözeltisini slaytlardan boşaltın ve birincil antikorlarla 310-350 μL bloke çözeltisi ile örtün ve nemlendirme odasında gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, bloke edici çözeltiyi / birincil antikorları slaytlardan boşaltın ve bir Coplin kavanozuna yerleştirin. Slaytları PBST ile 2-3 kez durulayın ve yıkama başına en az 5 dakika boyunca bir çalkalayıcıda PBST ile 3-5x yıkayın.
- Son yıkama sırasında, ikincil antikorları veya blokaj çözeltisinde kullanılacak herhangi bir doğrudan konjugatı hazırlayın. Fotobeyazlatmayı önlemek için bu antikorların ışıkta geçirdiği süreyi en aza indirin.
- Sekonder antikorları/doğrudan konjugatları seyreltin: 488 nm eşek anti-tavuk (1:1000) veya tavşan karşıtı (1:1000) veya fare karşıtı (1:1000), 568 nm eşek anti-keçi (1:1000) veya anti-tavşan (1:1000) veya Phalloidin (miyofiberler; 1:100), DAPI boyası (çekirdekler; 1:500).
- Kızakları, nemlendirme odasında ikincil antikorlar ve / veya doğrudan konjugatlarla bloke edici çözeltinin 310-350 μL'si ile örtün. RT'de 1-2 saat boyunca inkübe edin. Örnekleri şu andan itibaren ışıktan koruyun.
- Bloke edici çözeltiyi / ikincil antikorları boşaltın ve bir Coplin kavanozuna yerleştirin. PBST ile bir kez durulayın ve yıkama başına en az 5 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde PBST ile 3-5x yıkayın. Işığa maruz kalmayı önlemek için Coplin kavanozunu kapalı tutun.
- Kenarlara dokunarak ve sırtı bir kağıt havluya karşı silerek slaytları mümkün olduğunca kurutun, ancak mendil bölümlerinin kurumasına izin vermeyin.
- Kızağın üst yatay kenarına üç veya dört damla sulu montaj ortamı ekleyin ve yavaşça bir kapak kayması ekleyin. Kapak kaymasının altında hava kabarcıkları oluşursa aşağı bastırmayın veya hareket etmeyin; herhangi bir basınç veya hareket, adipositlerin kırılgan hücresel mimarisini bozabilir.
- Görüntülemeden önce montaj ortamının gece boyunca karanlıkta kalmasına izin verin.
7. Tam montajlı immünofloresan boyama
- ~ 1 saatlik fiksasyondan sonra (bkz. adım 3.14), sabit TA'dan miyolifleri soymak için keskin uçlu cımbız kullanın.
- Ayrılan lifleri 24 delikli bir tabağa yerleştirin ve PBST ile her biri 3 dakika boyunca 3 kat yıkayın. Sonraki tüm inkübasyonlar için, buharlaşmayı önlemek için kapağı eklediğinizden emin olun.
- Antikorların daha iyi penetrasyonunu sağlamak için bir çalkalayıcıda RT'de (200-300 μL) 1x PBS'de% 1 Triton X-100'de 1 saat boyunca inkübe edin.
- PBST ile birkaç kez duruladıktan sonra, blokaj çözeltisi (200-300 μL) ile örtün ve 4 ° C'de gece boyunca bir nutator veya çalkalayıcı üzerinde bloke edin.
- Blokaj çözeltisinde birincil antikorları istenen konsantrasyonda seyreltin (konsantrasyonun iki katına çıkarılması iyi bir başlangıç noktası olma eğilimindedir). Numuneleri (200-300 μL) bir nutator veya çalkalayıcı üzerinde gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Numuneleri gün boyunca PBST ile titizlikle yıkayın, çalkalayıcıdaki RT'de sık sık değişiklik yapın, her yıkamada 30-60 dakika boyunca yaklaşık 4-6x.
- Blokaj çözeltisindeki ikincil antikorları istenen konsantrasyonda (1:500 iyi çalışma eğilimindedir) artı nükleer boyama ile seyreltin ve numuneleri (200-300 μL) 4 ° C'de gece boyunca bir nutator veya çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
- Numuneleri çalkalayıcıdaki RT'de sık sık değişikliğe uğrayarak gün boyunca PBST ile titizlikle yıkayın, her yıkamada 30-60 dakika boyunca yaklaşık 4-6x kez veya gece boyunca 4 ° C'de yıkayın.
- Monte etmek için, fazla PBST'yi nazikçe kurutun ve ardından lifleri bir cam slayt üzerinde bir veya iki damla montaj ortamına yerleştirin (Şekil 4A). Kapak kaymasını (18 mm x 18 mm) yükseltmek için küçük kil ayaklar ekleyin; bu, liflerin ezilmesini önleyecek ve kapak kaymasını slayta sabitleyecektir. Modelleme bileşikleri bunun için iyi çalışır. Kapak kayması sabitlendikten sonra, kapak kaymasının altındaki alan dolana kadar kenara daha fazla orta ekleyin.
NOT: Solma önleyici ajanlar içeren bir montaj ortamı kullanmak yerine, doku yükselen bir gliserol serisinden (PBS'de% 30 ila% 80 gliserol) de hareket ettirilebilir. - Montaj ortamının kürlenmesini sağlamak için görüntülemeden önce 1-2 gün bekleyin.
8. Kas içi yağın görüntülenmesi
- Mikroskobu açın ve görüntüleme yazılımını başlatın. Slaytı sahne alanında sabitleyin.
NOT: Kas kesitlerindeki adipositleri görüntülemek için, geniş alan mikroskobu ile kombine edilmiş 5x veya 10x objektif genellikle yeterlidir. WM-IF'yi görselleştirmek için bir konfokal mikroskop gereklidir. - Görüntülenecek alanı tanımlamak için herhangi bir kanalı kullanın.
- Görüntüleme yazılımında, her kanal için kazanç ve pozlama süresini ayarlayın.
- Her kanaldaki tüm dokunun görüntülerini alın (mikroskop ve kullanılan yazılıma göre otomatik veya manuel) ve tam TA kesitinin bir bileşimini oluşturmak için tek tek karoları birleştirin.
NOT: Aynı TA'nın iki veya üç farklı bölümünün görüntülerini farklı derinliklerde çekmeniz önerilir. Her bölümdeki adipositleri ölçerek ve daha sonra ortalamayı bildirerek, örneğin enjeksiyon hatalarından dolayı kas içi yağ miktarındaki lokalize farklılıklardan kaçınılacaktır.
9. Adipositlerin nicelleştirilmesi
- Daha önce yüklenmemişse, Hücre Sayacı eklentisini ImageJ'ye (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html) ekleyin.
- Görüntüleri ImageJ'ye TIF dosyaları veya orijinal mikroskop dosyaları olarak aktarın. ImageJ'deki her kanalı ayrı bir TIF dosyası olarak görüntüleyin.
NOT: LIF veya benzeri mikroskop dosyası türleri kullanılıyorsa, Biyolojik Biçimler İçe Aktarma seçenekleri altında, Yığını Birlikte Görüntüle için Köprü Yığını'nı seçin ve Kanalları Böl kutusunu işaretleyin. Dosyayı açmak için Tamam'ı tıklatın. Ayrıca, Otomatik Ölçeklendirme kutusunun işaretli olmadığından emin olun. - Her kanalın görüntülerinin 8 bit biçiminde (ve gri) olduğundan emin olun: Görüntü > > 8 bit yazın.
- DAPI (mavi), GFP (yeşil), PERILIPIN (kırmızı) ve PHALLOIDIN (gri) görüntüleri birleştirme: Görüntü > Renk > Kanalları Birleştirme.
- Ölçeğin (Analiz > Kümesi Ölçeği) mikron cinsinden olup olmadığını kontrol edin. Serbest seçim aracını kullanarak, her kesitin yaralı ve yaralanmamış kısmını ana hatlarıyla belirtin, ardından ölçün (Analiz > Ölçüm) ve yaralı ve yaralanmamış alanı bir elektronik tabloya kaydedin.
NOT: Yaralı kas, miyoliflerden yoksun alanlar veya merkezi olarak yerleştirilmiş çekirdekler içeren miyoliflerin doldurduğu alanlar olarak tanımlanabilir. - Hücre sayacını başlat: CellCounter> eklentileri başlatmak >.
- Bir sayaç türü seçin, ardından her adipositi sayın. Toplam adiposit sayısını bir elektronik tabloya kaydedin, ardından yaralı alanın 1mm2'si başına adiposit sayısını hesaplayın.
10. RT-qPCR kullanılarak adipojenik gen ekspresyon analizi
- RNA İzolasyonu
- Başlamadan önce, RNaz içermeyen suyu önceden 45 ° C'ye ısıtın ve taze% 70 EtOH (numune başına 350 μL) hazırlayın.
- Numuneyi içeren her tüpe 1.000 μL guanidium tiyosiyanat ekleyin (bkz. adım 3.12.). Boncuk çırpıcı onaylı tüplerin kullanılması önemlidir.
DİKKAT: Guanidium tiyosiyanat toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve bir duman başlığı içinde tutun. - Her tüpe üç orta boy boncuk veya bir büyük ve bir küçük boncuk ekleyin.
- Bir boncuk çırpıcı kullanarak dokuyu 50 Hz'de 2-4 dakika homojenize edin. Doku tipine ve numune büyüklüğüne bağlı olarak, 10 dakika kadar sürebilir.
- 200 μL kloroform ekleyin.
DİKKAT: Kloroform toksiktir. Kişisel koruyucu ekipman giyin ve bir duman başlığı içinde tutun. - Örnekleri 15 s boyunca çalkalayın. RT'de 2-3 dakika kuluçkaya yatırın.
- 12.000 x g'da 15 dakika santrifüj. Şeffaf süpernatantın (RNA'yı içeren üst tabaka) 350 μL'sini pipetle çıkarın ve 350 μL% 70 etanol içeren yeni bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Alt protein ve / veya DNA katmanlarını aspire etmemeye dikkat edin
- 700 μL'ye kadar karışımı, 2 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirilmiş bir mini spin kolonuna aktarın. Üreticinin talimatlarını izleyerek RNA izolasyonu ile devam edin.
- Beklenen verime bağlı olarak 30-50 μL RNaz içermeyen su ile sültü. RNA'yı buz üzerinde tutun ve bir spektrofotometre kullanarak verimi ölçün. RNA'yı -80 °C'de saklayın
NOT: DNaz tedavi adımını atlamak mümkündür, çünkü RNA tabakasının sadece üst 350 μL'sini dikkatlice çıkarmak DNA kontaminasyonunu önlemede yeterlidir. RT-qPCR analizine ek olarak, izole RNA, RNA dizilimi için de kullanılabilir, bu durumda bir DNaz tedavi adımı şiddetle tavsiye edilir.
- cDNA sentezi
- Üreticinin talimatlarını izleyerek cDNA'yı bir cDNA sentez kiti ile sentezlemek için 1 μg'a kadar RNA kullanın.
- Çalıştırma tamamlandıktan sonra, 80 μL RNaz içermeyen su ekleyin. Numuneleri -20 °C'de saklayın.
- Adiposit seçici genlerin RT-qPCR'si.
- 384 kuyucuklu bir format kullanarak, her bir kuyucuğun dibine 1 μL astar (~ 1 μM nihai konsantrasyon) ekleyin. Ön kurutma astarları daha sıkı teknik kopyalarla sonuçlanır. Astarlar tamamen buharlaşana kadar kapalı bırakın (plaka, buharlaşmayı hızlandırmak için 37 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtma bloğuna yerleştirilebilir).
- Dört ila sekiz teknik replikasyonla numune reaksiyonlarını aşağıdaki gibi ayarlayın: 2.5 μL boya bazlı RT-PCR ana karışımı, 2.1 μL RNaz içermeyen su ve kuyu başına 5 μL toplam hacim ile 0.4 μL cDNA (~ 1 ng). Aşağıdaki termal çevrim koşulları kullanılmıştır: 15 s için 95 ° C'de denatüre etme ve 40 döngü için 25 s için 60 ° C'de tavlama / uzatma.
- Burada açıklandığı gibi ΔΔCT'yi hesaplayarak ham BT (döngü eşiği) değerlerini temizlik genleri (yani Hprt ve Pde12) seviyelerine normalleştirin38. Astar dizileri için20'ye bakınız.
NOT: RT-qPCR analizi için eksi Ters Transkripsiyon (-RT) kontrolü, PCR reaksiyonu ve primer validasyon kullanımı gibi standart uygulamalar izlenmelidir.
Representative Results
Kas içi yağın immünofloresan görselleştirmesi
Yukarıdaki adımları takip ederek ve Şekil 1A'yı görüntüleyerek, TA doku kesitleri, LN2 soğutmalı izopentanda hasattan hemen sonra dondurulmuş veya 2.5 saat boyunca% 4 PFA'da sabitlenmiş olan 21 günlük bir gliserol sonrası yaralanmadan toplanmıştır. Her iki numunenin kriyoseksiyonu ve boyanmasından sonra, görüntüler TA'nın en büyük alanı olan göbek ortasından çekildi. Sabit olmayan TA'lardan elde edilen PERILIPIN + adipositler (Şekil 1B), sabit kesitlere (Şekil 1C) kıyasla morfolojiyi önemli ölçüde değiştirmiş, bu da tanımlamalarını, görselleştirmelerini ve sonraki niceliklendirmelerini çok daha zor ve potansiyel olarak yanlış hale getirmiştir. Not etmek gerekirse, ilk PERILIPIN + lipit damlacıkları yaralanmadan yaklaşık 5 gün sonra tespit edildi ve çoğu adiposit 7. günde oluştu. Yaralanmadan 21 gün sonra, adipositler tamamen olgunlaşmıştı.
TA başına düşen yağ miktarı, indüklenen yaralanmanın ciddiyeti ile güçlü bir şekilde ilişkili olduğundan, kas içi yağ oluşumunu etkili bir şekilde gözlemlemek ve incelemek için TA'lar önemli ölçüde yaralanmalıdır. Kadavra TA'larına mürekkep kullanarak enjeksiyon yapmak, yaralanma şiddetini arttırmanın harika bir yoludur. Başarılı yaralanmalar kasların% 50'sinin üzerinde olma eğilimindedir. Not etmek gerekirse, kasın yaralı bölgeleri, kas liflerinden yoksun alanları veya yenilenen bir kas lifinin bilinen bir özelliği olan en az bir merkezi olarak yerleştirilmiş çekirdek içeren kas lifleri tarafından doldurulan alanları temsil eder.
Bu protokol, FAP'lar ve 3D'deki yağlar için lekelenmeye kolayca uyarlanabilir. Bunun için, TA post-fiksasyonundan çoklu miyofiberler dikkatlice ayrıldı, ardından tam monte immünofloresan izledi. Önemli olan, lifleri cam slayda uygun şekilde sabitlemek ve aynı zamanda dokunun aşırı sıkışmasını önlemektir. Kalıplanabilir kil ayaklar kullanarak, kullanıcı gerekli kalınlığı ayarlayabilir ve kapak kaymasını slayta sabitleyebilir, hatta ters çevrilmiş bir mikroskop kullanımına izin verebilir (Şekil 4A). Bu yöntem PDGFRa+ FAP'ları, Phalloidin+ miyofiberleri ve PERILIPIN eksprese eden adipositleri etiketlemek için başarıyla kullanılmıştır (Şekil 4B, Ek Video 1 ve Ek Video 2). 150 μm kalınlığa kadar uzanan çoklu z-düzlemlerinde görüntüler elde edildikten sonra, mikroskop yazılımındaki 3D oluşturma modülü bir 3D rekonstrüksiyon oluşturmak için kullanıldı.
Şekil 4: Tam montajlı immünofloresan boyama . (A) Numunenin nasıl monte edileceğine ve tam montajlı boyama için kapak kaymasının nasıl ekleneceğine dair üstten ve yandan görünüm. (B) FAP'ların (yeşil; sol) ve adipositlerin (kırmızı; sağ) miyolifler (gri) ve çekirdeklerle (mavi) birlikte temsili 3D rekonstrüksiyonları. Ölçek çubukları: 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Kas içi yağın miktarının belirlenmesi
Kas içi yağın görüntüleri alındıktan sonra, PERLIPIN + adipositlerin sayısını manuel olarak saymak için ImageJ / FIJI'deki Hücre Sayacı fonksiyonu kullanıldı (Şekil 5A). Daha sonra, kas bölümünün toplam alanı ve miyolifler içinde merkezi olarak yerleştirilmiş çekirdekler tarafından tanımlanan yaralı alan belirlendi. Yaralanma şiddetini kontrol etmek için, toplam adiposit sayısı yaralı bölgeye bölündü ve yaralı kasın 1mm2'si başına yağ hücresi sayısı ile sonuçlandı. Genellikle,% <30 yaralanma gösteren TA'lar niceliklerin dışında tutulur. Not etmek gerekirse, adipositler yaralanmadan nadir olmasına rağmen, kesitsel alan başına sıfır ila sekiz arasında değişmekle birlikte, toplam adiposit sayısı hala toplam alana göre normalleştirilmiştir. Şekil 5B'de vurgulandığı gibi, bir gliserol yaralanması, yaralanmamış bir TA kasına kıyasla büyük miktarda kas içi yağa neden olur. Alternatif olarak, Perilipin boyama yüksek sinyal-gürültü oranı ile çok temiz olduğundan, Perilipin tarafından işgal edilen toplam alanı belirlemek için Parçacık Analiz işlevini kullanmak da mümkündür. Bununla birlikte, bu yöntem daha küçük ve daha az adiposit arasında ayrım yapamayacaktır. En az dört bireysel hayvandan üç bölüme kadar görüntüleme ve nicelleştirme yapıldı ve fare başına mevcut ortalama yağ hücresi sayısı bildirildi.
Şekil 5: Kas içi yağın nicelleştirilmesi . (A) ImageJ'deki Hücre Sayacı işlevini kullanarak PERILIPIN + adipositlerin (beyaz) nasıl sayılacağına dair temsili görüntü. Ölçek çubuğu: 50 μm. (B) Gliserol enjeksiyonundan 21 gün sonra tüm TA adiposit miktarları, yaralı bölgenin 1mm2'sine normalleştirilmiştir. Her nokta bir farenin ortalamasını temsil eder. SEM olarak gösterilen hata çubukları. **** = p < 0,0001. (C) RT-qPCR analizi için homojenizasyon ve ardından kloroform ile faz ayırma sonrası RNA tabakası kullanılmaktadır. (D) Pparg ve Cepbα, erken adipojenik genler ve iki olgun adiposit belirteci olan Plin1 ve Adipoq'un ekspresyon seviyelerinde, gliserol hasarından sonra farklı zaman noktalarında katlama değişiklikleri. Her nokta bir farenin ortalamasını temsil eder. SEM olarak gösterilen hata çubukları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Mevcut kas içi yağ miktarını bağımsız olarak doğrulamak için, çeşitli adipojenik belirteçlerin gen ekspresyon seviyeleri belirlenebilir. Bunun için RNA, immünofloresan için kullanılan aynı TA kasının bir kısmından (yukarıdaki adımlara bakın) yaralanma sonrası farklı noktalarda izole edilebilir. Dokuyu homojenize etmek için guanidium thiocyanate ile kombinasyon halinde bir boncuk çırpıcı kullanıldı. Kloroform eklendikten sonra santrifüjleme yapıldıktan sonra, üst RNA içeren tabaka dikkatlice ekstrakte edildi ve RNA temizliği için mini spin kolonları kullanıldı (Şekil 5C). Bu yöntem rutin olarak RT-qPCR ve RNAseq gibi tüm aşağı akış analizleri için uygun yüksek kalitede ve miktarda RNA üretir. RT-qPCR için, adipojenik ila kat hizmetleri genlerinin göreceli ekspresyon seviyeleri belirlendi ve ΔΔCT yöntemi38'i takiben herhangi bir göreceli değişiklik değerlendirildi. Şekil 5D'de açıklandığı gibi, yaralanmamış TA kası ile karşılaştırıldığında, gliserol hasarı, yaralanmadan sonraki 3 gün içinde Pparg ve Cebpα gibi erken adipojenik belirteçlerin ekspresyonunu indükler. Adiponektin (Adipoq) ve Perilipin (Plin1) gibi olgun belirteçler, gliserol hasarından 5 gün sonra tespit edilebilir.
Adipositlerin genetik soy takibi
Burada sunulan adiposit boyama protokolü, FAP'ların genetik soy izlemesini, adipositlere kaderlerini haritalamak ve takip etmek için kolayca uyarlanabilir. Örneğin, daha önce PdgfrαCreERT2'de tamoksifen uygulaması yoluyla rekombinasyonun indüklenebileceğini göstermiştik; Rosa26 EYFP fareleri, yaralanmadan 2 hafta önce, floksed durdurma kodlamasını etkili bir şekilde ortadan kaldırır ve FAP'larda EYFP ekspresyonunu silinmez bir şekilde aktive eder (Şekil 6A). Burada sunulan tamoksifen rejimi ile yüksek rekombinasyon verimlilikleri elde ettik, PDGFRα + FAP'ların ~% 75'i EYFP 20'yi ifade ediyor, diğer laboratuvarların 27,39,40 bildirdiğine benzer şekilde. FAP'ların gerçekten kas içi yağın hücresel kökeni olduğunu gösteren FAP'ların çoğu, gliserol hasarından 7 gün sonra EYF + PERILIPIN eksprese eden adipositlere dönüşmüştür (Şekil 6B).
Şekil 6: FAP'ların soy izlemesi. (A) Deney düzeneğine şematik genel bakış. (B) PDGFRa+ FAP'lar (kırmızı, ok uçları) ve PERILIPIN+ adipositler (kırmızı, yıldız işaretleri) içinde EYFP'nin (sarı) başarılı rekombinasyonunu ve aktivasyonunu gösteren temsili immünofloresan görüntüler. Ölçek çubukları: 25 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Birden fazla hücre tipinin tespiti
Bu protokol miyojenik bölmeyi görselleştirmek için de kullanılabilir. PAX7 ve MYOD1'e karşı antikorlar kullanılarak, sırasıyla kas kök hücreleri (MuSC'ler) ve miyoblastlar, PFA ile sabitlenmiş kas dokusu bölümünde bile gliserol hasarından 5 gün sonra kolayca tespit edilebilir (Şekil 7). Bu nedenle, sunulan protokol çok yönlüdür ve sadece adipositleri ve FAP'ları etiketlemek ve görüntülemek için değil, aynı zamanda miyojenik soyun diğer hücre tiplerine de uyarlanabilir.
Şekil 7: Kas kök hücresi ve miyoblast immünofloresan boyama . (A) Deney düzeneğine şematik genel bakış. (B) PAX7 ile kas kök hücresinin (MuSC) (sarı, sol) ve MYOD1 ile miyoblastların (sarı, sağ) başarılı bir şekilde boyandığını gösteren temsili immünofloresan görüntüler. LAMININ, miyolifleri (beyaz) ana hatlarıyla belirtir ve çekirdekler camgöbeği içindedir. Ölçek çubukları: 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video 1: FAP'ların 3D gösterimi. Yaralanmadan 21 gün sonra sırasıyla PHALLOIDIN (gri), PDGFRα (yeşil) ve DAPI (mavi) için boyanmış miyofiberlerin, FAP'ların ve çekirdeklerin üç boyutlu rekonstrüksiyonu. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Video 2: Kas içi yağın 3D oluşturulması. Gliserol hasarından 21 gün sonra miyolifin yerini alan miyofiber demetlerinin (gri, PHALLOIDIN) ve kas içi yağın (kırmızı, PERILIPIN) hacimsel olarak oluşturulması. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Bu protokol, kas içi yağın verimli bir şekilde görselleştirilmesine ve titizlikle ölçülmesine olanak tanıyan kapsamlı ve ayrıntılı bir protokolü özetlemektedir. Aynı kası, biri immünofloresan diğeri RT-qPCR analizi için kullanılan iki parçaya bölerek, bu protokol aynı zamanda çok yönlüdür. Ayrıca, belirli koşullar altında adipositlere dönüşümlerini incelemek için FAP'ların genetik soy takibi ile birleştirilebilir ve çoklu ek hücre tiplerini etiketlemek ve görüntülemek için oldukça uyarlanabilir.
Kas içi yağları görselleştirmek için en sık kullanılan yollar parafin kesitleri, ardından hematoksilin ve eozin boyama veya Oil Red O (ORO) gibi lipofilik boyalar için boyanmış dondurulmuş kesitlerdir. Bununla birlikte, parafin ile işlenmiş dokular en iyi histolojiyi korurken, aynı işlem lipofilik boyaların kullanımını önleyen tüm lipitleri de çıkarır. Lipofilik boyama yöntemleri hem PFA ile sabitlenmiş hem de sabitlenmemiş doku kesitlerinde işe yarayacak olsa da, lipit damlacıkları kapak kaymasına basınç uygulanarak kolayca yer değiştirir, böylece kas içi yağın uzamsal dağılımını bozar. Bunu atlatmak için, yakın tarihli bir çalışma, ORO + adipositleri bütüne monte bir yaklaşım kullanarak görselleştirmek için titiz bir protokol oluşturdu. Bunun için yazarlar, kas içi yağın tüm TA41 boyunca uzamsal dağılımını görselleştirmek için TA'yı hücreselleştirdiler. Bu teknik ne kadar güçlü olursa olsun, ek hücresel yapıları işaretlemek için diğer ko-lekelerin kullanılmasını da önler. Burada sunulan tüm montaj immünofloresan yaklaşımı, hücresel ortamın ince haritalanmasına izin veren çeşitli belirteçlerle adipositleri birlikte boyamak için kullanılabilir. Bununla birlikte, en büyük zorluklardan biri, antikorların doku penetrasyonudur. Ne kadar çok lif bir arada tutulursa, antikorların mevcut tüm antijenlere eşit şekilde nüfuz etmesi ve bağlanması o kadar zor olacaktır. Bu nedenle, bu yöntem küçük lif gruplarına bakarken en etkilidir. Aynı zamanda, kas içi yağın genel anatomik yeri, sadece küçük, soyulmuş lif demetlerine odaklanırken kaybedildiğinden bu da bir sınırlamadır. Bununla birlikte, yeni doku temizleme yöntemlerinin ve yeni görüntüleme teknolojisinin mevcut gelişimi ile birlikte, gelecekte daha fazla doku penetrasyonu ve görselleştirme mümkün olacaktır42,43,44.
Kas dokusunun önceden sabitlenmesi adiposit morfolojisini korurken, kas sağlığının önemli bir ölçümü olan miyoliflerin boyutunu değerlendirmek için de bir zorluk yaratır. Miyofiber boyutu, miyoliflerin kesit alanının ölçülmesiyle belirlenir. Kas dokusunun önceden fiksasyonunun, miyolifleri özetlemek için mevcut belirteçlerin çoğunun31'in başarısız olmasına neden olacağını daha önce bildirmiştik. Bu engelin üstesinden gelmek için, sabit kas bölümleri31'de bile miyofiber boyutunun ölçülmesine izin veren yeni bir görüntü segmentasyon boru hattı geliştirdik. Bu nedenle, bu protokolle birlikte, kas dokusunun önceden sabitlenmesinden kaynaklanan çoğu dezavantajın üstesinden gelen sağlam ve verimli bir doku işleme boru hattı kurduk.
Bu yaklaşımın bir diğer önemli avantajı çok yönlülüktür. TA'yı iki parçaya bölerek, bir kastan elde edilebilecek bilgi miktarı en üst düzeye çıkarılır. Bu sadece hayvan sayısını azaltmakla kalmaz, aynı zamanda gen ekspresyonu yoluyla histolojiyi doğrulayarak ekstra bir kontrol katmanı ekler ve bunun tersi de geçerlidir. Ek olarak, adipojenik genlerin ötesinde birçok farklı gen incelenebilir. İzole RNA, bütün bir kas RNAseq deneyi için de kullanılabilir. Son olarak, dondurulmuş kas parçası protein çalışması için de kullanılabilir. Bu protokolün bir sınırlaması, yaralanmanın TA'nın tüm uzunluğu boyunca tutarlı olmama olasılığıdır. Bu, iki kas parçasının içerdikleri kas içi yağ miktarında farklılaştığı bir senaryoya yol açabilir ve böyle bir numunenin herhangi bir aşağı akış analizinden dışlanmasını garanti edebilir. Bu nedenle, kas içi yağ miktarı hakkında önemli sonuçlar çıkarmak için sadece RT-qPCR'ye güvenilmemesi, bunun yerine histolojik nicelemelere destekleyici veriler olarak güvenilmesi önerilir.
Birlikte, bu protokol, yağlı fibrozla mücadele etmek için yeni tedavi seçeneklerinin geliştirilmesinde ilk adım olan kas içi yağın görselleştirilmesine ve miktarının belirlenmesine izin verecek sağlam, verimli ve titiz bir doku işleme boru hattını özetlemektedir. Aynı zamanda, çok yönlüdür ve kas içindeki birçok farklı hücre tipine ve diğer dokulardaki adipositlere uyarlanabilir.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Kopinke laboratuvarı üyelerine, veri toplama ve makalenin eleştirel okuması konusunda yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Ayrıca, Florida Üniversitesi'ndeki Miyoloji Enstitüsü üyelerine, el yazması hakkındaki değerli katkıları için teşekkür ederiz. Çalışma, NIH hibesi 1R01AR079449 tarafından desteklenmiştir. Şekil 2, Biorender ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% PFA (Pack of 12, 10 mL bottles) | Electron Miscroscopy Sciences | 15710 | |
| 2.0 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-138 | microcentrifuge tubes for snapfreezing/bead beating |
| 2-Methylbutane (4 L) | Fisher Chemical | O3551-4 | isopentane |
| Absolute Ethanol (200 proof) | ThermoFisher Scientific | BP2818100 | |
| AffiniPure Fab fragment donkey anti-mouse | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | mouse-on-mouse blocking |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-chicken secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 703-545-155 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A21206 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-goat secondary antibody | Invitrogen | A11057 | |
| Alexa Fluor 568 donkey anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11037 | |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin antibody | Invitrogen | A12380 | Dissolved in 1.5 mL methanol (~66 µM working solution) |
| BioLite 24-well Multidishes | ThermoFisher Scientific | 930186 | 24 well plate for PFA tissue incubation |
| Biometra TOne | analytikjena | 8462070301 | Thermal cycler |
| Chicken anti-GFP antibody | Aves Labs | GFP-1020 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol 24:1(v/v) for molecular biology, DNAse, RNAse, and Protease free | ThermoFisher Scientific | AC327155000 | |
| Corn oil | Sigma Aldrich | C8267 | |
| DAPI stain | Invitrogen | D1306 | 150 µM working solution in dH2O |
| Donkey Serum (100 mL) | Millipore Sigma | 5058837 | for blocking solution |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | sharp-tipped tweezers |
| Fine Scissors Straight 9 cm | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | mounting medium |
| Glycerol, 99.5%, for molecular biology (500 mL) | Acros Organics | 327255000 | |
| Goat anti-PDGFRα antibody | R&D | AF1062 | |
| Hybridization Oven | VWR | 230301V | for Tamoxifen incubation |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Vector Laboratories | H-4000 | hydrophobic pen |
| Insulin Syringe with Micro-Fine IV needle (28 G) | BD | 329461 | |
| Insulin Syringe with Slip Tip, 1 mL | BD | 329654 | Insulin syringe without needle, for oral gavaging |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 78938441 | |
| Leica DMi8 inverted microscope | Leica | micrscope used for widefield IF and confocal imaging | |
| Micro Slides | VWR | 48311-703 | positively charged microscope slides |
| mouse anti-MYOD antibody | Invitrogen | MA1-41017 | |
| mouse anti-PAX7 antibody (supernatant) | DSHB | AB 428528 | |
| MX35 Premier+ Microtome blades | ThermoFisher Scientific | 3052835 | microtome blades |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND2000 | spectrophotometer for RNA yield |
| Play-Doh | Hasbro | modeling compound | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher Scientific | A25742 | green dye PCR master mix |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | 17033-211-38 | vet ophthalmic ointment |
| QuantStudi 6 Flex Real-Time 384-well PCR System | Applied Biosystems | 4485694 | qPCR machine |
| Rabbit anti-perilipin antibody | Cell Signaling Technology | 9349S | |
| Red-Rotor Shaker | Hoefer Scientific | PR70-115V | shaker for IF staining |
| Richard-Allan Scientific Slip-Rite Cover Glass | ThermoFisher Scientific | 152460 | coverslips |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74106 | contains mini spin columns |
| Safe-Lock Tubes 1.5 ml, natural | Eppendorf | 22363204 | |
| Sample Tubes RB (2 mL) | QIAGEN | 990381 | |
| Sodium azide | Alfa Aesar | 14314 | |
| Stainless Steel Beads, 2.8 mm | Precellys | KT03961-1-101.BK | small beads |
| Stainless Steel Beads, 5 mm | QIAGEN | 69989 | medium beads |
| Stainless Steel Beads, 7 mm | QIAGEN | 69990 | large beads |
| Stainless Steel Disposable Scalpels | Miltex | 327-4102 | scalpel |
| Stainless steel feeding tube, 20 G x 38 mm, straight | Instech Laboratories | FTSS-20S-3 | gavage needle |
| Tamoxifen | Toronto Research Chemicals | T006000 | |
| Tissue Plus O.C.T. Compound | Fisher HealthCare | 4585 | embedding medium |
| TissueLyser LT | QIAGEN | 85600 | bead beater |
| TissueLyser LT Adapter, 12-Tube | QIAGEN | 69980 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura | 4566 | specimen molds |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596026 | guanidium thiocyanate |
| Tween20 (500 mL) | Fisher BioReagents | BP337-500 | |
| VWR Micro Slides - Superfrost Plus | VWR | 48311703 | |
| Wheaton Coplin staining jars | Millipore Sigma | S6016 | Coplin jar |
References
- Milad, N., et al. Increased plasma lipid levels exacerbate muscle pathology in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Skeletal Muscle. 7 (1), 19 (2017).
- Goodpaster, B. H., et al. Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women. Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).
- Goodpaster, B. H., et al. Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men and women. Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).
- Goodpaster, B. H., et al. The loss of skeletal muscle strength, mass, and quality in older adults: the health, aging and body composition study. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (10), 1059-1064 (2006).
- Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus. American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).
- Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss. Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).
- Burakiewicz, J., et al. Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy. Journal of Neurology. 264 (10), 2053-2067 (2017).
- Murphy, W. A., Totty, W. G., Carroll, J. E. MRI of normal and pathologic skeletal muscle. American Journal of Roentgenology. 146 (3), 565-574 (1986).
- Willcocks, R. J., et al. Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large duchenne muscular dystrophy cohort. Annals of Neurology. 79 (4), 535-547 (2016).
- Wokke, B. H., et al. Quantitative MRI and strength measurements in the assessment of muscle quality in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (5), 409-416 (2014).
- Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions. Skeletal Muscle. 11 (1), 16 (2021).
- El Agha, E., et al. Mesenchymal stem cells in fibrotic disease. Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).
- Joe, A. W., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles. Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).
- Scott, R. W., Arostegui, M., Schweitzer, R., Rossi, F. M. V., Underhill, T. M. Hic1 defines quiescent mesenchymal progenitor subpopulations with distinct functions and fates in skeletal muscle regeneration. Cell Stem Cell. 25 (6), 797-813 (2019).
- Uezumi, A., et al. Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle. Journal of Cell Science. 124, Pt 21 3654-3664 (2011).
- Hogarth, M. W., et al. Fibroadipogenic progenitors are responsible for muscle loss in limb girdle muscular dystrophy 2B. Nature Communications. 10 (1), 2430 (2019).
- Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Stumm, J., et al. Odd skipped-related 1 (Osr1) identifies muscle-interstitial fibro-adipogenic progenitors (FAPs) activated by acute injury. Stem Cell Research. 32, 8-16 (2018).
- Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. Ciliary Hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis. Cell. 170 (2), 340-351 (2017).
- Huang, Y., Das, A. K., Yang, Q. Y., Zhu, M. J., Du, M. Zfp423 promotes adipogenic differentiation of bovine stromal vascular cells. PLoS One. 7 (10), 47496 (2012).
- Sun, Y. -M., et al. PDGFRα regulated by miR-34a and FoxO1 promotes adipogenesis in porcine intramuscular preadipocytes through Erk signaling pathway. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2424 (2017).
- Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. Identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) in skeletal muscle in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e61750 (2021).
- Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).
- Santini, M. P., et al. Tissue-resident PDGFRalpha(+) progenitor cells contribute to fibrosis versus healing in a context- and spatiotemporally dependent manner. Cell Reports. 30 (2), 555-570 (2020).
- Uezumi, A., et al. Identification and characterization of PDGFRalpha+ mesenchymal progenitors in human skeletal muscle. Cell Death & Disease. 5, 1186 (2014).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Soliman, H., et al. Pathogenic potential of Hic1-expressing cardiac stromal progenitors. Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).
- Chung, M. I., Bujnis, M., Barkauskas, C. E., Kobayashi, Y., Hogan, B. L. M. Niche-mediated BMP/SMAD signaling regulates lung alveolar stem cell proliferation and differentiation. Development. 145 (9), Cambridge, England. (2018).
- Hilgendorf, K. I., et al. Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis. Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).
- Waisman, A., Norris, A. M., Elías Costa, M., Kopinke, D. Automatic and unbiased segmentation and quantification of myofibers in skeletal muscle. Scientific Reports. 11 (1), 11793 (2021).
- Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1, 4 (2001).
- Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration. PLoS One. 8 (8), 71084 (2013).
- Mahdy, M. A., Lei, H. Y., Wakamatsu, J., Hosaka, Y. Z., Nishimura, T. Comparative study of muscle regeneration following cardiotoxin and glycerol injury. Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger: Official Organ of the Anatomische Gesellscaft. 202, 18-27 (2015).
- Pisani, D. F., Bottema, C. D., Butori, C., Dani, C., Dechesne, C. A. Mouse model of skeletal muscle adiposity: a glycerol treatment approach. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (3), 767-773 (2010).
- Kawai, H., et al. Experimental glycerol myopathy: a histological study. Acta Neuropathologica. 80 (2), 192-197 (1990).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Uezumi, A., et al. Mesenchymal Bmp3b expression maintains skeletal muscle integrity and decreases in age-related sarcopenia. The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139617 (2021).
- Biferali, B., et al. Prdm16-mediated H3K9 methylation controls fibro-adipogenic progenitors identity during skeletal muscle repair. Science Advances. 7 (23), 9371 (2021).
- Biltz, N. K., Meyer, G. A. A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle. Skeletal Muscle. 7 (1), (2017).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), Cambridge, England. (2021).
- Gómez-Gaviro, M. V., Sanderson, D., Ripoll, J., Desco, M. Biomedical applications of tissue clearing and three-dimensional imaging in health and disease. iScience. 23 (8), 101432 (2020).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
