Artigo de método

Implementação de ressecção de tumor cerebral minimamente invasiva em roedores para coleta de tecido de alta viabilidade

DOI:

10.3791/64048

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9 de maio de 2022

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1Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurosurgery, University of Maryland School of Medicine, 3Marlene and Stewart Greenebaum Comprehensive Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, 4Diagnostic Radiology and Nuclear Medicine, University of Maryland School of Medicine, 5Pontifical Catholic University of Parana, 6Department of Pathology, University of Maryland School of Medicine, 7Departments of Ophthalmology, Oncology and Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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O presente protocolo descreve uma ressecção padronizada de tumores cerebrais em roedores através de uma abordagem minimamente invasiva com um sistema integrado de preservação de tecidos. Esta técnica tem implicações para espelhar com precisão o padrão de cuidado em roedores e outros modelos animais.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente protocolo descreve um paradigma padronizado para ressecção do tumor cerebral de roedores e preservação de tecidos. Na prática clínica, a ressecção máxima do tumor é o tratamento padrão de cuidados para a maioria dos tumores cerebrais. No entanto, os modelos de tumor cerebral pré-clínicos mais disponíveis atualmente não incluem ressecção, ou utilizam modelos de ressecção cirúrgica que consomem tempo e levam a morbidade, mortalidade ou variabilidade experimental significativas pós-operatórias. Além disso, a realização da ressecção em roedores pode ser assustadora por várias razões, incluindo a falta de ferramentas cirúrgicas ou protocolos clinicamente comparáveis e a ausência de uma plataforma estabelecida para coleta padronizada de tecidos. Este protocolo destaca o uso de um dispositivo de ressecção multifuncional e não ablativo e um sistema integrado de preservação de tecidos adaptado da versão clínica do dispositivo. O dispositivo aplicado no presente estudo combina sucção tífica e uma lâmina cilíndrica na abertura para precisamente sondar, cortar e tecido de sucção. O dispositivo de ressecção minimamente invasivo executa suas funções através do mesmo orifício de rebarba usado para a implantação inicial do tumor. Essa abordagem minimiza alterações na anatomia regional durante cirurgias de biópsia ou ressecção e reduz o risco de perda significativa de sangue. Esses fatores reduziram significativamente o tempo de operação (<2 min/animal), melhoraram a sobrevivência animal pós-operatória, reduziram a variabilidade em grupos experimentais e resultaram em alta viabilidade de tecidos e células ressecadas para análises futuras. Este processo é facilitado por uma velocidade da lâmina de ~1.400 ciclos/min, o que permite a colheita de tecidos em um sistema fechado estéril que pode ser preenchido com uma solução fisiológica de escolha. Dada a importância emergente de estudar e modelar com precisão o impacto da cirurgia, preservação e rigorosa análise comparativa de amostras de ressecção de tumores regionalizadas e terapêuticas fornecidas por intra-cavidade, este protocolo único ampliará as oportunidades de explorar questões sem resposta sobre o manejo perioperatório e a descoberta terapêutica para pacientes com tumor cerebral.

Introdução

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Glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral primário mais comum e agressivo em adultos. Apesar dos recentes avanços na neurocirurgia, no desenvolvimento de medicamentos direcionados e na radioterapia, a taxa de sobrevivência de 5 anos para pacientes com GBM é inferior a 5%, uma estatística que não melhorou significativamente em mais de três décadas1. Por isso, há necessidade de estratégias de tratamento mais eficazes.

Para desenvolver novas terapias, torna-se cada vez mais evidente que os protocolos de investigação precisam (1) utilizar modelos preclínicos traduzíveis que recapitulem com precisão a heterogeneidade e microambiente tumoral, (2) espelham o regime terapêutico padrão utilizado em pacientes com GBM, que atualmente inclui cirurgia, radioterapia e quimioterapia, e (3) explicam a diferença entre núcleo ressecado e residual, que atualmente inclui cirurgia, radioterapia e quimioterapia, e (3) explicam a diferença entre núcleo ressecado e residual, residual, tecidos tumorais invasivos 2,3,4,5. No entanto, a maioria dos modelos de tumor cerebral pré-clínicos atualmente disponíveis não implementam ressecção cirúrgica ou utilizam modelos de ressecção cirúrgica que são relativamente demorados, levando a uma quantidade significativa de perda de sangue ou falta de padronização. Além disso, a realização da ressecção de tumores cerebrais de roedores pode ser desafiadora devido à falta de ferramentas ou protocolos cirúrgicos clinicamente comparáveis e à ausência de uma plataformaestabelecida 6 para coleta sistemática de tecidos (Tabela 1).

O presente protocolo visa descrever um paradigma padronizado para ressecção do tumor cerebral de roedores e preservação do tecido utilizando um sistema de ressecção minimamente invasivo não ablativo multifuncional (MIRS) e um sistema integrado de preservação de tecidos (TPS) (Figura 1). Espera-se que essa técnica única forneça uma plataforma padronizada que possa ser utilizada em diversos estudos em pesquisas pré-científicas para GBM e outros tipos de modelos de tumor cerebral. Pesquisadores que investigam modalidades terapêuticas ou diagnósticas para tumores cerebrais podem implementar esse protocolo para alcançar uma ressecção padronizada em seus estudos.

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Protocolo

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Todos os estudos em animais foram aprovados pela Universidade de Maryland e pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Johns Hopkins. Foram utilizados para o presente estudo camundongos C57BL/6, de 6 a 8 semanas de idade. Os camundongos foram obtidos a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). Todos os regulamentos de Biossegurança Nível 2 (BSL-2) foram seguidos, incluindo o uso de máscaras, luvas e vestidos.

1. Implantação inicial de tumor intracraniano

  1. Na fase inicial do estudo, intracranianamente injete cada rato com 100.000 células (gl261 linha de células glioma murine) suspensas em 4 μL de soro fisiológico tamponado de fosfato (1x PBS) a uma profundidade de 2,5 mm após o relatório publicado anteriormente7.
  2. Quantifique o sinal tumoral em cada camundongo usando o sistema de imagem in vivo 8 9 dias após a implantação do tumor.
    NOTA: Se necessário, estratifique os camundongos em dois grupos com base na carga tumoral. No presente estudo, os dois grupos foram: (1) camundongos com carga tumoral relativamente pequena (sinal bioluminescente médio = 5,5e+006 ± 0,1e+006 fótons/s, n = 10) e (2) camundongos com carga tumoral relativamente grande (sinal bioluminescente médio = 1,69e+007 ± 0,2e+007 fótons/s, n = 10), (p < 0,05, teste de Mann-Whitney)9.
  3. Divida cada grupo em dois subgrupos comparáveis.
    NOTA: Neste estudo, os dois subgrupos foram: camundongos não tratados (n = 5) e camundongos com tumores submetidos à ressecção cirúrgica utilizando o MIRS (n = 5), (p > 0,05, teste de Mann-Whitney)9.
  4. A partir do dia da ressecção, acompanhe a progressão do tumor utilizando o sistema de imagem in vivo em uma frequência baseada no padrão de crescimento do tumor.
    NOTA: Para a linha celular GL261, acompanhe a progressão do tumor no dia da ressecção e, em seguida, a cada 3-6 dias.

2. Ressecção tumoral usando MIRS

  1. Anestesiar o camundongo usando uma mistura de gás isoflurano-O2 em uma câmara de indução ou injeção intraperitoneal de solução de xilazina/cetamina.
    1. Se usar o anestésico a gás, defina a vazão do gás para 1,0 mL/min e o vaporizador para 2,0% para indução de anestesia, normalmente exigindo 3-5 min na câmara (ver Tabela de Materiais).
    2. Se usar o anestésico injetável, anestesia os camundongos injetando 0,2 mL de solução anestésico (80-100 mg/kg de cetamina e 10-12,5 mg/kg de xilazina, ver Tabela de Materiais) intraperitonetalmente.
  2. Avalie o animal para sedação adequada, beliscando o dedo do dedo do sol. Aplique pomada oftalmica nos olhos para evitar o ressecamento da córnea. Administrar um analgésico (0,03-0,06 mg/kg buprenorfina subcutânea) antes do procedimento.
  3. Coloque o mouse sobre o quadro estereotático (ver Tabela de Materiais) uma vez confirmada a sedação completa.
    NOTA: Se usar o anestésico gasoso, coloque o nariz do camundongo em um cone de nariz onde ele continuará a receber a mistura isoflurane-O2 durante o procedimento (1,5%).
  4. Retire o grampo anterior e remova o cabelo com um creme depilatório ou raspando. Desinfete a pele com ciclos alternados de um esfoliante à base de clorexidina/betadina e álcool. Em seguida, usando um bisturi estéril, crie uma incisão longitudinal de 1 cm ao longo da cicatriz cirúrgica anterior.
  5. Conecte a peça de mão MIRS ao braço estereotático através do suporte do adaptador/peça de mão para maior estabilidade e precisão.
  6. Configure a máquina MIRS (ver Tabela de Materiais) usando as seguintes configurações (Figura 1).
    1. Insira o conjunto do cabo de alimentação no painel traseiro no recipiente do cabo de alimentação. Ligue ou desligue a energia do sistema por toggling (1 = ON, 0 = OFF).
    2. Insira uma extremidade da mangueira de nitrogênio (fornecida com o console) no encaixe masculino no painel traseiro do console. Gire a porca de conexão no sentido horário para apertar a conexão.
      NOTA: A extremidade oposta da mangueira precisa ser conectada ao suprimento de nitrogênio.
    3. Antes de fixar a mangueira à fonte de nitrogênio, confirme que a pressão de alimentação não excede 100 psig, que é a pressão de alimentação recomendada para o console.
      NOTA: O console gerará sua própria aspiração quando ativado pelo pedal do pé uma vez que o nitrogênio tenha sido fornecido ao console.
    4. Fixar a tampa da porta de vácuo e selá-la para evitar qualquer vazamento no sistema de vácuo. Qualquer vazamento no sistema de aspiração afetará o desempenho do console MIRS.
    5. Se a aspiração estiver abaixo de 17 durante a configuração ou escoramento, verifique se o botão de aspiração na parte frontal do console está definido no nível máximo (100), certifique-se de que não há vazamento no sistema de aspiração e confirme se a pressão de fornecimento de entrada de nitrogênio está correta.
    6. Para conectar o pedal do pé ao console, insira o conector do pedal do pé cinza em seu recipiente cinza até que ele clique e se encaixe na posição.
      NOTA: O conector do pedal do pé se conecta ao console em uma orientação, e ele é chaveado.
    7. Para conectar a peça de mão ao console, insira o conector azul da peça de mão em seu recipiente azul até que ele clique e se encaixe na posição.
      NOTA: O conector da peça de mão se conecta ao console em uma orientação, e é digitado.
    8. Prime cada peça de mão antes de usar o sistema aspirando fluido estéril de uma tigela pequena para a abertura, através da tubulação e peça de mão, e, em seguida, para o recipiente para garantir que o interior da tubulação e peça de mão são lubrificados para reduzir as oclusãos teciduais.
    9. Prepare-se para aspiração sozinho ou aspiração com corte selecionando o modo apropriado no painel frontal do console. Inicie usando o pedal do pé.
  7. Insira a cânula MIRS de 23 G no orifício da rebarba a uma profundidade de 2,5 mm.
  8. Inicie o processo de ressecção deprimindo o pedal do pé conectado à cânula. Realize um ciclo completo (360°) ou mais de ressecção usando o botão de controle na peça de mão.
    NOTA: Quanto mais ciclos realizados, maior o volume de tecido tumoral ressecado.
  9. Uma vez que o processo de ressecção esteja concluído, retire a cânula MIRS de 23 G do orifício da rebarba e use 5 mL de PBS 1x para lavar a tubulação e desalojar quaisquer detritos residuais.
  10. Remova o mouse da estrutura estereotática e feche a ferida com um grampeador ou material de sutura 4-0 (ver Tabela de Materiais).
  11. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento ou sob uma luz de aquecimento durante a recuperação da anestesia antes de devolvê-lo à sua gaiola.
  12. Depois que o experimento estiver completo, purgue a cânula através da descarga. Alternar com mídia gelada e ar para "empurrar" todo o tecido ressecado de volta para o recipiente de coleta. Remova o recipiente de coleta do sistema e retire-o com a tampa fornecida.
  13. Após completar a etapa 2.12, coloque a ponta distal da cânula em 3% H2O2 e aplique sucção em 24-25 em Hg para preencher a linha de sucção de volta ao recipiente de coleta de sucção e deixe ficar para 60-90 s. Lave com mídia estéril pulsando ar e mídia intermitentemente.
  14. Monitore os camundongos para obter sinais neurológicos (movimentos erráticos anormais ou convulsões) após o procedimento.
  15. Eutanize os camundongos com graves prejuízos neurológicos (torne-se letárgico, tenha uma aparência magro, curvado para trás ou tenha movimentos erráticos).
    NOTA: Para o presente estudo, foram utilizados 200 mg/kg de uma solução de eutanásia comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) para eutanásia de cada rato.

3. Coleta de tecidos via TPS

  1. Mergulhe a amostra de tumor em um prato de cultura tecidual contendo um meio de lise RBC (ver Tabela de Materiais) por 5 min a temperatura ambiente.
    NOTA: O tecido colhido do MIRS no TPS será principalmente na forma de células únicas, juntamente com pequenos pedaços de tecido.
  2. Coloque um filtro de 70 μm (ver Tabela de Materiais) em um tubo cônico de 50 mL e use um êmbolo de uma seringa de 5 mL para passar a amostra do tumor através do filtro.
  3. Com uma pipeta de transferência, use a mídia RPMI-1640 para facilitar a passagem de células e qualquer massa tecidual através do filtro.
  4. Centrifugar a 428 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernatante por uma pipeta.
  5. Resuspend cada amostra em 5 mL de meio RPMI-1640 preparado.
  6. Para aumentar a viabilidade tecidual, especialmente se grandes pedaços de tecido forem visualizados na impressão inicial, adicione os volumes necessários do coquetel enzimático (contendo DNAse I, colagenase IV, dispase, Papain e EDTA, consulte Tabela de Materiais) a cada amostra. Use o vórtice para misturar as soluções.
    NOTA: O passo 3.6 é opcional. A composição do coquetel enzimánico (para um volume total de 5 mL/amostra): 300 μL de DNAse I Grau II, 150 μL de Colagenase/Dispase (cleaves fibronectin, colagenase IV, I e aminoácidos não poluar), 250 μL de Papain (protease não específica) e 6 μL de 0,5 M EDTA.
  7. Coloque as amostras em uma incubadora de shaker situada a 200 rpm, 37 °C por 20 min.
  8. Após 20 min, gire as amostras a 428 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernatante.
  9. Filtre células únicas através de um coador de células de 70 μm e gire a 274 x g por 3 min a 4 °C. Realizar análise de viabilidadecelular 10 com Trypan Blue e Hemocytómetro (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: A viabilidade do dia 0 varia de 30%a 70% e aumenta significativamente dentro de 2-3 dias.
  10. Prossiga para as etapas 4, 5 ou 6, dependendo do teste de viabilidade necessário.

4. Células em crescimento na cultura aderente

  1. Em uma capa de fluxo laminar certificada, resuspenque a pelota em meio aderente contendo soro (como DMEM, 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina/streptomicina (P/S) e células de placa em um frasco de células aderentes.
  2. Manter as células em ambiente controlado incubado (37 °C, 5% DE CO2).

5. Células em crescimento na cultura de suspensão (neurosferas)

  1. Em uma capa de fluxo laminar certificada, resuspenque a pelota em célula-tronco completa sem soromeio 11 e placa em um frasco de suspensão.
  2. Manter as células em um ambiente controlado incubado (37 °C, 5% CO2) por 2-3 dias para permitir a formação da neurosfera.
  3. Após a visualização das neurosferas no meio de cultura, use Trypsin-EDTA ou Accutase (ver Tabela de Materiais) para obter suspensões unicelulares para a passagem.
    NOTA: Enquanto os cuidados especiais são tomados durante a colheita e a mídia apropriada que suporta células-tronco neurais é usada, as células-tronco no tecido colhido devem formar neurosferas dentro de alguns dias.

6. Preparando células para reimplantação

  1. Resuspend a pelota a uma concentração de 100.000 células vivas por 4 μL de 1x PBS.
  2. Injete imediatamente em camundongos ingênuos usando o método de implantação do tumor intracraniano (passo 1).

7. Análise histológica

  1. Imediatamente após a ressecção, extraia e fixa os cérebros em 4% de paraformaldeído (PFA) por 24h12.
  2. Transfira os cérebros para uma solução de 30% de sacarose até que estejam saturados com sacarose (afundado até o fundo do recipiente).
  3. Transfira os cérebros para uma solução de 70% de etanol.
  4. Realize a incorporação de blocos de parafina, secção e hematoxilina padrão e eosina (H&E) após o relatório publicado anteriormente13.
    NOTA: A espessura de cada seção tomada para coloração foi de 10 μm.

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Resultados

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A ressecção cirúrgica utilizando o MIRS resulta em uma diminuição significativa da carga tumoral
No grupo com menor carga tumoral, o sinal bioluminescente médio da linha de base foi de 5,5e+006 fótons/s ± 0,2e+006 no subgrupo submetido à ressecção. Após a ressecção, o sinal bioluminescente médio diminuiu para 3,09e+006 fótons/s ± 0,3e+006, (p <0.0001, teste de Mann-Whitney)9 (Figura 2). O sinal bioluminescente aumentou ...

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Discussão

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A ressecção tumoral é uma pedra angular dos planos de tratamento de oncologia neurocirúrgica para tumores cerebrais de baixo grau e de alto grau. A citoredução e a debulição do tumor se correlacionam com a melhora da função neurológica e a sobrevida geral em pacientes com tumores cerebrais 1,2,5,6. Embora os protocolos de ressecção cirúrgica tenham sido descritos anteriormente em modelos de roe...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BT tem financiamento de pesquisa da NIH e é coproprietária da Accelerating Combination Therapies*, e a Ashvattha Therapeutics Inc. licenciou uma de suas patentes. GW tem financiamento nih (R01NS107813). A HB é consultora paga da Insightec e presidente do Conselho Consultivo Médico da empresa. Este acordo foi revisado e aprovado pela Universidade Johns Hopkins após suas políticas de conflito de interesses. A HB tem financiamento de pesquisa da NIH, Johns Hopkins University, e filantropia e é consultora da CraniUS, Candel Therepeutics, Inc., Accelerating Combination Therapies*, Catalio Nexus Fund II, LLC*, LikeMinds, Inc*, Galen Robotics, Inc.* e Nurami Medical*. (*inclui equidade ou opções).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Seringas de 1 mLBD309628
tubos cônicos de 15 mLCorning430052
200 prova de etanolPharmCo111000200
pipetas de 5 mLCoStar4487
Filtro de 70 mícronsFisher08-771-2
AccutaseMillipore SigmaSIG-SCR005
Anased (injeção de xilazina, 100 mg / mL)Sistema de anestesia Covetrus33198
Patterson Scientific78935903
Recipiente de resíduos de gás anestésicoPatterson Scientific78909457
de bancada sob a almofadaCovidien10328
C57Bl / 6, camundongos de 6-8 semanas CharlesRiver LaboratoriesCódigo de cepa 027
ChroMini ProMoserTipo 1591-Q
Colagenase-DispersãoRoche# 10269638001
Countess II Contador de Células AutomatizadoThermo Fisher
Countess II FL HemacitômetroThermo FisherA25750
Solução de Remoção de DetritosMiltenyi Biotech# 130-109-398
D-LuciferinaGoldbioLUCK-1G
DMEM F12 mídiaCorning10-090-CV
DMEM mídiaCorning10-013-CV
DNAse ISigma Aldrich#10104159001
Eppendorf tubosPosi-Click1149K01
Solução de eutanásiaHenry Schein71073
FBSMillipore SigmaF4135
Soro Bovino FetalThermo Fisher10437-028
FormalinaInvitrogenINV-28906
GazeHenry Schein101-4336
hEGFPeproTech EC100-15
HeparinaSigma H-3149
hFGF-bPeproTech EC1001-18B
Câmara de induçãoPatterson Scientific78933388
IsofluranoCovetrus11695-6777-2
Vaporizador de isofluranoPatterson Scientific78916954
CetaminaCovetrus11695-0703-1
Kopf Quadro estereotáxicoKopf Instruments5001
Microscópio de campo de luzUnidade de Microinjeção BioTekCytation 5
Kopf5001
Broca MicromotorForedomF210418
Sistema de Ressonância MagnéticaBruker7T Biospec Avance III Scanner de Ressonância
NICO Myriad SystemNICO Corporation
Pomada Oftálmica Pomada
PapaínaSigma Aldrich#P4762
PBSInvitrogen#14190250
PenStrepMillipore SigmaN1638
Solução PercollSigma Aldrich #P4937
Controlador de pipetaFalconA07260
Solução de iodo-povidonaAplicare52380-1905-08
ProgesteronaSigmaP-8783
PutrescineSigmaP-5780
RPMI MediaInvitrogenINV-72400120
Lâmina de bisturiCovetrus7319
Cabo de bisturiFerramentas de Belas Ciências91003-12
Marcador de peleTime OutD538,851
Grampo removedorMikRonACR9MM
GrampeadorMikRonACA9MM
GramposArgila Adams427631
Quadro EstereotáxicoKopf Instruments5000
SacaroseSigma AldrichS9378
Sutura, vicryl 4-0EthiconJ494H
T-75 frascode culturaSarstedt83-3911-002
TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x)LonzaBP10-548E
Tripsina-EDTACorningMDT-25-053-CI
protetor Magnética Veterinária Puralube

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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