Summary
פרוטוקול זה מדגים כיצד לבודד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בחבל הטבור האנושי (hUC-MSC-sEVs) באמצעות הגדרה פשוטה בקנה מידה של מעבדה. התפלגות הגודל, ריכוז החלבונים, סמני sEVs והמורפולוגיה של hUC-MSC-sEV מבודדים מאופיינים בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, בדיקת חלבון BCA, כתם מערבי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, בהתאמה.
Abstract
התהליך מבוסס האולטרה-צנטריפוגה נחשב לשיטה הנפוצה לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEVs). עם זאת, התשואה משיטת בידוד זו נמוכה יחסית, ושיטות אלה אינן יעילות בהפרדת תת-סוגים של sEV. מחקר זה מדגים שיטת סינון פשוטה לבידוד שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות מסוג MSC (hUC-MSC-sEVs) שמקורן בחבל הטבור האנושי, המופרדות בהצלחה על-ידי אולטרה-סינון מהמדיום המותנה של hUC-MSCs. התפלגות הגודל, ריכוז החלבונים, הסמנים האקזוזומליים (CD9, CD81, TSG101) והמורפולוגיה של hUC-MSC-sEV המבודדים אופיינו בניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, בדיקת חלבון BCA, כתם מערבי ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, בהתאמה. גודלם של ה-hUC-MSC-sEV המבודדים היה 30-200 ננומטר, עם ריכוז חלקיקים של 7.75 ×-10 10 חלקיקים/מ"ל וריכוז חלבון של80 מק"ג/מ"ל. נצפו פסים חיוביים לסמנים אקסוזומליים CD9, CD81 ו-TSG101. מחקר זה הראה כי hUC-MSC-sEV בודדו בהצלחה מתווך מותנה hUC-MSCs, ואפיון הראה כי המוצר המבודד עמד בקריטריונים שהוזכרו על ידי מידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות 2018 (MISEV 2018).
Introduction
על פי MISEV 2018, sEVs הם חלקיקים דו-שכבתיים ליפידים שאינם משכפלים ללא גרעין פונקציונלי, בגודל של 30-200 ננומטר1. sEV שמקורם ב-MSC מכיל מולקולות איתות חשובות הממלאות תפקידים חשובים בהתחדשות רקמות, כגון מיקרו-רנ"א, ציטוקינים או חלבונים. הם הפכו יותר ויותר ל"נקודה חמה" מחקרית ברפואה רגנרטיבית ובטיפול ללא תאים. מחקרים רבים הראו כי sEV שמקורו ב-MSC יעיל כמו MSC בטיפול במצבים שונים, כגון אימונומודולציה 2,3,4,5, שיפור אוסטאוגנזה 6, סוכרת7,8 או התחדשות כלי דם 9,10. עם התקדמות ניסויי השלב המוקדם, הודגשו שלוש סוגיות מפתח עיקריות ביחס לתרגום הקליני של MSCs-EVs: תפוקת כלי הרכב החשמליים, טוהר כלי הרכב החשמליים (נקיים מפסולת תאים ומזהמים ביולוגיים אחרים כגון חלבון וציטוקינים), ושלמות הממברנה הדו-שכבתית הפוספוליפידית של כלי הרכב החשמליים לאחר בידוד.
שיטות שונות פותחו כדי לבודד sEVs, תוך ניצול הצפיפות, הצורה, הגודל וחלבון פני השטח של sEVs11. שתי השיטות הנפוצות ביותר בבידודים של כלי רכב חשמליים הן טכניקות מבוססות אולטרה-צנטריפוגה ואולטרה-סינון.
שיטות מבוססות אולטרה-צנטריפוגה נחשבות לשיטות תקן זהב בבידוד כלי רכב חשמליים. שני סוגים של טכניקות אולטרה-צנטריפוגות המשמשות בדרך כלל הן אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית ואולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. עם זאת, שיטות אולטרה-צנטריפוגות גורמות לעתים קרובות לתפוקה נמוכה ודורשות ציוד יקר עבור אולטרה-צנטריפוגות במהירות גבוהה (100,000-200,000 × גרם)11. יתר על כן, טכניקות אולטרה-צנטריפוגה לבדן אינן יעילות בהפרדת תת-סוגים של כלי רכב חשמליים (sEV ורכבים חשמליים גדולים), וכתוצאה מכך נוצרת שכבת משקעים לא טהורה11. לבסוף, אולטרה-צנטריפוגה של שיפוע צפיפות עשויה גם היא לגזול זמן רב ולדרוש צעדי זהירות נוספים כגון תוספת חיץ סוכרוז כדי לעכב את נזקי השיפוע במהלך שלבי האצה והאטה12. לפיכך, אולטרה-צנטריפוגה מובילה בדרך כלל לתנובה נמוכה יחסית ואינה מסוגלת להפלות בין אוכלוסיות שונות של כלי רכב חשמליים13, מה שמגביל את יישומה להכנת רכב חשמלי בקנה מידה גדול11.
השיטה השנייה לבידוד רכב חשמלי היא באמצעות אולטרה-פילטרציה, המבוססת על סינון גודל. אולטרה-סינון הוא חסכוני יחסית בזמן ובהשוואה לאולטרה-צנטריפוגה, מכיוון שהוא אינו כרוך בציוד יקר או בזמני עיבוד ארוכים14. לפיכך, אולטרה-סינון נראה כטכניקת בידוד יעילה יותר משתי שיטות האולטרה-צנטריפוגה שהוזכרו לעיל. המוצרים המבודדים יכולים להיות ספציפיים יותר בהתבסס על גודל הנקבוביות ותפוקה גבוהה יותר15. עם זאת, הכוח הנוסף המופעל בתהליך הסינון עלול לגרום לעיוות או התפרצות של כלי הרכב החשמליים16.
המאמר הנוכחי הציע פרוטוקול benchtop חסכוני וזמן לבידוד sEV הנגזרים מ- MSC לצורך ניתוח במורד הזרם ולמטרות טיפוליות. השיטה המתוארת במאמר זה שילבה שיטת סינון פשוטה עם צנטריפוגה עליונה כדי לבודד כלי רכב חשמליים בעלי תפוקה גבוהה ובאיכות טובה מ- hUC-MSCs לצורך ניתוח במורד הזרם, כולל ניתוח גודל חלקיקים, בדיקת סמנים ביולוגיים והדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות כל החומרים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. תאי גזע מזנכימליים של חבל הטבור האנושי ותרבית
- תרבית את hUC-MSCs בצפיפות זריעה של 5 × 103/cm2 ב- DMEM, בתוספת 8% טסיות דם אנושיות ו- 1% Pen-Strep. לדגור על התאים ב 37 ° C ב 5% CO2. החלף את מדיום תרבית התאים כל 3 ימים כדי להבטיח צמיחה תקינה של תאים.
- הרחיבו את התאים למעבר 5 בצלוחיות T175 לבידוד sEV.
הערה: יש צורך בצלוחיות רבות כדי לקצור יבול גבוה של sEV (היבול עולה עם מספר התאים).
2. בידוד שלפוחית חוץ-תאית קטנה מ-hUC - MSCs
- החלף את מדיום התרבית ב- DMEM טרי ללא פנול אדום בתוספת 1% Pen-Strep [מדיום מותנה (CM)] כאשר התרבית מגיעה למפגש של 70%-80% במעבר 5.
אזהרה: יש להשתמש במדיה בסיסית בלבד; הימנע FBS ותוסף טסיות דם אנושיות כדי למנוע זיהום על ידי sEV חיצוניים. - לאחר 24 שעות, צנטריפוגה CM ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להסיר פסולת התא. אספו וסננו את הסופרנאטנט דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים הגדולים מ-220 ננומטר.
- מלא את יחידת המסנן הצנטריפוגלי ב- 30 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) המסונן דרך מסנן 0.2 מיקרומטר. צנטריפוגה את יחידת המסנן הצנטריפוגלי ב 3,500 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- מלאו את ה-CM המסונן ביחידת הסינון הצנטריפוגלית (הנפח המרבי של כל יחידה הוא 70 מ"ל). צנטריפוגה CM ב 3,500 × גרם ב 4 ° C.
הערה: יש לעקוב אחר משך הצנטריפוגה מעת לעת עד שהפתרון מגיע לפני השטח של המסנן. - יש להשליך את התמיסה לכוס תמיסת התסנין. צנטריפוגה הפוכה את מסנן הדגימה עם איסוף תרכיז ב 1,000 x גרם ב 4 ° C למשך 2 דקות.
- מעבירים את ה-CM המרוכז בחזרה ליחידת המסנן הצנטריפוגלי. הוסף 30 מ"ל של PBS מסונן ליחידת המסנן הצנטריפוגלי וצנטריפוגה את היחידה ב 3,500 × גרם ב 4 ° C.
- יש להשליך את התמיסה לכוס תמיסת התסנין. התקינו איסוף מרוכזת על יחידת המסנן וצנטריפוגה הפוכה ב-1,000 × גרם למשך 2 דקות ב-4°C כדי לקבל את ה-sEV המטוהרים.
- סנן את כלי הרכב החשמליים דרך מסנן מזרקים בגודל 0.22 מיקרומטר.
- העבר את הדגימות לצינורות חדשים ואחסן אותן ב -80 ° C לניתוח נוסף.
3. אפיון hUC-MSC-sEVs
- ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים
- דללו את hUC-MSC-sEV המבודדים ב-PBS מסונן ל-20-100 חלקיקים/מסגרת.
- הכניסו 1 מ"ל של הדגימה המדוללת לתא נת"ע באמצעות מזרקים חד פעמיים של 1 מ"ל.
- קבעו את הגדרות המדידה בהתאם: התאימו את רמת המצלמה לרמה 14, קבעו את סף הגילוי כך שיכלול כמה שיותר חלקיקים עם הגבלה שסופרים 10-100 צלבים אדומים , וספירת הצלב הכחול מוגבלת לחמישה.
- עבור כל מדידה, הקליטו חמישה סרטונים בני דקה ונתחו אותם באמצעות תוכנת NanoSight עם סף זיהוי של חמישה.
- בצע מדידות בשלשה עבור כל דגימה.
- ניתוח כתמים מערביים
- Lyse, hUC-MSC-sEVs עם בדיקת משקעים רדיואימונוגרפיים קרים כקרח (RIPA) lysis buffer, לדגור במשך 30 דקות ב 4 °C, ו צנטריפוגה ב 200 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאסוף את supernatant.
- כמת את החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון של חומצה ביצינכונינית (BCA). הרכיבו את אלקטרופורזה הג'ל בהתאם ובצעו אלקטרופורזה בג'ל במתח של 90 וולט עד שהחלבון מגיע לקצה ג'ל הערימה. שנה את המתח ל 200 V כדי להפריד את החלבונים עד סוף ג'ל הפתרון.
- בצע העברה חצי יבשה כדי להעביר את החלבונים מהג'ל לקרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) ב 15 V למשך 1 שעות.
- חסום את קרום PVDF עם 3% אלבומין בסרום בקר (BSA)/Tris-buffered מלוחים-0.1% v/v Tween 20 (TBS-T) למשך שעה אחת על שייקר בטמפרטורת החדר. יש לדגור על קרום PVDF עם נוגדנים ראשוניים באופן הבא: נוגדן חד-שבטי נגד CD 9 של עכבר (1:500), נוגדן חד-שבטי נגד CD 81 של עכבר (1:500), נוגדן חד-שבטי של עכבר נגד GRP 94 נגד TSG 101 נוגדן חד-שבטי (1:500) ב-4°C למשך הלילה עם טלטול מתמיד.
- למחרת, שטפו את קרום PVDF 5 x 5 דקות עם TBS-T והמשיכו לדגור עם נוגדן משני: עכבר מצומד חזרת חלבון קושר מסוג IgG kappa (m-IgGκ BP-HRP) (1:5,000) למשך שעה אחת עם תסיסה בטמפרטורת החדר.
- שוב, שטפו את קרום PVDF עם TBS-T חמש פעמים, ודמיינו את הממברנה במצלמת CCD (charge-coupled imager) באמצעות מגיב זיהוי כימילומינסנציה. נתח את רמת הביטוי של החלבונים באמצעות תוכנת ImageJ. ראשית, פתח את קובץ התמונה ב- ImageJ (קובץ | פתוח...). שפר את איכות התמונה על-ידי התאמת הבהירות והניגודיות (תמונה | התאמה | בהירות/ניגודיות). התאם את התמונה עד שהכתמים נראים בבירור, לחץ על כפתור החל ולאחר מכן שמור את התמונות בפורמט TIFF (קובץ | שמירה בשם | טיף...).
- מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת
- דללו חלק אחד של דגימת hUC-MSC-sEV בארבעה חלקים של PBS מסונן לנפח כולל של 10 μL ודגרו על רשת נחושת מצופה פחמן למשך 15 דקות.
- יש להסיר את עודפי הדגימה באמצעות מגבון מעבדה ולאפשר לה להתייבש באוויר למשך 3 דקות.
- יש לדגור על 10 μL של תמיסת 1% חומצה פוספוטונגסטית (PTA) כדי להכתים את הדגימה למשך 3 דקות.
- יש להסיר את עודפי תמיסת ה-PTA 1% באמצעות מגבון מעבדה ולאפשר לה להתייבש באוויר למשך 3 דקות.
- השתמש בדגימה להדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.
הערה: עיין באיור 1 לקבלת שלבי הניסוי הסכמטיים המסוכמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 מראה של-hUC-MSC-sEV יש מצב גודל חלקיקים של 53 ננומטר, בעוד ששיאים משמעותיים אחרים של גודל חלקיקים היו 96 ו-115 ננומטר. ריכוז hUC-MSC-sEV שנמדד על ידי נת"ע היה 7.75 ×10 10 חלקיקים למ"ל. ריכוז החלבונים של hUC-MSC-sEV שנמדד בבדיקת BCA היה כ-80 מיקרוגרם/מ"ל.
בניתוח כתמים מערביים, hUC-MSC-sEV הדגימו פסים חיוביים עבור סמנים אקסוזומליים CD9, CD81 ו-TSG101, אך היו שליליים עבור GRP94 (איור 3). GRP94 הוא סמן רשתית אנדופלסמי המשמש בדרך כלל כסמן שלילי עבור sEVs. hUC-MSC-sEV המבודדים הודגמו תחת TEM כדי לקבוע את גודלם ואת המורפולוגיה שלהם. hUC-MSCs-sEVs בגודל ~100 ננומטר והראו מבנה קרום דו-שכבתי דמוי גביע (איור 4).
איור 1: סכמת עבודה של בידוד, ניקוי ואפיון של כלי רכב חשמליים. המדיום המותנה נאסף מתרבית MSC וסונן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר כדי להסיר חלקיקים גדולים. התווך המסונן הועבר ליחידת סינון צנטריפוגלית כדי לרכז את כלי הרכב החשמליים ולצנטריפוגה הפוכה כדי לאסוף את כלי הרכב החשמליים המרוכזים. לאחר מכן הושעו מחדש כלי הרכב החשמליים המרוכזים באמצעות PBS קר ומסונן, והצעדים חזרו על עצמם עם יחידת סינון צנטריפוגלית לשלבי השטיפה. לבסוף, כלי הרכב החשמליים עוקרו על ידי סינון של 0.22 מיקרומטר לפני שאופיינו באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, ניתוח כתמים מערביים ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים של hUC-MSC-sEV מבודדים. ה-hUC-MSC-sEV דוללו פי 100-1,000 ב-PBS מובהר ונמדדו באמצעות Nanosight NS300 המצויד במצלמת CMOS, עדשת 20x אובייקטיבית, מודול לייזר כחול (488 ננומטר) ותוכנת NTA. הנתון הוא ייצוג של נת"ע בשלשה. קיצורים: hUC-MSC-sEVs = שלפוחיות חוץ תאיות קטנות MSC שמקורן בחבל הטבור האנושי; נת"ע = ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים; CMOS = מוליך למחצה משלים של תחמוצת מתכת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ביטוי הסמן הביולוגי של hUC-MSC-sEVs . (A) ניתוח כתם מערבי של סמן חיובי אקסוזומלי CD9. (B) ניתוח כתמים מערביים של סמן חיובי אקסוזומלי CD81. (C) ניתוח כתמים מערביים של סמן חיובי אקסוזומלי TSG101. (D) ניתוח כתם מערבי של סמן שלילי GRP94. כל ארבעת הסמנים הושוו לליזט התא כביקורת. משמאל לימין, סולם, Cell lysate, hUC-MSC-sEVs (A,B); סולם, hUC-MSC-sEVs, Cell lysate, hUC-MSC-sEVs, Cell lysate (C); סולם, תא ליזט, hUC-MSC-sEV (D). זוגות התא ליזט הם משני עותקים משוכפלים, ותמונות אלה הן תמונות מייצגות מניסויים שבוצעו במשולש. קיצור: hUC-MSC-sEVs = שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות MSC שמקורן בחבל הטבור האנושי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מורפולוגיה של hUC-MSC-sEV בודדים תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. hUC-MSC-sEVs הודגרו על רשת נחושת מצופה פחמן והוכתמו בחומצה פוספוטונגסטית 1% לפני שנצפו תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. hUC-MSC-sEVs, בגודל של כ-100 ננומטר, הראו מבנה קרום דו-שכבתי דמוי גביע. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. התמונה היא נציגה של שלושה לכידות עצמאיות. קיצור: hUC-MSC-sEVs = שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות MSC שמקורן בחבל הטבור האנושי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כלי רכב חשמליים הם אחת מתת-הקבוצות החשובות של ההפרשה ב-MSCs הממלאים תפקיד מכריע במהלך תהליכים נורמליים ופתולוגיים. עם זאת, sEVs, עם טווח גודל בין 30 ל -200 ננומטר, עלו ככלי פוטנציאלי לטיפול ללא תאים בעשור האחרון. טכניקות שונות פותחו כדי לבודד sEV מ MSCs. עם זאת, אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית, אולטרה-סינון, משקעים מבוססי פולימרים, לכידת זיקה חיסונית ומשקעים מבוססי מיקרופלואידיקה הם בעלי יתרונות וחסרונות שונים17. אף אחת מטכניקות בידוד אלה אינה יכולה להשיג שיעור החלמה גבוה וספציפיות. לפיכך, על החוקרים לבחור את השיטות המתאימות בהתאם להעדפותיהם בהתבסס על שיעור החלמה גבוה או ספציפיות גבוהה.
לפני הבידוד של MSCs sEVs, MSCs הוערכו עבור סמנים פני שטח חיוביים (CD90, CD105, CD73) וסמנים שליליים (CD34, CD11b, CD19, CD45 ו- HLA-DR) על ידי ציטומטריית זרימה כמתואר קודם18. היתרון הטכני של מחקר זה של כלי רכב חשמליים עשוי לספק פתרון למצב הנוכחי. זה דורש רק ספסל בסיסי שהוצב במעבדה כדי להימנע משימוש בציוד מתקדם כדי לבודד כלי רכב חשמליים. MSCs הורעבו עם מדיה תרבותית בפרוטוקול המתואר מבלי להוסיף שום סרום. זה חיוני כדי למנוע כל זיהום של כלי רכב חשמליים שמקורו בתוספי סרום. עם זאת, בהתחשב בכך שתוספי סרום הם בלתי נמנעים במקרים מסוימים, ניתן לשקול תוספי סרום מרוקנים אקסוזום בגיבוש מדיה תרבית מלאה. בנוסף, מדיה נטולת פנול אדום יכולה לשמש כתחליף למדיה סטנדרטית בתרבית מכיוון שמחוון pH נפוץ זה עלול לגרום לבעיות במדידות קולורימטריות15. ניתן לשפר את הפרוטוקול על ידי שימוש במסנן משאבה של 0.22 מיקרומטר במקום מסנן מזרקים רגיל במהלך הסרת חלקיקים הגדולים מ- 220 ננומטר. יש לנקוט אמצעי זהירות כדי לשפר את התשואה של כלי רכב חשמליים. בצנטריפוגה האחרונה של CM באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלית, יש להימנע מצנטריפוגה ממושכת כדי להבטיח שיש נפח תמיסה מספיק כדי להוציא את ה- sEV מהמסנן. התעלמות מכך עשויה להפחית את תפוקת כלי הרכב החשמליים שנאספו בשלב הצנטריפוגה ההפוכה.
פרוטוקול זה מוגבל להיקף המעבדה, וככזה, עשוי שלא להתאים לבידוד בקנה מידה גדול בתעשייה. זאת בשל העלות הגבוהה של שימוש חד פעמי ביחידת מסנן צנטריפוגלית, שאינה ריאלית לבידוד בקנה מידה גדול, הכולל בדרך כלל נפח של עד אלפי ליטרים של CM. לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול סינון פשוט בקנה מידה סטנדרטי לבידוד sEV הנגזרים מ- MSC. פרוטוקול זה מתאים גם לטיהור כלי רכב חשמליים מבודדים לצורך ניתוח נוסף במורד הזרם. למרות שפרוטוקול זה תוכנן במיוחד עבור כלי רכב חשמליים שמקורם ב-MSC, ניתן להשתמש בחלק מהפרוטוקול המתואר כדי לבודד כלי רכב חשמליים ממקורות שונים, כגון נוזל גוף, קווי תאים או מקורות אחרים מסוג נוזל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
פרסום סרטון זה נתמך על ידי My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).
- Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
- Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
- Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
- Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).
- Jayabalan, N., et al. Frontiers in Endocrinology. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).
- Wei, Y., et al. Biomaterials. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).
- Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).
