Summary
Bu protokol, insan göbek kordonu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin küçük hücre dışı veziküllerinin (hUC-MSC-sEV'ler) basit bir laboratuvar ölçeğinde tezgah üstü ayar ile nasıl izole edileceğini göstermektedir. İzole hUC-MSC-sEV'lerin boyut dağılımı, protein konsantrasyonu, sEVs belirteçleri ve morfolojisi, sırasıyla nanopartikül izleme analizi, BCA protein testi, batı lekesi ve iletim elektron mikroskobu ile karakterize edilir.
Abstract
Ultra santrifüjleme bazlı işlem, küçük hücre dışı veziküller (sEV'ler) izolasyonu için yaygın bir yöntem olarak kabul edilir. Bununla birlikte, bu izolasyon yönteminden elde edilen verim nispeten daha düşüktür ve bu yöntemler sEV alt tiplerini ayırmada verimsizdir. Bu çalışma, hUC-MSC'lerin şartlandırılmış ortamından ultrafiltrasyon ile başarıyla ayrılan insan göbek kordonu kaynaklı MSC küçük hücre dışı vezikülleri (hUC-MSC-sEV'ler) izole etmek için basit bir tezgah üstü filtrasyon yöntemini göstermektedir. İzole edilmiş hUC-MSC-sEV'lerin boyut dağılımı, protein konsantrasyonu, ekzozomal belirteçleri (CD9, CD81, TSG101) ve morfolojisi sırasıyla nanopartikül izleme analizi, BCA protein testi, batı lekesi ve iletim elektron mikroskobu ile karakterize edildi. İzole edilmiş hUC-MSC-sEV'lerin boyutu, 7.75 × 10 10 parçacık / mL'lik bir parçacık konsantrasyonu ve 80 μg / mL'lik bir protein konsantrasyonu ile 30-200 nm idi. Ekzozomal belirteçler CD9, CD81 ve TSG101 için pozitif bantlar gözlendi. Bu çalışma, hUC-MSC-sEV'lerin hUC-MSC'lerin şartlandırılmış ortamından başarıyla izole edildiğini ve karakterizasyonun, izole edilen ürünün Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimal Bilgi 2018 (MISEV 2018) tarafından belirtilen kriterleri karşıladığını göstermiştir.
Introduction
MISEV 2018'e göre, sEV'ler, fonksiyonel çekirdeği olmayan, 30-200 nm1 büyüklüğünde, replikasyon yapmayan lipit çift katmanlı parçacıklardır. MSC türevi sEV'ler, mikroRNA, sitokinler veya proteinler gibi doku rejenerasyonunda önemli rol oynayan önemli sinyal molekülleri içerir. Rejeneratif tıpta ve hücresiz tedavide giderek daha fazla araştırma "sıcak noktası" haline geldiler. Birçok çalışma, MSC kaynaklı sEV'lerin, immünomodülasyon 2,3,4,5, osteogenezi arttırma 6, diabetes mellitus7,8 veya vasküler rejenerasyon 9,10 gibi farklı durumların tedavisinde MSC'ler kadar etkili olduğunu göstermiştir. Erken faz denemeleri ilerledikçe, MSC'ler-EV'lerin klinik çevirisi ile ilgili üç ana anahtar konu vurgulanmıştır: EV'lerin verimi, EV'lerin saflığı (hücre kalıntılarından ve protein ve sitokinler gibi diğer biyolojik kirleticilerden arındırılmış) ve izolasyondan sonra EV'lerin fosfolipid çift katmanlı zarının bütünlüğü.
sEV'leri izole etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, sEV'lerin11'in yoğunluğundan, şeklinden, boyutundan ve yüzey proteininden yararlanılmıştır. EV izolasyonlarında en yaygın iki yöntem ultrasantrifüjleme tabanlı ve ultrafiltrasyon bazlı tekniklerdir.
Ultra santrifüjleme bazlı yöntemler, sEV'lerin izolasyonunda altın standart yöntemler olarak kabul edilir. Genellikle kullanılan iki tip ultrasantrifüjleme tekniği, diferansiyel ultrasantrifüjleme ve yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjlemedir. Bununla birlikte, ultrasantrifüjleme yöntemleri genellikle düşük verimle sonuçlanır ve yüksek hızlı ultra santrifüj (100.000-200.000 × g) için pahalı ekipman gerektirir11. Ayrıca, ultrasantrifüjleme teknikleri tek başına EV alt tiplerinin (sEV'ler ve büyük EV'ler) ayrılmasında verimsizdir ve saf olmayan bir tortu tabakası11 ile sonuçlanır. Son olarak, yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme de zaman alıcı olabilir ve hızlanma ve yavaşlama adımları12 sırasında gradyan hasarını önlemek için sakkaroz tampon ilavesi gibi ek önlem adımları gerektirebilir. Bu nedenle, ultrasantrifüjleme genellikle nispeten düşük bir verime yol açar ve farklı EVs13 popülasyonları arasında ayrım yapamaz, bu da büyük ölçekli EV hazırlığı11 için uygulamasını sınırlar.
İkinci EV izolasyon yöntemi, boyut filtrasyonuna dayanan ultrafiltrasyon yoluyladır. Ultrafiltrasyon, pahalı ekipman veya uzun işleme süreleri içermediğinden ultrasantrifüjlemeye kıyasla nispeten zaman ve maliyet etkindir14. Bu nedenle, ultrafiltrasyon, yukarıda belirtilen her iki ultrasantrifüjleme yönteminden daha etkili bir izolasyon tekniği gibi görünmektedir. İzole edilen ürünler, gözenek boyutlarına ve daha yüksek verime bağlı olarak daha spesifik olabilir15. Bununla birlikte, filtreleme işlemi sırasında ortaya çıkan ek kuvvet, EV'lerin16'sının deformasyonuna veya patlamasına neden olabilir.
Mevcut makale, MSC'den türetilmiş sEV'leri aşağı akış analizi ve terapötik amaçlar için izole etmek için maliyet ve zaman açısından etkili bir tezgah üstü protokol önermiştir. Bu makalede açıklanan yöntem, partikül boyutu analizi, biyobelirteç testi ve elektron mikroskobik görüntüleme dahil olmak üzere aşağı akış analizi için yüksek verimli ve kaliteli EV'leri hUC-MSC'lerden izole etmek için basit bir filtreleme yöntemini tezgah üstü santrifüjleme ile birleştirdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, ekipmanlar ve yazılımlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. İnsan göbek kordonu mezenkimal kök hücreler ve kültür
- DMEM'de 5 × 103/cm2'lik bir tohumlama yoğunluğunda hUC-MSC'leri kültürleyin,% 8 İnsan Trombosit Lizatı ve% 1 Pen-Strep ile desteklenmiştir. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2'de inkübe edin. Uygun hücre büyümesini sağlamak için hücre kültürü ortamını her 3 günde bir değiştirin.
- sEV izolasyonu için hücreleri T175 şişelerinde 5. pasaja genişletin.
NOT: Yüksek miktarda sEV toplamak için birçok şişeye ihtiyaç vardır (verim, hücre sayısıyla birlikte artar).
2. hUC'den küçük hücre dışı vezikül izolasyonu - MSC'ler
- Kültür ortamını, 5. pasajda kültür %70-%80 akıcılığa ulaştığında %1 Pen-Strep [Şartlandırılmış ortam (CM)] ile desteklenmiş taze fenol-kırmızı serbest DMEM ile değiştirin.
DİKKAT: Yalnızca bazal medya kullanın; Harici sEV'lerin kontaminasyonunu önlemek için FBS ve insan trombosit lizat takviyesinden kaçının. - 24 saat sonra, hücre kalıntılarını gidermek için CM'yi 200 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. 220 nm'den büyük parçacıkları çıkarmak için süpernatantı 0,22 μm'lik bir filtreden toplayın ve filtreleyin.
- Santrifüjlü filtre ünitesini, 0,2 μm'lik bir filtreden süzülmüş 30 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurun. Santrifüj filtre ünitesini 3.500 × g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Filtrelenmiş CM'yi santrifüj filtre ünitesine doldurun (her ünitenin maksimum hacmi 70 mL'dir). CM'yi 4 °C'de 3.500 × g'da santrifüjleyin.
NOT: Santrifüjleme süresi, çözelti filtrenin yüzeyine ulaşana kadar zaman zaman izlenmelidir. - Çözeltiyi filtrat çözelti kabına atın. Numune filtre kabını, konsantre toplama kabı ile 4 °C'de 4 °C'de 2 dakika boyunca ters santrifüjleyin.
- Konsantre CM'yi tekrar santrifüj filtre ünitesine aktarın. Santrifüj filtre ünitesine 30 mL filtrelenmiş PBS ekleyin ve üniteyi 4 °C'de 3.500 × g'da santrifüj edin.
- Çözeltiyi filtrat çözelti kabına atın. Filtre ünitesine bir konsantre toplama kabı takın ve saflaştırılmış sEV'leri elde etmek için 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1.000 × g'da ters santrifüj yapın.
- sEV'leri 0,22 μm şırınga filtresinden geçirin.
- Numuneleri yeni tüplere aktarın ve daha fazla analiz için -80 ° C'de saklayın.
3. hUC-MSC-sEV'lerin karakterizasyonu
- Nanopartikül izleme analizi
- Filtrelenmiş PBS'deki izole edilmiş hUC-MSC-sEV'leri 20-100 parçacık/çerçeveye seyreltin.
- 1 mL tek kullanımlık şırıngalar kullanarak seyreltilmiş numunenin 1 mL'sini NTA odasına yerleştirin.
- Ölçüm ayarlarını buna göre ayarlayın: kamera seviyesini seviye 14'e ayarlayın, 10-100 kırmızı çarpı işaretinin sayılması kısıtlamasıyla mümkün olduğunca çok parçacık içerecek şekilde algılama eşiğini belirleyin ve mavi çarpı sayısı beş ile sınırlıdır.
- Her ölçüm için beş adet 1 dakikalık video kaydedin ve bunları beş algılama eşiğine sahip NanoSight Yazılımını kullanarak analiz edin.
- Her numune için üçlü olarak ölçümler yapın.
- Batı lekelenme analizi
- hUC-MSC-sEV'leri buz gibi soğuk radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) lizis tamponu ile lize edin, 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj yapın. Supernatan'ı topla.
- Bir Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kiti kullanarak proteini sayısallaştırın. Jel elektroforez setini buna göre monte edin ve protein istifleme jelinin sonuna ulaşana kadar 90 V'ta jel elektroforezi gerçekleştirin. Çözücü jelin sonuna kadar proteinleri ayırmak için voltajı 200 V olarak değiştirin.
- Proteinleri jelden 1 saat boyunca 15 V'ta bir poliviniliden diflorür (PVDF) membranına aktarmak için yarı kuru transfer gerçekleştirin.
- PVDF membranını oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda 1 saat boyunca %3 sığır serum albümini (BSA)/Tris tamponlu salin-%0,1 v/v Tween 20 (TBS-T) ile bloke edin. PVDF membranını birincil antikorlarla aşağıdaki gibi inkübe edin: fare anti-CD 9 monoklonal antikoru (1:500), fare anti-CD 81 monoklonal antikoru (1:500), fare anti-CTP 94 monoklonal fare anti-TSG 101 monoklonal antikoru (1:500) gece boyunca sürekli sallanarak.
- Ertesi gün, PVDF zarını TBS-T ile 5 x 5 dakika yıkayın ve ikincil bir antikor ile daha fazla inkübe edin: yaban turpu peroksidaz konjuge fare IgG kappa bağlayıcı protein (m-IgGκ BP-HRP) (1:5,000) oda sıcaklığında ajitasyonla 1 saat boyunca.
- Yine, PVDF membranını TBS-T ile beş kez yıkayın ve membranı bir kemilüminesans algılama reaktifi kullanarak şarj bağlantılı (CCD) bir görüntüleyicide görselleştirin. ImageJ yazılımını kullanarak proteinlerin ekspresyon seviyesini analiz edin. İlk olarak, görüntü dosyasını ImageJ (Dosya | Açık...). Parlaklığı ve kontrastı ayarlayarak görüntünün kalitesini artırın (Resim | Ayarlama | Parlaklık/Kontrast). Lekeler açıkça görünene kadar görüntüyü ayarlayın, Uygula düğmesine tıklayın ve ardından görüntüleri TIFF biçiminde kaydedin (Dosya | Farklı Kaydet | TIFF...).
- İletim elektron mikroskobu
- hUC-MSC-sEVs numunesinin bir kısmını dört parça filtrelenmiş PBS ile toplam 10 μL hacme kadar seyreltin ve karbon kaplı bakır ızgarada 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Fazla numuneyi bir laboratuvar mendili kullanarak çıkarın ve 3 dakika boyunca hava ile kurumasını bekleyin.
- Numuneyi 3 dakika boyamak için 10 μL% 1 fosfotungstik asit (PTA) çözeltisini inkübe edin.
- Fazla %1 PTA çözeltisini bir laboratuvar mendili kullanarak çıkarın ve 3 dakika boyunca hava ile kurumasını bekleyin.
- İletim elektron mikroskobu görüntülemesi için numuneyi kullanın.
NOT: Özetlenen şematik deneme adımları için Şekil 1'e bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2 , hUC-MSC-sEV'lerin 53 nm'de bir parçacık boyutu moduna sahip olduğunu, partikül boyutunun diğer önemli zirvelerinin ise 96 ve 115 nm olduğunu göstermektedir. NTA tarafından ölçülen hUC-MSC-sEV'lerin konsantrasyonu 7.75 ×10 10 parçacık / mL idi. BCA testi ile ölçülen hUC-MSC-sEV'lerin protein konsantrasyonu yaklaşık 80 μg / mL idi.
Batı lekeleme analizinde, hUC-MSC-sEV'ler CD9, CD81 ve TSG101 eksozomal belirteçleri için pozitif bantlar gösterdi, ancak GRP94 için negatifti (Şekil 3). GRP94, sEV'ler için negatif bir belirteç olarak yaygın olarak kullanılan bir endoplazmik retikulum belirtecidir. İzole edilmiş hUC-MSC-sEV'ler, boyutlarını ve morfolojilerini belirlemek için TEM altında görselleştirildi. hUC-MSC'ler-sEV'ler ~ 100 nm boyutundadır ve fincan benzeri çift katmanlı bir membran yapısı göstermiştir (Şekil 4).
Şekil 1: sEV'lerin izolasyonu, temizlenmesi ve karakterizasyonunun çalışma şeması. Şartlandırılmış ortam MSC kültüründen toplandı ve büyük parçacıkları gidermek için 0.22 μm'lik bir filtreden geçirildi. Filtrelenmiş ortam, sEV'leri konsantre etmek için bir santrifüj filtre ünitesine aktarıldı ve konsantre sEV'leri toplamak için ters santrifüj edildi. Konsantre sEV'ler daha sonra soğuk, filtrelenmiş PBS ile yeniden askıya alındı ve yıkama adımları için adımlar bir santrifüj filtre ünitesi ile tekrarlandı. Son olarak, sEV'ler nanopartikül izleme analizi, batı lekeleme analizi ve iletim elektron mikroskobu kullanılarak karakterize edilmeden önce 0.22 μm filtrasyon ile sterilize edildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İzole hUC-MSC-sEV'lerin Nanopartikül İzleme Analizi. hUC-MSC-sEV'ler 100-1.000x arıtılmış PBS ile seyreltildi ve CMOS kamera, 20x objektif lens, mavi lazer modül (488 nm) ve NTA yazılımı ile donatılmış Nanosight NS300 kullanılarak ölçüldü. Şekil, NTA'nın üçlü olarak bir temsilidir. Kısaltmalar: hUC-MSC-sEVs = insan göbek kordonu kaynaklı MSC küçük hücre dışı veziküller; NTA = nanopartikül izleme analizi; CMOS = tamamlayıcı metal oksit yarı iletken. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: hUC-MSC-sEV'lerin biyobelirteç ekspresyonu . (A) CD9 ekzozomal pozitif belirtecinin Batı leke analizi. (B) CD81 ekzozomal pozitif belirtecinin Batı leke analizi. (C) TSG101 ekzozomal pozitif belirtecinin Batı leke analizi. (D) GRP94 negatif belirtecinin Batı leke analizi. Dört belirtecin tümü kontrol olarak hücre lizatı ile karşılaştırıldı. Soldan sağa, Merdiven, Hücre lizatı, hUC-MSC-sEV'ler (A,B); Merdiven, hUC-MSC-sEV'ler, Hücre lizat, hUC-MSC-sEV'ler, Hücre lizatı (C); Merdiven, Hücre lizat, hUC-MSC-sEV'ler (D). Hücre lizat çiftleri iki kopyadan oluşur ve bu görüntüler üçlü olarak gerçekleştirilen deneylerden temsili görüntülerdir. Kısaltma: hUC-MSC-sEVs = insan göbek kordonu kaynaklı MSC küçük hücre dışı veziküller. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İletim elektron mikroskobu altında tek hUC-MSC-sEV'lerin morfolojisi. hUC-MSC-sEV'ler karbon kaplı bir bakır ızgara üzerinde inkübe edildi ve iletim elektron mikroskobu altında görülmeden önce% 1 fosfotungstik asit ile boyandı. Yaklaşık 100 nm büyüklüğündeki hUC-MSC-sEV'ler, fincan benzeri çift katmanlı bir membran yapısı gösterdi. Ölçek çubuğu = 100 nm. Görüntü, üç bağımsız yakalamanın bir temsilcisidir. Kısaltma: hUC-MSC-sEVs = insan göbek kordonu kaynaklı MSC küçük hücre dışı veziküller. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EV'ler, normal ve patolojik süreçler sırasında çok önemli bir rol oynayan MSC'lerdeki sekretomun önemli alt kümelerinden biridir. Bununla birlikte, 30 ila 200 nm arasında bir boyut aralığına sahip olan sEV'ler, son on yılda hücresiz tedavi için potansiyel bir araç olarak artmıştır. sEV'leri MSC'lerden izole etmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, diferansiyel ultrasantrifüjleme, ultrafiltrasyon, polimer bazlı çökeltme, immünoaffinite yakalama ve mikroakışkan bazlı çökeltme farklı avantaj ve dezavantajlara sahiptir17. Bu izolasyon tekniklerinin hiçbiri yüksek bir iyileşme oranı ve özgüllük elde edemez. Bu nedenle, araştırmacılar yüksek iyileşme oranına veya yüksek özgüllüğe dayalı olarak tercihlerine göre uygun yöntemleri seçmelidir.
MSC'lerin sEV'lerinin izolasyonundan önce, MSC'ler pozitif yüzey belirteçleri (CD90, CD105, CD73) ve negatif belirteçler (CD34, CD11b, CD19, CD45 ve HLA-DR) için daha önce tarif edildiği gibi akış sitometrisi ile değerlendirildi18. Bu sEV'ler çalışmasının teknik avantajı, mevcut duruma bir çözüm sağlayabilir. sEV'leri izole etmek için üst düzey ekipman kullanmaktan kaçınmak için laboratuvarda yalnızca temel bir tezgah üstü kurulum gerektirir. MSC'ler, açıklanan protokolde herhangi bir serum eklenmeden kültür medyası ile aç bırakıldı. Bu, serum takviyesinden kaynaklanan EV'lerin kontaminasyonunu önlemek için çok önemlidir. Bununla birlikte, bazı durumlarda serum takviyelerinin kaçınılmaz olduğu göz önüne alındığında, eksozom tükenmiş serum takviyeleri, tam kültür ortamının formüle edilmesinde düşünülebilir. Ek olarak, fenol kırmızısı içermeyen ortam, standart kültür ortamının yerine kullanılabilir, çünkü bu yaygın pH göstergesi potansiyel olarak kolorimetrik ölçümlerle ilgili sorunlara neden olabilir15. Protokol, 220 nm'den büyük partiküllerin uzaklaştırılması sırasında geleneksel bir şırınga filtresi yerine 0,22 μm'lik bir pompa filtresi kullanılarak geliştirilebilir. SEV'lerin verimini artırmak için önlemler alınmalıdır. CM'nin bir santrifüjlü filtre ünitesinden geçen son santrifüjlemesinde, sEV'leri filtreden çıkarmak için yeterli miktarda çözelti olduğundan emin olmak için uzun süreli santrifüjlemeden kaçınılmalıdır. Bunu göz ardı etmek, ters santrifüjleme adımı sırasında toplanan sEV'lerin verimini azaltabilir.
Bu protokol laboratuvar ölçeği ile sınırlıdır ve bu nedenle endüstride büyük ölçekli izolasyon için uygun olmayabilir. Bunun nedeni, genellikle binlerce litreye kadar CM'lik bir hacim içeren büyük ölçekli izolasyon için uygun olmayan bir santrifüjlü filtre ünitesinin bir kerelik kullanımının yüksek maliyetinden kaynaklanmaktadır. Özetle, MSC'lerden türetilen sEV'leri izole etmek için basit, tezgah üstü ölçekli bir filtreleme protokolü sunuyoruz. Bu protokol aynı zamanda daha fazla aşağı akış analizi için izole edilmiş sEV'lerin saflaştırılması için de uygundur. Bu protokol özellikle MSC'lerden türetilen sEV'ler için tasarlanmış olsa da, açıklanan protokolün bir kısmı sEV'leri vücut sıvısı, hücre hatları veya diğer sıvı tipi kaynaklar gibi farklı kaynaklardan izole etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu videonun yayınlanması My CytoHealth Sdn. Bhd tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).
- Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
- Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
- Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
- Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).
- Jayabalan, N., et al. Frontiers in Endocrinology. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).
- Wei, Y., et al. Biomaterials. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).
- Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).
