Summary
Detta protokoll visar hur man isolerar humana navelsträngshärledda mesenkymala stamcellers små extracellulära vesiklar (hUC-MSC-sEVs) med en enkel bänkinställning i laboratorieskala. Storleksfördelningen, proteinkoncentrationen, sEV-markörerna och morfologin hos isolerade hUC-MSC-sEVs kännetecknas av nanopartikelspårningsanalys, BCA-proteinanalys, western blot respektive transmissionselektronmikroskop.
Abstract
Den ultracentrifugeringsbaserade processen anses vara den vanliga metoden för isolering av små extracellulära vesiklar (sEV). Utbytet från denna isoleringsmetod är dock relativt lägre, och dessa metoder är ineffektiva för att separera sEV-subtyper. Denna studie demonstrerar en enkel bänkfiltreringsmetod för att isolera humana navelsträngshärledda MSC små extracellulära vesiklar (hUC-MSC-sEVs), framgångsrikt separerade genom ultrafiltrering från det konditionerade mediet av hUC-MSC. Storleksfördelningen, proteinkoncentrationen, exosomala markörer (CD9, CD81, TSG101) och morfologin hos de isolerade hUC-MSC-sEVs karakteriserades med nanopartikelspårningsanalys, BCA-proteinanalys, western blot respektive transmissionselektronmikroskop. De isolerade hUC-MSC-sEVs storlek var 30-200 nm, med en partikelkoncentration på 7,75 × 10 10 partiklar/ml och en proteinkoncentration på80 μg/ml. Positiva band för exosomala markörer CD9, CD81 och TSG101 observerades. Denna studie visade att hUC-MSC-sEVs framgångsrikt isolerades från hUC-MSCs konditionerade medium, och karakterisering visade att den isolerade produkten uppfyllde kriterierna som nämns i Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).
Introduction
Enligt MISEV 2018 är sEV icke-replikerande lipid-dubbelskiktspartiklar utan funktionell kärna närvarande, med en storlek på 30-200 nm1. MSC-härledda sEVs innehåller viktiga signalmolekyler som spelar viktiga roller i vävnadsregenerering, såsom mikroRNA, cytokiner eller proteiner. De har alltmer blivit en "hotspot" för forskning inom regenerativ medicin och cellfri terapi. Många studier har visat att MSC-härledda sEVs är lika effektiva som MSC vid behandling av olika tillstånd, såsom immunmodulering 2,3,4,5, förbättrad osteogenes6, diabetes mellitus 7,8 eller vaskulär regenerering 9,10. I takt med att prövningarna i tidig fas fortskrider har tre huvudfrågor i samband med den kliniska översättningen av MSC-EV lyfts fram: EV: s utbyte, EV: s renhet (fri från cellskräp och andra biologiska föroreningar som protein och cytokiner) och integriteten hos fosfolipid-dubbelskiktsmembranet i EV: erna efter isolering.
Olika metoder har utvecklats för att isolera sEV och utnyttja densiteten, formen, storleken och ytproteinet hos sEVs11. De två vanligaste metoderna vid sEV-isolering är ultracentrifugeringsbaserade och ultrafiltreringsbaserade tekniker.
Ultracentrifugeringsbaserade metoder betraktas som guldstandardmetoder i sEVs isolering. Två typer av ultracentrifugeringstekniker som vanligtvis används är differentiell ultracentrifugering och densitetsgradient ultracentrifugering. Ultracentrifugeringsmetoder resulterar emellertid ofta i lågt utbyte och kräver dyr utrustning för höghastighets ultracentrifug (100 000–200 000 × g)11. Dessutom är enbart ultracentrifugeringstekniker ineffektiva när det gäller att separera EV-subtyper (sEV och stora EV), vilket resulterar i ett orent sedimentskikt11. Slutligen kan ultracentrifugering av densitetsgradienter också vara tidskrävande och kräva ytterligare försiktighetssteg såsom tillsats av sackarosbuffert för att hämma gradientskadorna under accelerations- och retardationssteg12. Därför leder ultracentrifugering vanligtvis till ett relativt lågt utbyte och kan inte diskriminera mellan olika populationer av EV13, vilket begränsar dess tillämpning för storskalig EV-beredning11.
Den andra metoden för EV-isolering är via ultrafiltrering, som är baserad på storleksfiltrering. Ultrafiltrering är relativt tids- och kostnadseffektivt jämfört med ultracentrifugering, eftersom det inte innebär dyr utrustning eller långa bearbetningstider14. Därför verkar ultrafiltrering vara en effektivare isoleringsteknik än båda ovannämnda ultracentrifugeringsmetoder. De isolerade produkterna kan vara mer specifika baserat på porstorlekar och högre utbyte15. Den extra kraft som uppstår under filtreringsprocessen kan dock leda till deformation eller utbrott av EV16.
Det aktuella dokumentet föreslog ett kostnads- och tidseffektivt bänkprotokoll för att isolera MSC-härledda sEVs för nedströmsanalys och terapeutiska ändamål. Metoden som beskrivs i detta dokument kombinerade en enkel filtreringsmetod med bänkcentrifugering för att isolera EV med hög avkastning och god kvalitet från hUC-MSC för nedströmsanalys, inklusive partikelstorleksanalys, biomarköranalys och elektronmikroskopisk avbildning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se materialförteckningen för detaljer om alla material, utrustning och programvara som används i detta protokoll.
1. Mänskliga navelsträngsmesenkymala stamceller och odling
- Odla hUC-MSC vid en sådddensitet på 5 × 103/cm2 i DMEM, kompletterat med 8% humant trombocytlysat och 1% Pen-Strep. Inkubera cellerna vid 37 °C i 5 %CO2. Byt ut cellodlingsmediet var 3: e dag för att säkerställa korrekt celltillväxt.
- Expandera cellerna för att passera 5 i T175-kolvar för sEV-isolering.
OBS: Många kolvar behövs för att skörda ett högt utbyte av sEV (utbytet ökar med antalet celler).
2. Liten extracellulär vesikelisolering från hUC - MSC
- Byt ut odlingsmediet med färskt fenolrött fritt DMEM kompletterat med 1% Pen-Strep [konditionerat medium (CM)] när kulturen når 70% -80% sammanflöde vid passage 5.
VARNING: Använd endast basala medier; undvik FBS och humant trombocytlysattillskott för att undvika kontaminering av externa sEV. - Efter 24 timmar, centrifugera CM vid 200 × g i 5 min vid 4 ° C för att avlägsna cellskräp. Samla upp och filtrera supernatanten genom ett 0,22 μm filter för att avlägsna partiklar större än 220 nm.
- Fyll centrifugalfilterenheten med 30 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) filtrerad genom ett 0,2 μm filter. Centrifugera centrifugalfilterenheten vid 3 500 × g i 5 min vid 4 °C.
- Fyll den filtrerade CM i centrifugalfilterenheten (varje enhets maximala volym är 70 ml). Centrifugera CM vid 3 500 × g vid 4 °C.
OBS: Centrifugeringens varaktighet bör övervakas från tid till annan tills lösningen har nått filtrets yta. - Kassera lösningen i filtratets lösningskopp. Omvänd centrifugera provfilterkoppen med koncentratuppsamlingsbägare vid 1 000 x g vid 4 °C i 2 minuter.
- Överför den koncentrerade CM tillbaka till centrifugalfilterenheten. Tillsätt 30 ml filtrerad PBS i centrifugalfilterenheten och centrifugera enheten vid 3 500 × g vid 4 °C.
- Kassera lösningen i filtratets lösningskopp. Installera en uppsamlingskopp på filterenheten och omvänd centrifug vid 1 000 × g i 2 minuter vid 4 °C för att erhålla de renade sEV.
- Filtrera sEVs genom ett 0,22 μm sprutfilter.
- Överför proverna till nya rör och förvara dem vid -80 °C för vidare analys.
3. Karakterisering av hUC-MSC-sEVs
- Analys av nanopartikelspårning
- Späd de isolerade hUC-MSC-sEVs i filtrerad PBS till 20-100 partiklar/ram.
- För in 1 ml av det utspädda provet i NTA-kammaren med 1 ml engångssprutor.
- Ställ in mätinställningarna därefter: justera kameranivån till nivå 14, bestäm detektionströskeln för att inkludera så många partiklar som möjligt med begränsningen att 10-100 röda kors räknas och det blå korsantalet är begränsat till fem.
- För varje mätning, spela in fem 1 min videor och analysera dem med hjälp av NanoSight Software med en detektionströskel på fem.
- Gör mätningar i tre exemplar för varje prov.
- Analys av västerländsk blotting
- Lysera hUC-MSC-sEVs med iskall RIPA-lyseringsanalys (radioimmunoprecipitationsanalys), inkubera i 30 minuter vid 4 °C och centrifugera vid 200 × g i 5 minuter vid 4 °C. Samla supernatanten.
- Kvantifiera proteinet med hjälp av ett Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit. Montera gelelektroforesen i enlighet därmed och utför gelelektrofores vid 90 V tills proteinet når staplingsgelens ände. Ändra spänningen till 200 V för att separera proteinerna till slutet av den upplösande gelen.
- Utför semidry transfer för att överföra proteinerna från gelen till ett polyvinylidendifluoridmembran (PVDF) vid 15 V i 1 timme.
- Blockera PVDF-membranet med 3% bovint serumalbumin (BSA)/Tris-buffrad saltlösning-0,1% v/v Tween 20 (TBS-T) i 1 timme på en shaker vid rumstemperatur. Inkubera PVDF-membranet med primära antikroppar enligt följande: mus anti-CD 9 monoklonal antikropp (1:500), mus anti-CD 81 monoklonal antikropp (1:500), mus anti-GRP 94 monoklonal mus anti-TSG 101 monoklonal antikropp (1:500) vid 4 °C över natten med konstant skakning.
- Nästa dag, tvätta PVDF-membranet 5 x 5 min med TBS-T och inkubera ytterligare med en sekundär antikropp: pepparrotsperoxidaskonjugerat mus-IgG kappabindande protein (m-IgGκ BP-HRP) (1:5 000) i 1 timme med omrörning vid rumstemperatur.
- Tvätta PVDF-membranet med TBS-T fem gånger och visualisera membranet i en laddningskopplad (CCD) avbildning med hjälp av ett kemiluminiscensdetekteringsreagens. Analysera uttrycksnivån för proteinerna med hjälp av ImageJ-programvaran. Öppna först bildfilen i ImageJ (File | Öppet...). Förbättra bildens kvalitet genom att justera ljusstyrka och kontrast (Bild | Justera | Ljusstyrka/kontrast). Justera bilden tills blottorna syns tydligt, klicka på knappen Apply och spara sedan bilderna i TIFF-format (File | Spara som | TIFF...).
- Transmissionselektronmikroskop
- Späd en del av hUC-MSC-sEVs-provet med fyra delar filtrerad PBS till en total volym på 10 μl och inkubera på ett kolbelagt koppargaller i 15 minuter.
- Ta bort överflödigt prov med en laboratorieduk och låt det lufttorka i 3 minuter.
- Inkubera 10 μl 1% fosfotungstisk syralösning (PTA) för att färga provet i 3 minuter.
- Ta bort överflödig 1% PTA-lösning med en laboratorieduk och låt den lufttorka i 3 minuter.
- Använd provet för transmissionselektronmikroskopavbildning.
Se figur 1 för de sammanfattade schematiska experimentstegen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 visar att hUC-MSC-sEVs har ett partikelstorleksläge vid 53 nm, medan andra signifikanta toppar av partikelstorlek var 96 och 115 nm. Koncentrationen av hUC-MSC-sEVs uppmätt med NTA var 7,75 × 1010 partiklar/ml. Proteinkoncentrationen av hUC-MSC-sEVs uppmätt med BCA-analysen var cirka 80 μg/ml.
I western blotting-analys visade hUC-MSC-sEVs positiva band för exosomala markörer CD9, CD81 och TSG101, men var negativa för GRP94 (figur 3). GRP94 är en endoplasmatisk retikulummarkör som vanligtvis används som en negativ markör för sEV. De isolerade hUC-MSC-sEVs visualiserades under TEM för att bestämma deras storlek och morfologi. hUC-MSC-sEVs storlek ~ 100 nm och visade en koppliknande tvåskiktsmembranstruktur (figur 4).
Figur 1: Arbetsschema för isolering, rengöring och karakterisering av sEV. Det konditionerade mediet samlades in från MSC-kulturen och filtrerades genom ett 0,22 μm filter för att avlägsna stora partiklar. Det filtrerade mediet överfördes till en centrifugalfilterenhet för att koncentrera sEV: erna och omvändcentrifugerades för att samla upp de koncentrerade sEV: erna. De koncentrerade sEV: erna återsuspenderades sedan med kall, filtrerad PBS, och stegen upprepades med en centrifugalfilterenhet för tvättstegen. Slutligen steriliserades sEV: erna genom 0,22 μm filtrering innan de karakteriserades med hjälp av nanopartikelspårningsanalys, western blotting-analys och transmissionselektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Nanopartikelspårningsanalys av isolerade hUC-MSC-sEV. hUC-MSC-sEVs späddes 100-1 000x med klarad PBS och mättes med Nanosight NS300 utrustad med en CMOS-kamera, en 20x objektivlins, en blå lasermodul (488 nm) och NTA-programvara. Figuren är en representation av NTA i tre exemplar. Förkortningar: hUC-MSC-sEVs = human navelsträngshärledd MSC små extracellulära vesiklar; NTA = analys av nanopartiklar; CMOS = komplementär metalloxidhalvledare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Biomarköruttrycket för hUC-MSC-sEVs . (A) Western blot-analys av CD9 exosomalt positiv markör. (B) Western blot-analys av CD81 exosomalt positiv markör. (C) Western blot-analys av TSG101 exosomalt positiv markör. (D) Western blot-analys av GRP94-negativ markör. Alla fyra markörerna jämfördes med celllysat som kontroll. Från vänster till höger, stege, celllysat, hUC-MSC-sEVs (A, B); Stege, hUC-MSC-sEVs, celllysat, hUC-MSC-sEVs, celllysat (C); Stege, celllysat, hUC-MSC-sEVs (D). Celllysatparen är från två replikat, och dessa bilder är representativa bilder från experiment utförda i tre exemplar. Förkortning: hUC-MSC-sEVs = human navelsträngshärledda MSC små extracellulära vesiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Morfologi för enstaka hUC-MSC-sEVs under transmissionselektronmikroskopi. hUC-MSC-sEVs inkuberades på ett kolbelagt kopparnät och färgades med 1% fosfotungstiksyra innan de betraktades under transmissionselektronmikroskopet. hUC-MSC-sEV, i storlek runt 100 nm, visade en koppliknande dubbelskiktsmembranstruktur. Skalstång = 100 nm. Bilden är en representant för tre oberoende fångster. Förkortning: hUC-MSC-sEVs = human navelsträngshärledda MSC små extracellulära vesiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EV är en av de viktiga delmängderna av sekretomet i MSC som spelar en avgörande roll under normala och patologiska processer. Men sEV, med ett storleksintervall mellan 30 och 200 nm, har ökat som ett potentiellt verktyg för cellfri terapi under det senaste decenniet. Olika tekniker utvecklades för att isolera sEV från MSC. Differentiell ultracentrifugering, ultrafiltrering, polymerbaserad utfällning, immunoaffinitetsinfångning och mikrofluidikbaserad utfällning har emellertid olika fördelar och nackdelar17. Ingen av dessa isoleringstekniker kan uppnå en hög återhämtningsgrad och specificitet. Således måste forskare välja lämpliga metoder enligt deras preferenser baserat på en hög återhämtningsgrad eller hög specificitet.
Före isoleringen av MSCs sEVs utvärderades MSC för positiva ytmarkörer (CD90, CD105, CD73) och negativa markörer (CD34, CD11b, CD19, CD45 och HLA-DR) genom flödescytometri som beskrivits tidigare18. Den tekniska fördelen med denna studie av elbilar kan ge en lösning på den nuvarande situationen. Det kräver bara en grundläggande bänkskiva i laboratoriet för att undvika att använda avancerad utrustning för att isolera sEV. MSC: erna svältes med odlingsmedier i det beskrivna protokollet utan tillsats av något serum. Detta är avgörande för att förhindra kontaminering av EV som härrör från serumtillskott. Men med tanke på att serumtillskott är oundvikliga i vissa fall kan exosomutarmade serumtillskott övervägas vid formulering av kompletta odlingsmedier. Dessutom skulle fenolröda medier kunna användas som ersättning för standardodlingssubstrat, eftersom denna gemensamma pH-indikator potentiellt skulle kunna orsaka problem med kolorimetriska mätningar15. Protokollet kan förbättras genom att använda ett 0,22 μm pumpfilter istället för ett konventionellt sprutfilter under avlägsnande av partiklar större än 220 nm. Försiktighetsåtgärder bör vidtas för att förbättra utbytet av elfordon. Vid den sista centrifugeringen av CM genom en centrifugalfilterenhet bör långvarig centrifugering undvikas för att säkerställa att det finns tillräcklig volym lösning för att eluera sEV från filtret. Att förbise detta kan minska utbytet av elfordon som samlats in under det omvända centrifugeringssteget.
Detta protokoll är begränsat till laboratorieskala och kan därför inte vara lämpligt för storskalig isolering inom industrin. Detta beror på den höga kostnaden för engångsanvändning av en centrifugalfilterenhet, vilket inte är möjligt för storskalig isolering, vilket i allmänhet innebär en volym på upp till tusentals liter CM. Sammanfattningsvis tillhandahåller vi ett enkelt filtreringsprotokoll i bänkskala för att isolera sEV som härrör från MSC. Detta protokoll är också lämpligt för rening av isolerade sEV för ytterligare nedströmsanalys. Även om detta protokoll är utformat specifikt för sEVs härledda från MSC, kan en del av det beskrivna protokollet användas för att isolera sEVs från olika källor, såsom kroppsvätska, cellinjer eller andra vätskekällor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Publiceringen av denna video stöddes av My CytoHealth Sdn. Bhd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).
- Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
- Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
- Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
- Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
- Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).
- Jayabalan, N., et al. Frontiers in Endocrinology. 8, Front Endocrinol. Lausanne. (2017).
- Wei, Y., et al. Biomaterials. 204, Biomaterials. 13-24 (2019).
- Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z.
- Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V.
- Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
- Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
- Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, San Diego, Calif. 64-74 (2015).
- Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).
