É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Ex Vivo Análise de Transientes de Ca2+ Ativados Mecanicamente em Células Uroteliais

1.2K vistas

⸱

DOI:

10.3791/64532

⸱

28 de setembro de 2022

 ,  , 
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve uma metodologia para avaliar a função de canais iônicos ativados mecanicamente em células uroteliais nativas usando o sensor fluorescente Ca2+ GCaMP5G.

Resumo

Canais iônicos ativados mecanicamente são transdutores biológicos que convertem estímulos mecânicos, como forças de estiramento ou cisalhamento, em sinais elétricos e bioquímicos. Em mamíferos, os canais ativados mecanicamente são essenciais para a detecção de estímulos externos e internos em processos tão diversos quanto a sensação de toque, audição, regulação do volume dos glóbulos vermelhos, regulação da pressão arterial basal e sensação de plenitude da bexiga urinária. Embora a função dos canais iônicos ativados mecanicamente tenha sido extensivamente estudada no cenário in vitro usando a técnica patch-pamp, avaliar sua função em seu ambiente nativo continua sendo uma tarefa difícil, muitas vezes devido ao acesso limitado aos locais de expressão desses canais (por exemplo, terminais aferentes, células de Merkel, barorreceptores e túbulos renais) ou dificuldades na aplicação da técnica patch-clamp (por exemplo, as superfícies apicais das células guarda-chuva uroteliais). Este protocolo descreve um procedimento para avaliar transientes de Ca 2+ evocados mecanicamente usando o sensor fluorescente GCaMP5G em uma preparação urotelial ex vivo, uma técnica que poderia ser prontamente adaptada para o estudo de eventos de Ca2+ evocados mecanicamente em outras preparações de tecidos nativos.

Introdução

As células epiteliais do trato urinário são submetidas a forças mecânicas à medida que o filtrado urinário viaja através dos néfrons, e a urina é bombeada para fora da pelve renal e viaja através dos ureteres para ser armazenada na bexiga urinária. Há muito se reconhece que as forças mecânicas (por exemplo, tensão de cisalhamento e estiramento) exercidas por fluidos nas células epiteliais que revestem o trato urinário regulam a reabsorção de proteínas no túbulo proximal e de solutos no néfron distal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, bem como o armazenamento de urina na bexiga urinária e micção14,15,16,17.

A conversão de estímulos mecânicos em sinais elétricos e bioquímicos, processo denominado mecanotransdução, é mediada por proteínas que respondem à deformação das estruturas celulares ou da matriz extracelular associada 18,19,20,21. Os canais iônicos ativados mecanicamente são únicos no sentido de que fazem a transição de um estado fechado para um estado permeável aberto em resposta a mudanças na tensão, pressão ou tensão de cisalhamento da membrana 18,19,20,21,22. Além disso, os transientes de Ca 2+ podem ser iniciados por mecanotransdução mediada por integrina ou por ativação de sistemas de adesão mecanorresponsivos em junções célula-célula23,24,25,26. A função do canal iônico é geralmente avaliada com a técnica patch-clamp, que envolve a formação de uma vedação gigaohm entre a membrana celular e a pipetapatch-27. No entanto, células localizadas em camadas profundas de tecido com uma matriz extracelular densa (por exemplo, túbulos renais) ou cercadas por uma barreira física (por exemplo, glicocálice) são de difícil acesso com uma micropipeta de vidro. Da mesma forma, células embutidas ou que são partes integrantes de tecidos com baixa estabilidade mecânica (por exemplo, o urotélio) não podem ser prontamente estudadas com a técnica patch-clamp. Como muitos canais iônicos ativados mecanicamente são permeáveis ao Ca 2+, uma abordagem alternativa é avaliar sua atividade por microscopia fluorescente usando um corante sensível ao Ca2+ ou indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs), como o GCaMP. Esforços recentes em engenharia de proteínas aumentaram significativamente a faixa dinâmica, a sensibilidade e a resposta dos GECIs28,29,30, e os avanços na genética permitiram sua expressão em populações celulares específicas, tornando-as ideais para estudar a mecanotransdução.

O urotélio, epitélio estratificado que recobre o interior da bexiga urinária, funciona como uma barreira, impedindo a difusão de solutos urinários no interstício vesical, mas também funciona como transdutor, sentindo a plenitude vesical e comunicando esses eventos aos nervos e musculatura subjacentes16. Estudos prévios mostraram que a comunicação entre o urotélio e os tecidos subjacentes requer os canais iônicos ativados mecanicamente Piezo1 e Piezo231. Para avaliar transientes de Ca 2+ induzidos mecanicamente em células uroteliais, uma nova técnica descrita que usa transferência de genes adenovirais para expressar o sensor de Ca2+ GCaMP5G em células uroteliais foi desenvolvida. Esta técnica emprega uma preparação de folha mucosa que fornece fácil acesso à camada celular guarda-chuva mais externa e um sistema assistido por computador para a estimulação mecânica simultânea de células individuais com uma micropipeta de vidro fechada e registro de mudanças na fluorescência ao longo do tempo.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

O cuidado e o manuseio dos animais foram realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh. Camundongos C57Bl/6J fêmeas de 2-4 meses de idade foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos comercialmente (ver Tabela de Materiais).

1. Montagem e configuração do equipamento

  1. Realize imagens Ca2+ com um microscópio vertical equipado com uma câmera de alta resolução e uma fonte de luz estável (consulte Tabela de materiais).
    1. Adquira as imagens com um software compatível com microscópio que permita o controle direto da câmera, da fonte de luz e do atuador piezo por meio de um dispositivo de E/S digital USB (consulte Tabela de materiais).
      Observação : Figura 1 representa um esquema da instalação. GCaMP5G tem um comprimento de onda de excitação de pico de 470 nm e um comprimento de onda de emissão de pico de 497 nm28. Use um cubo de filtro adequado para imagens GCaMP5G.
  2. Para a estimulação de células uroteliais individuais na preparação da mucosa da bexiga (ver passo 2), utilize um atuador piezoelétrico controlado por um controlador piezo de circuito aberto de canal único (ver Tabela de Materiais). Monte o atuador piezoelétrico em um micromanipulador.
    1. Monte as micropipetas de vidro em um suporte de pipeta afixado ao atuador piezoelétrico (Figura 1). Operar remotamente o controlador piezo por um conversor analógico/digital controlado por um programa de aquisição e análise de dados eletrofisiológicos (consulte Tabela de Materiais).
      NOTA: Um gatilho externo, na forma de um sinal de lógica transistor-transistor (TTL) iniciado pelo software de imagem, é utilizado para acionar o protocolo de estimulação no software de aquisição e análise de dados eletrofisiológicos que movimenta o atuador piezoelétrico (Figura 1).
  3. Verifique se o software de geração de imagens (consulte Tabela de materiais) faz interface com o dispositivo de E/S digital. Configure um canal de saída digital no dispositivo de E/S digital USB para entregar o sinal TTL ao conversor analógico/digital, que iniciará o protocolo no software de eletrofisiologia que move o atuador piezoelétrico.
    1. Use um cabo para conectar a porta Start BNC no conversor analógico/digital ao aterramento (GND) e um terminal de parafuso no dispositivo de E/S digital USB.
  4. Configure o protocolo de gravação no software de imagem.
    Observação : as etapas a seguir descrevem como gerar um protocolo que enviará um sinal TTL e iniciar a coleta de imagens em intervalos de tempo especificados.
    1. Configure o protocolo de aquisição no software de imagem clicando no Gerenciador de Experimentos e selecionando Novo Experimento. Uma nova janela será aberta.
    2. Selecione o ícone Time Lapse Loop e arraste-o para a janela recém-aberta; defina o número de ciclos como 2 e o intervalo como a configuração mais rápida permitida na configuração.
    3. No ícone Obturador transmitido/obturador manual, selecione o ícone NI USB-6501 e arraste-o para a janela Time Lapse Loop e, em seguida, defina o NI USB-6501 como fechado. Arraste um NI USB-6501 adicional do obturador transmitido/obturador manual para a janela Time Lapse Loop e defina-o como aberto. Para conectar os dois ícones NI USB-6501, arraste a ponta de seta na lateral do ícone fechado NI USB-6501 e puxe até que ele toque no ícone aberto NI USB-6501. Uma linha que conecta os dois ícones será exibida.
    4. Arraste outro Time Lapse Loop para a janela do Gerenciador de Experimentos e conecte-o ao primeiro puxando a ponta da seta. Defina os parâmetros para gravação. Defina o número de ciclos do novo Time Lapse Loop como 2400.
    5. No ícone Aquisição de imagem , arraste o filtro GFP para o loop de lapso de tempo recém-aberto e defina o tempo de exposição para 100 ms.
    6. Defina o tipo de imagem da câmera como 8 bits, a resolução como 576 x 576 (Binning 4 x 4), o clock de pixels para 480 MHz e a correção de pixels quentes como padrão.
      NOTA: Os parâmetros podem ser ajustados dependendo do nível de expressão do sensor fluorescente, da sensibilidade da câmera e da configuração da configuração.
  5. Configure o Lab Bench no software de eletrofisiologia (consulte Tabela de Materiais).
    NOTA: Isso definirá o sinal de saída em mV do conversor analógico/digital.
    1. Vá para o menu Configurar no software de eletrofisiologia e selecione Lab Bench. Na janela Sinais de Saída resultante, selecione Saída Analógica #1, pressione o sinal Adicionar e nomeie-o (por exemplo, "Piezo"). Defina a Unidade de Sinal como mV e o Fator de Escala (mV/V) como 1.
  6. Gerar um protocolo de estimulação no software de eletrofisiologia seguindo os passos abaixo.
    1. Para gerar um novo protocolo de estimulação no software de eletrofisiologia, vá para o item de menu Adquirir e selecione Novo Protocolo.
    2. Defina Modo/Taxa como Estimulação Episódica, Executar/Julgamento como 1, Varrer/Executar como 1 e Duração (s) da Varredura como 150.
    3. No menu Saídas , selecione o canal #1 Piezo como Saída analógica.
    4. No menu Acionador , defina o gatilho como Digitador Iniciar Entrada e Temporizador Interno.
    5. No menu Forma de onda, selecione o canal #1 e Forma de onda analógica com Épocas. Defina a Etapa A como Etapa, o Primeiro Nível como 0, o Nível Delta como 0, a Primeira duração como 10000 e a Duração Delta como 0.
    6. Defina a Etapa B como Etapa, o Primeiro nível como 10, o Nível Delta como 0, a Primeira Duração como 1000 e a Duração Delta como 0. Defina a Etapa C como Etapa, o Primeiro Nível como 0, o Nível Delta como 0, a Primeira Duração como 130000 e a Duração Delta como 0.
    7. Salve o protocolo e nomeie-o Protocolo de estimulação.
  7. Use um cabo BNC para conectar a Saída Analógica #1 no conversor analógico/digital à ENTRADA EXT na frente do controlador piezo de circuito aberto de canal único (consulte Tabela de Materiais).
  8. Fabricar micropipetas de vidro para a estimulação mecânica de células guarda-chuva a partir de tubos de vidro capilar seguindo os passos abaixo.
    1. Coloque o vidro capilar em um extrator (consulte Tabela de Materiais) e ajuste-o com os botões de retenção capilar.
    2. Posicione a unidade de aquecimento em toda a sua altura. Ajuste o primeiro controle deslizante de posição de terminação de tração do extrator para 5.
    3. Ajuste o primeiro botão do aquecedor para 76,7 e o segundo botão para 52,7.
    4. Puxe o capilar de vidro em duas etapas pressionando o botão Iniciar.
    5. Feche a ponta da micropipeta com uma microforja (ver Tabela de Materiais) com o botão de ajuste do aquecedor ajustado a 60.
      NOTA: Para o presente protocolo, o diâmetro final da ponta da micropipeta usada para cutucar células individuais é de ~1-3 μm.
  9. Verifique se a micropipeta estimulante move a distância especificada no protocolo de estimulação.
    NOTA: Os passos a seguir são para garantir que 12,5 s após o início do protocolo de estimulação no software de eletrofisiologia, um pulso de tensão com duração de 1 s seja gerado, fazendo com que o atuador piezoelétrico se mova 20 μm.
    1. Monte uma micropipeta no suporte e prenda-a ao atuador piezoelétrico.
    2. Coloque o atuador piezoelétrico e a micropipeta anexada paralelamente ao centro do estágio do microscópio e dentro da área de visão.
    3. Concentre-se na ponta da pipeta e imobilize a haste de montagem piezoelétrica (consulte Tabela de materiais) com fita adesiva. Sob iluminação de campo brilhante, ajuste os parâmetros da câmera para obter uma imagem clara da ponta da pipeta.
    4. Abra o protocolo de estimulação no software de eletrofisiologia e configure-o para jogar.
      NOTA: O protocolo de eletrofisiologia não será iniciado até que o sinal TTL enviado pelo software de imagem seja recebido.
    5. No Gerenciador de experimentos no software de geração de imagens, pressione Iniciar para iniciar a aquisição de dados.
      NOTA: Isso acionará o protocolo no software de eletrofisiologia, que acionará o atuador piezoelétrico. O protocolo no software de imagem irá gerar um arquivo com as imagens do experimento.
  10. Verifique a distância percorrida pela pipeta seguindo os passos abaixo.
    1. Para medir a distância percorrida pela pipeta durante o protocolo de estimulação, selecione o item Contar e Medir no software de imagem.
    2. No menu Medida , selecione a opção Medição e ROI e uma nova janela aparecerá abaixo da janela do filme.
    3. No menu Medida , escolha a Linha Arbitrária.
    4. Na janela do filme, desenhe uma linha arbitrária começando na ponta da pipeta. Observe que o final da linha arbitrária será ajustado posteriormente.
    5. Clique com o botão direito do mouse na linha arbitrária para converter a linha em uma região de interesse (ROI), que será visível em todos os quadros de filmes.
    6. Inspecione o filme e ajuste o final da linha arbitrária (ROI) para a posição final percorrida pela pipeta em resposta ao estímulo.
      NOTA: A distância percorrida pela pipeta em μm aparecerá na janela Medição e ROI . O protocolo de estimulação pode ser modificado de acordo com as necessidades do usuário.

2. Transdução in situ e isolamento da mucosa vesical

  1. Transduzir bexigas de camundongos fêmeas in situ com um adenovírus que codifica o cDNA do CGaMP5G de acordo com o procedimento descrito no protocolo de transdução do vírus31.
    1. Ao transduzir células uroteliais para experimentos de imagem Ca2+ , instilar as bexigas com 50 μL da solução contendo 2 x 107 partículas virais infecciosas (PIV).
      NOTA: Esta técnica tende a restringir a expressão de CGaMP5G para a camada de célula guarda-chuva. Alternativamente, experimentos poderiam ser conduzidos com bexigas urinárias colhidas de camundongos transgênicos expressando CGaMP5G em células uroteliais (ou seja, expressão de GCaMP5G impulsionada por um promotor de uroplacina-2) ou qualquer outro tipo de célula de interesse.
  2. 24-72 h após a transdução, eutanasiar os ratos por asfixia por CO2 e realizar uma toracotomia, abrindo a cavidade torácica com tesoura para causar o colapso dos pulmões.
  3. Canular a uretra com cateter 24 G. Exponha a bexiga por uma incisão abdominal de ~1,5 cm através da pele e do músculo e use uma sutura de 6,0 (ver Tabela de Materiais) para fixar o cateter à uretra.
  4. Colhe-se a bexiga e a uretra32 e afixe uma almofada de suporte de borracha de silicone (ver Tabela de Materiais) banhada em solução de gravação contendo (em mM): 135 NaCl, 5,0 KCl, 1 MgCl 2,2,5 CaCl2, 10 glicose, 10 HEPES, pH 7,4 e borbulhada com 100% O2 (Figura 2A).
  5. Separe a mucosa vesical da camada muscular subjacente com pinça fina, seguindo relatos publicados anteriormente32 (Figura 2B).
  6. Abrir a mucosa da bexiga e fixá-la com o urotélio voltado para uma inserção de elastômero de silicone no fundo de um prato cultivado com tecido de 35 mm de diâmetro (Figura 2C).

3. Estimulação mecânica de células uroteliais individuais e imagens de Ca2+

  1. Monte o prato cultivado com a mucosa vesical fixada no estágio microscópico equipado com uma incubadora de prato de cultura com elementos de aquecimento resistivo (Figura 2E). Perfundir (seguindo as instruções do fabricante, ver Tabela de Materiais) a placa de cultura celular continuamente a uma taxa de 1,7 mL/min com solução de gravação aquecida a ~37 °C com um aquecedor em linha.
  2. Manter a temperatura da incubadora e das soluções de placas de tecido a ~37 °C com um modelo de controlador de temperatura bipolar de canal duplo (ver Tabela de Materiais). Equilibrar o tecido na câmara com perfusão contínua por pelo menos 15 minutos antes de realizar procedimentos experimentais adicionais.
  3. Para registrar os transientes de Ca2+ induzidos mecanicamente, submerja a micropipeta na solução banhando a mucosa da bexiga fixada no prato de tecido. Mova a micropipeta para o centro do campo com a ajuda de uma objetiva de varredura de baixa ampliação (4x) usando iluminação de campo brilhante.
    1. Mova a micropipeta para perto da superfície do tecido urotelial movendo coordenadamente o micromanipulador no plano vertical e ajustando o foco.
    2. Mude a objetiva para uma com maior ampliação (20x) adequada para imunofluorescência com alta abertura numérica (NA).
    3. Defina o micromanipulador como Fino e mova a micropipeta para perto da parte superior da célula alvo.
    4. Altere o campo de visão para câmera e pressione Live no software de imagem.
      NOTA: Isso deve ligar o obturador refletido e permitir a observação do sinal fluorescente emitido pelo tecido no computador.
    5. Ajuste o foco para visualizar a parte superior da célula e ajuste a posição da pipeta, se necessário.
    6. Abra o protocolo de estimulação no software de eletrofisiologia e configure-o para jogar.
      NOTA: O protocolo no software de eletrofisiologia não será iniciado até que o sinal TTL enviado pelo software de imagem seja recebido.
    7. No Gerenciador de experimentos no software de geração de imagens, pressione Iniciar para iniciar a aquisição de dados. Isso acionará o protocolo no software de eletrofisiologia, que acionará o atuador piezoelétrico e gerará um arquivo com as imagens do experimento. O protocolo de estimulação pode ser modificado de acordo com as necessidades do usuário.

4. Análise dos dados

  1. Quantifique a intensidade de fluorescência ao longo do tempo seguindo as etapas abaixo.
    1. Abra o arquivo de imagem no software de imagem e selecione a janela Contagem e Medida . Selecione a ferramenta de polígono e desenhe um ROI nos limites da célula que foi cutucada.
    2. Vá para a janela Medida, selecione Perfil de Intensidade, defina a medição como Ao longo do tempo, Resultados como Média, Subtração em segundo plano como nenhuma e pressione Executar. A intensidade média de fluorescência será calculada ao longo do tempo (Figura 3).
    3. Para exportar os dados do perfil de intensidade, clique no ícone do Excel na janela Resultados do Perfil de Intensidade. Isso permitirá que o usuário escolha a pasta de destino e o nome do arquivo e salve os dados em um formato .xlsx.
  2. Realizar análise de dados utilizando gráficos científicos e software de análise de dados (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: A amplitude do pico de Ca2+ evocado por cutucada é expressa como a mudança na intensidade de fluorescência (ΔF/F), onde F é a intensidade de fluorescência de GCaMP5G no tempo 0, e ΔF é a diferença entre os máximos de intensidade de fluorescência e o basal no tempo 0. O decaimento da resposta Ca2+ também pode ser calculado (não mostrado).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

O presente protocolo descreve uma técnica para avaliar transientes de Ca 2+ evocados mecanicamente em células guarda-chuva usando o sensor fluorescente de Ca2+ GCaMP5G. A transdução adenoviral foi empregada para expressar GCaMP5G em células uroteliais devido à sua alta eficiência e por produzir um nível elevado de expressão. Imagens fluorescentes de criosecções coradas de uma bexiga transduzida são mostradas na Figura 2D. Para esses experimentos, a expressão de GCaMP5G ...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Todos os organismos, e aparentemente a maioria dos tipos celulares, expressam canais iônicos que respondem a estímulos mecânicos 20,33,34,35,36,37. A função desses canais ativados mecanicamente tem sido predominantemente avaliada com a técnica patch-praçad. No entanto, devido a problemas de acessibilidade, os estudos patch-cl...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do NIH R01DK119183 (para G.A. e MDC) e S10OD028596 (para G.A.) e pelo Cell Physiology and Model Organism Kidney Imaging Cores do Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
20x ObjetivaOlympusUMPlanFL N
24 G ¾ ” cateterMedline Lâmina Suresite IV
4x ObjetivaOlympusUPlanFL N
Conversor analógico/digitalMolecular DevicesDigidata 1440A
Anti-GFP anticorpoAbcam Ab6556
Divisor de feixeChromaT495lpxr
Controlador de temperatura bipolar Warner InstrumentsTC-344B
CaCl2Fluka21114-1L1 M
solução cellSens softwareOlympusImaging software
CMOS câmeraHamamatsuORCA fusão
Donkey anti-coelho conjugado com Alexa Fluor 488 Jackson ImmunoResearch711-545-152
ExcelMicrosoft Corporation
Filtro Croma ET470/40X
Capilares de vidro Corning 8250 vidroWarner Instruments G85150T-4
GlicoseSigmaG8270
HEPES AquecedorH4034
Warner InstrumentsSH-27B
KClSigma793590
Fonte de luzSutter InstrumentsLambda XL 
Tubulação da bomba do coletorFisherbrand14-190-510ID 1.52 mm
Tubulação da bomba do coletorFisherbrand14-190-533ID 2.79 mm
MgCl2SigmaM9272
Mouses Jackson Lab6642-4 meses de idade fêmea C57BL/6J
MicroforgeNarishige Micromanipulador MF-830
Sutter InstrumentsMP-285
MicroscópioOlympusBX51W
Montagem de mídia com DAPIInvitrogenS36964 Slowfade Diamond Antifade com DAPI
NaCl Software SigmaS7653
pClampMolecular DevicesVersão 10.4Software de aquisição e análise de dados de eletrofisiologia Patch-clamp
Bomba peristálticaGilsonMinipuls 3
Atuador piezoelétricoThorlabsPAS005
Suporte de pipetaWorld Precision Instruments
Extrator de pipetasNarishigePP-830
Base aquecida de troca rápida com perfusão e kit de anel adaptadorPlataforma de troca rápida Warner InstrumentsQE-1se encaixa em prato de 35 mm   
Rodamina-faloidina InvitrogenR415
Sigma-PlotSystat Software IncVersão 14.0Software de análise de dados e gráficos científicos   
Elastômero de siliconeDowSylgard 184
Controlador piezo de circuito aberto de canal únicoThorlabsMDT694B
Almofada quadrada de suporte de gradeTed Pella10520
SuturaAD SurgicalS-S618R136-0 Haste de
montagem de TeflonFeito sob medidaUse para montar o atuador piezoelétrico no micromanipulador
TubulaçãoFisher Scientific14171129Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN
Dispositivo de E/S Digital USB National InstrumentsNI USB-6501
em linha Sigma Sylk

Referências

  1. Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
  2. Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
  3. Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
  4. Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
  5. Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
  6. Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
  7. Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
  8. Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
  9. Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
  10. Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
  11. Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
  12. Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
  13. Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
  14. Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
  15. Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
  16. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  17. Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
  18. Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
  19. Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
  20. Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A. Mechanically activated ion channels. Neuron. 87 (6), 1162-1179 (2015).
  21. Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
  22. Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
  23. Ross, T. D., et al. Integrins in mechanotransduction. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 613-618 (2013).
  24. Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14(2021).
  25. Huveneers, S., de Rooij, J. Mechanosensitive systems at the cadherin-F-actin interface. Journal of Cell Science. 126, 403-413 (2013).
  26. Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. Integrin-mediated mechanotransduction. Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).
  27. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
  28. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  29. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
  30. Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170(2013).
  31. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984(2021).
  32. Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
  33. Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
  34. Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
  35. Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558(2014).
  36. Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055(2020).
  37. Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Etiquetas

Canais Mecanicamente AtivadosTransit rios de C lcioPrepara o Ex VivoEstimula o Mec nicaSensor de C lcio FluorescenteImagem de GCaMP5GC lulas Guarda chuvaMucosa da BexigaIntensidade de Fluoresc ncia
Ex Vivo Análise de Transientes de Ca2+ Ativados Mecanicamente em Células Uroteliais
Entre em contato
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.