Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Langsigtet dyrkning og overvågning af isolerede Caenorhabditis elegans på faste medier i enheder med flere brønde

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, 2Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania

Summary

Her præsenteres en optimeret protokol til dyrkning af isolerede individuelle nematoder på faste medier i mikrofabrikerede multibrøndsenheder. Denne tilgang gør det muligt at overvåge individuelle dyr gennem hele deres liv for en række fænotyper relateret til aldring og sundhed, herunder aktivitet, kropsstørrelse og form, bevægelsesgeometri og overlevelse.

Abstract

Nematoden Caenorhabditis elegans er blandt de mest almindelige modelsystemer, der anvendes i aldringsforskning på grund af dens enkle og billige dyrkningsteknikker, hurtige reproduktionscyklus (~ 3 dage), kort levetid (~ 3 uger) og adskillige tilgængelige værktøjer til genetisk manipulation og molekylær analyse. Den mest almindelige tilgang til gennemførelse af aldringsundersøgelser i C. elegans, herunder overlevelsesanalyse, involverer dyrkning af populationer på titusinder til hundreder af dyr sammen på faste nematodevækstmedier (NGM) i petriplader. Mens denne tilgang indsamler data om en population af dyr, sporer de fleste protokoller ikke individuelle dyr over tid. Præsenteret her er en optimeret protokol til langsigtet dyrkning af individuelle dyr på mikrofabrikerede polydimethylsiloxan (PDMS) enheder kaldet WorMotels. Hver enhed gør det muligt at dyrke op til 240 dyr i små brønde, der indeholder NGM, hvor hver brønd isoleres af en kobbersulfatholdig voldgrav, der forhindrer dyrene i at flygte. Med udgangspunkt i den oprindelige WorMotel-beskrivelse giver dette papir en detaljeret protokol til støbning, forberedelse og udfyldning af hver enhed med beskrivelser af almindelige tekniske komplikationer og råd til fejlfinding. Inden for denne protokol er teknikker til konsekvent indlæsning af NGM i små mængder, konsekvent tørring af både NGM og bakteriel mad, muligheder for levering af farmakologiske indgreb, instruktioner til og praktiske begrænsninger for genbrug af PDMS-enheder og tip til minimering af udtørring, selv i miljøer med lav luftfugtighed. Denne teknik tillader langsgående overvågning af forskellige fysiologiske parametre, herunder stimuleret aktivitet, ustimuleret aktivitet, kropsstørrelse, bevægelsesgeometri, sundhedslængde og overlevelse i et miljø, der ligner standardteknikken til gruppekultur på faste medier i petriplader. Denne metode er kompatibel med dataindsamling med høj kapacitet, når den bruges sammen med automatiseret mikroskopi og analysesoftware. Endelig diskuteres begrænsningerne ved denne teknik samt en sammenligning af denne tilgang til en nyligt udviklet metode, der bruger mikrobakker til dyrkning af isolerede nematoder på faste medier.

Introduction

Caenorhabditis elegans er almindeligt anvendt i aldringsundersøgelser på grund af deres korte generationstid (ca. 3 dage), kort levetid (ca. 3 uger), let dyrkning i laboratoriet, høj grad af evolutionær bevarelse af molekylære processer og veje med pattedyr og bred tilgængelighed af genetiske manipulationsteknikker. I forbindelse med aldringsundersøgelser giver C. elegans mulighed for hurtig generering af levetidsdata og ældre populationer til analyse af fænotyper i det sene liv hos levende dyr. Den typiske fremgangsmåde til gennemførelse af ormeældningsundersøgelser indebærer manuel måling af levetiden for en population af orme, der opretholdes i grupper på 20 til 70 dyr på faste agarnematodevækstmedier (NGM) i 6 cm petriplader1. Brug af alderssynkroniserede populationer muliggør måling af levetid eller tværsnitsfænotyper hos individuelle dyr på tværs af populationen, men denne metode udelukker overvågning af individuelle dyrs egenskaber over tid. Denne tilgang er også arbejdskrævende og begrænser dermed størrelsen af den befolkning, der kan testes.

Der er et begrænset antal dyrkningsmetoder, der giver mulighed for langsgående overvågning af individuelle C. elegans gennem hele deres levetid, og hver har et særskilt sæt fordele og ulemper. Microfluidics-enheder, herunder WormFarm2, NemaLife3 og "adfærdschip"4, blandt andet 5,6,7, tillader overvågning af individuelle dyr over tid. Dyrkning af orme i flydende kultur ved hjælp af plader med flere brønde muliggør ligeledes overvågning af enten individuelle dyr eller små populationer af C. elegans over tid 8,9. Det flydende miljø repræsenterer en særskilt miljøkontekst fra det almindelige kulturmiljø på faste medier i petriplader, som kan ændre aspekter af dyrefysiologi, der er relevante for aldring, herunder fedtindhold og ekspression af stressresponsgener10,11. Evnen til direkte at sammenligne disse undersøgelser med størstedelen af data indsamlet om aldrende C. elegans er begrænset af forskelle i potentielt vigtige miljøvariabler. Worm Corral12 er en tilgang, der er udviklet til at huse individuelle dyr i et miljø, der i højere grad replikerer typisk solid media-kultur. Worm Corral indeholder et forseglet kammer for hvert dyr på et mikroskopglas ved hjælp af hydrogel, hvilket muliggør langsgående overvågning af isolerede dyr. Denne metode bruger standard brightfield-billeddannelse til at registrere morfologiske data, såsom kropsstørrelse og aktivitet. Dyr placeres dog i hydrogelmiljøet som embryoner, hvor de forbliver uforstyrrede i hele deres levetid. Dette kræver anvendelse af betinget sterile mutante eller transgene genetiske baggrunde, hvilket begrænser både kapaciteten til genetisk screening, da hver ny mutation eller transgen skal krydses ind i en baggrund med betinget sterilitet, og kapaciteten til lægemiddelscreening, da behandlinger kun kan anvendes én gang på dyrene som embryoner.

En alternativ metode udviklet af Fang-Yen-laboratoriet tillader dyrkning af orme på faste medier i individuelle brønde af en mikrofabrikeret polydimethylsiloxan (PDMS) enhed kaldet en WorMotel13,14. Hver enhed placeres i en enkeltbrøndsbakke (dvs. med samme dimensioner som en 96-brøndplade) og har 240 brønde adskilt af en voldgrav fyldt med en aversiv opløsning for at forhindre ormene i at rejse mellem brønde. Hver brønd kan huse en enkelt orm i løbet af sin levetid. Enheden er omgivet af vandabsorberende polyacrylamidgelpellets (kaldet "vandkrystaller"), og bakken er forseglet med Parafilm laboratoriefilm for at opretholde fugtigheden og minimere udtørringen af mediet. Dette system gør det muligt at indsamle data om sundhed og levetid for de enkelte dyr, mens brugen af faste medier bedre sammenfatter det miljø, som dyr oplever i langt størstedelen af de offentliggjorte C. elegans-levetidsundersøgelser, hvilket muliggør mere direkte sammenligninger. For nylig er der udviklet en lignende teknik ved hjælp af polystyrenmikrobakker, der oprindeligt blev brugt til mikrocytotoksicitetsassays15 i stedet for PDMS-enheden16. Mikrobakkemetoden giver mulighed for indsamling af individualiserede data for orme dyrket på faste medier og har forbedret kapaciteten til at indeholde orme under forhold, der typisk ville forårsage flugt (f.eks. Stressfaktorer eller kostbegrænsning), idet afvejningen er, at hver mikrobakke kun kan indeholde 96 dyr16, mens multibrøndsenheden, der anvendes her, kan indeholde op til 240 dyr.

Præsenteret her er en detaljeret protokol til forberedelse af multi-well-enheder, der er optimeret til plade-til-plade-konsistens og forberedelse af flere enheder parallelt. Denne protokol blev tilpasset fra den oprindelige protokol fra Fang-Yen-laboratoriet13. Specifikt er der beskrivelser for teknikker til at minimere kontaminering, optimere den konsekvente tørring af både det faste medie og den bakterielle fødekilde og levere RNAi og lægemidler. Dette system kan bruges til at spore individuel sundhed, levetid og andre fænotyper, såsom kropsstørrelse og form. Disse multibrøndsenheder er kompatible med eksisterende systemer med høj kapacitet til måling af levetid, hvilket kan fjerne meget af det manuelle arbejde, der er involveret i traditionelle levetidseksperimenter og give mulighed for automatiseret, direkte levetidsmåling og sundhedssporing i individuelle C. elegans i skala.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling af stamopløsninger og medier

BEMÆRK: Før du begynder at forberede multibrøndsenhederne, skal du forberede følgende stamopløsninger og medier.

  1. Stamopløsninger til nematodevækstmedier (NGM) og lavsmeltet NGM (lmNGM):
    1. Forbered 1 M K 2 HPO4: Tilsæt 174,18 g K2HPO4 til en1 L flaske, og fyld den op til 1 liter med sterilt deioniseret vand. Autoklave (121 °C, 15 psig) i 30 minutter og opbevares ved stuetemperatur (RT).
    2. Forbered 1 M KPi, pH 6,0: Tilsæt 136,09 g KH2HPO4 til en 1 L flaske, og fyld den op til 1 liter med sterilt deioniseret vand. Titrer med 1 M K2HPO4 til pH 6,0. Autoklave (121 °C, 15 psig) i 30 min, og opbevares på RT.
    3. Forbered 1 M CaCl 2: Tilsæt 73,5 g CaCl2 til en 500 ml flaske, og fyld den op til 500 ml med sterilt deioniseret vand. Autoklave (121 °C, 15 psig) i 30 min, og opbevares på RT.
    4. Forbered 1 M MgSO4: Tilsæt 123,25 gMgSO4 til en 500 ml flaske, og fyld den op til 500 ml med sterilt deioniseret vand. Autoklave (121 °C, 15 psig) i 30 min, og opbevares på RT.
    5. Forbered 5 mg / ml kolesterol: Kombiner 2,5 g kolesterol, 275 ml 100% ethanol og 25 ml sterilt deioniseret vand i en 500 ml gul flaske. Opbevares hos RT.
    6. Forbered 50 mM floxuridin: Kombiner 0,1231 g floxuridin og 10 ml sterilt deioniseret vand i et 15 ml konisk rør. Filtrer det med et 0,22 μm filter ved hjælp af en 10 ml sprøjte. Der anvendes en prøve på hver 1 mikrocentrifugeglas i 10 mikrocentrifugeglas, og de opbevares ved -20 °C.
    7. Forbered 50 mg / ml carbenicillin: I et 15 ml konisk rør kombineres 500 mg carbenicillin med 10 ml sterilt deioniseret vand. Filtrer det med et 0,22 μm filter ved hjælp af en 10 ml sprøjte. Der anvendes en prøve på hver 1 mikrocentrifugeglas i 10 mikrocentrifugeglas, og de opbevares ved -20 °C.
    8. Forbered 1 mM isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG): I et 15 ml konisk rør kombineres 2,38 g IPTG med 10 ml sterilt deioniseret vand. Filtrer det med et 0,22 μm filter ved hjælp af en 10 ml sprøjte. Der anvendes en prøve på hver 1 mikrocentrifugeglas i 10 mikrocentrifugeglas, og de opbevares ved -20 °C.
    9. Forbered 100 mg / ml ampicillin: I et 15 ml konisk rør kombineres 1 g ampicillin med 10 ml sterilt deioniseret vand. Filtrer det med et 0,22 μm filter ved hjælp af en 10 ml sprøjte. Der anvendes en prøve på hver 1 mikrocentrifugeglas i 10 mikrocentrifugeglas, og de opbevares ved -20 °C.
  2. Forberedelse af nematodevækstmedier (NGM) til generel vedligeholdelse af C. elegans
    1. For at fremstille 50 plader kombineres 10 g Bacto agar, 1,5 g NaCl, 1,25 g Bacto pepton og 486 ml ultrarent vand i en 1 L kolbe. Autoklave på væskecyklus (121 °C, 15 psig) i mindst 30 minutter for at sterilisere.
    2. Efter autoklave, efter at mediet er afkølet til 55 °C, tilsættes 12,5 ml 1 M KPi, 500 μL 1 MMgSO4, 500 μL 1 MCaCl2 og 500 μL 5 mg/ml kolesterol.
    3. Brug en steril teknik til at hælde 10 ml medier i hver 60 mm plade (50 i alt). Efter at mediet er størknet (mindst 30 minutter efter hældning), pipetteres 300 μL bakteriekultur (fremstillet i henhold til trin 4 og trin 10), der er vokset natten over på midten af pladen. Lad pladen stå på bænken, så bakteriekulturen tørrer og vokser tykkere (1-2 dage). Pladerne opbevares ved 4 °C.
  3. Forbered forblandingen med lavsmeltende nematodevækstmedier (lmNGM):
    1. I en 500 ml kolbe kombineres 4 g lavsmeltet agarose, 0,5 g Bacto Peptone og 195 ml ultrarent vand. Autoklave på væskecyklus (121 °C, 15 psig) i mindst 30 minutter for at sterilisere.
    2. Mens mediet stadig er smeltet, fordeles 10 ml alikvoter i sterile reagensglas af glas. Hvert reagensglas forsegles med parafilm efterfulgt af en reagensglashætte for at bevare lmNGM-forblandingen og forhindre udtørring. Mediet størkner og kan opbevares i ~2 uger ved RT før brug.
  4. Forbered 142,8 mM NaCl: I en 250 ml flaske kombineres 0,8345 g NaCl og 100 ml sterilt deioniseret vand. Autoklave (121 °C, 15 psig) i 30 min, og opbevares på RT.
  5. Forbered vaskemiddelopløsning: I et 15 ml konisk rør kombineres 3 ml Tween 20 og 7 ml sterilt deioniseret vand. Bland grundigt, filtrer steriliser med et 0,22 μm filter ved hjælp af en 10 ml sprøjte og opbevar ved RT.
  6. Forbered kobbersulfatopløsning: I en steril 50 ml flaske kombineres 20 ml sterilt deioniseret vand, 0,5 gCuSO4 og 100 μL vaskemiddelopløsning (fremstillet i trin 1.5). Bland indtil CuSO4 er opløst. Opbevares hos RT.
  7. Forbered vandabsorberende polyacrylamidkrystaller: I en autoklavesikker klemmeflaske kombineres 150 ml deioniseret vand og 1 g type S superabsorberende polymer. Bland forsigtigt ved at vende flasken flere gange. Autoklave på væskecyklus (121 °C, 15 psig) i mindst 20 minutter og opbevares ved RT.
  8. Forbered lysogeni bouillon (LB): I et 1 L eller større bægerglas kombineres 20 g LB-pulver med 1 liter deioniseret vand. Der blæses i to 500 ml bægerglas. Autoklave (121 °C, 15 psig) i 30 min, og opbevares på RT
  9. Forbered lysogeni bouillon (LB) agarplader:
    1. I en 1 liter kolbe kombineres 10 g LB-pulver, 7,5 g Bacto agar og 500 ml deioniseret vand. Autoklave på væskecyklus (121 °C, 15 psig) i 30 min.
    2. Hvis det ønskes, tilsættes valgfri antibiotika (postautoklave, efter at mediet er afkølet til 55 °C): 500 μL 100 mg/ml ampicillin. Brug en steril teknik til at hælde 20 ml medier i hver 100 mm plade (25 i alt) og opbevar ved 4 °C.

2. Udskrivning af 3D-multibrøndsenhedsformen

BEMÆRK: Hver enhed er støbt fra PDMS ved hjælp af en brugerdefineret 3D-trykt form. En enkelt form kan producere så mange enheder som nødvendigt; Men hvis du forsøger at forberede flere enheder på samme tid, kræves der en 3D-trykt form for hver enhed, der skal fremstilles parallelt.

  1. Hent STL-filen (se Supplerende fil 1).
  2. Udskriv formen med en 3D-printer med høj opløsning.
    BEMÆRK: Printerens opløsning skal være tilstrækkelig høj til at tillade ensartede brønd- og voldgravsvolumener. Den foreslåede printeropløsning er en XY-opløsning på mindst ~40 μm og en lagopløsning på 28 μm. Det materiale, der bruges af 3D-printeren, er lige så vigtigt, da mange materialetyper forhindrer PDMS i at hærde. Fra erfaring fungerer forme produceret af PolyJet-printere med høj opløsning (opløsning: X-akse = 600 dpi, Y-akse = 600 dpi, Z-akse = 1.600 dpi) ved hjælp af Vero Black-printmaterialet konsekvent. 3D-udskrivning af formene, der blev brugt i denne undersøgelse, blev outsourcet (udskrivningsdetaljer findes i materialetabellen).

3. Forberedelse af multibrøndsenheden

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver, hvordan den 3D-printede form bruges til at oprette PDMS-multibrøndenheden.

  1. Indstil hærdeovnen til 55 °C for at tillade forvarmning.
  2. Bestem antallet af enheder, der skal fremstilles i en batch. For hver enhed blandes 60 g PDMS-base og 6 g hærdemiddel i en stor engangsvejebåd (eller lignende engangsbeholder) ved hjælp af en engangsspatel.
  3. Anbring PDMS-blandingen i et vakuumkammer i 30 minutter ved -0,08 MPa for at fjerne bobler.
  4. Hæld PDMS-blandingen i hver 3D-printet form. Fyld formen helt, med PDMS-blandingen, der strækker sig lidt over toppen af formen. Opbevar overskydende PDMS-blanding for at genopfylde formen i tilfælde af spild.
  5. Sæt den fyldte form og enhver ekstra PDMS-blanding i vakuumkammeret i 25 minutter ved -0,08 MPa for at fjerne eventuelle bobler, der er skabt under hældeprocessen.
  6. Fjern den fyldte form fra vakuumkammeret, og pop eventuelle resterende bobler med en engangsspatel. Brug spatlen til at børste synligt snavs eller resterende bobler til kanten af formen væk fra brøndene. Eventuelle resterende snavs eller bobler kan potentielt forstyrre billeddannelsen i de senere trin.
  7. Sørg for, at formen er fyldt fuldstændigt med PDMS-blandingen; Det er almindeligt, at en lille del af blandingen spildes ud, mens den er i vakuumkammeret eller under overførsel. Påfyld med den ekstra PDMS-blanding, der blev afgasset i trin 3.5. Dette bør ikke skabe bobler, men hvis der dannes nogen, kan de forsigtigt børstes til siden af formen med spatelen.
  8. Placer en flad akrylplade oven på den PDMS-fyldte form ved først at placere den ene kant og langsomt sænke den anden, indtil akrylen sidder fladt oven på formen og fortrænger enhver PDMS-blanding, der strækker sig over kanten. Hvis der dannes bobler, mens du placerer akrylpladen, skal du langsomt fjerne akrylen, genopfylde formen med PDMS-blanding, hvis det er nødvendigt, og genstarte akrylplaceringen. Akrylpladen danner en flad bund til den støbte enhed og sikrer, at alle brønde er på samme niveau i forhold til bunden.
  9. Placer en vægt på 2,5 lb oven på akrylen. Flere forme, hver med en separat akrylplade, kan stables. Sæt de vægtede forme i ovnen, og lad dem hærde ved 55 °C natten over.
  10. Den næste dag skal du fjerne vægtene og formene fra ovnen.
  11. Arbejd forsigtigt et barberblad mellem akryl og hærdet PDMS for at bryde forseglingen. Fjern forsigtigt akrylen fra toppen af formen. PDMS vil have indstillet sig på dette tidspunkt, og fjernelse af akryl kan tage en vis kraft.
  12. Brug en barbermaskine eller en metalspatel til forsigtigt at løsne siderne af det hærdede PDMS fra formen. Det er let at rive PDMS på dette stadium; Arbejd langsomt og forsigtigt rundt om kanten for at fjerne PDMS-enheden intakt.
    BEMÆRK: Frisktrykte forme er særligt klæbrige til de første tre anvendelser, og PDMS rives ofte, mens de forsøger at fjerne enheden. Med flere anvendelser bliver det lettere at fjerne det hærdede PDMS fra formen.
  13. Pak enheden ind i aluminiumsfolie, og forsegl den med autoklavetape. Autoklave på et tørt program i mindst 15 minutter ved 121 °C, 15 psig til sterilisering. Efter autoklavering skal du opbevare de indpakkede enheder på bænken og bruge dem efter behov.

4. Striber bakterierne

BEMÆRK: Begynd at forberede de bakterier, der vil blive brugt som ormenes fødekilde, mens de er på multi-well-enheden. De mest almindelige bakterier er Escherichia coli stamme OP50 (eller stamme HT115 til RNAi-forsøg). Udfør dette trin mindst 2 dage, før du føjer ormene til enheden.

  1. Streak bakterierne på en frisk LB plade. Sørg for, at eventuelle stammespecifikke selektive additiver (f.eks. ampicillin til valg af et plasmid, der giver ampicillinresistens over for bakterierne) er inkluderet i LB-pladerne.
  2. Pladen inkuberes ved 37 °C natten over (~18 timer) for at lade kolonierne vokse.

5. Klargøring af multibrøndsenheden til medieindlæsning

BEMÆRK: Overfladen på silikone PDMS-materialet, der udgør enheden, er hydrofob, hvilket forhindrer brønde med lille volumen og aversive voldgrave i at blive fyldt med henholdsvis NGM og kobbersulfat. For at omgå dette problem bruges et iltplasma til midlertidigt at ændre enhedens overfladeegenskaber til at være hydrofile, så brøndene og voldgraven kan fyldes inden for et begrænset tidsvindue (op til ~ 2 timer). Dette afsnit beskriver trinene til afslutning af plasmarensningsprocessen. Fuldfør dette trin mindst 1 dag, før du opdager enhedens brønde med bakterier, da dvælende virkninger af plasmarensningen kan forstyrre pletblødning. I betragtning af tidspunktet for afsnit 5-7 er den praktiske grænse for disse trin pr. tekniker tre enheder parallelt.

  1. Forvarm en tørperlebadsinkubator til 90 °C som forberedelse til sektion 6.
  2. Da den samlede medievolumen, der er nødvendig for at fylde hullerne i en multibrøndsanordning, er lille sammenlignet med mængden for petriplader, fremstilles et stort parti NGM og alikvoten det i reagensglas (se trin 1.3).
    BEMÆRK: Dette kan gøres på forhånd, da mediernes rør kan opbevares på bænken i ~ 2 uger. Hvis mediet er blevet klargjort og aliquoteret i rør, fortsættes til trin 5.3.
  3. Mens du bærer handsker, skal du pakke en autoklaveret multi-well-enhed ud; Undgå at røre ved nogen af brøndene. Skær et lille hak i øverste højre hjørne af enheden for at angive, hvor mange gange den er blevet brugt/genbrugt (se afsnit 15 nedenfor for instruktioner og anbefalinger til rengøring og genbrug af hver enhed).
  4. Anbring op til tre uindpakkede enheder i plasmarenseren med brøndene opad. Kør plasmarenseren.
    BEMÆRK: Følgende detaljerede instruktioner gælder for plasmaætsningen PE-50 plasmarenseren. De specifikke trin og indstillinger skal tilpasses og muligvis genoptimeres til andre plasmarensere.
    1. Kontroller, at plasmarenserens effektniveau er indstillet til 75%.
    2. Sørg for, at udluftnings- og isoleringsventilerne begge er i OFF-position .
    3. Åbn hovedventilen på ilttanken. Vent, indtil regulatortrykket falder til mellem 15 psig og 20 psig, og drej derefter isolationsventilen til ON-position .
    4. Tænd for vakuumpumpen og plasmarenseren.
    5. Indtast følgende indstillinger på plasmarenseren (første brug), eller kontroller, at de tidligere programmerede indstillinger er korrekte:
      Plasmatid: 3:00 min
      Vakuum sætpunkt: 149,5 mTorr
      Atmosfærisk udluftning: 45 s
      Udrensningsventil: 5 s
      Gasstabilisering: 15 s
      Vakuumalarm: 3:00 min
      Automatisk cyklus-fra: TIL
    6. Tryk på Enter for at gå til menuen Kommandoer. Brug højre piletast til at vælge Opsætningsmenu, og tryk derefter på Enter. Rul gennem alle indstillingerne ved at trykke på Enter for at bekræfte hver aktuel indstilling og derefter højre pil for at gå til den næste indstilling.
    7. Gå tilbage til kommandomenuen ved at trykke på pil op og derefter på venstre pil.
    8. På skærmbilledet Kommandomenu skal du trykke på Enter. Vælg Kommandoer PLASMA ved at trykke på Enter. Systemet gennemgår følgende faser:
      Plasma Pumpdown
      Gasstabilisering: I denne fase justeres Gas 1-knappen på plasmarenseren, indtil flowmåleren er på 10 cc/min.
      Plasma tid
      Rens Pumpdown
      Plasmacyklus afsluttet
      Kammer Vent
      BEMÆRK: Denne proces bør tage ca. 5-10 minutter at fuldføre. Når alle faser er fuldført, vises kommandomenuen på skærmen igen. Hvis trykket ikke bliver lavt nok under plasmapumpdown-fasen , fortsætter plasmarenseren ikke til næste fase, og skærmen viser en fejlmeddelelse. Hvis dette sker, skal du kontrollere vakuumpumpens olie. Hvis olieniveauet er lavt, eller olien er uklar/snavset, kan udskiftning af olien gøre det muligt for vakuumtrykket at nå det nødvendige niveau.
    9. Sluk for hovedventilen på ilttanken.
    10. Drej meget langsomt udluftningsventilen til ON-position , og lad ilttankens regulatortryk vende tilbage til nul.
    11. Drej isolationsventilen til OFF-position .
    12. Sluk for vakuumpumpen og plasmarenseren.
      BEMÆRK: Den hydrofile overflademodifikation af multibrøndindretningen af plasmarenseren er midlertidig og bliver gradvist mindre effektiv over tid (op til ca. 2 timer). Fortsæt gennem afsnit 6 og afsnit 7 så hurtigt som muligt.

6. Fyldning af brøndene med lmNGM

BEMÆRK: En tørperlebadsinkubator skal være tændt og forvarmet fra trin 5.1. Sørg for, at badet har nået 90 °C.

  1. Steriliser en polystyrenbakke med en enkelt brønd pr. enhed ved at sprøjte indersiden af bakken med 70% ethanol og tørre den tør med en opgaveserviet.
  2. Fjern hver enhed fra plasmarenseren med en handskehånd, og læg den i en rengjort bakke.
  3. Anbring et 25 ml engangspipettebassin i perlebadets inkubator efter opvarmning til 90 °C.
  4. Der samles et glas størknet lmNGM-forblanding pr. enhed, der skal fyldes (se trin 1.3).
  5. LmNGM-reagensglassene anbringes i et 200 ml glasbægerglas, og hætterne og parafilmen fjernes. Mikrobølgeovn i ~ 20 s, indtil mediet smelter tilstrækkeligt til at hælde (tilstedeværelsen af nogle faste medier er fint på dette stadium).
  6. Den smeltede lmNGM-forblanding fra flere reagensglas kombineres i et andet sterilt 200 ml bægerglas. Fortsæt mikrobølgeovn i yderligere 20 s for at nå i alt 40 s. Hvis lmNGM-forblandingen begynder at koge over, skal du stoppe mikrobølgeovnen og lade lmNGM-forblandingen bundfælde sig, før du fortsætter.
  7. Fjern den smeltede lmNGM-forblanding fra mikrobølgeovnen, og lad den afkøle til ~60 °C.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt afkøles mediet og størkner igen efter ~ 5 min. Fortsæt straks til trin 6.8 og trin 6.9.
  8. For hver 10 ml lmNGM-forblanding tilsættes følgende (i nævnte rækkefølge): 250 μL 1 M KPi, 10 μL 1 MMgSO4, 10 μL 1 MCaCl2 og 10 μL 5 mg/ml kolesterol.
    1. For at forhindre ægklækning ved overvågning af voksne på enheden tilsættes 10 μL 50 mM floxuridin.
    2. For at vælge et RNAi-plasmid og inducere ekspressionen af RNA'et tilsættes 5 μL 50 mg / ml carbenicillin og 12 μL 1 mM IPTG.
      BEMÆRK: Antibiotika eller andre tilsætningsstoffer kan ændres afhængigt af eksperimentets design. Testforbindelser / lægemidler kan også tilføjes til medierne på dette stadium.
  9. Hæld den smeltede lmNGM i 25 ml bassinet i perlebadet.
  10. Fyld enhedens huler med lmNGM ved hjælp af en 200 μL multikanals repeaterpipette.
    1. Indstil repeateren til at dispensere alikvoter på 14 μL (14 μL kan dispenseres op til 14 gange, hvis der anvendes en 200 μL pipettespids).
    2. Monter fem pipettespidser. Enhedens brønde har samme afstand som en 384-brøndplade. Standard multikanalpipetter er fordelt, så brugeren kan pipette ind i hvert andet hul i en række/kolonne.
    3. Fyld spidserne med smeltet lmNGM. Hæld de første 14 μL tilbage i det lmNGM-holdige bassin.
    4. Der overføres hurtigt, men forsigtigt, 14 μL i de indre huller (hvidt i figur 1B), begyndende med dem, der er markeret med et "x" i figur 1B, og bevæger sig hen over pladen til højre og derefter nedad, idet der dispenseres i alt 12 gange (60 huller).
    5. Dispenser den resterende lmNGM tilbage i bassinet, da den endelige delprøve typisk er mindre end 14 μL.
    6. Gentag trin 6.10.3-6.10.5, indtil alle de indre huller er fyldt.
    7. Derefter indstilles repeateren til at dispensere alikvoter på 15 μL. Trin 6.10.3-6.10.5 gentages, men i stedet for de indre huller fyldes den yderste ring af hullerne (grå i figur 1B), begyndende med hullerne markeret med "+" i figur 1B og bevæger sig rundt om pladens yderkant.
      BEMÆRK: Arbejd hurtigt, så mediet ikke størkner i pipettespidserne. Undgå at spilde lmNGM i voldgraven. De ydre brønde har tendens til at tørre hurtigere. De ekstra 1 μL lmNGM gør det muligt for den endelige tørrede brønd at have en plan overflade i samme tørretid som de indre brønde.
  11. Som et kvalitetskontroltrin skal du undersøge hver brønd for at identificere dem med fejl, der kan forstyrre billeddannelsen, herunder brønde, der er underfyldte (lmNGM-overfladen er nedsænket under kanten af brønden), overfyldt (lmNGM-overfladen har en kuplet top) og indeholder bobler eller snavs.
  12. Fjern den størknede lmNGM fra de utilfredsstillende brønde med en kort platintrådpluk eller vakuumaspirator. Genopfyld de tomme brønde med frisk smeltet lmNGM. Fjern også alle medier, der flød over i voldgraven med en kort platintrådpluk eller vakuumaspirator.

7. Tilsætning af kobbersulfat til voldgraven

BEMÆRK: Denne enheds brønde er omgivet af en kontinuerlig voldgrav. Her er voldgraven fyldt med kobbersulfat, der virker som et afstødningsmiddel og afskrækker ormene fra at flygte fra deres brønde.

  1. Brug en 200 μL pipette til at dispensere 200 μL kobbersulfatopløsning (se trin 1.6) i enhedens voldgrav i hvert hjørne, 2x pr. Hjørne. Dette skal være et stort nok volumen til, at kobbersulfatet kan strømme gennem hele voldgraven. Pas på ikke at overfylde voldgraven på noget tidspunkt; Kobbersulfatet bør ikke røre brøndenes øverste overflade.
  2. Hvis kobbersulfatet ikke flyder let gennem hele voldgraven, skal du bruge en kort platintrådpluk til at hjælpe med at bryde spændingen og trække kobbersulfatet gennem voldgraven.
  3. Når kobbersulfatet er strømmet gennem hele voldgraven, fjernes så meget kobbersulfat som muligt fra voldgraven ved hjælp af en 200 μL pipette eller aspiration med et vakuum. Den resterende rest vil være tilstrækkelig til at afskrække ormene fra at forlade deres brønde. Hvis voldgraven efterlades fuld af kobbersulfatopløsning, risikerer kobbersulfat at spilde i brøndene, hvilket ville få orme til at flygte.

8. Tilføjelse af autoklaverede vandkrystaller

BEMÆRK: For at opretholde fugtigheden i pladen og forhindre udtørring af lmNGM er hver enhed omgivet af mættede vandabsorberende polyacrylamidkrystaller.

  1. Forbered vandkrystallerne (se trin 1.7).
  2. Brug en klemmeflaske til at tilføje vandkrystallerne i mellemrummet mellem enheden og bakkevæggene. Luk bakkelåget, og pakk alle fire sider ind med et stykke parafilm. Tilsæt to ekstra stykker parafilm for at forsegle pladen helt.
    BEMÆRK: Vandkrystaller kan fremstilles i et bægerglas og øses i bakken med en steriliseret spatel. Dette tilføjer imidlertid tid til proceduren og øger den tid, hver bakke er åben og udsat for potentielle forurenende stoffer.
  3. Lad den forseglede enhed stå på bænken indtil næste dag, når bakterierne er klar til at blive opdaget. Sørg for, at enhederne opbevares med hullerne opad, efter at lmNGM er blevet tilføjet.

9. Forberedelse af en alderssynkroniseret population af orme

BEMÆRK: Følgende trin giver en synkroniseret population af orme, der er klar til at tilføje til multibrøndsenheden på det fjerde larvestadie (L4). Imidlertid kan orme på forskellige udviklingsstadier også tilføjes. Dette trin skal udføres 2 dage, før ormene føjes til enheden, hvis L4'er ønskes. Juster tidspunktet for synkronisering for det ønskede livsstadium.

  1. For konsistente ældningsundersøgelser opretholdes C. elegans på NGM-standardplader (se trin 1.2 ved 20 °C under godt fodrede forhold).
  2. Få en synkroniseret population af dyr fra en lagerplade via standardmetoder, for eksempel blegning17 eller tidsindstillet æglægning1.
  3. Tilsæt isolerede æg til en NGM-plade plettet med bakterier. Æggene klækkes på denne plade, og ormene når L4-larvestadiet om 2 dage for vildtypedyr.

10. Inokulering af bakteriekulturen

BEMÆRK: Bakterier anvendes som den primære fødekilde til C. elegans, oftest E. coli-stammer OP50 eller HT115. Bakterierne er koncentreret 10 gange, hvilket skal redegøres for i volumenet af den fremstillede kultur. Forbered en bakteriekultur dagen før du opdager enheden.

  1. Fra LB-pladen, der er forberedt i trin 4, skal du vælge en enkelt koloni og pode 12 ml steril LB pr. Enhed, der skal opdages. Inkluder selektive midler, hvis det er nødvendigt for den bakteriestamme, der anvendes.
  2. Dyrk bakteriekulturen natten over (~ 18 timer) i en 37 ° C inkubator med omrystning ved ~ 250 o / min.

11. Spotting brøndene med koncentrerede bakterier

BEMÆRK: Et lille volumen koncentrerede bakterier tilsættes til hver brønd, hvilket er tilstrækkeligt til at fodre ormene i hele deres levetid på enheden. Bakteriekulturen skal tørres, før ormene kan tilsættes til brøndene. Da medievolumenet i hver brønd er lille (14-15 μL) i forhold til det tilsatte bakterievolumen (5 μL), kan det kemiske indhold af bakteriemediet påvirke brøndens kemiske miljø. For at tage højde for dette koncentreres bakterierne og resuspenderes i saltvand for at fjerne udtømt LB og samtidig undgå hypoosmotisk stress. Der er ikke tilsat salt til lmNGM-opskriften (se trin 1.3-1.4), da det tilsættes på dette tidspunkt.

  1. Efter dyrkning af bakterierne natten over som beskrevet i afsnit 10 koncentreres bakteriekulturen 10x. Pellet bakterierne ved centrifugering ved ~3.400 x g i 20 min, bortskaf supernatanten, og genopslæm pellet i 1/10 af det oprindelige dyrkningsvolumen på 142,8 mM NaCl (se trin 1.4). For eksempel, for at få øje på en enhed med 240 brønde, skal du dreje 12 ml kultur ned og resuspendere i 1,2 ml 142,8 mM NaCl.
    BEMÆRK: Testforbindelser / lægemidler kan tilsættes til den resuspenderede bakteriekultur før spotting.
  2. Brug en gentagen pipette til at spotte hvert hul med 5 μL af de koncentrerede bakterier. Undgå direkte kontakt med lmNGM-overfladen, da pipettespidsen kan gennembore lmNGM og lade ormen grave sig ned under brøndens overflade. Pas på ikke at lade bakterierne spilde ind i voldgraven, fordi ormene vil blive tiltrukket af det og flygte ind i voldgraven.
  3. Tør de plettede bakterier med bakkelågene fjernet. Dette trin er vigtigt for brøndmiljøets langsigtede integritet, og der er en række forskellige måder at tørre de plettede enheder på. Uanset hvilken metode der anvendes, skal du sørge for, at enheden forbliver i et sterilt miljø, da den skal sidde afdækket, mens bakterierne tørrer. Øget luftstrøm reducerer tørretiden kraftigt. Tørring kan udføres som beskrevet i nedenstående trin:
    1. Lad enheden være utildækket i en ren, forseglet beholder, såsom en plastikbeholder, der er blevet rengjort med 10% blegemiddel, efterfulgt af 70% ethanol. Denne tørringsmetode kan tage flere timer.
    2. Anbring enhederne uden låg i en steril laminær strømningshætte (svarende til den foretrukne metode nedenfor).
    3. Tør enhederne ved hjælp af en specialbygget "tørrekasse" (den optimerede metode, der blev fulgt i denne undersøgelse), som kan konstrueres til minimale omkostninger ved hjælp af computerventilatorer og HEPA-filtre (se den supplerende fil 1).
      BEMÆRK: Uanset hvilken metode der anvendes, skal tørretrinnet optimeres til det lokale miljø. Overvåg ofte, hvor hurtigt brøndene tørrer, indtil den typiske tørretid er identificeret. I omgivelser med lav luftfugtighed resulterer brugen af en tørreboks i en tørretid på ~30-40 min. Lad ikke pladerne blive for tørre, da medierne i brøndene krymper og synker. Det er bedre at fjerne enheden fra tørring, mens et par brønde stadig er våde, end at lade det tørre længere og potentielt overtørre et stort antal brønde.
  4. Kontroller vandkrystallerne. Hvis størstedelen af vandkrystallerne i bakken er tørret ud og har mistet volumen under tørringsprocessen, tilsættes mere til bakken.
  5. Når bakterierne er tørre, tilsættes ormene straks (afsnit 12) eller forsegles bakken til senere brug. Luk bakkelåget for at forsegle, og pakk alle fire sider ind med et enkelt stykke parafilm. Gentag to gange for i alt tre Parafilm-lag. Efter at have pakket bakken helt ind, kan enheden efterlades på bænken ved stuetemperatur i op til 4 dage, før ormene tilsættes (afsnit 12).

12. Tilføjelse af orme til multibrøndsenheden

  1. Tilsæt manuelt en orm pr. brønd til hver brønd ved hjælp af en platinplukning for at overføre dyrene fra ormepladerne fremstillet i afsnit 9. Vælg kun orme, der er på det ønskede livsstadium og alder.
    BEMÆRK: Hvis det tager mere end 1 time at tilføje ormene til enheden, kan det resultere i udtørring af lmNGM, så ormene skal tilføjes så hurtigt som muligt. Hvis du vælger flere orme (20+) ad gangen, før du føjer dem til enhedens brønde, kan det hjælpe med at øge hastigheden.

13. Afslutning af forberedelsen af enheden til langvarig brug

BEMÆRK: Disse trin sikrer, at enhedens brønde forbliver hydreret under eksperimentets varighed.

  1. Undersøg vandkrystallerne. Sørg for, at vandkrystallerne er i niveau med toppen af enheden, men ikke flyder over på den. Tilsæt yderligere vandkrystaller til bakken, hvis det er nødvendigt.
  2. Tilsæt en dråbe tilberedt vaskemiddelopløsning (se trin 1.5) på indersiden af bakkens låg, og gnid ind med en opgaveserviet, indtil vaskemiddelopløsningen er tørret. Dette forhindrer tåge på låget, efter at enheden er forseglet inde i bakken, så ormene er tydeligt synlige.
  3. Pak bakken ind med tre stykker Parafilm ved hjælp af en specifik teknik, der fremmer Parafilm-forseglingens langsigtede integritet.
    1. Stræk et stykke parafilm lidt, så det kun dækker to sider af bakken. Gentag dette med et andet stykke parafilm for at dække de to andre sider.
    2. Lagdelt oven på det første lag Parafilm, tag et sidste stykke Parafilm, stræk det helt og vikl alle fire sider. Hvis de er korrekt forseglet, skal enhedens brønde forblive hydreret i ~ 2 måneder.
      BEMÆRK: Parafilmens integritet skal overvåges hver 1-2 uge, og parafilmen skal udskiftes, hvis den er brudt.
  4. Fjern eventuelle fingeraftryk fra toppen af bakken ved hjælp af en opgaveserviet, der er fugtet med 70% ethanol.

14. Indsamling af data

BEMÆRK: Formålet med denne undersøgelse er at beskrive kulturmetoden. Når de er befolket, er enheder med flere brønde kompatible med langsgående overvågning af en række fænotyper. Her gives grundlæggende vejledning til måling af flere af de mest almindelige parametre.

  1. Levetid: Overvåg levetiden ved at banke på pladen eller udsætte ormene for et stærkt blåt lys hver 1-3 dag. Score som død, hvis der ikke observeres nogen bevægelse. Disse multibrøndsenheder er også kompatible med automatiserede billedbehandlings- og analyserørledninger til estimering af levetid13,18.
  2. Aktivitet: Overvåg de enkelte dyrs aktivitet gennem hele livet ved at tage statiske billeder eller videoer af dyrene i enhedens brønde og vurdere den tilbagelagte afstand, hastighed eller andre bevægelsesmålinger. Enhederne er også kompatible med automatiserede billedbehandlings- og analyserørledninger til estimering af aktivitet13,18.
  3. Kropsstørrelse og form: Overvåg ændringerne i kropsstørrelse og form ved at tage statiske billeder af dyrene i enhedens brønde og kvantificere de visuelle parametre ved hjælp af standard billeddannelsesteknikker. I princippet bør denne dyrkningsmetode være kompatibel med eksisterende software til en mere sofistikeret vurdering af ormens kropsform 19,20,21.

15. Genbrug af enhederne

BEMÆRK: Når et eksperiment er afsluttet, kan enhederne med flere brønde rengøres og genbruges op til tre gange. Yderligere genbrug begynder at påvirke ormefænotyperne, muligvis forårsaget af kemikalier fra medierne eller bakterier, der opbygges i væggene i PDMS-materialet.

  1. Kassér parafilmen, og fjern enheden fra bakken. Kontroller hakene i øverste højre hjørne af enheden, som angiver, hvor mange gange den er blevet brugt. Hvis den er blevet brugt tre gange, skal du kassere enheden. Hvis det har været brugt mindre end tre gange, skal du rengøre og genbruge det.
    BEMÆRK: Bakkerne er fremstillet af polystyren og er ikke direkte i kontakt med lmNGM, bakterier eller tilsætningsstoffer til mediet. De kan genbruges mange gange, så længe de forbliver visuelt klare.
  2. Skyl eventuelle resterende vandkrystaller ud af bakken. Sprøjt indersiden af bakken med 10% blegemiddelopløsning, og lad den sidde i 10 min. Skyl med deioniseret vand og tør straks for at undgå vandpletter.
  3. Hold enheden under rindende vand for at begynde at rense mediet ud af brøndene. Bøj forsigtigt og drej enheden under vandet for at hjælpe med at løsne mediet fra brøndene, men bøj ikke så langt, at enheden rives. Udtag eventuelle resterende medier, der sidder fast i hullerne, med en 200 μL pipettespids.
  4. Fyld et 2 L bægerglas med en omrøringsstang ~3/4 fuld med deioniseret vand, og bring det i kog på en kogeplade.
  5. Tilsæt en eller to multibrøndsanordninger og en omrøringsstang til det kogende vand. Tænd for magnetisk omrøring til en lav hastighed (~ 200 o / min) for forsigtigt at omrøre enhederne i vandet. Lad enhederne koge i 10 minutter.
  6. Fjern enhederne fra vandet med metalpincet, og læg dem med godt siden nedad på køkkenrulle for at dræne. Lad enhederne tørre mindst natten over.
  7. Når enhederne er helt tørre, skal du pakke dem ind i folie og forsegle dem med autoklavetape. Skriv på autoklavebåndet, hvor mange gange enheden er blevet brugt. Autoklave på et tørt program i 15 minutter ved 121 °C for at sterilisere. Enhederne er nu klar til genbrug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

WorMotel-kultursystemet kan bruges til at indsamle en række data, herunder vedrørende levetid, sundhed og aktivitet. Offentliggjorte undersøgelser har brugt multi-well enheder til at studere levetid og sundhedspan 13,14, hviletilstand og søvn 22,23,24 og adfærd 25. Levetid kan scores manuelt eller gennem en samling af billeder og downstream billedanalyse. I den førstnævnte tilgang kan ormene observeres manuelt efter en stimulus (f.eks. Tapping pladen eller udsættelse for blåt lys) hver 1-3 dage og scores som død, hvis der ikke observeres nogen bevægelse, svarende til standardmetoder på petriplader1. Sidstnævnte fremgangsmåde er ens, bortset fra at ormbevægelse kan bestemmes ved at sammenligne ramme-til-ramme-forskelle mellem billederne taget efter stimulus er blevet anvendt. Dette giver en ekstra fordel, idet flytning giver oplysninger både om aktivitetsniveauet for de enkelte dyr på det pågældende tidspunkt og giver en metrik, hvormed levetid (f.eks. ophør af bevægelse) og sundhedslængde (flere definitioner er blevet foreslået) kan bestemmes. Billederne kan yderligere bruges til at udtrække yderligere fysiologiske parametre såsom kropsstørrelse, kropsform og kropsholdning.

For at demonstrere systemets kapacitet undersøgte vi det klassiske epistatiske forhold mellem insulinreceptoren, kodet af genet daf-2, og nedstrøms FOXO familie transkriptionsfaktor kodet af daf-16 i sammenhæng med levetid, sundhedslængde og daglig aktivitet for individuelle dyr. Vildtype (stamme N2) og daf-16(mu68) funktionstab (stamme CF1038) C. elegans fodret med E. coli (stamme HT115), der udtrykker enten kontrol (tom vektor; EV) eller daf-2 RNAi-fodringskonstruktioner blev dyrket i multibrøndsenheder, og hvert dyr blev overvåget for levetid (figur 2A), sundhedslængde (figur 2B) og daglig aktivitet (figur 2C). Aktiviteten blev overvåget dagligt ved at tage en række stillbilleder hver 5. sek. i 2 minutter, hvor ormene blev udsat for stærkt blåt lys i 5 sekunder efter 1 minut for at stimulere aktiviteten (ifølge Churgin et al.13). Den daglige aktivitet for hvert dyr blev estimeret ved at normalisere baggrunden på tværs af brønde og billeder, identificere ormeområdet i hvert billede og beregne ændringen i området mellem tilstødende billeder. Levetid blev defineret som den alder, hvor aktivitet sidst blev observeret for hver orm, og sundhedslængde blev defineret som den alder, hvor en orm ikke længere kunne bevæge sig en fuld kropslængde. Som forventet fra adskillige tidligere undersøgelser (f.eks. Kenyon et al.26, Murphy et al.27) resulterede daf-16 (mu86) mutationen i korte levetider og forhindrede levetidsforlængelse fra RNAi-knockdown af daf-2 (figur 2A). Et lignende mønster blev observeret for sundhedstid (figur 2B). Som en fordel ved at bruge multi-well enhedskultursystemer muliggør kapaciteten til at spore individuelle dyr gennem hele livet en detaljeret analyse af den individuelle variation i hver målt fænotype på tværs af populationen. For eksempel kan variationen i levetid og sundhedslængde på tværs af individuelle dyr sammenlignes enten i absolutte termer (figur 2D) eller som en brøkdel af den samlede levetid (figur 2E). Fænotyper tidligt i livet kan yderligere sammenlignes med fænotyper i det sene liv, herunder levetid, hos individuelle dyr på tværs af en population. F.eks. korrelerede den kumulative aktivitet for hvert enkelt dyr i hele levetiden (dvs. arealet under kurven [AUC] for individuel aktivitet) bedre med levetiden (figur 2F) end den kumulative levetid frem til dag 5 i livet (figur 2G) på tværs af alle de målte betingelser. Vi understreger, at formålet med dette arbejde er at give en detaljeret protokol til konstruktion af multi-well-miljøet til sporing af individuelle dyr over tid, ikke til måling af en bestemt fænotype ved hjælp af enheden. De repræsentative resultater vist i figur 2 giver blot et eksempel på de fænotyper, der kan måles i dette system. Når det er konstrueret, er multibrøndsmiljøet kompatibelt med en lang række teknikker til måling af fænotyperne af fritkravlende orme på faste medier.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over de mikrofabrikerede multibrøndsenheder . (A) Individuelle C. elegans dyrkes på faste lavsmeltede nematodevækstmedier (lmNGM) agarosepuder podet med bakteriel mad i individuelle brønde. Rummet mellem brøndene er belagt med et aversivt kemikalie (kobbersulfat) for at isolere hver orm i brønden. Hver enhed er fastgjort inde i en enkeltbrøndsbakke. Bakkens omkreds er fyldt med vandkrystaller for at opretholde fugtigheden. Bakken er forseglet med Parafilm for at tillade iltudveksling. Billede oprettet med BioRender.com. B) Oversigt over multibrøndsanordningen med angivelse af den foreslåede rækkefølge for påfyldning af brøndene. De indre brønde (hvide) modtager 14 μL lmNGM. De ydre brønde (grå) modtager 15 μL lmNGM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Korrelation af målte fænotyper på tværs af populationer i individuelle dyr ved hjælp af multi-well-enheder. Alle panelerne leverer data fra det samme eksperiment, der sammenligner fire grupper af dyr: vildtype (N2) dyr underlagt tom vektor EV (RNAi) (N = 138), vildtypedyr underlagt daf-2 (RNAi) (N = 151), daf-16 (mu86) dyr underlagt EV (RNAi) (N = 123) og daf-16 (mu86) dyr underlagt daf-2 (RNAi ) (N = 135). (A) Levetidsforlængelsen fra daf-2 (RNAi) blokeres af daf-16 (mu86) nullmutationen. Parvis signifikans mellem grupper bestemt af log-rank-testen (survdiff-funktion i R). (B) Den sundhedsperiode, der her defineres som den dag, hvor et dyr ikke længere kan bevæge en fuld kropslængdeforlængelse fra daf-2 (RNAi), blokeres af daf-16 (mu86) nullmutationen. Parvis signifikans mellem grupper bestemt af log-rank-testen (survdiff-funktion i R). (C) Det 3-dages rullende gennemsnit af aktivitet over hele levetiden reduceres med både daf-16(mu86) og daf-2(RNAi). Signifikans beregnet ved hjælp af Mann-Whitney U-testen for at sammenligne arealet under kurven for aktivitet over levetiden for individuelle dyr mellem grupper. D) Helbredstilstand og levetid for hver population som absolutte værdier (gennemsnit ± standardafvigelse i gennemsnittet). (E) Levetid og levetid for hver population normaliseret til total levetid inden for hver gruppe (gennemsnit ± standardfejl i gennemsnittet). F) Den kumulative aktivitet i hele levetiden (areal under kurven [AUC] over hele levetiden) for individuelle dyr korrelerer bedre med levetiden end (G) aktiviteten for individuelle dyr på en bestemt dag i hele levetiden (aktivitetskorrelationen på dag 8, der repræsenterer det punkt, hvor den gennemsnitlige aktivitet maksimeres, vises), beregnet ved lineær regression (lm-funktion i R). n.s. = ikke signifikant, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Alle p-værdier blev justeret for flere sammenligninger ved hjælp af Bonferroni-metoden til sammenligninger foretaget inden for hvert panel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: STL-fil til udskrivning af 3D-multibrøndsenhedsformen Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

WorMotel-systemet er et kraftfuldt værktøj til indsamling af individualiserede data for hundredvis af isolerede C. elegans over tid. Efter de tidligere undersøgelser ved hjælp af multi-well-enheder til applikationer i udviklingshvile, bevægelsesadfærd og aldring var målet med dette arbejde at optimere forberedelsen af multi-well-enheder til langsigtet overvågning af aktivitet, sundhed og levetid på en højere gennemstrømningsmåde. Dette arbejde giver en detaljeret protokol til forberedelse af enheder med flere brønde, der optimerer mange af trinene fra den oprindelige protokol13, fremhæver nøglepunkter, der kan give tekniske vanskeligheder, og giver en diskussion om genbrug af pladerne og andre materialer.

Med henblik på skalering - som et laboratorium, der i øjeblikket forbereder mellem 10 og 20 enheder på en typisk uge - var en topovervejelse, om enhederne kunne genbruges og i så fald i hvilken grad. Der er en højere omkostning i form af både tid og penge i at forberede PDMS-enheder i forhold til at udføre traditionel kultur på petriplader, men disse højere omkostninger kan reduceres ved at genbruge PDMS eller andre komponenter i systemet. Med mange genanvendelser begyndte PDMS at udvikle en gul farve, hvilket sandsynligvis afspejler akkumulering af forbindelser fra lmNGM-mediet eller bakterierne. De dyr, der blev dyrket på disse plader, viste også en højere flugtrate og reduceret levetid. Baseret på snesevis af eksperimenter er tre anvendelser optimale til genbrug af disse PDMS-enheder, hvilket gør det muligt at vurdere aldersrelaterede fænotyper uden en målbar indvirkning fra PDMS-nedbrydning, samtidig med at antallet af nye enheder, der skal støbes (hvilket sparer omkostninger). Vi bekræftede endvidere, at forsøgsmatchede dyr dyrket på enheder ved deres første, anden og tredje brug producerede overlevelseskurver, der næsten ikke kunne skelnes og ikke statistisk forskellige (data ikke vist). Bakkerne, der bruges til at indeholde enhederne, er lavet af polystyren og kan rengøres og genbruges på ubestemt tid, hvis de forbliver fri for ridser eller andre mærker, der kan forstyrre visualiseringen af ormene.

En vigtig udfordring ved forberedelse af multibrøndsenheder til applikationer, der varer mere end ~ 2 uger, er forebyggelse af pladeforurening med miljøbakterier og svampe. Der er flere trin, hvor sterilisering er afgørende for at forhindre forurening. Disse inkluderer autoklavering af alle enheder inden brug, kogning af de enheder, der er beregnet til genbrug, autoklavering af de absorberende vandkrystaller, der bruges til at opretholde fugtighed, rengøring af bakkerne, der indeholder enhederne med både blegemiddel og ethanol før brug, og filtersterilisering af vaskemiddelopløsningen, der påføres låget på bakken for at forhindre tåge og tilsættes til kobbersulfatopløsningen. Implementering af hver af disse ændringer reducerede især kontamineringshændelser, hvilket gjorde det muligt konsekvent at bruge de forseglede enheder til langsgående overvågning i hele levetiden, selv under forhold for lang levetid (f.eks. knockout af DAF-2), der kræver overvågning i >45 dage. Den her beskrevne protokol indeholder to ændringer af den oprindelige protokol til langtidsanvendelser designet til at opretholde ensartet brøndtørring og forhindre udtørring. For det første blev enhedens samlede dybde øget med 2 mm for at øge kapaciteten for vandkrystaller. Over lange eksperimenter, især i et miljø med lav luftfugtighed, førte for få vandkrystaller i bakken til udtørring af lmNGM. Sammen med flere vandkrystaller var det nødvendigt at øge mængden af agarose, der blev tilsat til brøndene langs kanten af enheden. Disse brønde havde tendens til at tørre først efter brøndbelastningen (sektion 6) og krympe. Brug af 14 μL agarose på de indvendige brønde var nok volumen til at fylde brøndene helt uden at skabe den kuplede top, der skyldes overfyldning af brøndene. Tilsætning af 15 μL agarose til de ydre brønde gav tilstrækkelig volumen til, at når brøndene begyndte at tørre ud, skrumpede de ind til et niveau, der kunne sammenlignes med de 14 μL, der blev tilsat i de indre brønde.

En af de største afvigelser fra den oprindelige protokol var at vende den rækkefølge, hvori brugeren indlæser lmNGM (sektion 6) og kobbersulfat (sektion 7). Oprindeligt blev kobbersulfatet først tilsat voldgraven, efterfulgt af at fylde brøndene med lmNGM13. Det blev observeret, at fyldning af brøndene med lmNGM så hurtigt efter plasmarensning som muligt forbedrede klæbelsen af lmNGM til brøndvæggene. At vente for længe efter plasmarensningen resulterede i brønde med bobler og kuplede toppe, som kan forstyrre visualiseringen af ormene. Det er især vigtigt at prioritere påfyldning af brøndene frem for tilsætning af kobbersulfat, når man forbereder flere enheder på samme tid for at sikre ensartede lmNGM-overflader af høj kvalitet. En ulempe ved at fylde brøndene først er, at den hydrofile overflademodifikation, der produceres af plasmarenseren, vil være slidt mærkbart, når brugeren går videre til tilsætning af kobbersulfat. Kobbersulfat flyder ikke let gennem voldgraven, når overfladen bliver mindre hydrofil, hvilket gør det udfordrende at opnå fuldstændig dækning. Tilsætning af vaskemiddel til kobbersulfatopløsningen for at fungere som overfladeaktivt middel forbedrer opløsningens strømning gennem voldgraven. En platintrådpluk kan også bruges til forsigtigt at lede kobbersulfatet gennem voldgraven ved at bryde spændingen på ethvert punkt, hvor kobbersulfatet har svært ved at flyde. Desuden, hvis kobbersulfatopløsningen blev efterladt i voldgraven, ville den let spildes i brøndene og forurene lmNGM-overfladen, når bakken vippes. Lastningsprocessens art gør det næsten umuligt at holde enheden tilstrækkelig plan hele vejen igennem for at forhindre kobber i at forurene en delmængde af brøndene. For at tage højde for dette fjernes kobbersulfatopløsningen fra voldgraven (trin 7.3), og det resterende kobbersulfat, der efterlades, er tilstrækkeligt til at afskrække de fleste orme fra at flygte. Som en sidste note om brugen af kobbersulfat som en aversiv barriere kan nogle afskrækningsmidler påvirke aldersassocierede fænotyper, herunder levetid. Anvendelsen af kobbersulfat i disse multibrøndsindretninger blev undersøgt af Churgin et al.13 og viste sig ikke at have nogen påviselig indvirkning på hverken levetid eller udvikling.

Andre mindre opdateringer af protokollen fokuserer på at forbedre de skridt, der er taget for at forberede PDMS. Et ekstra afgasningstrin efter blanding af PDMS-basen og hærdningsmidlet blev tilføjet, da dette er en proces, der genererer mange bobler. Fjernelse af størstedelen af boblerne, inden blandingen tilsættes til enhedens forme, minimerer de bobler, der er tilbage efter det andet afgasningstrin. For at sikre, at bunden af enheden er helt flad og jævn, en funktion, der er vigtig for helpladebilleddannelse, blev der lagt et stykke glas eller akryl over toppen af den fyldte form. Dette trin er ikke vigtigt - men stadig nyttigt - for applikationer, der kun undersøger en brønd ad gangen, da brugeren manuelt kan justere fokus for hver brønd. Endelig var hærdning af PDMS ved en højere temperatur (55 °C) nødvendig på det sted, hvor denne version af protokollen blev optimeret (Tucson, Arizona, USA), i modsætning til de 40 °C, der var angivet i den oprindelige protokol (optimeret i Philadelphia, Pennsylvania, USA). Dette tyder på, at forskelle mellem steder (såsom klima eller de præcise reagenser og udstyr, der anvendes) kan påvirke de specifikke trin i protokollen, såsom hærdningstemperatur eller tørringsteknikker, og at disse muligvis skal optimeres på hvert sted. For eksempel spiller luftfugtighed en stor rolle i bestemmelsen af tørretiden for pladerne efter pletblødning, og dette kan variere meget mellem steder eller årstider.

I princippet kan dette multibrøndsenhedssystem bruges til at indsamle data om enhver fænotype, der kan måles under standard brightfieldmikroskopi på petriplader - levetid, sundhedstid, ustimuleret / stimuleret bevægelse, kropsstørrelse og form, bevægelsesgeometri - med den ekstra evne til at spore disse målinger for individuelle orme over tid. Som nævnt i indledningen er der andre metoder til at erhverve individuelle data om hele levetiden. Microfluidics-enheder28 eller multibrøndplader29 giver mulighed for at følge de enkelte dyrs livshistorie, men kun ved at dyrke ormene i flydende medier. Et flydende miljø kan ændre ormenes transkriptom 10,11,30 i forhold til faste medier og inducerer forskellige fysiologiske og adfærdsændringer, herunder episodisk svømning 31, øget energiforbrug 10,32 og forhøjet oxidativ stress 10. I hvilken grad levetid og andre målinger relateret til sund aldring kan sammenlignes direkte mellem flydende og faste medier er uklart. Multibrøndsenheder med fast kultur muliggør sporing af en enkelt orm i et miljø, der kan sammenlignes med standardgruppekultur på petriplader. Den buede struktur af enhedsvæggen giver mulighed for billeddannelse af orme overalt inde i brønden, hvilket i princippet gør disse enheder kompatible med mere sofistikerede værktøjer til analyse af en orm, såsom Worm Tracker33.

Evnen til at overvåge individuelle dyr i løbet af et forsøg på en multi-well-enhed ledsages af flere begrænsninger. For det første, selv med en optimeret protokol, kræver disse enheder mere tid at konfigurere pr. dyr end standardkultur på petriplader, hvilket giver data om et enkelt dyr på bekostning af den samlede prøvestørrelse. Ormene er dog også isoleret til individualiserede brønde, hvilket fjerner nogle af komplikationerne forbundet med automatiseret levetidsmåling, såsom automatisk at detektere individuelle dyr, der holder op med at bevæge sig, mens de rører hinanden. Automatisering mere end genvinder den tid, der er tabt til den mere komplekse opsætning, og giver mulighed for mere high-throughput screening13,18. For det andet vil eksperimentelle forhold, som ormene ikke kan lide mere end kobbersulfatgraven, såsom stærke stressfremkaldende midler (f.eks. Paraquat) eller diætbegrænsning, føre til, at ormene flygter fra brøndene og ind i voldgraven. For det tredje, mens PDMS-enhederne tillader brightfield og darkfield mikroskopi, har PDMS-materialet tendens til at have både høj og ujævn baggrundsfluorescens, sidstnævnte sandsynligvis som følge af støv eller andre mikropartikler, der bliver indlejret i PDMS under støbning, hvilket begrænser deres anvendelse i fluorescerende mikroskopi. Endelig antyder misfarvningen observeret i PDMS for enheder, der genbruges over flere eksperimenter, og den tilhørende reduktion i levetid og stigning i flugt, at mediekomponenterne og andre tilsatte kemikalier igler ind i PDMS over tid. I hvilken grad dette kan påvirke aldrende fænotyper eller lægemiddelbehandlinger undersøges i øjeblikket. Som tidligere nævnt er der en alternativ metode til en enkeltormkultur, der ligner PDMS multi-well-enheder, men i stedet bruger kommercielt tilgængelige mikrobakker til dyrkning af isolerede dyr16. Disse mikrobakker er lavet af polystyren, hvilket undgår det potentielle problem med udvaskningsmediekomponenter og har konsistent fluorescensbaggrund, hvilket muliggør direkte in vivo-fluorescensbilleddannelse direkte på pladen. Mikrobakkebrøndene er også omgivet af palmitinsyre i stedet for kobbersulfatet, der anvendes i protokollen beskrevet her, hvilket er mere aversivt og reducerer fraktionen af orme, der forlader deres brønde, selv i tilfælde af stressfremkaldende midler og diætbegrænsning. Disse fordele realiseres på bekostning af brøndenes lavere pakkeeffektivitet, da mikrobakkerne maksimalt tillader dyrkning af 96 orme i en enkelt bakke i modsætning til PDMS-enhedernes 240 ormkapacitet. Specifikationerne for det ønskede resultat af et eksperiment vil påvirke, hvilke af disse systemer der skal udnyttes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne anfører, at de ikke har nogen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH R35GM133588 til G.L.S., en United States National Academy of Medicine Catalyst Award til G.L.S., State of Arizona Technology and Research Initiative Fund administreret af Arizona Board of Regents og Ellison Medical Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 lb weight CAP Barbell RP-002.5
Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) Falken Design ACRYLIC-CL-3-8/1224 Large sheet cut to smaller sizes 
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Autoclavable squeeze bottle Nalgene 2405-0500
Bacto agar BD Difco 214030
Bacto peptone Thermo Scientific 211677
Basin, 25 mL VWR 89094-664 Disposable pipette basin 
Cabinet style vacuum desiccator  SP Bel-Art F42400-4001 Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. 
CaCl2 Acros Organics 349615000
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Wildtype strain
Carbenicillin  GoldBio C-103-25
Centrifuge Beckman 360902
Cholesterol ICN Biomedicals Inc 101380
Compressed oxygen tank Airgas UN1072
CuSO4 Fisher Chemical C493-500
Dry bead bath incubator Fisher Scientific 11-718-2
Escherichia coli OP50  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Standard labratory food for C. elegans
Ethanol Millipore ex0276-4
Floxuridine Research Products International F10705-1.0
Hybridization oven Techne 731-0177 Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice
Incubators Shel Lab 2020 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria 
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) GoldBio I2481C100
K2HPO4 Fisher Chemical P288-500
KH2PO4 Fisher Chemical P286-1
Kimwipes KimTech 34155 Task wipes
LB Broth, Lennox BD Difco 240230
Low melt agarose Research Products International A20070-250.0
MgSO4 Fisher Chemical M-8900
Microwave  Sharp R-530DK
Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 Rainin 17013800 The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided
NaCl Fisher Bioreagents BP358-1
Nunc OmniTray Thermo Scientific 264728 Clear polystyrene trays
Parafilm M Fisher Scientific 13-374-10 Double-wide (4 in)
Petri plate, 100 mM  VWR 25384-342
Petri plate, 60 mM  Fisher Scientific FB0875713A
Plasma cleaner Plasma Etch, Inc. PE-50
PLATINUM vacuum pump JB Industries DV-142N 
PolyJet 3D printer Stratasys  Objet500 Connex3 PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)
Shaking incubator Lab-Line 3526CC
smartSpatula LevGo, Inc. 17211 Disposable spatula
Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) M2 Polymer Technologies Type S Referred to in main text as "water crystals"
SYLGARD 184 Silicone Elastomer base The Dow Chemical Company 2065622
SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent The Dow Chemical Company 2085925
Syringe filter (0.22 µm) Nest Scientific USA Inc.  380111
Syringe, 10 mL  Fisher Scientific 14955453
TWEEN 20 Thermo Scientific J20605-AP Detergent
Vacuum pump oil VWR 54996-082
VeroBlackPlus Stratasys  RGD875 Rigid 3D printing filament
Weigh boat Thermo Scientific WB30304 Large enough for PDMS mixture volume

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  2. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  3. Rahman, M., et al. NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10, 16190 (2020).
  4. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  5. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. Liu, X., Sun, Y. 13, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 13 295-321 (2021).
  6. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  7. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9, 14340 (2019).
  8. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
  9. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
  10. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
  11. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
  12. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  13. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  14. Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
  15. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  16. Espejo, L., et al. Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  18. Freitas, S. Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. University of Arizona. , Tucson, USA. Master's thesis (2021).
  19. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape. PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).
  20. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , (2013).
  21. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
  22. Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental. microPublication Biology. 2020, (2020).
  23. Iannacone, M. J., et al. The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans. eLife. 6, 19837 (2017).
  24. McClanahan, P. D., et al. A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress. Scientific Reports. 10, 4140 (2020).
  25. Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).
  26. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  27. Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  28. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  29. Lionaki, E., Tavernarakis, N. High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).
  30. Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction. The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).
  31. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).
  32. Hartman, J. H., et al. Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity. Scientific Reports. 8, 8359 (2018).
  33. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).

Tags

Tilbagetrækning nummer 190
Langsigtet dyrkning og overvågning af isolerede <em>Caenorhabditis elegans</em> på faste medier i enheder med flere brønde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardea, E. A., DeNicola, D.,… More

Gardea, E. A., DeNicola, D., Freitas, S., Peterson, W., Dang, H., Shuck, K., Fang-Yen, C., Sutphin, G. L. Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices. J. Vis. Exp. (190), e64681, doi:10.3791/64681 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter