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Culture à long terme et surveillance de Caenorhabditis elegans isolés sur des milieux solides dans des dispositifs multipuits

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, 2Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania

Summary

Un protocole optimisé pour la culture de nématodes individuels isolés sur des milieux solides dans des dispositifs multipuits microfabriqués est présenté ici. Cette approche permet de surveiller chaque animal tout au long de sa vie pour une variété de phénotypes liés au vieillissement et à la santé, y compris l’activité, la taille et la forme du corps, la géométrie du mouvement et la survie.

Abstract

Le nématode Caenorhabditis elegans est l’un des systèmes modèles les plus couramment utilisés dans la recherche sur le vieillissement en raison de ses techniques de culture simples et peu coûteuses, de son cycle de reproduction rapide (~3 jours), de sa courte durée de vie (~3 semaines) et de ses nombreux outils disponibles pour la manipulation génétique et l’analyse moléculaire. L’approche la plus courante pour mener des études sur le vieillissement chez C. elegans, y compris l’analyse de survie, consiste à cultiver des populations de dizaines à des centaines d’animaux ensemble sur des milieux de croissance de nématodes solides (NGM) dans des plaques de Petri. Bien que cette approche recueille des données sur une population d’animaux, la plupart des protocoles ne suivent pas les animaux individuels au fil du temps. Un protocole optimisé pour la culture à long terme d’animaux individuels sur des dispositifs microfabriqués de polydiméthylsiloxane (PDMS) microfabriqués appelés WorMotels est présenté ici. Chaque dispositif permet de cultiver jusqu’à 240 animaux dans de petits puits contenant du NGM, chaque puits étant isolé par un fossé contenant du sulfate de cuivre qui empêche les animaux de fuir. S’appuyant sur la description originale de WorMotel, ce document fournit un protocole détaillé pour le moulage, la préparation et le remplissage de chaque appareil, avec des descriptions des complications techniques courantes et des conseils pour le dépannage. Ce protocole comprend des techniques pour le chargement constant de NGM en petit volume, le séchage constant du NGM et des aliments bactériens, des options pour la réalisation d’interventions pharmacologiques, des instructions et des limites pratiques pour la réutilisation des dispositifs PDMS, et des conseils pour minimiser la dessiccation, même dans des environnements à faible humidité. Cette technique permet la surveillance longitudinale de divers paramètres physiologiques, y compris l’activité stimulée, l’activité non stimulée, la taille corporelle, la géométrie du mouvement, la durée de santé et la survie, dans un environnement similaire à la technique standard pour la culture de groupe sur des milieux solides dans des plaques de Petri. Cette méthode est compatible avec la collecte de données à haut débit lorsqu’elle est utilisée conjointement avec un logiciel de microscopie et d’analyse automatisé. Enfin, les limites de cette technique sont discutées, ainsi qu’une comparaison de cette approche avec une méthode récemment développée qui utilise des microplateaux pour cultiver des nématodes isolés sur des milieux solides.

Introduction

Caenorhabditis elegans est couramment utilisé dans les études sur le vieillissement en raison de son temps de génération court (environ 3 jours), de sa courte durée de vie (environ 3 semaines), de sa facilité de culture en laboratoire, de son degré élevé de conservation évolutive des processus moléculaires et des voies avec les mammifères et de la grande disponibilité des techniques de manipulation génétique. Dans le contexte des études sur le vieillissement, C. elegans permet la génération rapide de données sur la longévité et de populations âgées pour l’analyse des phénotypes en fin de vie chez les animaux vivants. L’approche typique pour mener des études sur le vieillissement des vers consiste à mesurer manuellement la durée de vie d’une population de vers maintenue en groupes de 20 à 70 animaux sur milieu de croissance du nématode gélose solide (NGM) dans des plaques de Petri de 6 cm1. L’utilisation de populations synchronisées selon l’âge permet de mesurer la durée de vie ou les phénotypes transversaux chez les animaux individuels de la population, mais cette méthode empêche de surveiller les caractéristiques des animaux individuels au fil du temps. Cette approche est également exigeante en main-d’œuvre, limitant ainsi la taille de la population pouvant être testée.

Il existe un nombre limité de méthodes de culture qui permettent la surveillance longitudinale de C. elegans tout au long de leur vie, et chacune présente un ensemble distinct d’avantages et d’inconvénients. Les dispositifs microfluidiques, y compris WormFarm2, NemaLife3 et la puce « comportementale »4, entre autres 5,6,7, permettent de surveiller des animaux individuels au fil du temps. La culture de vers en culture liquide à l’aide de plaques multipuits permet également de surveiller des animaux individuels ou de petites populations de C. elegans au fil du temps 8,9. L’environnement liquide représente un contexte environnemental distinct de l’environnement de culture commun sur les milieux solides dans les plaques de Petri, ce qui peut modifier les aspects de la physiologie animale qui sont pertinents pour le vieillissement, y compris la teneur en graisse et l’expression des gènes de réponse au stress10,11. La capacité de comparer directement ces études à la majorité des données recueillies sur le vieillissement de C. elegans est limitée par les différences dans les variables environnementales potentiellement importantes. Le Worm Corral12 est une approche développée pour héberger des animaux individuels dans un environnement qui reproduit plus fidèlement la culture médiatique solide typique. Le Worm Corral contient une chambre scellée pour chaque animal sur une lame de microscope utilisant de l’hydrogel, permettant la surveillance longitudinale des animaux isolés. Cette méthode utilise l’imagerie en fond clair standard pour enregistrer des données morphologiques, telles que la taille et l’activité corporelles. Cependant, les animaux sont placés dans l’environnement hydrogel en tant qu’embryons, où ils restent intacts tout au long de leur vie. Cela nécessite l’utilisation de milieux génétiques mutants ou transgéniques conditionnellement stériles, ce qui limite à la fois la capacité de dépistage génétique, car chaque nouvelle mutation ou transgène doit être croisé dans un arrière-plan avec stérilité conditionnelle, et la capacité de dépistage de médicaments, car les traitements ne peuvent être appliqués qu’une seule fois aux animaux en tant qu’embryons.

Une méthode alternative développée par le laboratoire Fang-Yen permet la culture de vers sur des milieux solides dans des puits individuels d’un dispositif microfabriqué de polydiméthylsiloxane (PDMS) appelé WorMotel13,14. Chaque dispositif est placé dans un plateau à puits unique (c’est-à-dire avec les mêmes dimensions qu’une plaque de 96 puits) et comporte 240 puits séparés par un fossé rempli d’une solution aversive pour empêcher les vers de se déplacer entre les puits. Chaque puits peut abriter un seul ver pendant toute sa durée de vie. L’appareil est entouré de granulés de gel de polyacrylamide absorbant l’eau (appelés « cristaux d’eau »), et le plateau est scellé avec un film de laboratoire Parafilm pour maintenir l’humidité et minimiser la dessiccation du média. Ce système permet de recueillir des données sur la durée de vie et la durée de vie de chaque animal, tandis que l’utilisation de milieux solides récapitule mieux l’environnement vécu par les animaux dans la grande majorité des études publiées sur la durée de vie de C. elegans, permettant ainsi des comparaisons plus directes. Récemment, une technique similaire a été développée en utilisant des microplateaux en polystyrène qui étaient à l’origine utilisés pour les tests de microcytotoxicité15 à la place du dispositif PDMS16. La méthode des microplateaux permet de recueillir des données individualisées sur les vers cultivés sur des milieux solides et a amélioré la capacité de contenir les vers dans des conditions qui causeraient généralement la fuite (par exemple, les facteurs de stress ou les restrictions alimentaires), le compromis étant que chaque microplateau ne peut contenir que 96 animaux16, alors que le dispositif multipuits utilisé ici peut contenir jusqu’à 240 animaux.

Vous trouverez ici un protocole détaillé pour la préparation de dispositifs multipuits optimisé pour la cohérence de plaque à plaque et la préparation de plusieurs dispositifs en parallèle. Ce protocole a été adapté du protocole original du laboratoire Fang-Yen13. Plus précisément, il existe des descriptions de techniques visant à minimiser la contamination, à optimiser le séchage constant des milieux solides et de la source alimentaire bactérienne, et à administrer l’ARNi et les médicaments. Ce système peut être utilisé pour suivre la durée de santé individuelle, la durée de vie et d’autres phénotypes, tels que la taille et la forme du corps. Ces dispositifs multipuits sont compatibles avec les systèmes à haut débit existants pour mesurer la durée de vie, ce qui peut éliminer une grande partie du travail manuel impliqué dans les expériences traditionnelles sur la durée de vie et offrir la possibilité de mesurer la longévité et de suivre la santé de C. elegans à grande échelle automatisés.

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Protocol

1. Préparation des solutions de stock et des supports

REMARQUE: Avant de commencer la préparation des dispositifs multipuits, préparez les solutions mères et les supports suivants.

  1. Solutions mères pour milieux de croissance des nématodes (NGM) et NGM à bas point de fusion (lmNGM):
    1. Préparer 1 M K 2 HPO4 : Ajouter 174,18 g de K2HPO4 dansune bouteille de 1 L et la remplir jusqu’à 1 L d’eau désionisée stérile. Autoclave (121 °C, 15 psig) pendant 30 min, et conserver à température ambiante (RT).
    2. Préparer 1 M KPi, pH 6,0: Ajouter 136,09 g de KH2HPO4 dans un flacon de 1 L et remplir jusqu’à 1 L d’eau désionisée stérile. Titrer avec 1 M K2HPO4 à pH 6,0. Autoclave (121 °C, 15 psig) pendant 30 min, et conserver à RT.
    3. Préparer 1 M de CaCl 2 : Ajouter 73,5 g de CaCl2 dans un flacon de 500 mL et remplir jusqu’à 500 mL d’eau désionisée stérile. Autoclave (121 °C, 15 psig) pendant 30 min, et conserver à RT.
    4. Préparer 1 M de MgSO 4 : Ajouter 123,25 g de MgSO4 dans une bouteille de 500 mL et remplir jusqu’à 500 mL d’eau désionisée stérile. Autoclave (121 °C, 15 psig) pendant 30 min, et conserver à RT.
    5. Préparer 5 mg/mL de cholestérol : Mélanger 2,5 g de cholestérol, 275 mL d’éthanol à 100 % et 25 mL d’eau désionisée stérile dans une bouteille ambrée de 500 mL. Magasin chez RT.
    6. Préparer 50 mM de floxuridine : Combiner 0,1231 g de floxuridine et 10 mL d’eau désionisée stérile dans un tube conique de 15 mL. Filtrez-stérilisez avec un filtre de 0,22 μm à l’aide d’une seringue de 10 mL. Aliquote 1 mL chacun dans 10 tubes microcentrifugés et les conserver à −20 °C.
    7. Préparer 50 mg/mL de carbénicilline : Dans un tube conique de 15 mL, mélanger 500 mg de carbénicilline avec 10 mL d’eau désionisée stérile. Filtrez-stérilisez avec un filtre de 0,22 μm à l’aide d’une seringue de 10 mL. Aliquote 1 mL chacun dans 10 tubes microcentrifugés et les conserver à −20 °C.
    8. Préparer 1 mM d’isopropyle ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) : Dans un tube conique de 15 mL, combiner 2,38 g d’IPTG avec 10 mL d’eau désionisée stérile. Filtrez-stérilisez avec un filtre de 0,22 μm à l’aide d’une seringue de 10 mL. Aliquote 1 mL chacun dans 10 tubes microcentrifugés et les conserver à −20 °C.
    9. Préparer 100 mg/mL d’ampicilline : Dans un tube conique de 15 mL, mélanger 1 g d’ampicilline avec 10 mL d’eau désionisée stérile. Filtrez-stérilisez avec un filtre de 0,22 μm à l’aide d’une seringue de 10 mL. Aliquote 1 mL chacun dans 10 tubes microcentrifugés et les conserver à −20 °C.
  2. Préparation des milieux de croissance des nématodes (NGM) pour l’entretien général de C. elegans
    1. Pour faire 50 plaques, dans une fiole de 1 L, mélanger 10 g de gélose au Botto, 1,5 g de NaCl, 1,25 g de peptone de Bacto et 486 mL d’eau ultrapure. Autoclave sur cycle liquide (121 °C, 15 psig) pendant au moins 30 min pour stériliser.
    2. Après l’autoclave, une fois le milieu refroidi à 55 °C, ajouter 12,5 mL de 1 M KPi, 500 μL de 1 M MgSO4, 500 μL de 1 M CaCl2 et 500 μL de 5 mg/mL de cholestérol.
    3. À l’aide d’une technique stérile, verser 10 mL de média dans chaque plaque de 60 mm (50 au total). Une fois le milieu solidifié (au moins 30 minutes après le versement), pipeter 300 μL de culture bactérienne (préparée selon les étapes 4 et 10) qui a été cultivée pendant la nuit au centre de la plaque. Laissez la plaque sur le banc, en laissant la culture bactérienne sécher et s’épaissir (1-2 jours). Conserver les plaques à 4 °C.
  3. Préparer le prémélange du milieu de croissance des nématodes à faible point de fusion (NGMlm) :
    1. Dans une fiole de 500 mL, mélanger 4 g d’agarose à bas point de fusion, 0,5 g de Bacto Peptone et 195 mL d’eau ultrapure. Autoclave sur cycle liquide (121 °C, 15 psig) pendant au moins 30 min pour stériliser.
    2. Pendant que le milieu est encore fondu, répartir 10 mL d’aliquotes dans des tubes à essai en verre stérile. Sceller chaque tube à essai avec du parafilm suivi d’un bouchon de tube à essai pour préserver le prémélange de NGMlm et empêcher la dessiccation. Le support se solidifiera et peut être stocké pendant ~2 semaines à RT avant utilisation.
  4. Préparer 142,8 mM de NaCl : Dans un flacon de 250 mL, mélanger 0,8345 g de NaCl et 100 mL d’eau désionisée stérile. Autoclave (121 °C, 15 psig) pendant 30 min, et conserver à RT.
  5. Préparer la solution détergente : Dans un tube conique de 15 mL, mélanger 3 mL de Tween 20 et 7 mL d’eau désionisée stérile. Bien mélanger, filtrer-stériliser avec un filtre de 0,22 μm à l’aide d’une seringue de 10 ml et conserver à TA.
  6. Préparer une solution de sulfate de cuivre : Dans un flacon stérile de 50 mL, mélanger 20 mL d’eau désionisée stérile, 0,5 g deCuSO4 et 100 μL de solution détergente (préparée à l’étape 1.5). Mélanger jusqu’à dissolution du CuSO4 . Magasin chez RT.
  7. Préparer des cristaux de polyacrylamide absorbant l’eau : Dans un flacon compresseur résistant aux autoclaves, mélanger 150 ml d’eau désionisée et 1 g de polymère super absorbant de type S. Mélanger délicatement en retournant la bouteille plusieurs fois. Autoclaver sur un cycle liquide (121 °C, 15 psig) pendant au moins 20 min, et conserver à TA.
  8. Préparer le bouillon de lysogénie (LB): Dans un bécher de 1 L ou plus, mélanger 20 g de poudre LB avec 1 L d’eau désionisée. Aliquote dans deux béchers de 500 mL. Autoclave (121 °C, 15 psig) pendant 30 min, et conserver à la méthode RT
  9. Préparer des plaques de gélose au bouillon lysogénique (LB):
    1. Dans une fiole de 1 L, mélanger 10 g de poudre LB, 7,5 g de gélose bacto et 500 mL d’eau désionisée. Autoclave sur cycle liquide (121 °C, 15 psig) pendant 30 min.
    2. Si vous le souhaitez, ajoutez des antibiotiques facultatifs (après l’autoclave, après refroidissement du milieu à 55 °C) : 500 μL d’ampicilline à 100 mg/mL. À l’aide d’une technique stérile, verser 20 mL de milieu dans chaque plaque de 100 mm (25 au total) et conserver à 4 °C.

2. Impression du moule 3D multi-puits

REMARQUE: Chaque appareil est moulé à partir de PDMS à l’aide d’un moule personnalisé imprimé en 3D. Un seul moule peut produire autant de dispositifs que nécessaire; Cependant, si vous essayez de préparer plusieurs appareils en même temps, un moule imprimé en 3D est nécessaire pour que chaque appareil soit fabriqué en parallèle.

  1. Téléchargez le fichier STL (voir Fichier supplémentaire 1).
  2. Imprimez le moule avec une imprimante 3D haute résolution.
    REMARQUE: La résolution de l’imprimante doit être suffisamment élevée pour permettre des volumes de puits et de douves constants. La résolution d’imprimante suggérée est une résolution XY minimale de ~40 μm et une résolution de couche de 28 μm. Le matériau utilisé par l’imprimante 3D est tout aussi important, car de nombreux types de matériaux empêcheront le PDMS de durcir. Par expérience, les moules produits par les imprimantes PolyJet haute résolution (résolution : axe X = 600 dpi, axe Y = 600 dpi, axe Z = 1 600 dpi) utilisant le matériau d’impression Vero Black fonctionnent de manière cohérente. L’impression 3D des moules utilisés dans cette étude a été externalisée (les détails d’impression peuvent être trouvés dans le tableau des matériaux).

3. Préparation du dispositif multipuits

REMARQUE: Cette section décrit comment le moule imprimé en 3D est utilisé pour créer le dispositif multipuits PDMS.

  1. Régler l’étuve de salaison à 55 °C pour permettre le préchauffage.
  2. Déterminez le nombre d’appareils à préparer en un lot. Pour chaque dispositif, mélanger 60 g de base PDMS et 6 g d’agent de durcissement dans un grand bateau de pesée jetable (ou un contenant jetable similaire) à l’aide d’une spatule jetable.
  3. Placer le mélange PDMS dans une chambre à vide pendant 30 minutes à -0,08 MPa pour éliminer les bulles.
  4. Versez le mélange PDMS dans chaque moule imprimé en 3D. Remplissez complètement le moule, le mélange PDMS s’étendant légèrement au-dessus du haut du moule. Gardez l’excès de mélange PDMS pour remplir le moule en cas de déversement.
  5. Placez le moule rempli et tout mélange PDMS supplémentaire dans la chambre à vide pendant 25 minutes à -0,08 MPa pour éliminer les bulles créées pendant le processus de coulée.
  6. Retirez le moule rempli de la chambre à vide et faites éclater les bulles restantes avec une spatule jetable. Utilisez la spatule pour brosser les débris visibles ou les bulles restantes jusqu’au bord du moule loin des puits. Les débris ou les bulles restants peuvent potentiellement interférer avec l’imagerie dans les étapes ultérieures.
  7. Assurez-vous que le moule est complètement rempli du mélange PDMS; Il est courant qu’une petite partie du mélange se répande dans la chambre à vide ou pendant le transfert. Remplissez à l’aide du mélange PDMS supplémentaire qui a été dégazé à l’étape 3.5. Cela ne devrait pas créer de bulles, mais si elles se forment, elles peuvent être doucement brossées sur le côté du moule avec la spatule.
  8. Placez une feuille d’acrylique plate sur le moule rempli de PDMS en plaçant d’abord un bord et en abaissant lentement l’autre jusqu’à ce que l’acrylique repose à plat sur le moule, déplaçant tout mélange PDMS s’étendant au-dessus du bord. Si des bulles se forment lors de la mise en place de la feuille d’acrylique, retirez lentement l’acrylique, remplissez le moule avec un mélange PDMS si nécessaire et recommencez la mise en place de l’acrylique. La feuille d’acrylique formera un fond plat pour le dispositif moulé et garantira que tous les puits sont au même niveau par rapport à la base.
  9. Placez un poids de 2,5 lb sur l’acrylique. Plusieurs moules, chacun avec une feuille d’acrylique séparée, peuvent être empilés. Placez les moules lestés dans le four et laissez-les durcir à 55 °C pendant la nuit.
  10. Le lendemain, retirez les poids et les moules du four.
  11. Travaillez soigneusement une lame de rasoir entre l’acrylique et le PDMS durci pour briser le joint. Retirez délicatement l’acrylique du haut du moule. Le PDMS aura réglé à ce stade, et le retrait de l’acrylique peut prendre une certaine force.
  12. À l’aide d’un rasoir ou d’une spatule en métal, desserrez soigneusement les côtés du PDMS durci du moule. Il est facile de déchirer le PDMS à ce stade; travaillez lentement et doucement autour du bord pour retirer le périphérique PDMS intact.
    REMARQUE: Les moules fraîchement imprimés sont particulièrement collants pour les trois premières utilisations, et le PDMS se déchire souvent en essayant de retirer l’appareil. Avec plus d’utilisations, il devient plus facile d’enlever le PDMS durci du moule.
  13. Enveloppez l’appareil dans du papier d’aluminium et scellez-le avec du ruban adhésif autoclave. Autoclave à sec pendant au moins 15 min à 121 °C, 15 psig à stériliser. Après l’autoclavage, rangez les appareils enveloppés sur le banc et utilisez-les au besoin.

4. Stier les bactéries

REMARQUE: Commencez à préparer les bactéries qui seront utilisées comme source de nourriture des vers pendant qu’ils sont sur le dispositif multipuits. La bactérie la plus commune est la souche OP50 d’Escherichia coli (ou la souche HT115 pour les expériences ARNi). Effectuez cette étape au moins 2 jours avant d’ajouter les vers à l’appareil.

  1. Étaler les bactéries sur une plaque LB fraîche. S’assurer que tous les additifs sélectifs spécifiques à la souche (p. ex., l’ampicilline pour sélectionner un plasmide conférant une résistance à l’ampicilline à la bactérie) sont inclus dans les plaques LB.
  2. Incuber la plaque à 37 °C pendant une nuit (~18 h) pour permettre aux colonies de se développer.

5. Préparation du dispositif multipuits pour le chargement des fluides

REMARQUE: La surface du matériau PDMS en silicone qui compose le dispositif est hydrophobe, ce qui empêche les puits de petit volume et les douves aversives d’être remplis de NGM et de sulfate de cuivre, respectivement. Pour contourner ce problème, un plasma d’oxygène est utilisé pour modifier temporairement les propriétés de surface du dispositif pour qu’il soit hydrophile, permettant aux puits et aux douves d’être remplis dans une fenêtre de temps limitée (jusqu’à ~2 h). Cette section décrit les étapes à suivre pour terminer le processus de nettoyage au plasma. Terminez cette étape au moins 1 jour avant de repérer les puits de l’appareil avec des bactéries, car les effets persistants du nettoyage du plasma peuvent interférer avec les taches. Compte tenu du calendrier des sections 5 à 7, la limite pratique pour ces étapes par technicien est de trois appareils en parallèle.

  1. Préchauffer un incubateur de bain de billes sèches à 90 °C en prévision de la section 6.
  2. Comme le volume total de milieu nécessaire pour remplir les puits d’un dispositif multipuits est faible par rapport à celui des plaques de Petri, préparer un grand lot de NGM et l’aliquoter dans des tubes à essai (voir étape 1.3).
    REMARQUE: Cela peut être fait à l’avance, car les tubes de média peuvent être stockés sur le banc pendant ~ 2 semaines. Si le milieu a été préparé et aliquote dans des tubes, passer à l’étape 5.3.
  3. Tout en portant des gants, déballez un appareil multipuits autoclavé; Évitez de toucher l’un des puits. Coupez une petite encoche dans le coin supérieur droit de l’appareil pour indiquer combien de fois il a été utilisé/réutilisé (voir la section 15 ci-dessous pour obtenir des instructions et des recommandations pour le nettoyage et la réutilisation de chaque appareil).
  4. Placez jusqu’à trois dispositifs non emballés dans le nettoyeur de plasma avec les puits orientés vers le haut. Exécutez le nettoyeur plasma.
    REMARQUE : Les instructions détaillées suivantes concernent le nettoyeur plasma Plasma Etch PE-50. Les étapes et les réglages spécifiques doivent être adaptés et éventuellement réoptimisés pour d’autres nettoyeurs plasma.
    1. Vérifiez que le niveau de puissance du nettoyeur plasma est réglé sur 75%.
    2. Assurez-vous que les soupapes d’évent et d’isolement sont toutes deux en position OFF .
    3. Ouvrez la vanne principale du réservoir d’oxygène. Attendez que la pression du régulateur tombe entre 15 psig et 20 psig, puis tournez la vanne d’isolement sur la position ON .
    4. Allumez la pompe à vide et le nettoyeur plasma.
    5. Entrez les paramètres suivants sur le nettoyeur plasma (première utilisation) ou vérifiez que les paramètres précédemment programmés sont corrects :
      Temps plasma: 3:00 min
      Point de consigne du vide: 149,5 mTorr
      Évent atmosphérique: 45 s
      Évent de purge: 5 s
      Stabilisateur de gaz: 15 s
      Alarme de vide: 3:00 min
      Auto Cycle-Off: ON
    6. Appuyez sur Entrée pour accéder au menu Commandes. Utilisez la touche Flèche droite pour sélectionner Menu Configuration, puis appuyez sur Entrée. Faites défiler tous les paramètres en appuyant sur Entrée pour confirmer chaque paramètre actuel, puis sur la flèche droite pour passer au paramètre suivant.
    7. Revenez au menu Commandes en appuyant sur la flèche vers le haut , puis sur la flèche gauche.
    8. Dans l’écran Menu commandes , appuyez sur Entrée. Sélectionnez Commandes PLASMA en appuyant sur Entrée. Le système passera par les phases suivantes :
      Pompage de plasma
      Stabilisation du gaz: Pendant cette phase, réglez le bouton Gas 1 du nettoyeur plasma jusqu’à ce que le débitmètre soit à 10 cc / min.
      Temps de plasma
      Purge Pompage
      Cycle plasma terminé
      Évent de chambre
      REMARQUE: Ce processus devrait prendre environ 5-10 minutes à compléter. Lorsque toutes les phases sont terminées, le menu Commandes s’affiche à nouveau à l’écran. Si, pendant la phase de pompage du plasma, la pression n’est pas suffisamment basse, le nettoyeur de plasma ne passera pas à la phase suivante et l’écran affichera un message d’erreur. Si cela se produit, vérifiez l’huile de la pompe à vide. Si les niveaux d’huile sont bas ou si l’huile est trouble / sale, changer l’huile peut permettre à la pression de vide d’atteindre le niveau nécessaire.
    9. Fermez la vanne principale du réservoir d’oxygène.
    10. Très lentement, tournez la soupape de ventilation en position ON et laissez la pression du régulateur du réservoir d’oxygène revenir à zéro.
    11. Tournez la vanne d’isolement sur la position OFF .
    12. Éteignez la pompe à vide et le nettoyeur plasma.
      REMARQUE: La modification hydrophile de la surface du dispositif multipuits par le nettoyeur plasma est temporaire et devient progressivement moins efficace au fil du temps (jusqu’à environ 2 h). Passez en revue les articles 6 et 7 le plus rapidement possible.

6. Remplissage des puits avec du lmNGM

REMARQUE: Un incubateur de bain de billes sèches doit être allumé et préchauffé à partir de l’étape 5.1. Assurez-vous que le bain a atteint 90 °C.

  1. Stérilisez un plateau de polystyrène à puits unique par appareil en pulvérisant l’intérieur du plateau avec de l’éthanol à 70 % et en l’essuyant avec une lingette de travail.
  2. Retirez chaque appareil du nettoyeur plasma avec une main gantée et placez-le dans un plateau nettoyé.
  3. Placer une lavabo à pipette jetable de 25 ml dans l’incubateur à bain de billes après l’avoir chauffée à 90 °C.
  4. Rassembler un tube de prémélange de NGMlm solidifié par dispositif à remplir (voir étape 1.3).
  5. Placer les tubes à essai de prémélange lmNGM dans un bécher en verre de 200 ml et retirer les bouchons et le parafilm. Micro-ondes pendant ~20 s jusqu’à ce que le média fond suffisamment pour verser (la présence de certains milieux solides est bonne à ce stade).
  6. Combiner le prémélange de NGM lm fondu provenant de plusieurs tubes à essai dans un autre bécher stérile de 200 mL. Continuer à passer au micro-ondes pendant 20 secondes supplémentaires pour atteindre un total de 40 s. Si le prémélange de lmNGM commence à bouillir, arrêtez le micro-ondes et laissez le prémélange de lmNGM se déposer avant de continuer.
  7. Retirer le prémélange de lmNGM fondu du four à micro-ondes et le laisser refroidir à ~60 °C.
    REMARQUE: À ce stade, le média refroidira et se resolidifiera après ~ 5 min. Passez immédiatement aux étapes 6.8 et 6.9.
  8. Pour chaque 10 mL de prémélange de lmNGM, ajouter ce qui suit (dans l’ordre) : 250 μL de 1 M KPi, 10 μL de 1 M MgSO4, 10 μL de 1 M CaCl2 et 10 μL de 5 mg/mL de cholestérol.
    1. Pour éviter l’éclosion des œufs lors de la surveillance des adultes sur l’appareil, ajoutez 10 μL de floxuridine de 50 mM.
    2. Pour sélectionner un plasmide ARNi et induire l’expression de l’ARN, ajouter 5 μL de carbénicilline à 50 mg/mL et 12 μL de 1 mM IPTG.
      REMARQUE: Les antibiotiques ou autres additifs peuvent être modifiés en fonction de la conception de l’expérience. Des composés / médicaments d’essai peuvent également être ajoutés au milieu à ce stade.
  9. Verser le lmNGM fondu dans la bassine de 25 ml dans le bain de perles.
  10. Remplissez les puits de l’appareil avec lmNGM à l’aide d’une pipette répétitrice multicanal de 200 μL.
    1. Réglez le répéteur pour distribuer des aliquotes de 14 μL (14 μL peuvent être distribués jusqu’à 14 fois si vous utilisez un embout de pipette de 200 μL).
    2. Montez cinq pointes de pipette. Les puits de l’appareil ont le même espacement qu’une plaque de 384 puits. Les pipettes multicanaux standard sont espacées de manière à ce que l’utilisateur puisse pipeter dans tous les autres puits d’une rangée/colonne.
    3. Chargez les pointes avec du lmNGM fondu. Remettre les 14 premiers μL dans le bassin contenant du lmNGM.
    4. En se déplaçant rapidement mais prudemment, distribuer 14 μL dans les puits intérieurs (blanc sur la figure 1B), en commençant par ceux marqués d’un « x » à la figure 1B et en traversant la plaque vers la droite, puis vers le bas, en distribuant un total de 12 fois (60 puits).
    5. Distribuer le NGM restant dans le bassin, car l’aliquote finale est généralement inférieure à 14 μL.
    6. Répétez les étapes 6.10.3-6.10.5 jusqu’à ce que tous les puits intérieurs aient été remplis.
    7. Ensuite, réglez le répéteur pour distribuer des aliquotes de 15 μL. Répétez les étapes 6.10.3 à 6.10.5, mais au lieu des puits intérieurs, remplissez l’anneau de puits le plus externe (gris sur la figure 1B), en commençant par les puits marqués d’un « + » à la figure 1B et en vous déplaçant autour du bord extérieur de la plaque.
      REMARQUE: Travaillez rapidement afin que le média ne se solidifie pas dans les extrémités des pipettes. Évitez de déverser du lmNGM dans le fossé. Les puits extérieurs ont tendance à sécher plus rapidement. Les 1 μL supplémentaires de lmNGM permettent au puits final séché d’avoir une surface plane dans le même temps de séchage que les puits intérieurs.
  11. À titre d’étape de contrôle de la qualité, examinez chaque puits pour identifier ceux qui présentent des défauts susceptibles d’interférer avec l’imagerie, y compris les puits qui sont sous-remplis (la surface du lmNGM est enfoncée sous le bord du puits), surremplis (la surface du lmNGM a un sommet en forme de dôme) et contenant des bulles ou des débris.
  12. Retirez le lmNGM solidifié des puits insatisfaisants à l’aide d’un pic court en fil de platine ou d’un aspirateur sous vide. Remplissez les puits vides avec du lmNGM fondu frais. De plus, retirez tout média qui a débordé dans le fossé avec un court pic en fil de platine ou un aspirateur à vide.

7. Ajouter du sulfate de cuivre au fossé

REMARQUE: Les puits de cet appareil sont entourés d’un fossé continu. Ici, le fossé est rempli de sulfate de cuivre, qui agit comme un répulsif et dissuade les vers de fuir de leurs puits.

  1. À l’aide d’une pipette de 200 μL, verser 200 μL de solution de sulfate de cuivre (voir étape 1.6) dans le fossé de l’appareil dans chaque coin, 2x par coin. Ce volume devrait être suffisamment important pour que le sulfate de cuivre puisse circuler dans tout le fossé. Veillez à ne pas trop remplir les douves à aucun moment; Le sulfate de cuivre ne doit pas toucher la surface supérieure des puits.
  2. Si le sulfate de cuivre ne s’écoule pas facilement dans tout le fossé, utilisez un court pic en fil de platine pour aider à briser la tension et faire glisser le sulfate de cuivre à travers le fossé.
  3. Une fois que le sulfate de cuivre a traversé la totalité du fossé, retirez autant de sulfate de cuivre que possible du fossé à l’aide d’une pipette de 200 μL ou par aspiration sous vide. Les résidus laissés sur place seront suffisants pour dissuader les vers de quitter leurs puits. Laisser le fossé plein de solution de sulfate de cuivre risque de se répandre dans les puits, ce qui provoquerait la fuite des vers.

8. Ajout de cristaux d’eau autoclavés

REMARQUE: Pour maintenir l’humidité dans la plaque et empêcher la dessiccation du lmNGM, chaque dispositif est entouré de cristaux de polyacrylamide absorbant l’eau saturés.

  1. Préparez les cristaux d’eau (voir étape 1.7).
  2. À l’aide d’une bouteille pressée, ajoutez les cristaux d’eau dans les espaces entre l’appareil et les parois du plateau. Fermez le couvercle du plateau et enveloppez les quatre côtés avec un morceau de Parafilm. Ajoutez deux morceaux supplémentaires de Parafilm pour sceller complètement la plaque.
    REMARQUE: Les cristaux d’eau peuvent être préparés dans un bécher et cuis dans le plateau avec une spatule stérilisée. Cependant, cela ajoute du temps à la procédure et augmente le temps pendant lequel chaque plateau est ouvert et exposé à des contaminants potentiels.
  3. Laissez l’appareil scellé sur la paillasse jusqu’au lendemain, lorsque les bactéries sont prêtes à être repérées. Assurez-vous que les dispositifs sont stockés avec les puits orientés vers le haut après l’ajout du lmNGM.

9. Préparation d’une population de vers synchronisée selon l’âge

REMARQUE : Les étapes suivantes donnent une population synchronisée de vers prêts à être ajoutés au dispositif multipuits au quatrième stade larvaire (L4). Cependant, des vers à différents stades de développement peuvent également être ajoutés. Cette étape doit être effectuée 2 jours avant d’ajouter les vers à l’appareil si des L4 sont souhaités. Ajustez le calendrier de synchronisation pour l’étape de vie souhaitée.

  1. Pour des études de vieillissement cohérentes, maintenir C. elegans sur des plaques de NGM standard (voir étape 1.2 à 20 °C dans des conditions bien alimentées).
  2. Obtenir une population synchronisée d’animaux à partir d’une plaque de stock via des méthodes standard, par exemple, blanchir17 ou pondre1 ponte chronométrée.
  3. Ajouter des œufs isolés à une plaque NGM tachetée de bactéries. Les œufs écloront sur cette assiette et les vers atteindront le stade larvaire L4 en 2 jours pour les animaux de type sauvage.

10. Inoculer la culture bactérienne

REMARQUE : Les bactéries sont utilisées comme principale source alimentaire pour C. elegans, le plus souvent les souches OP50 ou HT115 d’E. coli. Les bactéries sont concentrées 10 fois, ce qui devrait être pris en compte dans le volume de la culture préparée. Préparez une culture bactérienne la veille du jour avant de repérer l’appareil.

  1. Dans la plaque LB préparée à l’étape 4, prélever une seule colonie et inoculer 12 ml de LB stérile par dispositif à repérer. Inclure des agents sélectifs si nécessaire pour la souche bactérienne utilisée.
  2. Cultiver la culture bactérienne pendant la nuit (~18 h) dans un incubateur à 37 °C avec agitation à ~250 tr/min.

11. Repérer les puits avec des bactéries concentrées

REMARQUE: Un petit volume de bactéries concentrées est ajouté à chaque puits, ce qui est suffisant pour nourrir les vers pendant toute leur durée de vie sur l’appareil. La culture bactérienne doit être séchée avant que les vers puissent être ajoutés aux puits. Comme le volume de milieu dans chaque puits est faible (14-15 μL) par rapport au volume de bactéries ajouté (5 μL), le contenu chimique du milieu bactérien peut avoir un impact sur l’environnement chimique du puits. Pour tenir compte de cela, les bactéries sont concentrées et remises en suspension dans de l’eau salée pour éliminer la LB appauvrie tout en évitant le stress hypoosmotique. Il n’y a pas de sel ajouté à la recette du lmNGM (voir les étapes 1.3-1.4) car il est ajouté à ce stade.

  1. Après avoir cultivé les bactéries pendant la nuit comme décrit à la section 10, concentrer la culture bactérienne 10x. Ensemencer les bactéries par centrifugation à ~3 400 x g pendant 20 min, éliminer le surnageant et remettre le granulé en suspension dans 1/10 du volume de culture initial de 142,8 mM de NaCl (voir étape 1.4). Par exemple, pour repérer un dispositif de 240 puits, faites tourner 12 mL de culture et remettez en suspension dans 1,2 mL de NaCl 142,8 mM.
    REMARQUE: Les composés / médicaments d’essai peuvent être ajoutés à la culture bactérienne remise en suspension avant le spotage.
  2. À l’aide d’une pipette répétée, repérer chaque puits avec 5 μL de bactéries concentrées. Évitez tout contact direct avec la surface du lmNGM, car l’extrémité de la pipette peut percer le lmNGM et permettre au ver de s’enfouir sous la surface du puits. Attention à ne pas laisser les bactéries se répandre dans le fossé car les vers y seront attirés et s’enfuiront dans le fossé.
  3. Sécher les bactéries tachetées avec les couvercles du plateau retirés. Cette étape est importante pour l’intégrité à long terme de l’environnement du puits, et il existe diverses façons de sécher les dispositifs tachetés. Quelle que soit la méthode utilisée, assurez-vous que l’appareil reste dans un environnement stérile, car il doit rester à découvert pendant que les bactéries sèchent. L’augmentation du débit d’air réduit considérablement le temps de séchage. Le séchage peut être effectué comme décrit dans les étapes ci-dessous:
    1. Laissez l’appareil découvert dans un contenant propre et scellé, comme un bac en plastique qui a été nettoyé avec 10% d’eau de Javel, suivi d’éthanol à 70%. Cette méthode de séchage peut prendre plusieurs heures.
    2. Placez les dispositifs découverts dans une hotte à flux laminaire stérile (similaire à la méthode préférée ci-dessous).
    3. Sécher les appareils à l’aide d’une « boîte de séchage » sur mesure (la méthode optimisée suivie dans cette étude), qui peut être construite à un coût minime à l’aide de ventilateurs de boîtier d’ordinateur et de filtres HEPA (voir le dossier supplémentaire 1).
      REMARQUE: Quelle que soit la méthode utilisée, l’étape de séchage doit être optimisée pour l’environnement local. Surveillez fréquemment la rapidité avec laquelle les puits sèchent jusqu’à ce que le temps de séchage typique ait été identifié. Dans un environnement peu humide, l’utilisation d’une boîte de séchage entraîne un temps de séchage de ~30-40 min. Ne laissez pas les plaques devenir trop sèches, car le fluide dans les puits rétrécira et coulera. Il est préférable de retirer l’appareil du séchage alors que quelques puits sont encore humides que de le laisser sécher plus longtemps et potentiellement trop sécher un grand nombre de puits.
  4. Vérifiez les cristaux d’eau. Si la majorité des cristaux d’eau dans le plateau ont séché et perdu du volume pendant le processus de séchage, ajoutez-en plus au plateau.
  5. Une fois les bactéries sèches, ajoutez les vers immédiatement (section 12) ou scellez le plateau pour l’utiliser plus tard. Pour sceller, fermez le couvercle du plateau et enveloppez les quatre côtés avec un seul morceau de Parafilm. Répétez deux fois pour un total de trois couches de parafilm. Après avoir complètement emballé le plateau, l’appareil peut être laissé sur le banc à température ambiante jusqu’à 4 jours avant d’ajouter les vers (section 12).

12. Ajout de vers au dispositif multipuits

  1. Ajouter manuellement un ver par puits à chaque puits à l’aide d’un pic en platine pour transférer les animaux des plaques de vers préparées à la section 9. Ne cueillez que les vers qui sont au stade de vie et à l’âge souhaités.
    REMARQUE: Prendre plus de 1 h pour ajouter les vers à l’appareil peut entraîner la dessiccation lmNGM, de sorte que les vers doivent être ajoutés le plus rapidement possible. Choisir plusieurs vers (20+) à la fois avant de les ajouter aux puits de l’appareil peut aider à augmenter la vitesse.

13. Terminer la préparation de l’appareil pour une utilisation à long terme

REMARQUE: Ces étapes garantissent que les puits de l’appareil restent hydratés pendant toute la durée de l’expérience.

  1. Examinez les cristaux d’eau. Assurez-vous que les cristaux d’eau sont au niveau du haut de l’appareil, mais ne débordent pas dessus. Ajoutez des cristaux d’eau supplémentaires au plateau si nécessaire.
  2. Ajouter une goutte de solution détergente préparée (voir étape 1.5) à l’intérieur du couvercle du plateau et frotter avec une lingette de travail jusqu’à ce que la solution de détergent soit sèche. Cela empêche la formation de buée sur le couvercle une fois que l’appareil est scellé à l’intérieur du plateau afin que les vers soient clairement visibles.
  3. Enveloppez le plateau avec trois morceaux de Parafilm en utilisant une technique spécifique qui favorise l’intégrité à long terme du sceau Parafilm.
    1. Étirez légèrement un morceau de Parafilm de manière à ce qu’il ne couvre que deux côtés du plateau. Répétez cette opération avec un deuxième morceau de Parafilm pour couvrir les deux autres côtés.
    2. Superposez la première couche de Parafilm, prenez un dernier morceau de Parafilm, étirez-le complètement et enveloppez les quatre côtés. S’ils sont correctement scellés, les puits de l’appareil doivent rester hydratés pendant ~ 2 mois.
      REMARQUE: L’intégrité du parafilm doit être surveillée toutes les 1-2 semaines, et le parafilm doit être remplacé s’il est cassé.
  4. Retirez toutes les empreintes digitales du haut du plateau à l’aide d’une lingette mouillée à 70 % d’éthanol.

14. Collecte des données

NOTE : Le but de cette étude est de décrire la méthodologie de culture. Une fois remplis, les dispositifs multipuits sont compatibles avec la surveillance longitudinale d’une variété de phénotypes. Ici, des conseils de base pour mesurer plusieurs des paramètres les plus courants sont fournis.

  1. Durée de vie: Surveillez la durée de vie en tapotant la plaque ou en exposant les vers à une lumière bleue brillante tous les 1 à 3 jours. Score comme mort si aucun mouvement n’est observé. Ces dispositifs multipuits sont également compatibles avec les pipelines d’imagerie et d’analyse automatisés pour estimer la durée de vie13,18.
  2. Activité : Surveillez l’activité de chaque animal tout au long de sa vie en prenant des images statiques ou des vidéos des animaux dans les puits de l’appareil et en évaluant la distance parcourue, la vitesse ou d’autres mesures de mouvement. Les appareils sont également compatibles avec les pipelines automatisés d’imagerie et d’analyse pour estimer l’activité13,18.
  3. Taille et forme du corps : Surveillez les changements de taille et de forme du corps en prenant des images statiques des animaux dans les puits de l’appareil et en quantifiant les paramètres visuels à l’aide de techniques d’imagerie standard. En principe, cette méthode de culture devrait être compatible avec les logiciels existants pour une évaluation plus sophistiquée de la forme du corps des vers 19,20,21.

15. Réutilisation des appareils

REMARQUE: Une fois l’expérience terminée, les dispositifs multipuits peuvent être nettoyés et réutilisés jusqu’à trois fois. Une réutilisation supplémentaire commence à avoir un impact sur les phénotypes du ver, peut-être causée par des produits chimiques provenant du milieu ou des bactéries qui s’accumulent dans les parois du matériau PDMS.

  1. Jetez le Parafilm et retirez l’appareil du plateau. Vérifiez les encoches dans le coin supérieur droit de l’appareil, qui indiquent combien de fois il a été utilisé. S’il a été utilisé trois fois, jetez l’appareil. S’il a été utilisé moins de trois fois, nettoyez-le et réutilisez-le.
    REMARQUE: Les plateaux sont fabriqués à partir de polystyrène et ne sont pas directement en contact avec le lmNGM, les bactéries ou tout additif au milieu. Ils peuvent être réutilisés plusieurs fois tant qu’ils restent visuellement clairs.
  2. Rincez tous les cristaux d’eau restants du plateau. Vaporisez l’intérieur du plateau avec une solution d’eau de Javel à 10% et laissez-le reposer pendant 10 minutes. Rincer à l’eau désionisée et sécher immédiatement pour éviter les taches d’eau.
  3. Tenez l’appareil sous l’eau courante pour commencer à nettoyer le média des puits. Pliez doucement et tordez l’appareil sous l’eau pour aider à desserrer le fluide des puits, mais ne pliez pas au point que l’appareil se déchire. Choisissez les milieux restants coincés dans les puits à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL.
  4. Remplir un bécher de 2 L avec une barre d’agitation ~3/4 plein d’eau désionisée, et porter à ébullition sur une plaque chauffante.
  5. Ajouter un ou deux dispositifs multipuits et une barre d’agitation à l’eau bouillante. Allumez l’agitation magnétique à basse vitesse (~200 tr/min) pour agiter doucement les appareils dans l’eau. Laissez les appareils bouillir pendant 10 min.
  6. Retirez les appareils de l’eau avec une pince à épiler en métal et placez-les bien à côté vers le bas sur des serviettes en papier pour les égoutter. Laissez les appareils sécher au moins pendant la nuit.
  7. Lorsque les appareils sont complètement secs, enveloppez-les dans du papier d’aluminium et scellez-les avec du ruban adhésif autoclave. Écrivez sur la bande de l’autoclave le nombre de fois que l’appareil a été utilisé. Autoclave à sec pendant 15 min à 121 °C pour stériliser. Les appareils sont maintenant prêts à être réutilisés.

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Representative Results

Le système de culture WorMotel peut être utilisé pour recueillir une variété de données, y compris concernant la durée de vie, la durée de vie et l’activité. Des études publiées ont utilisé des dispositifs multipuits pour étudier la durée de vie et la durée de vie 13,14, la quiescence et le sommeil 22,23,24 et le comportement 25. La durée de vie peut être évaluée manuellement ou par le biais d’une collection d’images et d’une analyse d’imagerie en aval. Dans la première approche, les vers peuvent être observés manuellement après un stimulus (par exemple, tapoter la plaque ou exposition à la lumière bleue) tous les 1 à 3 jours et être marqués comme morts si aucun mouvement n’est observé, comme les méthodes standard sur les plaques de Petri1. Cette dernière approche est similaire, sauf que le mouvement du ver peut être déterminé en comparant les différences d’image à image entre les images prises après l’application du stimulus. Cela procure un avantage supplémentaire en ce sens que le mouvement fournit des renseignements à la fois sur le niveau d’activité des animaux individuels à ce moment-là et fournit une mesure permettant de déterminer la durée de vie (p. ex. cessation des déplacements) et la durée de santé (plusieurs définitions ont été proposées). Les images peuvent également être utilisées pour extraire des paramètres physiologiques supplémentaires tels que la taille du corps, la forme du corps et la posture du corps.

Pour démontrer la capacité du système, nous avons examiné la relation épistatique classique entre le récepteur de l’insuline, codé par le gène daf-2, et le facteur de transcription de la famille FOXO en aval codé par daf-16 dans le contexte de la durée de vie, de la durée de santé et de l’activité quotidienne des animaux individuels. Perte fonctionnelle de type sauvage (souche N2) et daf-16(mu68) (souche CF1038) C. elegans nourri à E. coli (souche HT115) exprimant l’un ou l’autre contrôle (vecteur vide; EV) ou daf-2 RNAi d’alimentation ont été cultivées dans des dispositifs multipuits, et chaque animal a été surveillé pour sa durée de vie (figure 2A), sa durée de santé (figure 2B) et son activité quotidienne (figure 2C). L’activité a été surveillée quotidiennement en prenant une série d’images fixes toutes les 5 secondes pendant 2 minutes, les vers étant exposés à une lumière bleue vive pendant 5 s à 1 minute pour stimuler l’activité (selon Churgin et al.13). L’activité quotidienne de chaque animal a été estimée en normalisant l’arrière-plan à travers les puits et les images, en identifiant la zone du ver dans chaque image et en calculant le changement de zone entre les images adjacentes. La durée de vie a été définie comme l’âge auquel l’activité a été observée pour la dernière fois pour chaque ver, et la durée de vie a été définie comme l’âge auquel un ver ne pouvait plus bouger sur toute la longueur du corps. Comme on pouvait s’y attendre dans de nombreuses études antérieures (p. ex. Kenyon et coll.26, Murphy et coll.27), la mutation daf-16(mu86) a entraîné une courte durée de vie et a empêché l’allongement de la durée de vie due à l’élimination de l’ARNi de daf-2 (figure 2A). Une tendance similaire a été observée pour la durée de vie (figure 2B). Comme avantage de l’utilisation de systèmes de culture multi-puits, la capacité de suivre les animaux individuels tout au long de la vie permet une analyse détaillée de la variation individuelle de chaque phénotype mesuré dans la population. Par exemple, la variation de la durée de vie et de la durée de vie entre les animaux individuels peut être comparée en termes absolus (figure 2D) ou en tant que fraction de la durée de vie totale (figure 2E). Les phénotypes en début de vie peuvent en outre être comparés aux phénotypes de fin de vie, y compris la durée de vie, chez des animaux individuels d’une population. Par exemple, l’activité cumulative de chaque animal individuel tout au long de la vie (c.-à-d. l’aire sous la courbe [ASC] pour l’activité individuelle) était mieux corrélée avec la durée de vie (figure 2F) que la durée de vie cumulative jusqu’au jour 5 de la vie (figure 2G) dans toutes les conditions mesurées. Nous soulignons que le but de ce travail est de fournir un protocole détaillé pour la construction de l’environnement multipuits pour le suivi des animaux individuels au fil du temps, et non pour mesurer un phénotype spécifique à l’aide de l’appareil. Les résultats représentatifs présentés à la figure 2 ne fournissent qu’un exemple des phénotypes qui peuvent être mesurés dans ce système. Une fois construit, l’environnement multipuits est compatible avec un large éventail de techniques de mesure des phénotypes de vers rampants sur des milieux solides.

Figure 1
Figure 1 : Schéma des dispositifs microfabriqués à puits multiples. (A) Les C. elegans individuels sont cultivés sur des pastilles d’agarose solides à faible point de fusion (lmNGM) ensemencées avec des aliments bactériens dans des puits individuels. L’espace entre les puits est recouvert d’un produit chimique aversif (sulfate de cuivre) pour isoler chaque ver dans son puits. Chaque appareil est sécurisé à l’intérieur d’un plateau à puits unique. Le périmètre du plateau est rempli de cristaux d’eau pour maintenir l’humidité. Le plateau est scellé avec du Parafilm pour permettre l’échange d’oxygène. Image créée avec BioRender.com. (B) Vue d’ensemble du dispositif multipuits indiquant l’ordre suggéré pour le chargement des puits. Les puits internes (blancs) reçoivent 14 μL de lmNGM. Les puits externes (gris) reçoivent 15 μL de lmNGM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Corrélation des phénotypes mesurés entre les populations d’animaux individuels à l’aide de dispositifs multipuits. Tous les panels fournissent des données de la même expérience comparant quatre groupes d’animaux : les animaux de type sauvage (N2) soumis au vecteur vide EV(RNAi) (N = 138), les animaux de type sauvage soumis à daf-2(ARNi) (N = 151), les animaux daf-16(mu86) soumis à EV(ARNi) (N = 123) et les animaux daf-16(mu86) soumis à daf-2(ARNi ) (N = 135). (A) L’extension de la durée de vie de daf-2(ARNi) est bloquée par la mutation nulle daf-16(mu86). Signification par paires entre groupes déterminée par le test log-rank (fonction survdiff dans R). (B) La durée de santé définie ici comme le jour où un animal ne peut plus bouger une extension de longueur complète du corps à partir de daf-2 (ARNi) est bloquée par la mutation nulle daf-16 (mu86). Signification par paires entre groupes déterminée par le test log-rank (fonction survdiff dans R). (C) La moyenne mobile sur 3 jours de l’activité tout au long de la vie est réduite à la fois par daf-16 (mu86) et daf-2 (ARNi). Signification calculée par le test U de Mann-Whitney pour comparer l’aire sous la courbe pour l’activité tout au long de la vie des animaux individuels entre les groupes. (D) Durée de santé et durée de vie pour chaque population en valeurs absolues (moyenne ± erreur-type de la moyenne). (E) Durée de santé et durée de vie de chaque population normalisées à la durée de vie totale au sein de chaque groupe (moyenne ± erreur-type de la moyenne). (F) L’activité cumulée tout au long de la vie (aire sous la courbe [ASC] tout au long de la vie) pour les animaux individuels est mieux corrélée avec la durée de vie que (G) l’activité des animaux individuels à un jour spécifique de la vie (la corrélation d’activité au jour 8, représentant le point où l’activité moyenne est maximisée, est montrée), calculée par régression linéaire (fonction lm dans R). n.s. = non significatif, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Toutes les valeurs de p ont été ajustées pour les comparaisons multiples à l’aide de la méthode de Bonferroni pour les comparaisons effectuées dans chaque panel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1: Fichier STL pour l’impression du moule 3D multi-puits Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Le système WorMotel est un outil puissant pour recueillir des données individualisées pour des centaines de C. elegans isolés au fil du temps. À la suite des études antérieures utilisant des dispositifs multipuits pour des applications dans la quiescence développementale, le comportement locomoteur et le vieillissement, l’objectif de ce travail était d’optimiser la préparation de dispositifs multipuits pour la surveillance à long terme de l’activité, de la santé et de la durée de vie de manière plus élevée. Ce travail fournit un protocole détaillé pour la préparation des dispositifs multipuits qui optimise de nombreuses étapes du protocole original13, met en évidence les points clés qui peuvent présenter des difficultés techniques et fournit une discussion sur la réutilisation des plaques et autres matériaux.

Aux fins de la mise à l’échelle, en tant que laboratoire qui prépare actuellement entre 10 et 20 appareils au cours d’une semaine typique, une considération primordiale était de savoir si les appareils pouvaient être réutilisés et, le cas échéant, dans quelle mesure. Il y a un coût plus élevé en termes de temps et d’argent dans la préparation des dispositifs PDMS par rapport à la culture traditionnelle sur des plaques de Petri, mais ces coûts plus élevés peuvent être réduits en réutilisant le PDMS ou d’autres composants du système. Avec de nombreuses réutilisations, le PDMS a commencé à développer une coloration jaune, reflétant probablement l’accumulation de composés provenant du milieu lmNGM ou des bactéries. Les animaux élevés sur ces plaques présentaient également un taux de fuite plus élevé et une durée de vie réduite. Sur la base de dizaines d’expériences, trois utilisations sont optimales pour réutiliser ces dispositifs PDMS, permettant d’évaluer les phénotypes liés à l’âge sans impact mesurable de la dégradation du PDMS tout en réduisant le nombre de nouveaux dispositifs à mouler (économisant ainsi sur les coûts). Nous avons en outre confirmé que les animaux appariés à l’expérience élevés sur des appareils lors de leur première, deuxième et troisième utilisation produisaient des courbes de survie presque impossibles à distinguer et non statistiquement différentes (données non présentées). Les plateaux utilisés pour contenir les appareils sont en polystyrène et peuvent être nettoyés et réutilisés indéfiniment s’ils restent exempts de rayures ou d’autres marques qui pourraient interférer avec la visualisation des vers.

Un défi clé pour la préparation de dispositifs multipuits pour des applications qui durent plus de ~ 2 semaines est la prévention de la contamination des plaques par des bactéries et des champignons environnementaux. Il existe plusieurs étapes auxquelles la stérilisation est essentielle pour prévenir la contamination. Il s’agit notamment de l’autoclavage de tous les dispositifs avant utilisation, de l’ébullition des dispositifs destinés à la réutilisation, de l’autoclavage des cristaux d’eau absorbants utilisés pour maintenir l’humidité, du nettoyage des plateaux contenant les dispositifs avec de l’eau de Javel et de l’éthanol avant utilisation, et de la stérilisation par filtre de la solution détergente appliquée sur le couvercle du plateau pour éviter la buée et ajoutée à la solution de sulfate de cuivre. La mise en œuvre de chacun de ces changements a considérablement réduit les événements de contamination, ce qui a permis aux dispositifs scellés d’être utilisés de manière cohérente pour la surveillance longitudinale tout au long de la durée de vie, même dans des conditions de longévité (p. ex. knockout de daf-2) qui nécessitent une surveillance pendant >45 jours. Le protocole décrit ici comprend deux modifications au protocole original pour les applications à long terme conçues pour maintenir un séchage constant des puits et prévenir la dessiccation. Tout d’abord, la profondeur totale de l’appareil a été augmentée de 2 mm pour augmenter la capacité des cristaux d’eau. Au cours de longues expériences, en particulier dans un environnement peu humide, trop peu de cristaux d’eau dans le plateau ont conduit à la dessiccation du lmNGM. Avec plus de cristaux d’eau, il était nécessaire d’augmenter le volume d’agarose qui a été ajouté aux puits le long du bord de l’appareil. Ces puits avaient tendance à sécher d’abord après la charge du puits (section 6) et à rétrécir. L’utilisation de 14 μL d’agarose sur les puits intérieurs était un volume suffisant pour remplir complètement les puits sans créer le sommet en forme de dôme résultant du remplissage excessif des puits. L’ajout de 15 μL d’agarose aux puits extérieurs a fourni suffisamment de volume pour que, lorsque les puits ont commencé à sécher, ils ont diminué à un niveau comparable aux 14 μL ajoutés dans les puits intérieurs.

L’un des écarts les plus importants par rapport au protocole original a été d’inverser l’ordre dans lequel l’utilisateur charge le lmNGM (section 6) et le sulfate de cuivre (section 7). À l’origine, le sulfate de cuivre a d’abord été ajouté au fossé, suivi du remplissage des puits avec du lmNGM13. Il a été observé que le remplissage des puits avec du lmNGM le plus tôt possible après le nettoyage du plasma améliorait l’adhérence du lmNGM aux parois du puits. Attendre trop longtemps après le nettoyage au plasma a entraîné des puits avec des bulles et des sommets en forme de dôme, ce qui peut interférer avec la visualisation des vers. Il est particulièrement important de donner la priorité au remplissage des puits plutôt qu’à l’ajout de sulfate de cuivre lors de la préparation simultanée de plusieurs dispositifs afin d’assurer des surfaces lmNGM cohérentes et de haute qualité. Un inconvénient du remplissage des puits en premier est que la modification de surface hydrophile produite par le nettoyeur de plasma aura sensiblement disparu au moment où l’utilisateur passera à l’ajout du sulfate de cuivre. Le sulfate de cuivre ne s’écoule pas facilement à travers le fossé lorsque la surface devient moins hydrophile, ce qui rend difficile l’obtention d’une couverture complète. L’ajout de détergent à la solution de sulfate de cuivre pour agir comme un tensioactif améliore l’écoulement de la solution à travers le fossé. Un pic en fil de platine peut également être utilisé pour guider doucement le sulfate de cuivre à travers le fossé en brisant la tension à tous les points où le sulfate de cuivre a de la difficulté à s’écouler. De plus, si la solution de sulfate de cuivre était laissée dans le fossé, elle se répandrait facilement dans les puits et contaminerait la surface du lmNGM lors de l’inclinaison du plateau. La nature du processus de chargement rend presque impossible de maintenir le dispositif suffisamment à niveau pour empêcher le cuivre de contaminer un sous-ensemble des puits. Pour tenir compte de cela, la solution de sulfate de cuivre est retirée du fossé (étape 7.3) et le sulfate de cuivre résiduel laissé derrière est suffisant pour dissuader la plupart des vers de fuir. En guise de note finale sur l’utilisation du sulfate de cuivre comme barrière aversive, certains répulsifs peuvent affecter les phénotypes associés à l’âge, y compris la durée de vie. L’utilisation de sulfate de cuivre dans ces dispositifs à puits multiples a été examinée par Churgin et coll.13 et n’a eu aucun impact détectable sur la durée de vie ou le développement.

D’autres mises à jour mineures du protocole visent à améliorer les mesures prises pour préparer le PDMS. Une étape de dégazage supplémentaire après mélange de la base PDMS et de l’agent de durcissement a été ajoutée, car il s’agit d’un processus qui génère de nombreuses bulles. Enlever la majorité des bulles avant d’ajouter le mélange aux moules de l’appareil minimise les bulles restantes après la deuxième étape de dégazage. Pour s’assurer que le fond de l’appareil est entièrement plat et uniforme, une caractéristique importante pour l’imagerie de la plaque entière, un morceau de verre ou d’acrylique a été posé sur le dessus du moule rempli. Cette étape n’est pas essentielle, bien que toujours utile, pour les applications qui n’examinent qu’un seul puits à la fois, car l’utilisateur peut ajuster manuellement la mise au point de chaque puits. Enfin, le durcissement du PDMS à une température plus élevée (55 °C) était nécessaire à l’endroit où cette version du protocole était optimisée (Tucson, Arizona, USA), contrairement aux 40 °C indiqués par le protocole original (optimisé à Philadelphie, Pennsylvanie, USA). Cela suggère que les différences entre les emplacements (telles que le climat ou les réactifs et équipements précis utilisés) peuvent affecter les étapes spécifiques du protocole, telles que la température de durcissement ou les techniques de séchage, et que celles-ci peuvent devoir être optimisées à chaque site. Par exemple, l’humidité ambiante joue un rôle important dans la détermination du temps de séchage des plaques après le spotting, et cela peut varier considérablement selon les endroits ou les saisons.

En principe, ce système de dispositifs multipuits peut être utilisé pour collecter des données sur n’importe quel phénotype pouvant être mesuré en microscopie à fond clair standard sur des plaques de Petri - durée de vie, durée de vie, mouvement non stimulé / stimulé, taille et forme du corps, géométrie du mouvement - avec la capacité supplémentaire de suivre ces mesures pour les vers individuels au fil du temps. Comme indiqué dans l’introduction, il existe d’autres méthodes pour acquérir des données individuelles sur l’ensemble de la durée de vie. Les dispositifs microfluidiques28 ou les plaques multipuits29 offrent la possibilité de suivre le cycle de vie de chaque animal, mais uniquement en cultivant les vers dans des milieux liquides. Un environnement liquide peut modifier le transcriptome des vers 10,11,30 par rapport aux milieux solides et induit des changements physiologiques et comportementaux distincts, y compris la nage épisodique 31, une dépense énergétique accrue 10,32 et un stress oxydatif élevé 10. La mesure dans laquelle la durée de vie et d’autres paramètres liés au vieillissement en santé peuvent être directement comparés entre les milieux liquides et solides n’est pas claire. Les dispositifs multipuits à culture solide permettent le suivi d’un seul ver dans un environnement comparable à la culture de groupe standard sur des plaques de Petri. La structure incurvée de la paroi de l’appareil permet d’imager les vers n’importe où à l’intérieur du puits, ce qui rend ces appareils compatibles, en principe, avec des outils plus sophistiqués pour l’analyse d’un seul ver, tels que Worm Tracker33.

La capacité de surveiller des animaux individuels tout au long d’une expérience sur un dispositif multipuits s’accompagne de plusieurs limitations. Tout d’abord, même avec un protocole optimisé, ces dispositifs nécessitent plus de temps à installer par animal que la culture standard sur des plaques de Petri, fournissant ainsi des données sur un seul animal au détriment de la taille globale de l’échantillon. Cependant, les vers sont également isolés dans des puits individualisés, éliminant ainsi certaines des complications associées à la mesure automatisée de la durée de vie, telles que la détection automatique des animaux individuels qui cessent de bouger lorsqu’ils se touchent. L’automatisation fait plus que récupérer le temps perdu à cause de la configuration plus complexe et offre la possibilité d’un criblage plus à haut débit13,18. Deuxièmement, les conditions expérimentales que les vers n’aiment pas plus que le fossé au sulfate de cuivre, telles que les agents induisant un stress puissant (par exemple, le paraquat) ou les restrictions alimentaires, conduiront les vers à fuir des puits et dans le fossé. Troisièmement, alors que les dispositifs PDMS permettent la microscopie à fond clair et à fond noir, le matériau PDMS a tendance à avoir une fluorescence de fond élevée et inégale, cette dernière résultant probablement de l’incrustation de poussière ou d’autres microparticules dans le PDMS pendant le moulage, ce qui limite leur application en microscopie fluorescente. Enfin, la décoloration observée dans le PDMS pour les dispositifs réutilisés au cours de multiples expériences et la réduction associée de la durée de vie et de l’augmentation de la fuite suggèrent que les composants du milieu et d’autres produits chimiques ajoutés s’infiltrent dans le PDMS au fil du temps. La mesure dans laquelle cela peut avoir un impact sur les phénotypes de vieillissement ou les traitements médicamenteux est actuellement à l’étude. Comme mentionné précédemment, il existe une méthode alternative pour une culture à ver unique qui est similaire aux dispositifs multipuits PDMS, mais qui utilise plutôt des microplateaux disponibles dans le commerce pour cultiver des animaux isolés16. Ces microplateaux sont fabriqués à partir de polystyrène, évitant ainsi le problème potentiel des composants du média de sangsue, et ont un fond de fluorescence cohérent, permettant une imagerie directe par fluorescence in vivo directement sur la plaque. Les puits de microplateaux sont également entourés d’acide palmitique à la place du sulfate de cuivre utilisé dans le protocole décrit ici, qui est plus aversif et réduit la fraction de vers qui quittent leurs puits, même dans le cas d’agents induisant le stress et de restrictions alimentaires. Ces avantages sont réalisés au prix d’une efficacité d’emballage réduite des puits, car les microplateaux permettent de cultiver un maximum de 96 vers dans un seul plateau, contrairement à la capacité de 240 vers des appareils PDMS. Les détails du résultat souhaité d’une expérience influenceront lequel de ces systèmes devrait être utilisé.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par NIH R35GM133588 à G.L.S., un prix Catalyst de l’Académie nationale de médecine des États-Unis à G.L.S., le Fonds d’initiative de technologie et de recherche de l’État de l’Arizona administré par l’Arizona Board of Regents et la Fondation médicale Ellison.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 lb weight CAP Barbell RP-002.5
Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) Falken Design ACRYLIC-CL-3-8/1224 Large sheet cut to smaller sizes 
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Autoclavable squeeze bottle Nalgene 2405-0500
Bacto agar BD Difco 214030
Bacto peptone Thermo Scientific 211677
Basin, 25 mL VWR 89094-664 Disposable pipette basin 
Cabinet style vacuum desiccator  SP Bel-Art F42400-4001 Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. 
CaCl2 Acros Organics 349615000
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Wildtype strain
Carbenicillin  GoldBio C-103-25
Centrifuge Beckman 360902
Cholesterol ICN Biomedicals Inc 101380
Compressed oxygen tank Airgas UN1072
CuSO4 Fisher Chemical C493-500
Dry bead bath incubator Fisher Scientific 11-718-2
Escherichia coli OP50  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Standard labratory food for C. elegans
Ethanol Millipore ex0276-4
Floxuridine Research Products International F10705-1.0
Hybridization oven Techne 731-0177 Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice
Incubators Shel Lab 2020 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria 
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) GoldBio I2481C100
K2HPO4 Fisher Chemical P288-500
KH2PO4 Fisher Chemical P286-1
Kimwipes KimTech 34155 Task wipes
LB Broth, Lennox BD Difco 240230
Low melt agarose Research Products International A20070-250.0
MgSO4 Fisher Chemical M-8900
Microwave  Sharp R-530DK
Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 Rainin 17013800 The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided
NaCl Fisher Bioreagents BP358-1
Nunc OmniTray Thermo Scientific 264728 Clear polystyrene trays
Parafilm M Fisher Scientific 13-374-10 Double-wide (4 in)
Petri plate, 100 mM  VWR 25384-342
Petri plate, 60 mM  Fisher Scientific FB0875713A
Plasma cleaner Plasma Etch, Inc. PE-50
PLATINUM vacuum pump JB Industries DV-142N 
PolyJet 3D printer Stratasys  Objet500 Connex3 PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)
Shaking incubator Lab-Line 3526CC
smartSpatula LevGo, Inc. 17211 Disposable spatula
Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) M2 Polymer Technologies Type S Referred to in main text as "water crystals"
SYLGARD 184 Silicone Elastomer base The Dow Chemical Company 2065622
SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent The Dow Chemical Company 2085925
Syringe filter (0.22 µm) Nest Scientific USA Inc.  380111
Syringe, 10 mL  Fisher Scientific 14955453
TWEEN 20 Thermo Scientific J20605-AP Detergent
Vacuum pump oil VWR 54996-082
VeroBlackPlus Stratasys  RGD875 Rigid 3D printing filament
Weigh boat Thermo Scientific WB30304 Large enough for PDMS mixture volume

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References

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rétractation numéro 190
Culture à long terme et surveillance de <em>Caenorhabditis elegans</em> isolés sur des milieux solides dans des dispositifs multipuits
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Gardea, E. A., DeNicola, D.,… More

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