Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Langsiktig kultur og overvåking av isolerte Caenorhabditis elegans på faste medier i flerbrønnsenheter

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, 2Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania

Summary

Presentert her er en optimalisert protokoll for dyrking av isolerte individuelle nematoder på faste medier i mikrofabrikerte flerbrønnsenheter. Denne tilnærmingen gjør det mulig å overvåke individuelle dyr gjennom hele livet for en rekke fenotyper relatert til aldring og helse, inkludert aktivitet, kroppsstørrelse og form, bevegelsesgeometri og overlevelse.

Abstract

Nematoden Caenorhabditis elegans er blant de vanligste modellsystemene som brukes i aldringsforskning på grunn av sine enkle og rimelige kulturteknikker, rask reproduksjonssyklus (~ 3 dager), kort levetid (~ 3 uker) og mange tilgjengelige verktøy for genetisk manipulasjon og molekylær analyse. Den vanligste tilnærmingen for å gjennomføre aldringsstudier i C. elegans, inkludert overlevelsesanalyse, innebærer dyrking av populasjoner på titalls til hundrevis av dyr sammen på faste nematodevekstmedier (NGM) i petrisklater. Selv om denne tilnærmingen samler inn data om en populasjon av dyr, sporer de fleste protokoller ikke individuelle dyr over tid. Presentert her er en optimalisert protokoll for langsiktig dyrking av individuelle dyr på mikrofabrikerte polydimetylsiloksan (PDMS) enheter kalt WorMotels. Hver enhet gjør det mulig å dyrke opptil 240 dyr i små brønner som inneholder NGM, med hver brønn isolert av en kobbersulfatholdig vollgrav som hindrer dyrene i å flykte. Basert på den opprinnelige WorMotel-beskrivelsen, gir dette dokumentet en detaljert protokoll for støping, klargjøring og utfylling av hver enhet, med beskrivelser av vanlige tekniske komplikasjoner og råd for feilsøking. Innenfor denne protokollen er teknikker for konsekvent lasting av små volum NGM, konsekvent tørking av både NGM og bakteriell mat, muligheter for å levere farmakologiske inngrep, instruksjoner for og praktiske begrensninger for gjenbruk av PDMS-enheter, og tips for å minimere uttørking, selv i miljøer med lav luftfuktighet. Denne teknikken tillater langsgående overvåking av ulike fysiologiske parametere, inkludert stimulert aktivitet, ustimulert aktivitet, kroppsstørrelse, bevegelsesgeometri, helsespenn og overlevelse, i et miljø som ligner standardteknikken for gruppekultur på faste medier i petrisklater. Denne metoden er kompatibel med datainnsamling med høy gjennomstrømning når den brukes sammen med automatisert mikroskopi- og analyseprogramvare. Til slutt diskuteres begrensningene i denne teknikken, samt en sammenligning av denne tilnærmingen til en nylig utviklet metode som bruker mikroskuffer til å dyrke isolerte nematoder på faste medier.

Introduction

Caenorhabditis elegans brukes ofte i aldringsstudier på grunn av deres korte generasjonstid (ca. 3 dager), kort levetid (ca. 3 uker), enkel dyrking i laboratoriet, høy grad av evolusjonær bevaring av molekylære prosesser og veier med pattedyr, og bred tilgjengelighet av genetiske manipulasjonsteknikker. I sammenheng med aldringsstudier tillater C. elegans rask generering av levetidsdata og eldre populasjoner for analyse av senlivsfenotyper hos levende dyr. Den typiske tilnærmingen for å gjennomføre ormaldringsstudier innebærer manuell måling av levetiden til en populasjon av ormer opprettholdt i grupper på 20 til 70 dyr på faste agarnematodevekstmedier (NGM) i 6 cm petrisklater1. Bruk av alderssynkroniserte populasjoner gjør det mulig å måle levetid eller tverrsnittsfenotyper hos enkeltdyr på tvers av populasjonen, men denne metoden utelukker overvåking av egenskapene til individuelle dyr over tid. Denne tilnærmingen er også arbeidskrevende, og begrenser dermed størrelsen på befolkningen som kan testes.

Det er et begrenset antall kulturmetoder som muliggjør langsgående overvåking av individuelle C. elegans gjennom hele levetiden, og hver har et distinkt sett med fordeler og ulemper. Microfluidics-enheter, inkludert WormFarm2, NemaLife3 og "behavior" chip4, blant annet 5,6,7, tillater overvåking av individuelle dyr over tid. Dyrking av ormer i flytende kultur ved hjelp av flerbrønnsplater tillater på samme måte overvåking av enten individuelle dyr eller små populasjoner av C. elegans over tid 8,9. Det flytende miljøet representerer en distinkt miljøkontekst fra det felles kulturmiljøet på faste medier i petrisklater, noe som kan endre aspekter av dyrefysiologi som er relevante for aldring, inkludert fettinnhold og uttrykket av stressresponsgener10,11. Muligheten til å direkte sammenligne disse studiene med flertallet av data samlet på aldring C. elegans er begrenset av forskjeller i potensielt viktige miljøvariabler. Worm Corral12 er en tilnærming utviklet for å huse individuelle dyr i et miljø som bedre replikerer typisk solid mediekultur. Worm Corral inneholder et forseglet kammer for hvert dyr på et mikroskopglass ved hjelp av hydrogel, noe som muliggjør langsgående overvåking av isolerte dyr. Denne metoden bruker standard lysfeltavbildning for å registrere morfologiske data, for eksempel kroppsstørrelse og aktivitet. Imidlertid plasseres dyr i hydrogelmiljøet som embryoer, hvor de forblir uforstyrret gjennom hele levetiden. Dette krever bruk av betinget steril mutant eller transgen genetisk bakgrunn, noe som begrenser både kapasiteten til genetisk screening, da hver ny mutasjon eller transgen må krysses inn i en bakgrunn med betinget sterilitet, og kapasiteten til narkotikascreening, da behandlinger bare kan brukes en gang på dyrene som embryoer.

En alternativ metode utviklet av Fang-Yen-laboratoriet tillater dyrking av ormer på faste medier i individuelle brønner av en mikrofabrikert polydimetylsiloksan (PDMS) enhet kalt en WorMotel13,14. Hver enhet er plassert i en enkeltbrønnsbrett (dvs. med samme dimensjoner som en 96-brønnplate) og har 240 brønner adskilt av en vollgrav fylt med en aversiv løsning for å forhindre at ormene reiser mellom brønner. Hver brønn kan huse en enkelt orm i løpet av levetiden. Enheten er omgitt av vannabsorberende polyakrylamidgelpellets (referert til som "vannkrystaller"), og brettet er forseglet med Parafilm laboratoriefilm for å opprettholde fuktigheten og minimere uttørking av mediet. Dette systemet gjør det mulig å samle inn helsespenn- og levetidsdata for individuelle dyr, mens bruken av solide medier bedre rekapitulerer miljøet som oppleves av dyr i det store flertallet av publiserte C. elegans levetidsstudier, og tillater dermed mer direkte sammenligninger. Nylig har en lignende teknikk blitt utviklet ved bruk av polystyrenmikrobrett som opprinnelig ble brukt til mikrocytotoksisitetsanalyser15 i stedet for PDMS-enheten16. Mikroskuffmetoden tillater innsamling av individualiserte data for ormer dyrket på faste medier og har forbedret kapasitet for å inneholde ormer under forhold som vanligvis ville føre til flukt (f.eks. stressorer eller diettbegrensning), med avveiningen at hver mikrobrett bare kan inneholde 96 dyr16, mens flerbrønnsenheten som brukes her, kan inneholde opptil 240 dyr.

Presentert her er en detaljert protokoll for å forberede flerbrønnsenheter som er optimalisert for plate-til-plate-konsistens og utarbeidelse av flere enheter parallelt. Denne protokollen ble tilpasset fra den opprinnelige protokollen fra Fang-Yen-laboratoriet13. Spesielt er det beskrivelser for teknikker for å minimere forurensning, optimalisere konsekvent tørking av både faste medier og bakteriell matkilde, og levere RNAi og narkotika. Dette systemet kan brukes til å spore individuell helse, levetid og andre fenotyper, for eksempel kroppsstørrelse og form. Disse flerbrønnsenhetene er kompatible med eksisterende systemer med høy gjennomstrømning for å måle levetiden, noe som kan fjerne mye av det manuelle arbeidet som er involvert i tradisjonelle levetidseksperimenter og gi mulighet for automatisert, direkte levetidsmåling og helsesporing i individuelle C. elegans i skala.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utarbeidelse av lagerløsninger og medier

MERK: Før du begynner forberedelsen av flerbrønnsinnretningene, må du forberede følgende lagerløsninger og medier.

  1. Stamløsninger for nematodevekstmedier (NGM) og lavsmelte NGM (lmNGM):
    1. Forbered 1 MK2 HPO4: Tilsett 174,18 g K2HPO4 til en 1 l flaske, og fyll den opp til 1 L med sterilt avionisert vann. Autoklav (121 °C, 15 psig) i 30 minutter, og oppbevares i romtemperatur (RT).
    2. Forbered 1 M KPi, pH 6,0: Tilsett 136,09 g KH2HPO4 til en 1 L-flaske, og fyll den opp til 1 L med sterilt avionisert vann. Titrat med 1 M K2HPO4 til pH 6,0. Autoklav (121 °C, 15 psig) i 30 min, og oppbevares ved RT.
    3. Forbered 1 M CaCl 2: Tilsett 73,5 g CaCl2 til en 500 ml flaske, og fyll den opp til 500 ml med sterilt avionisert vann. Autoklav (121 °C, 15 psig) i 30 min, og oppbevares ved RT.
    4. Forbered 1 M MgSO 4: Tilsett 123,25 g MgSO4 til en 500 ml flaske, og fyll den opp til 500 ml med sterilt avionisert vann. Autoklav (121 °C, 15 psig) i 30 min, og oppbevares ved RT.
    5. Forbered 5 mg / ml kolesterol: Kombiner 2,5 g kolesterol, 275 ml 100% etanol og 25 ml sterilt avionisert vann i en 500 ml gul flaske. Oppbevares hos RT.
    6. Forbered 50 ml floxuridin: Kombiner 0,1231 g floxuridin og 10 ml sterilt avionisert vann i et 15 ml konisk rør. Filtrer-steriliser den med et 0,22 μm filter ved hjelp av en 10 ml sprøyte. Aliquot 1 ml hver i 10 mikrosentrifugerør, og oppbevar dem ved -20 ° C.
    7. Forbered 50 mg / ml karbenicillin: I et 15 ml konisk rør, kombiner 500 mg karbenicillin med 10 ml sterilt avionisert vann. Filtrer-steriliser den med et 0,22 μm filter ved hjelp av en 10 ml sprøyte. Aliquot 1 ml hver i 10 mikrosentrifugerør, og oppbevar dem ved -20 ° C.
    8. Forbered 1 mM isopropyl ß-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG): I et 15 ml konisk rør, kombiner 2,38 g IPTG med 10 ml sterilt avionisert vann. Filtrer-steriliser den med et 0,22 μm filter ved hjelp av en 10 ml sprøyte. Aliquot 1 ml hver i 10 mikrosentrifugerør, og oppbevar dem ved -20 ° C.
    9. Forbered 100 mg / ml ampicillin: I et 15 ml konisk rør, kombiner 1 g ampicillin med 10 ml sterilt avionisert vann. Filtrer-steriliser den med et 0,22 μm filter ved hjelp av en 10 ml sprøyte. Aliquot 1 ml hver i 10 mikrosentrifugerør, og oppbevar dem ved -20 ° C.
  2. Klargjøring av nematodevekstmedier (NGM) for generelt vedlikehold av C. elegans
    1. For å lage 50 plater, i en 1 L kolbe, kombiner 10 g Bacto agar, 1,5 g NaCl, 1,25 g Bacto pepton og 486 ml ultrarent vann. Autoklav på væskesyklus (121 °C, 15 psig) i minst 30 minutter for å sterilisere.
    2. Etter autoklav, etter at mediet er avkjølt til 55 °C, tilsett 12,5 ml 1 M KPi, 500 μL 1 M MgSO4, 500 μL 1 M CaCl2 og 500 μL 5 mg/ml kolesterol.
    3. Bruk en steril teknikk til å helle 10 ml medier i hver 60 mm plate (50 totalt). Etter at mediet har størknet (minst 30 minutter etter helling), pipetter 300 mikrol bakteriekultur (tilberedt i henhold til trinn 4 og trinn 10) som har blitt dyrket over natten på midten av platen. La platen stå på benken, slik at bakteriekulturen tørker og vokser tykkere (1-2 dager). Oppbevar platene ved 4 °C.
  3. Forbered lavsmelte nematode vekstmedier (lmNGM) pre-blanding:
    1. I en 500 ml kolbe kombinerer du 4 g lavsmelteagarose, 0,5 g Bacto Peptone og 195 ml ultrarent vann. Autoklav på væskesyklus (121 °C, 15 psig) i minst 30 minutter for å sterilisere.
    2. Mens mediet fortsatt er smeltet, distribuer 10 ml alikoter i sterile glassreagensrør. Forsegl hvert reagensrør med Parafilm etterfulgt av en reagensrørhette for å bevare lmNGM-forblandingen og forhindre uttørking. Mediet vil stivne og kan lagres i ~ 2 uker på RT før bruk.
  4. Forbered 142,8 mM NaCl: Kombiner 0,8345 g NaCl og 100 ml sterilt avionisert vann i en 250 ml flaske. Autoklav (121 °C, 15 psig) i 30 min, og oppbevares ved RT.
  5. Forbered vaskemiddelløsning: I et 15 ml konisk rør kombinerer du 3 ml mellom 20 og 7 ml sterilt avionisert vann. Bland grundig, filtrer-steriliser med et 0,22 μm filter ved hjelp av en 10 ml sprøyte, og oppbevar ved RT.
  6. Forbered kobbersulfatløsning: I en steril 50 ml flaske, kombiner 20 ml sterilt avionisert vann, 0,5 g CuSO4 og 100 mikrol vaskemiddeloppløsning (tilberedt i trinn 1,5). Bland til CuSO4 er oppløst. Oppbevares hos RT.
  7. Forbered vannabsorberende polyakrylamidkrystaller: I en autoklavsikker klemmeflaske, kombiner 150 ml avionisert vann og 1 g Type S superabsorberende polymer. Bland forsiktig ved å snu flasken flere ganger. Autoklav på væskesyklus (121 °C, 15 psig) i minst 20 minutter, og oppbevares ved RT.
  8. Forbered lysogen buljong (LB): I et 1 L eller større beger, kombiner 20 g LB-pulver med 1 liter avionisert vann. Aliquot i to 500 ml begerglass. Autoklav (121 °C, 15 psig) i 30 min, og oppbevares ved RT
  9. Forbered lysogen buljong (LB) agarplater:
    1. I en 1 l kolbe, kombiner 10 g LB-pulver, 7,5 g Bacto Agar og 500 ml avionisert vann. Autoklav på væskesyklus (121 °C, 15 psig) i 30 minutter.
    2. Tilsett eventuelt valgfri antibiotika (etter autoklav, etter at media er avkjølt til 55 °C): 500 μL 100 mg/ml ampicillin. Bruk en steril teknikk til å helle 20 ml medier i hver 100 mm plate (25 totalt) og oppbevare ved 4 °C.

2. Skrive ut 3D multi-well enhetsformen

MERK: Hver enhet er støpt fra PDMS ved hjelp av en tilpasset 3D-trykt form. En enkelt form kan produsere så mange enheter som nødvendig; Men hvis du prøver å forberede flere enheter samtidig, kreves det en 3D-trykt form for hver enhet som skal lages parallelt.

  1. Last ned STL-filen (se tilleggsfil 1).
  2. Skriv ut formen med en 3D-skriver med høy oppløsning.
    MERK: Oppløsningen til skriveren må være tilstrekkelig høy til å tillate konsistente brønn- og vollgravvolumer. Den foreslåtte skriveroppløsningen er en minimum XY-oppløsning på ~40 μm og en lagoppløsning på 28 μm. Materialet som brukes av 3D-skriveren er like viktig, da mange materialtyper vil forhindre PDMS i å herde. Av erfaring fungerer former produsert av høyoppløselige PolyJet-skrivere (oppløsning: X-akse = 600 dpi, Y-akse = 600 dpi, Z-akse = 1,600 dpi) ved bruk av Vero Black-utskriftsmaterialet konsekvent. 3D-utskriften av formene som ble brukt i denne studien ble outsourcet (utskriftsdetaljer finner du i materialfortegnelsen).

3. Forberedelse av flerbrønnsenheten

MERK: Denne delen beskriver hvordan den 3D-printede formen brukes til å lage PDMS-enheten med flere brønner.

  1. Sett herdeovnen på 55 °C for å tillate forvarming.
  2. Bestem antall enheter som skal klargjøres i en batch. For hver enhet blander du 60 g PDMS-base og 6 g herdemiddel i en stor engangsveiebåt (eller lignende engangsbeholder) ved hjelp av en engangsslikkepott.
  3. Plasser PDMS-blandingen i et vakuumkammer i 30 minutter ved -0,08 MPa for å fjerne bobler.
  4. Hell PDMS-blandingen i hver 3D-printet form. Fyll formen helt, med PDMS-blandingen som strekker seg litt over toppen av formen. Hold overflødig PDMS-blanding for å fylle formen i tilfelle søl.
  5. Sett den fylte formen og eventuell ekstra PDMS-blanding i vakuumkammeret i 25 minutter ved -0,08 MPa for å fjerne eventuelle bobler som oppstår under helleprosessen.
  6. Fjern den fylte formen fra vakuumkammeret, og pop eventuelle gjenværende bobler med en engangsslikkepott. Bruk slikkepotten til å børste eventuelle synlige rusk eller gjenværende bobler til kanten av formen vekk fra brønnene. Eventuelt gjenværende rusk eller bobler kan potensielt forstyrre avbildningen i de senere trinnene.
  7. Forsikre deg om at formen er fylt helt med PDMS-blandingen; Det er vanlig at en liten del av blandingen søler ut mens den er i vakuumkammeret eller under overføring. Påfyll med den ekstra PDMS-blandingen som ble avgasset i trinn 3.5. Dette skal ikke skape bobler, men hvis noen gjør det, kan de forsiktig børstes til siden av formen med slikkepotten.
  8. Plasser et flatt akrylark på toppen av den PDMS-fylte formen ved først å plassere den ene kanten og sakte senke den andre til akrylen sitter flatt på toppen av formen, og forskyve eventuell PDMS-blanding som strekker seg over kanten. Hvis det dannes bobler mens du legger akrylplaten, fjern akrylen sakte, fyll formen på nytt med PDMS-blanding om nødvendig, og start akrylplasseringen på nytt. Akrylplaten vil danne en flat bunn for den støpte enheten og sikre at alle brønnene er på samme nivå i forhold til basen.
  9. Plasser en vekt på 2,5 kg på toppen av akryl. Flere former, hver med et eget akrylark, kan stables. Sett de vektede formene i ovnen, og la dem herde ved 55 °C over natten.
  10. Neste dag, fjern vektene og formene fra ovnen.
  11. Arbeid forsiktig et barberblad mellom akryl og herdet PDMS for å bryte forseglingen. Fjern akryl forsiktig fra toppen av formen. PDMS vil ha satt på dette punktet, og fjerning av akryl kan ta litt kraft.
  12. Bruk en barberhøvel eller en metallspatel, løsne forsiktig sidene av den herdede PDMS fra formen. Det er lett å rive PDMS på dette stadiet; arbeid sakte og forsiktig rundt kanten for å fjerne PDMS-enheten intakt.
    MERK: Nytrykte former er spesielt klissete for de tre første bruksområdene, og PDMS tårer ofte mens du prøver å fjerne enheten. Med flere bruksområder blir det lettere å fjerne herdet PDMS fra formen.
  13. Pakk enheten inn i aluminiumsfolie, og forsegl den med autoklavbånd. Autoklav på tørr syklus i minst 15 minutter ved 121 °C, 15 psig for å sterilisere. Etter autoklavering, oppbevar de innpakkede enhetene på benken, og bruk dem etter behov.

4. Striper bakteriene

MERK: Begynn å forberede bakteriene som skal brukes som ormenes matkilde mens de er på flerbrønnsenheten. De vanligste bakteriene er Escherichia coli-stamme OP50 (eller stamme HT115 for RNAi-eksperimenter). Fullfør dette trinnet minst 2 dager før du legger ormene til enheten.

  1. Strip bakteriene på en fersk LB-plate. Forsikre deg om at eventuelle stammespesifikke selektive tilsetningsstoffer (f.eks. ampicillin for å velge et plasmid som gir ampicillinresistens mot bakteriene) er inkludert i LB-platene.
  2. Inkuber platen ved 37 ° C over natten (~ 18 timer) for å la koloniene vokse.

5. Klargjøring av flerbrønnsanordningen for medielasting

MERK: Overflaten av silikon PDMS-materialet som utgjør enheten er hydrofob, noe som forhindrer at brønnene med lite volum og aversive vollgraver fylles med henholdsvis NGM og kobbersulfat. For å omgå dette problemet brukes et oksygenplasma til midlertidig å endre overflateegenskapene til enheten som skal være hydrofil, slik at brønnene og vollgraven kan fylles innen et begrenset tidsvindu (opptil ~ 2 timer). Denne delen beskriver trinnene for å fullføre plasmarensingsprosessen. Fullfør dette trinnet minst 1 dag før du oppdager enhetens brønner med bakterier, da dvelende effekter av plasmaren kan forstyrre spotting. Gitt tidspunktet for § 5-7, er den praktiske grensen for disse trinnene per tekniker tre enheter parallelt.

  1. Forvarm en badekuvøse med tørr perle til 90 °C som forberedelse til avsnitt 6.
  2. Siden det totale medievolumet som trengs for å fylle brønnene i en flerbrønnsenhet er lite sammenlignet med Petri-plater, klargjør du et stort parti NGM og alikoter det i reagensrør (se trinn 1.3).
    MERK: Dette kan gjøres på forhånd, da rørene av media kan lagres på benken i ~ 2 uker. Hvis mediene er klargjort og alisitert i rør, fortsett til trinn 5.3.
  3. Mens du bruker hansker, pakk ut en autoklavert flerbrønnsenhet; Unngå å berøre noen av brønnene. Klipp et lite hakk øverst til høyre på enheten for å indikere hvor mange ganger den har blitt brukt/gjenbrukt (se avsnitt 15 nedenfor for instruksjoner og anbefalinger for rengjøring og gjenbruk av hver enhet).
  4. Plasser opptil tre uinnpakkede enheter i plasmarenseren med brønnene vendt opp. Kjør plasmarenseren.
    MERK: Følgende detaljerte instruksjoner gjelder for plasma etch PE-50 plasmarenser. De spesifikke trinnene og innstillingene må tilpasses og muligens optimaliseres for andre plasmarensere.
    1. Kontroller at plasmarensereffektnivået er satt til 75%.
    2. Kontroller at både ventilasjons- og isolasjonsventilene er i AV-posisjon .
    3. Åpne hovedventilen på oksygentanken. Vent til regulatortrykket synker til mellom 15 psig og 20 psig, og vri deretter isolasjonsventilen til PÅ-posisjon .
    4. Slå på vakuumpumpen og plasmarenseren.
    5. Skriv inn følgende innstillinger på plasmarenseren (første gangs bruk), eller kontroller at de tidligere programmerte innstillingene er riktige:
      Plasma Tid: 3:00 min
      Vakuum settpunkt: 149,5 mTorr
      Atmosfærisk ventil: 45 s
      Purge Vent: 5 s
      Gassstabilisering: 15 s
      Vakuum Alarm: 3:00 min
      Auto Cycle-Off: PÅ
    6. Trykk ENTER for å gå til kommandomenyen. Bruk PIL HØYRE til å velge Oppsettmeny, og trykk deretter ENTER. Bla gjennom alle innstillingene ved å trykke Enter for å bekrefte hver gjeldende innstilling og deretter høyrepilen for å gå til neste innstilling.
    7. Gå tilbake til kommandomenyen ved å trykke PIL OPP og deretter PIL VENSTRE.
    8. På skjermbildet Kommandomeny trykker du ENTER. Velg Kommandoer PLASMA ved å trykke Enter. Systemet vil gå gjennom følgende faser:
      Plasma Pumpdown
      Gassstabilisering: I løpet av denne fasen, juster Gas 1-knappen på plasmarenseren til strømningsmåleren er på 10 cc / min.
      Plasma tid
      Rens nedpumping
      Plasma syklus fullført
      Kammer Vent
      MERK: Denne prosessen bør ta omtrent 5-10 minutter å fullføre. Når alle fasene er fullført, vises kommandomenyen på skjermen igjen. Hvis trykket ikke blir lavt nok i løpet av plasmapumpdownfasen , vil plasmarenseren ikke gå videre til neste fase, og skjermen vil vise en feilmelding. Hvis dette skjer, må du kontrollere vakuumpumpeoljen. Hvis oljenivået er lavt eller oljen er uklar/skitten, kan oljeskifte tillate vakuumtrykket å nå det nødvendige nivået.
    9. Slå av hovedventilen på oksygentanken.
    10. Svært sakte, vri ventilasjonsventilen til PÅ-posisjon , og la regulatortrykket til oksygentanken gå tilbake til null.
    11. Vri isolasjonsventilen til AV-stilling .
    12. Slå av vakuumpumpen og plasmarenseren.
      MERK: Den hydrofile overflatemodifiseringen av flerbrønnsenheten av plasmarenseren er midlertidig og blir gradvis mindre effektiv over tid (opptil ca. 2 timer). Gå gjennom del 6 og seksjon 7 så raskt som mulig.

6. Fylling av brønnene med lmNGM

MERK: En tørr perlebadinkubator skal være på og forvarmet fra trinn 5.1. Sørg for at badet har nådd 90 °C.

  1. Steriliser ett polystyrenbrett med én brønn per enhet ved å spraye innsiden av brettet med 70 % etanol og tørke det tørt med en arbeidsserviett.
  2. Fjern hver enhet fra plasmarenseren med en hansket hånd, og legg den i en rengjort skuff.
  3. Plasser et 25 ml engangs pipettebasseng i perlebadinkubatoren etter oppvarming til 90 °C.
  4. Samle ett rør størknet lmNGM forblanding per enhet som skal fylles (se trinn 1.3).
  5. Plasser lmNGM pre-mix reagensrør i et 200 ml glassbeger, og fjern lokkene og Parafilm. Mikrobølgeovn i ~ 20 s til mediet smelter tilstrekkelig til å helles (tilstedeværelsen av noen faste medier er bra på dette stadiet).
  6. Kombiner den smeltede lmNGM-forblandingen fra flere reagensrør til et annet sterilt 200 ml beger. Fortsett mikrobølgeovnen i ytterligere 20 s for å nå totalt 40 s. Hvis lmNGM-forblandingen begynner å koke over, stopp mikrobølgeovnen og la lmNGM-forblandingen sette seg før du fortsetter.
  7. Fjern den smeltede lmNGM forblandingen fra mikrobølgeovnen, og la den avkjøles til ~ 60 ° C.
    MERK: På dette stadiet vil mediet avkjøles og størkne etter ~ 5 min. Gå umiddelbart til trinn 6.8 og trinn 6.9.
  8. For hver 10 ml lmNGM forblanding, tilsett følgende (i rekkefølge): 250 μL av 1 M KPi, 10 μL av 1 M MgSO4, 10 μL av 1 M CaCl2 og 10 μL av 5 mg / ml kolesterol.
    1. For å forhindre eggklekking når du overvåker voksne på enheten, tilsett 10 μL 50 mM floksuridin.
    2. For å velge for et RNAi-plasmid og for å indusere ekspresjonen av RNA, tilsett 5 μL 50 mg / ml karbenicillin og 12 μL 1 mM IPTG.
      MERK: Antibiotika eller andre tilsetningsstoffer kan endres avhengig av utformingen av eksperimentet. Testforbindelser/legemidler kan også tilsettes mediet på dette stadiet.
  9. Hell den smeltede lmNGM i 25 ml bassenget i perlebadet.
  10. Fyll enhetens brønner med lmNGM ved hjelp av en 200 μL flerkanals repeaterpipette.
    1. Still inn repeateren til å dispensere alikoter på 14 μL (14 μL kan dispenseres opptil 14 ganger hvis du bruker en 200 μL pipettespiss).
    2. Monter fem pipettespisser. Enhetens brønner har samme avstand som en 384-brønnplate. Standard flerkanalspipetter er fordelt slik at brukeren kan pipette inn i annenhver brønn i en rad/kolonne.
    3. Legg spissene med smeltet lmNGM. Dispenser de første 14 μL tilbake i det lmNGM-holdige bassenget.
    4. Flytt raskt, men forsiktig, dispenser 14 μL inn i de indre brønnene (hvit i figur 1B), start med de som er merket med en "x" i figur 1B og flytt over platen til høyre og deretter ned, dispenser totalt 12 ganger (60 brønner).
    5. Dispenser den gjenværende lmNGM tilbake i bassenget, da den endelige alikoten vanligvis er mindre enn 14 μL.
    6. Gjenta trinn 6.10.3-6.10.5 til alle indre brønner er fylt.
    7. Sett deretter repeateren til å dispensere alikoter på 15 μL. Gjenta trinn 6.10.3-6.10.5, men i stedet for de indre brønnene, fyll den ytterste ringen av brønner (grå i figur 1B), begynn med brønnene merket med "+" i figur 1B og flytt rundt ytterkanten av platen.
      MERK: Arbeid raskt slik at mediet ikke stivner i pipettespissene. Unngå å søle lmNGM i vollgraven. De ytre brønnene har en tendens til å tørke raskere. De ekstra 1 μL lmNGM gjør at den endelige tørkede brønnen får en jevn overflate i samme tørketid som de indre brønnene.
  11. Som et kvalitetskontrolltrinn, undersøk hver brønn for å identifisere de med feil som kan forstyrre avbildning, inkludert brønner som er underfylte (lmNGM-overflaten er sunket under kanten av brønnen), overfylt (lmNGM-overflaten har en kuppelformet topp) og inneholder bobler eller rusk.
  12. Fjern størknet lmNGM fra de utilfredsstillende brønnene med en kort platinatrådplukk eller vakuumaspirator. Fyll de tomme brønnene med fersk smeltet lmNGM. Fjern også eventuelle medier som fløt over i vollgraven med en kort platinatrådplukk eller vakuumaspirator.

7. Tilsetning av kobbersulfat til vollgraven

MERK: Denne enhetens brønner er omgitt av en kontinuerlig vollgrav. Her er vollgraven fylt med kobbersulfat, som fungerer som avstøtende og avskrekker ormene fra å flykte fra brønnene sine.

  1. Bruk en 200 μL pipette til å dispensere 200 μL kobbersulfatløsning (se trinn 1.6) i enhetens vollgrav i hvert hjørne, 2x per hjørne. Dette bør være et stort nok volum for kobbersulfatet å strømme gjennom hele vollgraven. Vær forsiktig så du ikke fyller vollgraven på noe tidspunkt; Kobbersulfatet skal ikke berøre brønnens øverste overflate.
  2. Hvis kobbersulfatet ikke strømmer lett gjennom hele vollgraven, bruk en kort platinatrådplukk for å bryte spenningen og dra kobbersulfatet gjennom vollgraven.
  3. Etter at kobbersulfatet har strømmet gjennom hele vollgraven, fjern så mye kobbersulfat som mulig fra vollgraven ved hjelp av en 200 μL pipette eller aspirasjon med vakuum. Resten som er igjen, vil være tilstrekkelig til å avskrekke ormene fra å forlate brønnene sine. Å forlate vollgraven full av kobbersulfatløsning risikerer kobbersulfat å spyle inn i brønnene, noe som vil føre til at ormer flykter.

8. Tilsetning av autoklaverte vannkrystaller

MERK: For å opprettholde fuktighet i platen og forhindre uttørking av lmNGM, er hver enhet omgitt av mettede vannabsorberende polyakrylamidkrystaller.

  1. Forbered vannkrystallene (se trinn 1.7).
  2. Bruk en klemflaske til å legge til vannkrystallene i mellomrommene mellom enheten og brettveggene. Lukk brettlokket, og pakk alle fire sidene med et stykke Parafilm. Legg til to ekstra stykker Parafilm for å forsegle platen helt.
    NOTAT: Vannkrystaller kan fremstilles i et beger og øses inn i brettet med en sterilisert slikkepott. Dette legger imidlertid til tid i prosedyren og øker tiden hver skuff er åpen og utsatt for potensielle forurensninger.
  3. La den forseglede enheten ligge på benken til neste dag når bakteriene er klare til å bli oppdaget. Forsikre deg om at enhetene er lagret med brønnene vendt opp etter at lmNGM er lagt til.

9. Forberedelse av en alderssynkronisert populasjon av ormer

MERK: Følgende trinn gir en synkronisert populasjon av ormer som er klare til å legges til flerbrønnsenheten i fjerde larvestadium (L4). Imidlertid kan ormer på ulike stadier av utvikling også legges til. Dette trinnet skal fullføres 2 dager før du legger ormene til enheten hvis L4s er ønsket. Juster tidspunktet for synkronisering for ønsket livsfase.

  1. For konsistente aldringsstudier, hold C. elegans på standard NGM-plater (se trinn 1.2 ved 20 °C under godt matede forhold).
  2. Få en synkronisert populasjon av dyr fra en lagerplate ved hjelp av standardmetoder, for eksempel bleking17 eller tidsbestemt egglegging1.
  3. Legg isolerte egg til en NGM-plate flekket med bakterier. Eggene klekkes på denne tallerkenen, og ormene vil nå L4-larvestadiet om 2 dager for villtypedyr.

10. Inokulere bakteriekulturen

MERK: Bakterier brukes som den primære matkilden for C. elegans, oftest E. coli-stammer OP50 eller HT115. Bakteriene er konsentrert 10 ganger, som bør regnskapsføres i volumet av den fremstilte kulturen. Forbered en bakteriekultur dagen før du oppdager enheten.

  1. Fra LB-platen som ble klargjort i trinn 4, velg en enkelt koloni og inokuler 12 ml steril LB per enhet som skal oppdages. Inkluder selektive midler om nødvendig for bakteriestammen som brukes.
  2. Dyrk bakteriekulturen over natten (~ 18 timer) i en 37 ° C inkubator med risting ved ~ 250 o / min.

11. Spotting brønnene med konsentrerte bakterier

MERK: Et lite volum konsentrerte bakterier legges til hver brønn, som er tilstrekkelig til å mate ormene for hele levetiden på enheten. Bakteriekulturen må tørkes før ormene kan legges til brønnene. Siden medievolumet i hver brønn er lite (14-15 μL) i forhold til det tilsatte bakterievolumet (5 μL), kan det kjemiske innholdet i bakteriemediet påvirke brønnens kjemiske miljø. For å ta hensyn til dette blir bakteriene konsentrert og resuspendert i saltvann for å fjerne utarmet LB samtidig som man unngår hypoosmotisk stress. Det er ikke tilsatt salt i lmNGM-oppskriften (se trinn 1.3-1.4) slik det tilsettes på dette stadiet.

  1. Etter dyrking av bakteriene over natten som beskrevet i avsnitt 10, konsentrer bakteriekulturen 10x. Pellet bakteriene ved å sentrifugere ved ~3,400 x g i 20 minutter, kast supernatanten og resuspender pelleten i 1/10 av det opprinnelige kulturvolumet på 142,8 mM NaCl (se trinn 1.4). For eksempel, for å oppdage en 240-brønns enhet, spinn ned 12 ml kultur og resuspender i 1,2 ml 142,8 mM NaCl.
    MERK: Testforbindelser / legemidler kan tilsettes den resuspenderte bakteriekulturen før spotting.
  2. Bruk en gjentatt pipette til å punktere hver brønn med 5 μL av de konsentrerte bakteriene. Unngå direkte kontakt med lmNGM-overflaten, da pipettespissen kan stikke hull på lmNGM og la ormen grave seg ned under overflaten av brønnen. Vær forsiktig så du ikke lar bakteriene spyle inn i vollgraven fordi ormene vil bli tiltrukket av det og flykte inn i vollgraven.
  3. Tørk de flekkete bakteriene med brettlokkene fjernet. Dette trinnet er viktig for den langsiktige integriteten til brønnmiljøet, og det finnes en rekke måter å tørke de flekkete enhetene på. Uansett hvilken metode som brukes, må du sørge for at enheten forblir i et sterilt miljø, da den må sitte utildekket mens bakteriene tørker. Økt luftstrøm reduserer tørketiden sterkt. Tørking kan utføres som beskrevet i trinnene nedenfor:
    1. La enheten stå utildekket i en ren, forseglet beholder, for eksempel en plastbeholder som har blitt rengjort med 10% blekemiddel, etterfulgt av 70% etanol. Denne metoden for tørking kan ta flere timer.
    2. Plasser enhetene uten lokk i en steril avtrekkshette for laminær luftstrøm (tilsvarende den foretrukne metoden nedenfor).
    3. Tørk enhetene ved hjelp av en spesialbygd "tørkeboks" (den optimaliserte metoden som ble fulgt i denne studien), som kan konstrueres til minimal kostnad ved hjelp av datamaskinvifter og HEPA-filtre (se tilleggsfil 1).
      MERK: Uansett hvilken metode som brukes, må tørketrinnet optimaliseres for det lokale miljøet. Overvåk ofte hvor raskt brønnene tørker til den typiske tørketiden er identifisert. I et miljø med lav luftfuktighet resulterer bruken av en tørkeboks i en tørketid på ~ 30-40 min. Ikke la platene bli for tørre, da mediene i brønnene vil krympe og synke. Det er bedre å fjerne enheten fra tørking mens noen brønner fortsatt er våte enn å la den tørke lenger og potensielt overtørke et stort antall brønner.
  4. Sjekk vannkrystallene. Hvis flertallet av vannkrystallene i brettet har tørket ut og mistet volum under tørkeprosessen, tilsett mer i brettet.
  5. Etter at bakteriene er tørre, tilsett ormene umiddelbart (avsnitt 12) eller forsegl brettet for å bruke det senere. For å forsegle, lukk brettlokket og pakk alle fire sidene med et enkelt stykke Parafilm. Gjenta to ganger for totalt tre Parafilm-lag. Etter at brettet er pakket helt inn, kan enheten stå på benken ved romtemperatur i opptil 4 dager før ormene tilsettes (avsnitt 12).

12. Legge til ormer til flerbrønnsenheten

  1. Tilsett manuelt en orm per brønn til hver brønn ved hjelp av en platinahakk for å overføre dyrene fra platene av ormer tilberedt i seksjon 9. Velg bare ormer som er i ønsket livsstadium og alder.
    MERK: Hvis du bruker mer enn 1 time på å legge ormene til enheten, kan det føre til uttørking av lmNGM, så ormene bør tilsettes så raskt som mulig. Å plukke flere ormer (20+) om gangen før du legger dem til enhetsbrønnene, kan bidra til å øke hastigheten.

13. Fullføre klargjøring av enheten for langvarig bruk

MERK: Disse trinnene sikrer at enhetens brønner forblir hydrert i løpet av eksperimentet.

  1. Undersøk vannkrystallene. Forsikre deg om at vannkrystallene er på nivå med toppen av enheten, men ikke renner over på den. Tilsett ekstra vannkrystaller i skuffen om nødvendig.
  2. Tilsett en dråpe tilberedt vaskemiddeloppløsning (se trinn 1.5) på innsiden av brettlokket, og gni inn med en arbeidsserviett til vaskemiddeloppløsningen har tørket. Dette forhindrer tåke på lokket etter at enheten er forseglet inne i skuffen slik at ormene er tydelig synlige.
  3. Pakk brettet med tre stykker Parafilm ved hjelp av en bestemt teknikk som fremmer den langsiktige integriteten til Parafilm-seglet.
    1. Strekk et stykke Parafilm litt slik at det bare dekker to sider av brettet. Gjenta dette med et annet stykke Parafilm for å dekke de to andre sidene.
    2. Lagvis på toppen av det første laget av Parafilm, ta et siste stykke Parafilm, strekk det helt og pakk alle fire sidene. Hvis de er ordentlig forseglet, bør enhetens brønner forbli hydrert i ~ 2 måneder.
      MERK: Parafilmens integritet bør overvåkes hver 1-2 uke, og Parafilm bør erstattes hvis den brytes.
  4. Fjern eventuelle fingeravtrykk fra toppen av skuffen ved hjelp av en arbeidsserviett fuktet med 70 % etanol.

14. Innsamling av dataene

MERK: Hensikten med denne studien er å beskrive kulturmetodikken. Når de er befolket, er flerbrønnsenheter kompatible med langsgående overvåking av en rekke fenotyper. Her gis grunnleggende veiledning for måling av flere av de vanligste parameterne.

  1. Levetid: Overvåk levetiden ved å banke på platen eller utsette ormene for et sterkt blått lys hver 1-3 dag. Skår som død hvis ingen bevegelse observeres. Disse flerbrønnsenhetene er også kompatible med automatiserte bilde- og analyserørledninger for estimering av levetid13,18.
  2. Aktivitet: Overvåk aktiviteten til individuelle dyr gjennom livet ved å ta statiske bilder eller videoer av dyrene i enhetens brønner og vurdere tilbakelagt avstand, hastighet eller andre beregninger av bevegelse. Enhetene er også kompatible med automatiserte bilde- og analyserørledninger for estimering av aktivitet13,18.
  3. Kroppsstørrelse og form: Overvåk endringene i kroppsstørrelse og form ved å ta statiske bilder av dyrene i enhetens brønner og kvantifisere de visuelle parametrene ved hjelp av standard bildebehandlingsteknikker. I prinsippet bør denne kulturmetoden være kompatibel med eksisterende programvare for en mer sofistikert vurdering av ormkroppsform 19,20,21.

15. Gjenbruk av enhetene

MERK: Etter at et eksperiment er fullført, kan flerbrønnsenhetene rengjøres og gjenbrukes opptil tre ganger. Ytterligere gjenbruk begynner å påvirke ormefenotypene, muligens forårsaket av kjemikalier fra mediet eller bakterier som bygger seg opp i veggene i PDMS-materialet.

  1. Kast Parafilm, og fjern enheten fra skuffen. Sjekk hakkene øverst til høyre på enheten, som indikerer hvor mange ganger den har blitt brukt. Hvis den har blitt brukt tre ganger, kaster du enheten. Hvis den har blitt brukt færre enn tre ganger, rengjør den og bruk den på nytt.
    MERK: Brettene er laget av isopor og er ikke i direkte kontakt med lmNGM, bakterier eller tilsetningsstoffer til mediet. De kan gjenbrukes mange ganger så lenge de forblir visuelt klare.
  2. Skyll ut eventuelle gjenværende vannkrystaller fra brettet. Spray innsiden av brettet med 10% blekemiddelløsning, og la den sitte i 10 minutter. Skyll med avionisert vann og tørk umiddelbart for å unngå vannflekker.
  3. Hold enheten under rennende vann for å begynne å rengjøre mediet ut av brønnene. Bøy og vri enheten forsiktig under vannet for å løsne mediet fra brønnene, men ikke bøy så langt at enheten tårer. Plukk ut eventuelle gjenværende medier som sitter fast i brønner med en 200 μL pipettespiss.
  4. Fyll et 2 L beger med en rørestang ~ 3/4 full med avionisert vann, og kok opp på en kokeplate.
  5. Tilsett en eller to flerbrønnsenheter og en rørestang til det kokende vannet. Slå på magnetomrøringen til lav hastighet (~ 200 o / min) for å forsiktig bearbeide enhetene i vannet. La enhetene koke i 10 minutter.
  6. Fjern enhetene fra vannet med metallpinsett, og legg dem med godt side ned på papirhåndklær for å tømme. La enhetene tørke på et minimum over natten.
  7. Når enhetene er helt tørre, pakk dem inn i folie og forsegl dem med autoklavbånd. Skriv på autoklavbåndet antall ganger enheten har blitt brukt. Autoklav på tørr syklus i 15 minutter ved 121 °C for å sterilisere. Enhetene er nå klare til gjenbruk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

WorMotel-kultursystemet kan brukes til å samle en rekke data, inkludert om levetid, helse og aktivitet. Publiserte studier har benyttet flerbrønnsenheter for å studere levetid og helsespenn 13,14, ro og søvn 22,23,24 og atferd 25. Levetiden kan skåres manuelt eller gjennom en samling bilder og nedstrøms bildeanalyse. I den tidligere tilnærmingen kan ormene observeres manuelt etter en stimulus (f.eks. banke på platen eller eksponering for blått lys) hver 1-3 dag og scores som død hvis ingen bevegelse observeres, i likhet med standardmetoder på petrisklate1. Den sistnevnte tilnærmingen er lik, bortsett fra at ormbevegelsen kan bestemmes ved å sammenligne ramme-til-ramme-forskjeller mellom bildene tatt etter at stimulansen er brukt. Dette gir en ekstra fordel ved at bevegelse gir informasjon både om aktivitetsnivået til individuelle dyr på det tidspunktet og gir en beregning som levetid (f.eks. opphør av bevegelse) og helsespenn (flere definisjoner er foreslått) kan bestemmes. Bildene kan videre brukes til å trekke ut ytterligere fysiologiske parametere som kroppsstørrelse, kroppsform og kroppsstilling.

For å demonstrere systemets kapasitet undersøkte vi det klassiske epistatiske forholdet mellom insulinreseptoren, kodet av genet daf-2, og nedstrøms FOXO-familiens transkripsjonsfaktor kodet av daf-16 i sammenheng med levetid, helsespann og daglig aktivitet for individuelle dyr. Villtype (stamme N2) og daf-16(mu68) funksjonstap (stamme CF1038) C. elegans matet E. coli (stamme HT115) som uttrykker enten kontroll (tom vektor; EV) eller daf-2 RNAi fôringskonstruksjoner ble dyrket i flerbrønnsenheter, og hvert dyr ble overvåket for levetid (figur 2A), helsespann (figur 2B) og daglig aktivitet (figur 2C). Aktiviteten ble overvåket daglig ved å ta en serie stillbilder hver 5. s i 2 minutter, med ormene utsatt for sterkt blått lys i 5 s på 1 minutt for å stimulere aktivitet (ifølge Churgin et al.13). Den daglige aktiviteten for hvert dyr ble estimert ved å normalisere bakgrunnen på tvers av brønner og bilder, identifisere ormeområdet i hvert bilde og beregne endringen i området mellom tilstøtende bilder. Levetid ble definert som alderen der aktiviteten sist ble observert for hver orm, og helsespan ble definert som alderen der en orm ikke lenger kunne bevege seg en hel kroppslengde. Som forventet fra mange tidligere studier (f.eks. Kenyon et al.26, Murphy et al.27), resulterte daf-16 (mu86) mutasjonen i korte levetider og forhindret levetidsforlengelse fra RNAi-knockdown av daf-2 (figur 2A). Et lignende mønster ble observert for helsespenn (figur 2B). Som en fordel ved å bruke flerbrønnsenhetskultursystemer, tillater kapasiteten til å spore individuelle dyr gjennom livet en detaljert analyse av den individuelle variasjonen i hver målt fenotype over hele populasjonen. For eksempel kan variasjonen i levetid og helsespann mellom individuelle dyr sammenlignes enten i absolutte termer (figur 2D) eller som en brøkdel av den totale levetiden (figur 2E). Fenotyper tidlig i livet kan videre sammenlignes med fenotyper sent i livet, inkludert levetid, hos individuelle dyr over en populasjon. For eksempel korrelerte den kumulative aktiviteten for hvert enkelt dyr over levetiden (dvs. arealet under kurven [AUC] for individuell aktivitet) bedre med levetiden (figur 2F) enn kumulativ levetid frem til dag 5 i livet (figur 2G) på tvers av alle de målte forholdene. Vi understreker at formålet med dette arbeidet er å gi en detaljert protokoll for å konstruere flerbrønnsmiljøet for å spore individuelle dyr over tid, ikke for å måle en bestemt fenotype ved hjelp av enheten. De representative resultatene presentert i figur 2 gir bare ett eksempel på fenotypene som kan måles i dette systemet. Når det er konstruert, er flerbrønnsmiljøet kompatibelt med et bredt spekter av teknikker for å måle fenotypene av frittkrypende ormer på faste medier.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av mikrofabrikerte flerbrønnsenheter . (A) Individuelle C. elegans dyrkes på faste lavsmelte nematodevekstmedier (lmNGM) agaroseputer frøet med bakteriell mat i individuelle brønner. Rommet mellom brønnene er belagt med et aversivt kjemikalie (kobbersulfat) for å isolere hver orm i brønnen. Hver enhet er festet i en enkeltbrønnsskuff. Omkretsen av brettet er fylt med vannkrystaller for å opprettholde fuktigheten. Brettet er forseglet med Parafilm for å tillate oksygenutveksling. Bilde opprettet med BioRender.com. (B) Oversikt over flerbrønnsinnretningen som angir den foreslåtte rekkefølgen for lasting av brønnene. De indre brønnene (hvite) mottar 14 μL lmNGM. De ytre brønnene (grå) mottar 15 μL lmNGM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Korrelasjon av målte fenotyper på tvers av populasjoner hos individuelle dyr ved bruk av flerbrønnsenheter. Alle panelene gir data fra det samme eksperimentet som sammenligner fire grupper av dyr: villtype (N2) dyr utsatt for tom vektor EV (RNAi) (N = 138), villtype dyr underlagt daf-2 (RNAi) (N = 151), daf-16 (mu86) dyr underlagt EV (RNAi) (N = 123) og daf-16 (mu86) dyr underlagt daf-2 (RNAi ) (N = 135). (A) Levetidsforlengelsen fra daf-2 (RNAi) er blokkert av daf-16 (mu86) nullmutasjon. Parvis signifikans mellom grupper bestemt av log-rank-testen (survdiff-funksjonen i R). (B) Helsespenn-definert her som dagen da et dyr ikke lenger kan bevege en full kroppslengdeforlengelse fra daf-2 (RNAi) er blokkert av daf-16 (mu86) nullmutasjon. Parvis signifikans mellom grupper bestemt av log-rank-testen (survdiff-funksjonen i R). (C) Det 3-dagers rullerende gjennomsnittet av aktivitet over hele levetiden reduseres med både daf-16 (mu86) og daf-2 (RNAi). Signifikans beregnet ved Mann-Whitney U-testen for å sammenligne arealet under kurven for aktivitet over livsløpet for enkeltdyr mellom grupper. (D) Helsespann og levetid for hver populasjon som absolutte verdier (gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet). (E) Helsespan og levetid for hver populasjon normalisert til total levetid innen hver gruppe (gjennomsnittlig ± standardfeil for gjennomsnittet). (F) Den kumulative aktiviteten over hele levetiden (areal under kurven [AUC] over hele levetiden) for individuelle dyr korrelerer bedre med levetiden enn (G) aktiviteten for individuelle dyr på en bestemt dag over hele levetiden (aktivitetskorrelasjonen på dag 8, som representerer punktet der den gjennomsnittlige aktiviteten maksimeres, vises), beregnet ved lineær regresjon (lm-funksjonen i R). n.s. = ikke signifikant, * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Alle p-verdier ble justert for multiple sammenligninger med Bonferroni-metoden for sammenligninger gjort innenfor hvert panel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: STL-fil for utskrift av 3D-flerbrønnsenhetsformen Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

WorMotel-systemet er et kraftig verktøy for å samle individualiserte data for hundrevis av isolerte C. elegans over tid. Etter de tidligere studiene ved bruk av flerbrønnsenheter for applikasjoner i utviklingsstillhet, lokomotorisk oppførsel og aldring, var målet med dette arbeidet å optimalisere utarbeidelsen av flerbrønnsenheter for langsiktig overvåking av aktivitet, helse og levetid på en høyere gjennomstrømningsmåte. Dette arbeidet gir en detaljert protokoll for klargjøring av flerbrønnsenheter som optimaliserer mange av trinnene fra den opprinnelige protokollen13, fremhever viktige punkter som kan by på tekniske vanskeligheter, og gir en diskusjon om gjenbruk av platene og andre materialer.

For skalering - som et laboratorium som for tiden forbereder mellom 10 og 20 enheter i en typisk uke - var en topp vurdering om enhetene kunne gjenbrukes og i så fall i hvilken grad. Det er en høyere kostnad i form av både tid og penger i å forberede PDMS-enheter i forhold til å gjennomføre tradisjonell kultur på Petri-plater, men disse høyere kostnadene kan reduseres ved å gjenbruke PDMS eller andre komponenter i systemet. Med mange gjenbruk begynte PDMS å utvikle en gul farge, som sannsynligvis reflekterer akkumulering av forbindelser fra lmNGM-mediet eller bakterier. Dyrene som ble dyrket på disse platene viste også en høyere fluktrate og redusert levetid. Basert på dusinvis av eksperimenter er tre bruksområder optimale for gjenbruk av disse PDMS-enhetene, slik at aldersrelaterte fenotyper kan vurderes uten målbar innvirkning fra PDMS-nedbrytning samtidig som antall nye enheter som må støpes reduseres (og dermed spare kostnader). Vi bekreftet videre at eksperimentmatchede dyr dyrket på enheter ved første, andre og tredje bruk produserte overlevelseskurver som var nesten uutslettelige og ikke statistisk forskjellige (data ikke vist). Skuffene som brukes til å inneholde enhetene er laget av isopor og kan rengjøres og gjenbrukes på ubestemt tid hvis de forblir fri for riper eller andre merker som kan forstyrre visualiseringen av ormene.

En sentral utfordring for å forberede flerbrønnsenheter for applikasjoner som varer mer enn ~ 2 uker, er forebygging av plateforurensning av miljøbakterier og sopp. Det er flere trinn der sterilisering er avgjørende for å forhindre forurensning. Disse inkluderer autoklavering av alle enhetene før bruk, koking av enhetene beregnet for gjenbruk, autoklavering av absorberende vannkrystaller som brukes til å opprettholde fuktighet, rengjøring av skuffene som inneholder enhetene med både blekemiddel og etanol før bruk, og filtersterilisering av vaskemiddelløsningen som påføres lokket på brettet for å forhindre tåke og tilsettes kobbersulfatløsningen. Implementering av hver av disse endringene reduserte spesielt kontamineringshendelser, slik at de forseglede enhetene konsekvent kan brukes til langsgående overvåking over hele levetiden, selv under pro-levetidsforhold (f.eks. knockout av daf-2) som krever overvåking i >45 dager. Protokollen beskrevet her inkluderer to modifikasjoner av den opprinnelige protokollen for langsiktige applikasjoner designet for å opprettholde konsekvent brønntørking og forhindre uttørking. Først ble den totale dybden på enheten økt med 2 mm for å øke kapasiteten til vannkrystaller. Over lange eksperimenter, spesielt i et miljø med lav luftfuktighet, førte for få vannkrystaller i brettet til uttørking av lmNGM. Sammen med flere vannkrystaller var det nødvendig å øke volumet av agarose som ble tilsatt brønnene langs kanten av enheten. Disse brønnene hadde en tendens til å tørke først etter brønnbelastningen (seksjon 6) og krympe. Ved å bruke 14 μL agarose på de innvendige brønnene var nok volum til å fylle brønnene helt uten å skape den kuppelformede toppen som skyldes overfylling av brønnene. Tilsetning av 15 μL agarose til de ytre brønnene ga nok volum til at når brønnene begynte å tørke ut, krympet de til et nivå sammenlignbart med 14 μL lagt til i de indre brønnene.

Et av de største avvikene fra den opprinnelige protokollen var å reversere rekkefølgen brukeren laster lmNGM (seksjon 6) og kobbersulfat (seksjon 7). Opprinnelig ble kobbersulfatet tilsatt vollgraven først, etterfulgt av fylling av brønnene med lmNGM13. Det ble observert at fylling av brønnene med lmNGM så snart etter plasmarengjøring som mulig forbedret adherensen av lmNGM til brønnveggene. Å vente for lenge etter plasmarengjøringen resulterte i brønner med bobler og kuppelformede topper, noe som kan forstyrre visualiseringen av ormene. Prioritering av fylling av brønnene fremfor tilsetning av kobbersulfat er spesielt viktig når du forbereder flere enheter samtidig for å sikre konsistente lmNGM-overflater av høy kvalitet. En ulempe med å fylle brønnene først er at den hydrofile overflatemodifikasjonen produsert av plasmarenseren vil ha slitt merkbart når brukeren går videre til å legge til kobbersulfatet. Kobbersulfat strømmer ikke lett gjennom vollgraven når overflaten blir mindre hydrofil, noe som gjør det utfordrende å oppnå fullstendig dekning. Tilsetning av vaskemiddel til kobbersulfatløsningen for å fungere som et overflateaktivt middel, forbedrer strømmen av løsningen gjennom vollgraven. En platinatrådplukk kan også brukes til å forsiktig lede kobbersulfatet gjennom vollgraven ved å bryte spenningen på ethvert punkt der kobbersulfatet har problemer med å flyte. Videre, hvis kobbersulfatløsningen ble igjen i vollgraven, ville den lett spyle inn i brønnene og forurense lmNGM-overflaten når du vipper brettet. Lasteprosessens natur gjør det nesten umulig å holde enheten tilstrekkelig nivå gjennom hele for å forhindre kobber i å forurense en delmengde av brønnene. For å ta hensyn til dette fjernes kobbersulfatløsningen fra vollgraven (trinn 7.3), og det gjenværende kobbersulfatet som er igjen, er tilstrekkelig til å avskrekke de fleste ormer fra å flykte. Som et siste notat om bruk av kobbersulfat som en aversiv barriere, kan noen repellenter påvirke aldersrelaterte fenotyper, inkludert levetid. Bruken av kobbersulfat i disse flerbrønnsinnretningene ble undersøkt av Churgin et al.13 og funnet å ikke ha noen påviselig innvirkning på verken levetid eller utvikling.

Andre mindre oppdateringer av protokollen fokuserer på å forbedre trinnene som er tatt for å forberede PDMS. Et ekstra avgassingstrinn etter blanding av PDMS-basen og herdemiddelet ble tilsatt, da dette er en prosess som genererer mange bobler. Fjerning av flertallet av boblene før blandingen tilsettes til enhetsformene, minimerer boblene som er igjen etter det andre avgassingstrinnet. For å sikre at bunnen av enheten er helt flat og jevn, en funksjon som er viktig for helplateavbildning, ble et stykke glass eller akryl lagt over toppen av den fylte formen. Dette trinnet er ikke viktig, men likevel nyttig, for programmer som bare undersøker én brønn om gangen, siden brukeren manuelt kan justere fokus for hver brønn. Til slutt var det nødvendig å herde PDMS ved høyere temperatur (55 ° C) på stedet der denne versjonen av protokollen ble optimalisert (Tucson, Arizona, USA), i motsetning til 40 ° C indikert av den opprinnelige protokollen (optimalisert i Philadelphia, Pennsylvania, USA). Dette antyder at forskjeller mellom steder (for eksempel klima eller nøyaktige reagenser og utstyr som brukes) kan påvirke de spesifikke trinnene i protokollen, for eksempel herdetemperatur eller tørketeknikker, og at disse kanskje må optimaliseres på hvert sted. For eksempel spiller luftfuktighet i omgivelsene en stor rolle for å bestemme tørketiden for platene etter spotting, og dette kan variere sterkt mellom steder eller årstider.

I prinsippet kan dette flerbrønnssystemet brukes til å samle inn data om enhver fenotype som kan måles under standard lysfeltmikroskopi på petrisklaters levetid, helsespenn, ikke-stimulert / stimulert bevegelse, kroppsstørrelse og form, bevegelsesgeometri - med den ekstra evnen til å spore disse beregningene for individuelle ormer over tid. Som nevnt innledningsvis finnes det andre metoder for å anskaffe individuelle helhetsdata. Microfluidics enheter28 eller multi-brønnplater29 gir muligheten til å følge livshistorien til individuelle dyr, men bare ved å dyrke ormene i flytende medier. Et flytende miljø kan endre ormenes transkriptom 10,11,30 i forhold til faste medier og induserer distinkte fysiologiske og atferdsendringer, inkludert episodisk svømming 31, økt energiforbruk 10,32 og forhøyet oksidativt stress 10. I hvilken grad levetid og andre beregninger relatert til sunn aldring kan sammenlignes direkte mellom flytende og faste medier, er uklart. Solid kultur multi-brønn enheter tillater sporing av enkeltormer i et miljø som kan sammenlignes med standard gruppekultur på petrisklater. Den buede strukturen til enhetsveggen gjør det mulig å avbilde ormer hvor som helst inne i brønnen, noe som gjør disse enhetene kompatible, i prinsippet, med mer sofistikerte verktøy for enkeltormanalyse, for eksempel Worm Tracker33.

Evnen til å overvåke individuelle dyr i løpet av et forsøk på en flerbrønnsenhet er ledsaget av flere begrensninger. For det første, selv med en optimalisert protokoll, krever disse enhetene mer tid å sette opp per dyr enn standardkultur på petrisklater, og gir dermed data fra ett dyr på bekostning av den totale prøvestørrelsen. Ormene er imidlertid også isolert til individualiserte brønner, og fjerner noen av komplikasjonene forbundet med automatisert levetidsmåling, for eksempel automatisk å oppdage individuelle dyr som slutter å bevege seg mens de berører hverandre. Automatisering mer enn gjenvinner tiden som går tapt til det mer komplekse oppsettet og gir mulighet for mer høy gjennomstrømningsscreening13,18. For det andre vil eksperimentelle forhold som ormene misliker mer enn kobbersulfatvollgraven, for eksempel sterke stressfremkallende midler (f.eks. Paraquat) eller diettbegrensning, føre til at ormene flykter fra brønnene og inn i vollgraven. For det tredje, mens PDMS-enhetene tillater lysfelt- og mørkefeltmikroskopi, har PDMS-materialet en tendens til å ha både høy og ujevn bakgrunnsfluorescens, sistnevnte skyldes sannsynligvis at støv eller andre mikropartikler blir innebygd i PDMS under støping, noe som begrenser deres anvendelse i fluorescerende mikroskopi. Endelig antyder misfargingen observert i PDMS for enheter gjenbrukt over flere eksperimenter og tilhørende reduksjon i levetid og økning i flukt at mediekomponentene og andre tilsatte kjemikalier igler inn i PDMS over tid. I hvilken grad dette kan påvirke aldrende fenotyper eller medikamentelle behandlinger blir for tiden undersøkt. Som nevnt tidligere er det en alternativ metode for en enkeltormkultur som ligner på PDMS flerbrønnsenheter, men i stedet bruker kommersielt tilgjengelige mikrobrett til dyrket isolerte dyr16. Disse mikrobrettene er laget av isopor, unngår det potensielle problemet med leeching media komponenter, og har konsistent fluorescens bakgrunn, noe som muliggjør direkte in vivo fluorescens avbildning direkte på platen. Mikrobrettbrønnene er også omgitt av palmitinsyre i stedet for kobbersulfatet som brukes i protokollen beskrevet her, noe som er mer aversivt og reduserer brøkdelen av ormer som forlater brønnene sine, selv når det gjelder stressfremkallende midler og diettbegrensning. Disse fordelene oppnås på bekostning av lavere pakkeeffektivitet i brønnene, da mikrobrettene tillater at maksimalt 96 ormer dyrkes i en enkelt skuff i motsetning til 240-ormkapasiteten til PDMS-enhetene. Spesifikasjonene for ønsket resultat av et eksperiment vil påvirke hvilke av disse systemene som skal benyttes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne opplyser at de ikke har noen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH R35GM133588 til G.L.S., en United States National Academy of Medicine Catalyst Award til G.L.S., State of Arizona Technology and Research Initiative Fund administrert av Arizona Board of Regents, og Ellison Medical Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 lb weight CAP Barbell RP-002.5
Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) Falken Design ACRYLIC-CL-3-8/1224 Large sheet cut to smaller sizes 
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Autoclavable squeeze bottle Nalgene 2405-0500
Bacto agar BD Difco 214030
Bacto peptone Thermo Scientific 211677
Basin, 25 mL VWR 89094-664 Disposable pipette basin 
Cabinet style vacuum desiccator  SP Bel-Art F42400-4001 Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. 
CaCl2 Acros Organics 349615000
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Wildtype strain
Carbenicillin  GoldBio C-103-25
Centrifuge Beckman 360902
Cholesterol ICN Biomedicals Inc 101380
Compressed oxygen tank Airgas UN1072
CuSO4 Fisher Chemical C493-500
Dry bead bath incubator Fisher Scientific 11-718-2
Escherichia coli OP50  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Standard labratory food for C. elegans
Ethanol Millipore ex0276-4
Floxuridine Research Products International F10705-1.0
Hybridization oven Techne 731-0177 Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice
Incubators Shel Lab 2020 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria 
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) GoldBio I2481C100
K2HPO4 Fisher Chemical P288-500
KH2PO4 Fisher Chemical P286-1
Kimwipes KimTech 34155 Task wipes
LB Broth, Lennox BD Difco 240230
Low melt agarose Research Products International A20070-250.0
MgSO4 Fisher Chemical M-8900
Microwave  Sharp R-530DK
Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 Rainin 17013800 The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided
NaCl Fisher Bioreagents BP358-1
Nunc OmniTray Thermo Scientific 264728 Clear polystyrene trays
Parafilm M Fisher Scientific 13-374-10 Double-wide (4 in)
Petri plate, 100 mM  VWR 25384-342
Petri plate, 60 mM  Fisher Scientific FB0875713A
Plasma cleaner Plasma Etch, Inc. PE-50
PLATINUM vacuum pump JB Industries DV-142N 
PolyJet 3D printer Stratasys  Objet500 Connex3 PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)
Shaking incubator Lab-Line 3526CC
smartSpatula LevGo, Inc. 17211 Disposable spatula
Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) M2 Polymer Technologies Type S Referred to in main text as "water crystals"
SYLGARD 184 Silicone Elastomer base The Dow Chemical Company 2065622
SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent The Dow Chemical Company 2085925
Syringe filter (0.22 µm) Nest Scientific USA Inc.  380111
Syringe, 10 mL  Fisher Scientific 14955453
TWEEN 20 Thermo Scientific J20605-AP Detergent
Vacuum pump oil VWR 54996-082
VeroBlackPlus Stratasys  RGD875 Rigid 3D printing filament
Weigh boat Thermo Scientific WB30304 Large enough for PDMS mixture volume

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  2. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  3. Rahman, M., et al. NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10, 16190 (2020).
  4. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  5. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. Liu, X., Sun, Y. 13, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 13 295-321 (2021).
  6. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  7. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9, 14340 (2019).
  8. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
  9. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
  10. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
  11. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
  12. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  13. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  14. Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
  15. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  16. Espejo, L., et al. Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  18. Freitas, S. Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. University of Arizona. , Tucson, USA. Master's thesis (2021).
  19. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape. PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).
  20. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , (2013).
  21. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
  22. Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental. microPublication Biology. 2020, (2020).
  23. Iannacone, M. J., et al. The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans. eLife. 6, 19837 (2017).
  24. McClanahan, P. D., et al. A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress. Scientific Reports. 10, 4140 (2020).
  25. Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).
  26. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  27. Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  28. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  29. Lionaki, E., Tavernarakis, N. High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).
  30. Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction. The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).
  31. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).
  32. Hartman, J. H., et al. Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity. Scientific Reports. 8, 8359 (2018).
  33. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).

Tags

Tilbaketrekking utgave 190
Langsiktig kultur og overvåking av isolerte <em>Caenorhabditis elegans</em> på faste medier i flerbrønnsenheter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardea, E. A., DeNicola, D.,… More

Gardea, E. A., DeNicola, D., Freitas, S., Peterson, W., Dang, H., Shuck, K., Fang-Yen, C., Sutphin, G. L. Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices. J. Vis. Exp. (190), e64681, doi:10.3791/64681 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter