Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

תרבית ארוכת טווח וניטור של Caenorhabditis elegans מבודדים על מדיה מוצקה במכשירים מרובי בארות

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64681
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, 2Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Sciences, University of Pennsylvania

Summary

מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לגידול נמטודות בודדות מבודדות על מדיה מוצקה בהתקנים מרובי בארות מיקרו-מפוברקים. גישה זו מאפשרת לעקוב אחר בעלי חיים בודדים לאורך חייהם עבור מגוון פנוטיפים הקשורים להזדקנות ולבריאות, כולל פעילות, גודל וצורת גוף, גיאומטריה של תנועה והישרדות.

Abstract

הנמטודה Caenorhabditis elegans היא בין מערכות המודל הנפוצות ביותר המשמשות במחקר ההזדקנות בשל טכניקות התרבית הפשוטות והזולות שלה, מחזור רבייה מהיר (~ 3 ימים), תוחלת חיים קצרה (~ 3 שבועות), וכלים זמינים רבים למניפולציה גנטית וניתוח מולקולרי. הגישה הנפוצה ביותר לביצוע מחקרי הזדקנות ב- C. elegans, כולל ניתוח הישרדות, כוללת גידול אוכלוסיות של עשרות עד מאות בעלי חיים יחד על מצע גידול נמטודות מוצקות (NGM) בלוחות פטרי. בעוד גישה זו אוספת נתונים על אוכלוסיית בעלי חיים, רוב הפרוטוקולים אינם עוקבים אחר בעלי חיים בודדים לאורך זמן. מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לגידול ארוך טווח של בעלי חיים בודדים על מכשירי פולידימתילסילוקסאן (PDMS) מיקרו-מפוברקים הנקראים WorMotels. כל מכשיר מאפשר לגדל עד 240 בעלי חיים בבארות קטנות המכילות גז טבעי טבעי, כאשר כל באר מבודדת על ידי חפיר המכיל נחושת גופרתית המונע מבעלי החיים לברוח. בהתבסס על התיאור המקורי של WorMotel, מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט לעיצוב, הכנה ואכלוס של כל מכשיר, עם תיאורים של סיבוכים טכניים נפוצים ועצות לפתרון בעיות. פרוטוקול זה כולל טכניקות לטעינה עקבית של גז טבעי בנפח קטן, ייבוש עקבי הן של גז טבעי טבעי והן של מזון חיידקי, אפשרויות למתן התערבויות פרמקולוגיות, הוראות ומגבלות מעשיות לשימוש חוזר במכשירי PDMS, וטיפים למזעור התייבשות, אפילו בסביבות עם לחות נמוכה. טכניקה זו מאפשרת ניטור אורכי של פרמטרים פיזיולוגיים שונים, כולל פעילות מגורה, פעילות לא מגורה, גודל גוף, גיאומטריה תנועתית, תוחלת בריאות והישרדות, בסביבה דומה לטכניקה הסטנדרטית לתרבות קבוצתית על מדיה מוצקה בלוחות פטרי. שיטה זו תואמת לאיסוף נתונים בתפוקה גבוהה כאשר משתמשים בה בשילוב עם תוכנת מיקרוסקופיה וניתוח אוטומטית. לבסוף, נדונות מגבלותיה של טכניקה זו, כמו גם השוואה של גישה זו לשיטה שפותחה לאחרונה המשתמשת במיקרו-מגשים לתרבית נמטודות מבודדות על מדיה מוצקה.

Introduction

Caenorhabditis elegans נפוצים במחקרי הזדקנות בגלל זמן הדור הקצר שלהם (כ -3 ימים), תוחלת חיים קצרה (כ -3 שבועות), קלות הגידול במעבדה, רמה גבוהה של שימור אבולוציוני של תהליכים מולקולריים ומסלולים עם יונקים, וזמינות רחבה של טכניקות מניפולציה גנטית. בהקשר של מחקרי הזדקנות, C. elegans מאפשרים יצירה מהירה של נתוני אריכות ימים ואוכלוסיות מבוגרות לניתוח פנוטיפים מאוחרים בבעלי חיים חיים. הגישה הטיפוסית לביצוע מחקרי הזדקנות תולעים כוללת מדידה ידנית של תוחלת החיים של אוכלוסיית תולעים המתוחזקת בקבוצות של 20 עד 70 בעלי חיים על מצע גידול נמטודות אגר מוצק (NGM) בלוחות פטרי בגודל 6 ס"מ1. שימוש באוכלוסיות מסונכרנות גיל מאפשר מדידה של תוחלת חיים או פנוטיפים חתך בבעלי חיים בודדים על פני האוכלוסייה, אך שיטה זו מונעת ניטור המאפיינים של בעלי חיים בודדים לאורך זמן. גישה זו היא גם עתירת עבודה, ובכך מגבילה את גודל האוכלוסייה שניתן לבדוק.

ישנן מספר מצומצם של שיטות תרבית המאפשרות ניטור אורכי של C. elegans בודדים לאורך כל חייהם, ולכל אחד מהם יש מערכת ייחודית של יתרונות וחסרונות. מכשירי מיקרופלואידיקה, כולל WormFarm2, NemaLife3 ושבב "התנהגות"4, בין היתר 5,6,7, מאפשרים ניטור של בעלי חיים בודדים לאורך זמן. גידול תולעים בתרבית נוזלית באמצעות לוחות מרובי בארות מאפשר באופן דומה ניטור של בעלי חיים בודדים או אוכלוסיות קטנות של C. elegans לאורך זמן 8,9. הסביבה הנוזלית מייצגת הקשר סביבתי שונה מסביבת התרבית הנפוצה על מצע מוצק בצלחות פטרי, אשר יכול לשנות היבטים בפיזיולוגיה של בעלי חיים הרלוונטיים להזדקנות, כולל תכולת שומן וביטוי גנים של תגובת דחק10,11. היכולת להשוות ישירות מחקרים אלה לרוב הנתונים שנאספו על הזדקנות C. elegans מוגבלת על ידי הבדלים במשתנים סביבתיים חשובים פוטנציאליים. Worm Corral12 היא גישה אחת שפותחה כדי לשכן בעלי חיים בודדים בסביבה שמשכפלת באופן הדוק יותר תרבות מדיה מוצקה טיפוסית. קורל התולעת מכיל תא אטום לכל בעל חיים במגלשת מיקרוסקופ באמצעות הידרוג'ל, המאפשר ניטור אורכי של בעלי חיים מבודדים. שיטה זו משתמשת בדימות שדה בהיר סטנדרטי כדי להקליט נתונים מורפולוגיים, כגון גודל גוף ופעילות. עם זאת, בעלי חיים ממוקמים בסביבת הידרוג'ל כעוברים, שם הם נשארים ללא הפרעה לאורך כל חייהם. זה דורש שימוש ברקע גנטי מוטנטי או טרנסגני סטרילי מותנה, מה שמגביל הן את היכולת לבדיקות גנטיות, שכן כל מוטציה או טרנסגן חדש צריך לעבור לרקע עם עקרות מותנית, והן את היכולת לבדיקת תרופות, שכן טיפולים יכולים להיות מיושמים רק פעם אחת על בעלי החיים כעוברים.

שיטה חלופית שפותחה על ידי מעבדת פאנג-ין מאפשרת גידול תולעים על מדיה מוצקה בבארות בודדות של מכשיר פולידימתילסילוקסאן (PDMS) מיקרו-מפוברק הנקרא WorMotel13,14. כל מכשיר ממוקם בתוך מגש באר אחת (כלומר, עם אותם ממדים כמו צלחת 96 בארות) ויש לו 240 בארות המופרדות על ידי חפיר מלא בתמיסה מרתיעה כדי למנוע את התולעים מלעבור בין בארות. כל באר יכולה לאכלס תולעת בודדת למשך תוחלת החיים שלה. המכשיר מוקף בכדורי ג'ל פוליאקרילאמיד סופגי מים (המכונים "גבישי מים"), והמגש אטום בסרט מעבדה Parafilm כדי לשמור על הלחות ולמזער את התייבשות המדיה. מערכת זו מאפשרת לאסוף נתוני תוחלת חיים ותוחלת חיים עבור בעלי חיים בודדים, בעוד שהשימוש במדיה מוצקה משחזר טוב יותר את הסביבה שחוו בעלי חיים ברוב המכריע של מחקרי תוחלת החיים של C. elegans שפורסמו, ובכך מאפשר השוואה ישירה יותר. לאחרונה פותחה טכניקה דומה באמצעות מיקרו-מגשים מפוליסטירן ששימשו במקור לבדיקות מיקרוציטוטוקסיות15 במקום מכשיר PDMS16. שיטת המיקרו-מגש מאפשרת איסוף נתונים פרטניים עבור תולעים שגודלו בתרבית על מצע מוצק ויש לה יכולת משופרת להכיל תולעים בתנאים שבדרך כלל יגרמו לבריחה (למשל, גורמי עקה או הגבלה תזונתית), כאשר התמורה היא שכל מיקרו-מגש יכול להכיל רק 96 בעלי חיים16, בעוד שהמכשיר הרב-באר המשמש כאן יכול להכיל עד 240 בעלי חיים.

מוצג כאן פרוטוקול מפורט להכנת התקנים מרובי בארות המותאם לעקביות צלחת לצלחת והכנת מכשירים מרובים במקביל. פרוטוקול זה הותאם מהפרוטוקול המקורי ממעבדת פאנג-ין13. באופן ספציפי, ישנם תיאורים לטכניקות כדי למזער זיהום, לייעל את הייבוש העקבי הן של המדיה המוצקה והן של מקור המזון החיידקי, ולספק RNAi ותרופות. מערכת זו יכולה לשמש למעקב אחר תוחלת הבריאות האישית, תוחלת החיים ופנוטיפים אחרים, כגון גודל הגוף וצורתו. התקנים מרובי בארות אלה תואמים למערכות קיימות בעלות תפוקה גבוהה למדידת תוחלת חיים, אשר יכולות להסיר חלק ניכר מהעבודה הידנית הכרוכה בניסויים מסורתיים בתוחלת חיים ולספק הזדמנות למדידה אוטומטית וישירה של אריכות ימים ומעקב בריאות ב- C. elegans בודדים בקנה מידה גדול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת פתרונות מלאי ומדיה

הערה: לפני תחילת הכנת המכשירים מרובי הקידוחים, הכן את פתרונות המלאי והמדיה הבאים.

  1. פתרונות מלאי עבור מדיה לגידול נמטודות (NGM) ו-NGM בהתכה נמוכה (lmNGM):
    1. הכינו 1 M K 2 HPO4: הוסיפו 174.18 גרם של K2HPO4 לבקבוק של 1 ליטר, ומלאו אותו עד 1 ליטר במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה. Autoclave (121°C, 15 psig) למשך 30 דקות, ולאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
    2. הכינו 1 M KPi, pH 6.0: הוסיפו 136.09 גרם של KH2HPO4 לבקבוק של 1 ליטר, ומלאו אותו עד 1 ליטר במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה. טיטראט עם 1 M K2HPO4 עד pH 6.0. Autoclave (121°C, 15 psig) למשך 30 דקות, ולאחסן ב-RT.
    3. הכינו 1 M CaCl 2: הוסיפו 73.5 גרם של CaCl2 לבקבוק של 500 מ"ל, ומלאו אותו עד 500 מ"ל במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה. Autoclave (121°C, 15 psig) למשך 30 דקות, ולאחסן ב-RT.
    4. הכינו 1 M MgSO 4: הוסיפו 123.25 גרם של MgSO4 לבקבוק של 500 מ"ל, ומלאו אותו עד 500 מ"ל במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה. Autoclave (121°C, 15 psig) למשך 30 דקות, ולאחסן ב-RT.
    5. הכינו 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול: ערבבו 2.5 גרם כולסטרול, 275 מ"ל של 100% אתנול ו-25 מ"ל של מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה בבקבוק ענבר של 500 מ"ל. יש לאחסן ב-RT.
    6. הכן 50 mM floxuridine: לשלב 0.1231 גרם של floxuridine ו 10 מ"ל של מים סטריליים deionized בצינור חרוטי 15 מ"ל. סנן לעקר אותו עם מסנן 0.22 מיקרומטר באמצעות מזרק 10 מ"ל. Aliquot 1 מ"ל כל אחד לתוך 10 צינורות microcentrifuge, ולאחסן אותם ב -20 ° C.
    7. הכן 50 מ"ג / מ"ל carbenicillin: בצינור חרוטי 15 מ"ל, לשלב 500 מ"ג של carbenicillin עם 10 מ"ל של מים סטריליים deionized. סנן לעקר אותו עם מסנן 0.22 מיקרומטר באמצעות מזרק 10 מ"ל. Aliquot 1 מ"ל כל אחד לתוך 10 צינורות microcentrifuge, ולאחסן אותם ב -20 ° C.
    8. הכן 1 mM isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG): בצינור חרוטי 15 מ"ל, לשלב 2.38 גרם של IPTG עם 10 מ"ל של מים סטריליים deionized. סנן לעקר אותו עם מסנן 0.22 מיקרומטר באמצעות מזרק 10 מ"ל. Aliquot 1 מ"ל כל אחד לתוך 10 צינורות microcentrifuge, ולאחסן אותם ב -20 ° C.
    9. הכן 100 מ"ג / מ"ל אמפיצילין: בצינור חרוטי 15 מ"ל, לשלב 1 גרם של ampicillin עם 10 מ"ל של מים סטריליים deionized. סנן לעקר אותו עם מסנן 0.22 מיקרומטר באמצעות מזרק 10 מ"ל. Aliquot 1 מ"ל כל אחד לתוך 10 צינורות microcentrifuge, ולאחסן אותם ב -20 ° C.
  2. הכנת מצע גידול נמטודות (NGM) לתחזוקה כללית של C. elegans
    1. כדי להפוך 50 צלחות, בבקבוק 1 L, לשלב 10 גרם של אגר Bacto, 1.5 גרם של NaCl, 1.25 גרם של פפטון Bacto, ו 486 מ"ל של מים טהורים במיוחד. Autoclave על מחזור נוזלי (121 ° C, 15 psig) לפחות 30 דקות כדי לעקר.
    2. לאחר autoclave, לאחר התקשורת התקרר ל 55 ° C, להוסיף 12.5 מ"ל של 1 M KPi, 500 μL של 1 M MgSO4, 500 μL של 1 M CaCl2, ו 500 μL של 5 מ"ג / מ"ל כולסטרול.
    3. באמצעות טכניקה סטרילית, יוצקים 10 מ"ל של מדיה לתוך כל צלחת 60 מ"מ (50 בסך הכל). לאחר שהמדיה התמצקה (לפחות 30 דקות לאחר המזיגה), פיפטה 300 מיקרוליטר של תרבית חיידקים (שהוכנה לפי שלב 4 ושלב 10) שגדלה במשך הלילה למרכז הצלחת. השאירו את הצלחת על הספסל, ואפשרו לתרבית החיידקים להתייבש ולגדול סמיכה יותר (1-2 ימים). אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של 4°C.
  3. הכינו מראש את התערובת המקדימה של מצע גידול נמטודות נמס נמוך (lmNGM):
    1. בבקבוק של 500 מ"ל, לשלב 4 גרם של agarose נמס נמוך, 0.5 גרם של Bacto Peptone, ו 195 מ"ל של מים טהורים במיוחד. Autoclave על מחזור נוזלי (121 ° C, 15 psig) לפחות 30 דקות כדי לעקר.
    2. בעוד התקשורת עדיין מותכת, להפיץ 10 מ"ל aliquotsלתוך מבחנות זכוכית סטרילית. אטמו כל מבחנה עם Parafilm ואחריו מכסה מבחנה כדי לשמר את התערובת המקדימה של lmNGM ולמנוע התייבשות. המדיה תתמצק וניתן לאחסן אותה במשך ~שבועיים ב- RT לפני השימוש.
  4. הכינו 142.8 mM NaCl: בבקבוק של 250 מ"ל, ערבבו 0.8345 גרם NaCl ו-100 מ"ל מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה. Autoclave (121°C, 15 psig) למשך 30 דקות, ולאחסן ב-RT.
  5. הכינו תמיסת דטרגנט: בצינור חרוטי של 15 מ"ל, ערבבו 3 מ"ל של טווין 20 ו-7 מ"ל של מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה. יש לערבב היטב, לעקר מסננים עם מסנן 0.22 מיקרומטר באמצעות מזרק 10 מ"ל, ולאחסן ב-RT.
  6. הכינו תמיסת נחושת גופרתית: בבקבוק סטרילי של 50 מ"ל, ערבבו 20 מ"ל מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה, 0.5 גרם של CuSO4 ו-100 מיקרוליטר של תמיסת חומרי ניקוי (שהוכנה בשלב 1.5). מערבבים עד שה-CuSO4 מתמוסס. יש לאחסן ב-RT.
  7. הכינו גבישי פוליאקרילאמיד סופגי מים: בבקבוק סחיטה בטוח לאוטוקלאב, ערבבו 150 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה וגרם אחד של פולימר סופג במיוחד מסוג S. מערבבים בעדינות על ידי היפוך הבקבוק מספר פעמים. Autoclave על מחזור נוזל (121 ° C, 15 psig) במשך 20 דקות לפחות, ולאחסן ב RT.
  8. הכינו ציר ליזוגני (LB): בכד של 1 ליטר או יותר, ערבבו 20 גרם אבקת ליברות עם 1 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה. Aliquot לתוך שתי כוסות 500 מ"ל. Autoclave (121°C , 15 psig) למשך 30 דקות, ולאחסן ב-RT
  9. הכינו צלחות אגר מרק ליזוגני (LB):
    1. בבקבוק של 1 ליטר, ערבבו 10 גרם של אבקת LB, 7.5 גרם של אגר Bacto ו-500 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה. Autoclave על מחזור נוזלי (121 ° C, 15 psig) במשך 30 דקות.
    2. אם תרצה, הוסף אנטיביוטיקה אופציונלית (לאחר autoclave, לאחר מדיה התקרר ל 55 ° C): 500 μL של 100 מ"ג / מ"ל אמפיצילין. באמצעות טכניקה סטרילית, יוצקים 20 מ"ל של מדיה לתוך כל צלחת 100 מ"מ (25 בסך הכל), ולאחסן ב 4 ° C.

2. הדפסת תבנית מכשיר רב באר תלת מימדית

הערה: כל התקן מעוצב מ-PDMS באמצעות תבנית מותאמת אישית המודפסת בתלת-ממד. תבנית אחת יכולה לייצר כמה מכשירים שצריך; עם זאת, אם מנסים להכין התקנים מרובים בו-זמנית, נדרשת תבנית אחת מודפסת בתלת-ממד כדי שכל מכשיר ייוצר במקביל.

  1. הורד את קובץ STL (ראה קובץ משלים 1).
  2. הדפס את התבנית באמצעות מדפסת תלת-ממד ברזולוציה גבוהה.
    הערה: הרזולוציה של המדפסת חייבת להיות גבוהה מספיק כדי לאפשר היטב עקבית ונפחי חפיר. רזולוציית המדפסת המוצעת היא רזולוציית XY מינימלית של ~40 מיקרומטר ורזולוציית שכבה של 28 מיקרומטר. החומר המשמש את מדפסת התלת-ממד חשוב לא פחות, שכן סוגי חומרים רבים ימנעו את ריפוי ה-PDMS. מניסיון, תבניות המיוצרות על ידי מדפסות PolyJet ברזולוציה גבוהה (רזולוציה: ציר X = 600 dpi, ציר Y = 600 dpi, ציר Z = 1,600 dpi) המשתמשות בחומר ההדפסה Vero Black פועלות באופן עקבי. ההדפסה התלת-ממדית של התבניות ששימשו במחקר זה נעשתה במיקור חוץ (פרטי ההדפסה ניתן למצוא בטבלת החומרים).

3. הכנת המכשיר מרובה בארות

הערה: סעיף זה מתאר כיצד תבנית המודפסת בתלת-ממד משמשת ליצירת התקן PDMS מרובה בארות.

  1. כוונו את תנור החימום ל-55°C כדי לאפשר חימום מוקדם.
  2. קבע את מספר המכשירים שיש להכין באצווה אחת. עבור כל מכשיר, ערבבו 60 גרם בסיס PDMS ו-6 גרם חומר מרפא בסירת שקילה חד פעמית גדולה (או מיכל חד פעמי דומה) באמצעות מרית חד פעמית.
  3. הניחו את תערובת ה-PDMS בתא ואקום למשך 30 דקות בטמפרטורה של -0.08 מגפ"ס כדי להסיר בועות.
  4. יוצקים את תערובת PDMS לכל תבנית המודפסת בתלת-ממד. ממלאים את התבנית לחלוטין, כאשר תערובת PDMS משתרעת מעט מעל החלק העליון של התבנית. יש לשמור את עודפי תערובת PDMS כדי למלא מחדש את התבנית במקרה של שפיכה.
  5. הכניסו את התבנית המלאה וכל תערובת PDMS נוספת לתא הוואקום למשך 25 דקות במחיר של -0.08 מגפ"ס כדי להסיר בועות שנוצרו בתהליך המזיגה.
  6. מוציאים את התבנית המלאה מתא הוואקום, ומפוצצים את כל הבועות שנותרו בעזרת מרית חד פעמית. השתמשו במרית כדי להבריש פסולת גלויה או בועות שנותרו לקצה התבנית הרחק מהבארות. כל הפסולת או הבועות שנותרו עלולות להפריע להדמיה בשלבים מאוחרים יותר.
  7. ודא כי התבנית מלאה לחלוטין עם תערובת PDMS; זה נפוץ עבור חלק קטן של התערובת להישפך החוצה בזמן בתא ואקום או במהלך העברה. מלאו מחדש באמצעות תערובת PDMS נוספת שהוצאה מהגז בשלב 3.5. זה לא אמור ליצור בועות, אבל אם יש כאלה, הם יכולים להיות מוברשים בעדינות לצד של התבנית עם מרית.
  8. הניחו יריעת אקריליק שטוחה על גבי תבנית ממולאת PDMS על ידי הנחת קצה אחד תחילה והנמכה איטית של השני עד שהאקריליק יושב שטוח על גבי התבנית, תוך החלפה של כל תערובת PDMS המשתרעת מעל הקצה. אם נוצרות בועות בעת הנחת יריעת האקריל, הסירו לאט את האקריל, מלאו מחדש את התבנית בתערובת PDMS במידת הצורך, והפעילו מחדש את מיקום האקריל. יריעת האקריליק תהווה תחתית שטוחה למכשיר היצוק ותבטיח שכל הבארות יהיו באותה רמה ביחס לבסיס.
  9. מניחים משקולת של 2.5 ליברות על גבי האקריל. ניתן לערום תבניות מרובות, כל אחת עם יריעת אקריליק נפרדת. מכניסים את התבניות המשוקללות לתנור, ונותנים להן להתרפא ב-55 מעלות למשך הלילה.
  10. למחרת, מוציאים את המשקולות ואת התבניות מהתנור.
  11. בזהירות לעבוד סכין גילוח בין אקריליק PDMS נרפא כדי לשבור את האטם. מסירים בזהירות את האקריליק מראש התבנית. ה-PDMS יקבע בשלב זה, והסרת האקריליק יכולה לקחת קצת כוח.
  12. בעזרת סכין גילוח או מרית מתכת, שחררו בזהירות את דפנות ה-PDMS שנרפא מהתבנית. קל לקרוע את PDMS בשלב זה; עבוד לאט ובעדינות מסביב לקצה כדי להסיר את התקן PDMS ללא פגע.
    הערה: תבניות מודפסות טריות הן דביקות במיוחד עבור שלושת השימושים הראשונים, וה- PDMS נקרע לעתים קרובות בעת ניסיון להסיר את המכשיר. עם שימושים נוספים, זה הופך להיות קל יותר להסיר את PDMS נרפא מן התבנית.
  13. עטפו את המכשיר ברדיד אלומיניום ואטמו אותו בסרט הדבקה אוטומטי. Autoclave על מחזור יבש לפחות 15 דקות ב 121 ° C, 15 psig כדי לעקר. לאחר האוטוקלאבינג, אחסנו את המכשירים העטופים על הספסל, והשתמשו בהם לפי הצורך.

4. למתוח את החיידקים

הערה: התחילו להכין את החיידקים שישמשו כמקור המזון של התולעים בזמן שהם נמצאים במכשיר הרב-באר. החיידק הנפוץ ביותר הוא זן Escherichia coli OP50 (או זן HT115 לניסויי RNAi). בצע שלב זה לפחות יומיים לפני הוספת התולעים למכשיר.

  1. פזרו את החיידקים על צלחת LB טרייה. ודא כי כל תוספים סלקטיביים ספציפיים לזן (למשל, אמפיצילין לבחירת פלסמיד המקנה עמידות אמפיצילין לחיידקים) כלולים בלוחות LB.
  2. לדגור על הצלחת ב 37 ° C במשך הלילה (~ 18 שעות) כדי לאפשר את המושבות לגדול.

5. הכנת מכשיר רב באר לטעינת מדיה

הערה: פני השטח של חומר הסיליקון PDMS המרכיב את המכשיר הם הידרופוביים, מה שמונע מילוי בארות בנפח קטן וחפירים מרתיעים בגז טבעי טבעי ובנחושת גופרתית, בהתאמה. כדי לעקוף בעיה זו, פלזמה חמצן משמש כדי לשנות באופן זמני את תכונות פני השטח של המכשיר להיות הידרופילי, המאפשר בארות וחפיר להיות מלא בתוך חלון זמן מוגבל (עד ~ 2 שעות). חלק זה מפרט את השלבים להשלמת תהליך ניקוי הפלזמה. השלם שלב זה לפחות יום אחד לפני איתור בארות המכשיר עם חיידקים, כמו השפעות מתמשכות של פלזמה נקי יכול להפריע איתור. בהתחשב בעיתוי של סעיפים 5-7, המגבלה המעשית לשלבים אלה לכל טכנאי היא שלושה מכשירים במקביל.

  1. מחממים אינקובטור אמבט חרוזים יבשים ל-90 מעלות צלזיוס כהכנה לסעיף 6.
  2. מכיוון שנפח המדיה הכולל הדרוש למילוי בארות של מכשיר מרובה בארות קטן בהשוואה לזה של לוחות פטרי, הכינו אצווה גדולה של גז טבעי טבעי והכניסו אותה למבחנות (ראו שלב 1.3).
    הערה: ניתן לעשות זאת מראש, מכיוון שניתן לאחסן את צינורות המדיה על הספסל למשך ~שבועיים. אם התקשורת הוכנה ו aliquoted לתוך צינורות, להמשיך לשלב 5.3.
  3. בעת לבישת כפפות, לפתוח מכשיר multi-well autoclaved; הימנעו מלגעת בכל אחת מהבארות. גזור חריץ קטן בפינה השמאלית העליונה של המכשיר כדי לציין כמה פעמים נעשה בו שימוש/שימוש חוזר (ראה סעיף 15 להלן לקבלת הוראות והמלצות לניקוי ושימוש חוזר בכל מכשיר).
  4. הכניסו עד שלושה מכשירים לא עטופים לשואב הפלזמה כשהבארות פונות כלפי מעלה. הפעל את שואב הפלזמה.
    הערה: ההוראות המפורטות הבאות מיועדות לשואב הפלזמה Plasma Etch PE-50. יש להתאים את השלבים וההגדרות הספציפיים ואולי למטב אותם מחדש עבור שואבי פלזמה אחרים.
    1. בדקו שרמת ההספק של שואב הפלזמה מוגדרת ל-75%.
    2. ודא ששסתומי האוורור והבידוד נמצאים שניהם במצב OFF .
    3. פתח את השסתום הראשי במיכל החמצן. המתן עד שלחץ הרגולטור ירד למצב שבין 15 psig ל- 20 psig, ולאחר מכן סובב את שסתום הבידוד למצב ON .
    4. הפעל את משאבת הוואקום ואת שואב הפלזמה.
    5. הזן את ההגדרות הבאות בשואב הפלזמה (שימוש ראשון), או ודא שההגדרות שתוכנתו בעבר נכונות:
      זמן פלזמה: 3:00 דקות
      ואקום נקודת הגדרה: 149.5 mTorr
      פתח אוורור אטמוספרי: 45 שניות
      פתח טיהור: 5 שניות
      ייצוב גז: 15 שניות
      אזעקת ואקום: 3:00 דקות
      כיבוי אוטומטי: מופעל
    6. הקש Enter כדי לעבור לתפריט פקודות. השתמש במקש חץ ימינה כדי לבחור בתפריט הגדרות ולאחר מכן הקש Enter. גלול בין כל ההגדרות על-ידי הקשה על Enter כדי לאשר כל הגדרה נוכחית ולאחר מכן על החץ ימינה כדי לעבור להגדרה הבאה.
    7. חזור לתפריט פקודות על-ידי הקשה על החץ למעלה ולאחר מכן על החץ שמאלה.
    8. במסך תפריט פקודות , הקש Enter. בחר פקודות PLASMA על-ידי הקשה על Enter. המערכת תעבור את השלבים הבאים:
      שאיבת פלזמה
      ייצוב גז: במהלך שלב זה, כוונן את ידית גז 1 בשואב הפלזמה עד שמד הזרימה יגיע ל-10 סמ"ק/דקה.
      זמן פלזמה
      טיהור שאיבה
      מחזור פלזמה הושלם
      פתח אוורור קאמרי
      הערה: תהליך זה אמור להימשך כ-5-10 דקות. לאחר השלמת כל השלבים, תפריט הפקודות מוצג שוב על המסך. אם במהלך שלב שאיבת הפלזמה, הלחץ אינו נמוך מספיק, שואב הפלזמה לא ימשיך לשלב הבא, והמסך יציג הודעת שגיאה. אם זה קורה, בדוק את שמן משאבת הוואקום. אם רמות השמן נמוכות או שהשמן עכור/מלוכלך, החלפת השמן יכולה לאפשר ללחץ הוואקום להגיע לרמה הדרושה.
    9. כבה את השסתום הראשי במיכל החמצן.
    10. לאט מאוד, סובב את שסתום האוורור למצב ON , ואפשר ללחץ הוויסות של מיכל החמצן לחזור לאפס.
    11. סובב את שסתום הבידוד למצב OFF .
    12. כבו את משאבת הוואקום ואת שואב הפלזמה.
      הערה: שינוי פני השטח ההידרופיליים של המכשיר הרב-באר על ידי מנקה הפלזמה הוא זמני והופך בהדרגה פחות יעיל עם הזמן (עד כשעתיים). המשך דרך סעיף 6 וסעיף 7 במהירות האפשרית.

6. מילוי הבארות עם lmNGM

הערה: אינקובטור אמבטיה חרוזים יבשים צריך להיות דולק ומחומם מראש משלב 5.1. ודא כי האמבטיה הגיעה 90 ° C.

  1. יש לעקר מגש פוליסטירן אחד בכל מכשיר על ידי ריסוס החלק הפנימי של המגש באתנול 70% וניגוב יבש במגבון משימה.
  2. הסר כל מכשיר ממנקה הפלזמה ביד כפפה, והנח אותו במגש ניקוי.
  3. מניחים אגן פיפטה חד פעמי של 25 מ"ל באינקובטור אמבט החרוזים לאחר חימומו ל -90 מעלות צלזיוס.
  4. יש לאסוף שפופרת אחת של תערובת קדם-יבשתית של lmNGM מוצק לכל מכשיר למילוי (ראה שלב 1.3).
  5. הניחו את המבחנות המקדימות לתערובת lmNGM בכד זכוכית בנפח 200 מ"ל, והסירו את הפקקים ואת הפרפילם. מיקרוגל במשך ~ 20 s עד שהמדיה נמסה מספיק כדי לשפוך (נוכחות של כמה מדיה מוצקה היא בסדר בשלב זה).
  6. ערבבו את התערובת המוקדמת של lmNGM מותך ממבחנות מרובות לכוס סטרילית נוספת של 200 מ"ל. המשיכו במיקרו במשך 20 שניות נוספות כדי להגיע לסך של 40 שניות. אם קדם-התערובת lmNGM מתחילה לרתוח, עצרו את המיקרוגל ואפשרו לתערובת הקדם-ל-lmNGM לשקוע לפני שתמשיכו.
  7. הסר את התערובת המותכת lmNGM מראש מהמיקרוגל, ואפשר לה להתקרר ל~ 60 ° C.
    הערה: בשלב זה, המדיה תתקרר ותתמצק מחדש לאחר ~5 דקות. המשך מיד לשלב 6.8 ולשלב 6.9.
  8. עבור כל 10 מ"ל של lmNGM מראש תערובת, להוסיף את הדברים הבאים (לפי הסדר): 250 μL של 1 M KPi, 10 μL של 1 M MgSO4, 10 μL של 1 M CaCl2, ו 10 μL של 5 מ"ג / מ"ל כולסטרול.
    1. כדי למנוע בקיעת ביצים בעת ניטור מבוגרים על המכשיר, להוסיף 10 μL של 50 mM floxuridine.
    2. כדי לבחור פלסמיד RNAi וכדי לגרום לביטוי של RNA, הוסף 5 μL של 50 מ"ג / מ"ל carbenicillin ו 12 μL של 1 mM IPTG.
      הערה: ניתן לשנות את האנטיביוטיקה או תוספים אחרים בהתאם לתכנון הניסוי. בשלב זה ניתן להוסיף גם תרכובות/תרופות לתקשורת.
  9. יוצקים את lmNGM מותך לתוך אגן 25 מ"ל באמבט חרוזים.
  10. מלא את בארות המכשיר עם lmNGM באמצעות פיפטה משחזר רב ערוצי 200 μL.
    1. הגדר את המשחזר לחלק aliquots של 14 μL (14 μL ניתן לחלק עד 14 פעמים אם באמצעות קצה פיפטה 200 μL).
    2. הר חמישה קצוות פיפטה. לבארות המכשיר יש מרווח זהה לזה של צלחת 384 בארות. פיפטות רב-ערוציות סטנדרטיות מרווחות, כך שהמשתמש יכול לבצע פיפטות לכל באר אחרת בשורה/עמודה.
    3. טען את הקצוות עם lmNGM מותך. שחררו את 14 μL הראשונים בחזרה לאגן המכיל lmNGM.
    4. אם תנועו במהירות אך בזהירות, שחררו 14 מיקרוליטר לתוך הבארות הפנימיות (לבן באיור 1B), התחילו מאלה המסומנות ב-"x" באיור 1B ונעו על פני הלוח ימינה ואז למטה, וחילקו בסך הכל 12 פעמים (60 בארות).
    5. הוציאו את ה-lmNGM הנותר בחזרה לאגן, מכיוון שהאליקוט הסופי הוא בדרך כלל פחות מ-14 μL.
    6. חזור על שלבים 6.10.3-6.10.5 עד שכל הבארות הפנימיות יתמלאו.
    7. לאחר מכן, הגדירו את המשחזר לחלק אליציטוטים של 15 μL. חזרו על שלבים 6.10.3-6.10.5, אך במקום הבארות הפנימיות, מלאו את הטבעת החיצונית ביותר של הבארות (אפור באיור 1B), החל מהבארות המסומנות ב-"+" באיור 1B ונעות סביב הקצה החיצוני של הצלחת.
      הערה: עבוד במהירות כדי שהמדיה לא תתמצק בקצות הפיפטה. הימנע משפיכת lmNGM לתוך החפיר. הבארות החיצוניות נוטות להתייבש מהר יותר. תוספת של 1 μL של lmNGM מאפשרת לבאר המיובשת הסופית לקבל משטח ישר באותו זמן ייבוש כמו הבארות הפנימיות.
  11. כשלב בקרת איכות, בדקו כל באר כדי לזהות את אלה עם פגמים שעלולים להפריע להדמיה, כולל בארות שאינן מלאות מספיק (פני השטח של lmNGM שקועים מתחת לקצה הבאר), מלאות יתר על המידה (למשטח lmNGM יש ראש כיפה) ומכילות בועות או פסולת.
  12. הסר את lmNGM מוצק מן הבארות לא משביע רצון עם פיק חוט פלטינה קצר או שואב ואקום. מלאו מחדש את הבארות הריקות ב- lmNGM מותך טרי. כמו כן, הסר כל מדיה שגלשה לתוך החפיר עם פיק חוט פלטינה קצר או שואב ואקום.

7. הוספת נחושת גופרתית לחפיר

הערה: הבארות של מכשיר זה מוקפות בחפיר רציף. כאן, החפיר מלא נחושת גופרתית, אשר פועל כמו דוחה ומרתיע את התולעים לברוח מן הבארות שלהם.

  1. באמצעות פיפטה של 200 μL, יש לפזר 200 μL של תמיסת נחושת גופרתית (ראה שלב 1.6) לתוך חפיר המכשיר בכל פינה, פי 2 לכל פינה. זה צריך להיות נפח גדול מספיק עבור נחושת גופרתית לזרום דרך החפיר כולו. היזהר לא למלא את החפיר יתר על המידה בשום שלב; נחושת גופרתית לא צריך לגעת במשטח העליון של הבארות.
  2. אם הנחושת הגופרתית אינה זורמת בקלות דרך החפיר כולו, השתמש בחוט פלטינה קצר כדי לעזור לשבור את המתח ולגרור את גופרתי הנחושת דרך החפיר.
  3. לאחר שהנחושת גופרתית זרמה דרך כל החפיר, הסר כמה שיותר נחושת גופרתית מהחפיר באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר או שאיפה עם ואקום. השאריות שיישארו מאחור יספיקו כדי להרתיע את התולעים מלעזוב את הבארות שלהן. השארת החפיר מלא בתמיסת נחושת גופרתית מסתכנת בשפיכת נחושת גופרתית לבארות, מה שיגרום לתולעים לברוח.

8. הוספת גבישי מים אוטוקלאביים

הערה: כדי לשמור על לחות בתוך הצלחת ולמנוע התייבשות של lmNGM, כל מכשיר מוקף גבישי פוליאקרילאמיד סופגי מים רוויים.

  1. הכינו את גבישי המים (ראו שלב 1.7).
  2. באמצעות בקבוק לחיצה, מוסיפים את גבישי המים ברווחים שבין המכשיר לדפנות המגש. סגרו את מכסה המגש ועטפו את כל ארבעת הצדדים בחתיכת פרפילם. מוסיפים שתי חתיכות נוספות של פרפילם כדי לאטום לחלוטין את הצלחת.
    הערה: גבישי מים ניתן להכין בכוס ולגרוף לתוך המגש עם מרית מעוקרת. עם זאת, זה מוסיף זמן להליך ומגדיל את הזמן שכל מגש פתוח וחשוף למזהמים פוטנציאליים.
  3. השאירו את המכשיר האטום על הספסל עד למחרת, כאשר החיידקים מוכנים לזיהוי. ודא שהמכשירים מאוחסנים כשהבארות פונות כלפי מעלה לאחר הוספת lmNGM.

9. הכנת אוכלוסיית תולעים מסונכרנת גיל

הערה: השלבים הבאים מניבים אוכלוסייה מסונכרנת של תולעים המוכנות להוסיף למכשיר מרובה בארות בשלב הזחל הרביעי (L4). עם זאת, תולעים בשלבים שונים של התפתחות ניתן להוסיף גם. שלב זה צריך להסתיים 2 ימים לפני הוספת התולעים למכשיר אם L4s רצויים. התאם את תזמון הסנכרון לשלב החיים הרצוי.

  1. למחקרי הזדקנות עקביים, יש לשמור על C. elegans על לוחות NGM סטנדרטיים (ראו שלב 1.2 בטמפרטורה של 20°C בתנאי תזונה טובה).
  2. להשיג אוכלוסייה מסונכרנת של בעלי חיים מצלחת מלאי באמצעות שיטות סטנדרטיות, למשל, הלבנה17 או הטלת ביצים מתוזמנת1.
  3. הוסיפו ביצים מבודדות לצלחת NGM המזוהה עם חיידקים. הביצים יבקעו על צלחת זו, והתולעים יגיעו לשלב הזחל L4 תוך יומיים עבור חיות בר.

10. חיסון תרבית החיידקים

הערה: חיידקים משמשים כמקור המזון העיקרי עבור C. elegans, לרוב זני E. coli OP50 או HT115. החיידקים מרוכזים פי 10, אשר צריך להיות אחראי על נפח של התרבות מוכנה. הכינו תרבית חיידקים יום לפני איתור המכשיר.

  1. מתוך צלחת LB מוכן בשלב 4, לבחור מושבה אחת, ולחסן 12 מ"ל של LB סטרילי לכל מכשיר כדי להיות מזוהה. כלול חומרים סלקטיביים במידת הצורך עבור זן החיידקים בשימוש.
  2. לגדל את תרבית החיידקים לילה (~ 18 שעות) באינקובטור 37 מעלות צלזיוס עם רעד ב~ 250 סל"ד.

11. איתור הבארות בחיידקים מרוכזים

הערה: נפח קטן של חיידקים מרוכזים מתווסף לכל באר, וזה מספיק כדי להזין את התולעים במשך כל תוחלת החיים שלהם על המכשיר. יש לייבש את תרבית החיידקים לפני שניתן יהיה להוסיף את התולעים לבארות. מכיוון שנפח המדיה בכל באר קטן (14-15 מיקרוליטר) ביחס לנפח החיידקים שנוסף (5 מיקרוליטר), התוכן הכימי של מצע החיידקים יכול להשפיע על הסביבה הכימית של הבאר. כדי להסביר זאת, החיידקים מרוכזים ומרחפים מחדש במי מלח כדי להסיר LB מדולדל תוך הימנעות מלחץ היפואוסמוטי. אין תוספת מלח למתכון lmNGM (ראה שלבים 1.3-1.4) כפי שהוא הוסיף בשלב זה.

  1. לאחר גידול החיידקים במשך הלילה כמתואר בסעיף 10, רכז את תרבית החיידקים פי 10. גלול את החיידקים על ידי צנטריפוגה ב~ 3,400 x גרם במשך 20 דקות, להיפטר supernatant, ולהשהות מחדש את הגלולה ב 1/10 של נפח התרבית המקורי של 142.8 mM NaCl (ראה שלב 1.4). לדוגמה, כדי לזהות מכשיר אחד של 240 בארות, ספין למטה 12 מ"ל של תרבית והשהה מחדש ב 1.2 מ"ל של 142.8 מילימטר NaCl.
    הערה: ניתן להוסיף תרכובות/תרופות בדיקה לתרבית החיידקים המושהה מחדש לפני האיתור.
  2. באמצעות פיפטה חוזרת, לאתר כל באר עם 5 μL של חיידקים מרוכזים. הימנע ממגע ישיר עם פני השטח של lmNGM, מכיוון שקצה הפיפטה יכול לחדור את lmNGM ולאפשר לתולעת להתחפר מתחת לפני השטח של הבאר. היזהרו לא לתת לחיידקים להישפך לתוך החפיר כי התולעים יימשכו אליו ויברחו לתוך החפיר.
  3. יבשו את החיידקים המנומרים עם הסרת מכסי המגש. שלב זה חשוב לשלמות ארוכת הטווח של סביבת הבאר, ויש מגוון דרכים לייבש את המכשירים המנומרים. לא משנה באיזו שיטה משתמשים, ודא שהמכשיר נשאר בסביבה סטרילית, מכיוון שהוא צריך לשבת חשוף בזמן שהחיידקים מתייבשים. זרימת אוויר מוגברת מפחיתה מאוד את זמן הייבוש. ניתן לבצע ייבוש כמתואר בשלבים הבאים:
    1. השאירו את המכשיר חשוף בכלי נקי ואטום, כגון פח פלסטיק שנוקה עם 10% אקונומיקה, ולאחר מכן 70% אתנול. שיטה זו של ייבוש יכול לקחת כמה שעות.
    2. הניחו את המכשירים ללא כיסוי במכסה מנוע סטרילי של זרימה למינרית (בדומה לשיטה המועדפת להלן).
    3. יבש את המכשירים באמצעות "קופסת ייבוש" מותאמת אישית (השיטה הממוטבת שננקטה במחקר זה), שניתן לבנות בעלות מינימלית באמצעות מאווררי מארז מחשב ומסנני HEPA (ראה קובץ משלים 1).
      הערה: ללא קשר לשיטה שבה נעשה שימוש, שלב הייבוש חייב להיות מותאם לסביבה המקומית. עקוב לעתים קרובות אחר מהירות ייבוש הבארות עד לזיהוי זמן הייבוש האופייני. בסביבת לחות נמוכה, השימוש בקופסת ייבוש גורם לזמן ייבוש של ~30-40 דקות. אל תתנו לצלחות להתייבש מדי, מכיוון שהמדיה בבארות תתכווץ ותשקע. עדיף להסיר את המכשיר מייבוש כאשר כמה בארות עדיין רטובות מאשר לתת לו להתייבש זמן רב יותר ואולי לייבש יתר על המידה מספר רב של בארות.
  4. בדוק את גבישי המים. אם רוב גבישי המים במגש התייבשו ואיבדו נפח בתהליך הייבוש, הוסיפו עוד למגש.
  5. לאחר שהחיידקים יבשים, מוסיפים מיד את התולעים (סעיף 12) או אוטמים את המגש לשימוש מאוחר יותר. כדי לאטום, סגור את מכסה המגש ועטוף את כל ארבעת הצדדים בחתיכה אחת של Parafilm. חזור על הפעולה פעמיים לקבלת שלוש שכבות פרפילם בסך הכל. לאחר עטיפת המגש לחלוטין, ניתן להשאיר את המכשיר על הספסל בטמפרטורת החדר עד 4 ימים לפני הוספת התולעים (סעיף 12).

12. הוספת תולעים למכשיר מרובה בארות

  1. הוסיפו ידנית תולעת אחת לכל באר לכל באר באמצעות פיק פלטינה כדי להעביר את בעלי החיים מצלחות התולעים שהוכנו בסעיף 9. בחרו רק תולעים שנמצאות בשלב החיים והגיל הרצויים.
    הערה: הוספת התולעים למכשיר למשך יותר משעה עלולה לגרום להתייבשות lmNGM, ולכן יש להוסיף את התולעים במהירות האפשרית. בחירת תולעים מרובות (20+) בכל פעם לפני הוספתן לבארות המכשיר יכולה לעזור להגביר את המהירות.

13. סיום הכנת המכשיר לשימוש ארוך טווח

הערה: שלבים אלה מבטיחים שבארות המכשיר יישארו רוויות מים למשך הניסוי.

  1. בחנו את גבישי המים. ודא שגבישי המים ישרים עם החלק העליון של המכשיר אך לא עולים על גדותיהם. במידת הצורך, הוסיפו גבישי מים נוספים למגש.
  2. הוסיפו טיפה של תמיסת חומרי ניקוי מוכנה (ראו שלב 1.5) לחלק הפנימי של מכסה המגש, ושפשפו עם מגבון משימה עד שתמיסת חומרי הניקוי תתייבש. פעולה זו מונעת ערפול על המכסה לאחר שהמכשיר אטום בתוך המגש, כך שהתולעים נראות בבירור.
  3. עטפו את המגש בשלוש חתיכות של Parafilm בטכניקה ספציפית המקדמת את שלמותו ארוכת הטווח של חותם Parafilm.
    1. מותחים מעט חתיכת Parafilm כך שהיא מכסה רק שני צדדים של המגש. חזור על כך עם חתיכה שנייה של Parafilm כדי לכסות את שני הצדדים האחרים.
    2. שכבות על גבי השכבה הראשונה של Parafilm, לקחת חתיכה אחרונה של Parafilm, למתוח אותו במלואו, ולעטוף את כל ארבעת הצדדים. אם אטום כראוי, בארות המכשיר צריך להישאר hydrated במשך ~ 2 חודשים.
      הערה: יש לפקח על שלמות הפרפילם כל 1-2 שבועות, ולהחליף את הפרפילם אם הוא שבור.
  4. הסירו את טביעות האצבע מראש המגש באמצעות מגבון משימה שהורטב באתנול 70%.

14. איסוף הנתונים

הערה: מטרת מחקר זה היא לתאר את מתודולוגיית התרבות. לאחר אכלוס, התקנים מרובי בארות תואמים ניטור אורך של מגוון רחב של פנוטיפים. כאן ניתנת הדרכה בסיסית למדידת כמה מהפרמטרים הנפוצים ביותר.

  1. תוחלת חיים: עקוב אחר תוחלת החיים על ידי הקשה על הצלחת או חשיפת התולעים לאור כחול בהיר כל 1-3 ימים. ציון כמת אם לא נצפתה תנועה. התקנים מרובי בארות אלה תואמים גם לצינורות הדמיה וניתוח אוטומטיים להערכת תוחלת חיים13,18.
  2. פעילות: עקוב אחר הפעילות של בעלי חיים בודדים לאורך החיים על ידי צילום תמונות סטטיות או סרטונים של בעלי החיים בבארות המכשיר והערכת המרחק שעבר, המהירות או מדדי תנועה אחרים. המכשירים תואמים גם לצינורות הדמיה וניתוח אוטומטיים להערכת פעילות13,18.
  3. גודל הגוף וצורתו: עקוב אחר השינויים בגודל הגוף וצורתו על ידי צילום תמונות סטטיות של בעלי החיים בבארות המכשיר וכימות הפרמטרים החזותיים באמצעות טכניקות הדמיה סטנדרטיות. באופן עקרוני, שיטת תרבית זו צריכה להיות תואמת לתוכנה קיימת להערכה מתוחכמת יותר של צורת גוף התולעת 19,20,21.

15. שימוש חוזר במכשירים

הערה: לאחר השלמת הניסוי, ניתן לנקות את המכשירים מרובי הקידוחים ולעשות בהם שימוש חוזר עד שלוש פעמים. שימוש חוזר נוסף מתחיל להשפיע על הפנוטיפים של התולעים, אולי בגלל כימיקלים מהמדיה או חיידקים שהצטברו בדפנות חומר ה-PDMS.

  1. מחק את Parafilm והסר את ההתקן מהמגש. בדוק את החריצים בפינה השמאלית העליונה של המכשיר, המציינים כמה פעמים נעשה בו שימוש. אם נעשה בו שימוש שלוש פעמים, מחק את ההתקן. אם נעשה בו שימוש פחות משלוש פעמים, נקו אותו ועשו בו שימוש חוזר.
    הערה: המגשים עשויים מפוליסטירן ואינם באים במגע ישיר עם lmNGM, חיידקים או תוספים כלשהם למדיה. ניתן לעשות בהם שימוש חוזר פעמים רבות כל עוד הם נשארים ברורים מבחינה חזותית.
  2. שטפו את שאריות גבישי המים מהמגש. רססו את החלק הפנימי של המגש בתמיסת אקונומיקה 10%, והניחו לו לשבת למשך 10 דקות. יש לשטוף במים נטולי יונים, ולייבש מיד כדי למנוע כתמי מים.
  3. החזק את המכשיר תחת מים זורמים כדי להתחיל לנקות את המדיה מהבארות. כופפו וסובבו בעדינות את המכשיר מתחת למים כדי לעזור לשחרר את המדיה מהבארות, אך אל תתכופפו עד כדי כך שהמכשיר נקרע. בחר את כל המדיה שנותרה תקועה בבארות עם קצה פיפטה 200 μL.
  4. ממלאים 2 ליטר במוט ערבוב ~ 3/4 מלא במים נטולי יונים, ומביאים לרתיחה על צלחת חמה.
  5. מוסיפים מכשיר אחד או שניים מרובי בארות ומערבבים למים הרותחים. הפעל את הערבוב המגנטי למהירות נמוכה (~ 200 סל"ד) כדי לעורר בעדינות את המכשירים במים. אפשר למכשירים להרתיח במשך 10 דקות.
  6. הוציאו את המכשירים מהמים עם פינצטה מתכתית, והניחו אותם היטב בצד על מגבות נייר לניקוז. אפשרו למכשירים להתייבש לפחות למשך הלילה.
  7. כאשר המכשירים יבשים לחלוטין, לעטוף אותם בנייר כסף, ולאטום אותם עם סרט autoclave. כתוב על קלטת autoclave את מספר הפעמים המכשיר היה בשימוש. Autoclave על מחזור יבש במשך 15 דקות ב 121 ° C כדי לעקר. המכשירים מוכנים כעת לשימוש חוזר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתן להשתמש במערכת התרבות של WorMotel כדי לאסוף מגוון נתונים, כולל לגבי תוחלת חיים, תוחלת חיים ופעילות. מחקרים שפורסמו השתמשו במכשירים מרובי בארות כדי לחקור את תוחלת החיים ותוחלת הבריאות 13,14, שקט ושינה 22,23,24 והתנהגות 25. ניתן לדרג את תוחלת החיים באופן ידני או באמצעות אוסף תמונות וניתוח הדמיה במורד הזרם. בגישה הראשונה, ניתן לצפות בתולעים באופן ידני בעקבות גירוי (למשל, הקשה על הצלחת או חשיפה לאור כחול) כל 1-3 ימים ולתת להן ציון כמתות אם לא נצפתה תנועה, בדומה לשיטות סטנדרטיות על לוחות פטרי1. הגישה השנייה דומה, אלא שניתן לקבוע את תנועת התולעת על ידי השוואת הבדלי מסגרת למסגרת בין התמונות שצולמו לאחר הפעלת הגירוי. זה מספק יתרון נוסף בכך שתנועה מספקת מידע הן על רמת הפעילות של בעלי חיים בודדים באותה נקודת זמן והן מספקת מדד שלפיו ניתן לקבוע את תוחלת החיים (למשל, הפסקת תנועה) ואת תוחלת הבריאות (הוצעו הגדרות מרובות). ניתן להשתמש בתמונות גם כדי לחלץ פרמטרים פיזיולוגיים נוספים כגון גודל גוף, צורת גוף ותנוחת גוף.

כדי להדגים את יכולת המערכת, בחנו את הקשר האפיסטאטי הקלאסי בין קולטן האינסולין, המקודד על ידי הגן daf-2, לבין גורם השעתוק של משפחת FOXO במורד הזרם המקודד על ידי daf-16 בהקשר של תוחלת חיים, תוחלת בריאות ופעילות יומיומית של בעלי חיים בודדים. סוג פראי (זן N2) ו-daf-16(mu68) אובדן תפקוד (זן CF1038) C. elegans ניזון מ-E. coli (זן HT115) המבטא את אחת משתי הבקרה (וקטור ריק; EV) או מבני ההזנה של דנ"א DAF-2 גודלו בתרבית במכשירים מרובי בארות, וכל חיה נוטרה עבור תוחלת חיים (איור 2A), תוחלת בריאות (איור 2B) ופעילות יומיומית (איור 2C). הפעילות נוטרה מדי יום על ידי צילום סדרה של תמונות סטילס כל 5 שניות במשך 2 דקות, כאשר התולעים נחשפו לאור כחול בהיר במשך 5 שניות בדקה אחת כדי לעורר פעילות (לפי Churgin et al.13). הפעילות היומית של כל חיה נאמדה על ידי נרמול הרקע על פני בארות ותמונות, זיהוי אזור התולעת בכל תמונה וחישוב השינוי בשטח בין תמונות סמוכות. תוחלת החיים הוגדרה כגיל שבו נצפתה הפעילות האחרונה עבור כל תולעת, ותוחלת הבריאות הוגדרה כגיל שבו התולעת כבר לא יכלה לנוע לאורך כל גופה. כצפוי ממחקרים קודמים רבים (למשל, Kenyon et al.26, Murphy et al.27), המוטציה daf-16(mu86) הביאה לתוחלת חיים קצרה ומנעה הארכת תוחלת חיים כתוצאה מהפלת ה-RNAi של daf-2 (איור 2A). דפוס דומה נצפה עבור תוחלת הבריאות (איור 2B). כיתרון של שימוש במערכות תרבית מרובות בארות, היכולת לעקוב אחר בעלי חיים בודדים לאורך החיים מאפשרת ניתוח מפורט של השונות האינדיבידואלית בכל פנוטיפ שנמדד על פני האוכלוסייה. לדוגמה, ניתן להשוות את השונות בתוחלת החיים ובתוחלת הבריאות בין חיות בודדות במונחים מוחלטים (איור 2D) או כשבריר מתוחלת החיים הכוללת (איור 2E). ניתן להשוות פנוטיפים של חיים מוקדמים לפנוטיפים מאוחרים, כולל תוחלת חיים, בבעלי חיים בודדים על פני אוכלוסייה. לדוגמה, הפעילות המצטברת של כל חיה בודדת לאורך תוחלת החיים (כלומר, האזור שמתחת לעקומה [AUC] עבור פעילות בודדת) הייתה מתואמת טוב יותר עם תוחלת החיים (איור 2F) מאשר תוחלת החיים המצטברת עד יום 5 לחיים (איור 2G) בכל התנאים שנמדדו. נדגיש כי מטרת עבודה זו היא לספק פרוטוקול מפורט לבניית סביבה מרובת בארות למעקב אחר בעלי חיים בודדים לאורך זמן, ולא למדידת פנוטיפ ספציפי באמצעות המכשיר. התוצאות המייצגות המוצגות באיור 2 מספקות רק דוגמה אחת לפנוטיפים שניתן למדוד במערכת זו. לאחר הבנייה, הסביבה מרובת הקידוחים תואמת למגוון רחב של טכניקות למדידת הפנוטיפים של תולעים זוחלות חופשיות על מדיה מוצקה.

Figure 1
איור 1: סכמטיות של התקנים מרובי בארות מיקרו-מפוברקים . (A) דגי C. elegans בודדים מתורבתים על גבי תחבושות אגרוז מוצקות בעלות נמטודות נמוכות המסה נמוכה (lmNGM) שנזרעו עם מזון חיידקי בבארות בודדות. החלל בין הבארות מצופה בכימיקל מרתיע (נחושת גופרתית) כדי לבודד כל תולעת בתוך הבאר שלה. כל מכשיר מאובטח בתוך מגש באר יחידה. היקף המגש מלא גבישי מים כדי לשמור על הלחות. המגש אטום עם Parafilm כדי לאפשר חילופי חמצן. התמונה נוצרה באמצעות BioRender.com. (ב) סקירה כללית של המכשיר הרב-באר המציין את הסדר המוצע לטעינת הבארות. הבארות הפנימיות (לבנות) מקבלות 14 μL של lmNGM. הבארות החיצוניות (אפורות) מקבלות 15 μL של lmNGM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מתאם של פנוטיפים שנמדדו בין אוכלוסיות בחיות בודדות באמצעות מכשירים מרובי בארות. כל הפאנלים מספקים נתונים מאותו ניסוי המשווים בין ארבע קבוצות של בעלי חיים: חיות מסוג בר (N2) הכפופות לווקטור ריק EV(RNAi) (N = 138), חיות בר הכפופות ל-daf-2(RNAi) (N = 151), חיות daf-16(mu86) הכפופות ל-EV(RNAi) (N = 123), וחיות daf-16(mu86) הכפופות ל-daf-2(RNAi) (N = 135). (A) הארכת תוחלת החיים מ-daf-2(RNAi) חסומה על-ידי מוטציית האפס daf-16(mu86). מובהקות זוגית בין קבוצות שנקבעה על ידי מבחן log-rank (פונקציית survdiff ב-R). (B) תוחלת הבריאות המוגדרת כאן כיום שבו בעל חיים אינו יכול עוד להזיז הארכת אורך גוף מלאה מ-daf-2(RNAi) נחסמה על ידי מוטציית האפס daf-16(mu86). מובהקות זוגית בין קבוצות שנקבעה על ידי מבחן log-rank (פונקציית survdiff ב-R). (C) ממוצע הפעילות המתגלגל של 3 ימים לאורך תוחלת החיים מופחת הן על-ידי daf-16(mu86) והן על-ידי daf-2(RNAi). מובהקות שחושבה על ידי מבחן Mann-Whitney U להשוואת השטח מתחת לעקומה לפעילות לאורך תוחלת החיים של בעלי חיים בודדים בין קבוצות. (D) תוחלת הבריאות ותוחלת החיים של כל אוכלוסייה כערכים מוחלטים (ממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע). (E) תוחלת הבריאות ותוחלת החיים של כל אוכלוסייה מנורמלת לתוחלת החיים הכוללת בכל קבוצה (ממוצע ± טעות תקן של הממוצע). (F) הפעילות המצטברת לאורך תוחלת החיים (השטח מתחת לעקומה [AUC] לאורך תוחלת החיים) עבור בעלי חיים בודדים מתואמת טוב יותר עם תוחלת החיים מאשר (G) הפעילות עבור בעלי חיים בודדים בכל יום ספציפי לאורך תוחלת החיים (מתאם הפעילות ביום 8, המייצג את הנקודה שבה הפעילות הממוצעת מקסימלית, מוצג), כפי שמחושב על ידי רגרסיה ליניארית (פונקציית lm ב-R). n.s. = לא משמעותי, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001. כל ערכי p הותאמו להשוואות מרובות בשיטת Bonferroni להשוואות שבוצעו בתוך כל לוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: קובץ STL להדפסת תבנית התקן רב באר תלת מימדית אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכת WorMotel היא כלי רב עוצמה לאיסוף נתונים אישיים עבור מאות C. elegans מבודדים לאורך זמן. בעקבות המחקרים הקודמים שהשתמשו במכשירים מרובי בארות ליישומים בשקט התפתחותי, התנהגות מוטורית והזדקנות, מטרת עבודה זו הייתה לייעל את ההכנה של מכשירים מרובי בארות לניטור ארוך טווח של פעילות, בריאות ותוחלת חיים באופן בתפוקה גבוהה יותר. עבודה זו מספקת פרוטוקול מפורט להכנת התקנים מרובי בארות המייעל רבים מהשלבים מפרוטוקול13 המקורי, מדגיש נקודות מפתח שעלולות להציג קשיים טכניים, ומספק דיון על שימוש חוזר בלוחות ובחומרים אחרים.

לצורך קנה מידה - כמעבדה שמכינה כיום בין 10 ל-20 מכשירים בשבוע טיפוסי - שיקול ראשון במעלה היה האם ניתן לעשות שימוש חוזר במכשירים, ואם כן, באיזו מידה. יש עלות גבוהה יותר הן מבחינת זמן והן מבחינת כסף בהכנת מכשירי PDMS ביחס להולכת תרבית מסורתית על לוחות פטרי, אך ניתן להפחית עלויות גבוהות אלה על ידי שימוש חוזר ב- PDMS או ברכיבים אחרים של המערכת. עם שימושים חוזרים רבים, PDMS החל לפתח צבע צהוב, ככל הנראה משקף הצטברות של תרכובות מן המדיה lmNGM או חיידקים. בעלי החיים שתורבתו על צלחות אלה הציגו גם שיעור בריחה גבוה יותר ותוחלת חיים קצרה יותר. בהתבסס על עשרות ניסויים, שלושה שימושים הם אופטימליים לשימוש חוזר במכשירי PDMS אלה, ומאפשרים להעריך פנוטיפים הקשורים לגיל ללא השפעה מדידה מהתפרקות PDMS תוך הפחתת מספר המכשירים החדשים שיש לעצב (ובכך לחסוך בעלויות). כמו כן, אישרנו כי בעלי חיים תואמי ניסוי שגודלו במכשירים בשימוש הראשון, השני והשלישי שלהם יצרו עקומות הישרדות שהיו כמעט בלתי ניתנות להבחנה ולא שונות סטטיסטית (הנתונים לא הוצגו). המגשים המשמשים להכלת המכשירים עשויים מפוליסטירן וניתן לנקות אותם ולעשות בהם שימוש חוזר ללא הגבלת זמן אם הם נשארים נקיים משריטות או סימנים אחרים שעלולים להפריע להדמיה של התולעים.

אתגר מרכזי להכנת התקנים מרובי בארות ליישומים שנמשכים יותר מ ~ 2 שבועות הוא מניעת זיהום צלחת על ידי חיידקים סביבתיים ופטריות. ישנם מספר שלבים בהם עיקור הוא קריטי למניעת זיהום. אלה כוללים אוטוקלאבינג של כל המכשירים לפני השימוש, הרתחת המכשירים המיועדים לשימוש חוזר, אוטוקלאבינג של גבישי המים הסופגים המשמשים לשמירה על לחות, ניקוי המגשים המכילים את המכשירים הן עם אקונומיקה והן עם אתנול לפני השימוש, וחיטוי מסנן של תמיסת חומרי הניקוי המיושמת על מכסה המגש למניעת ערפול ומתווספת לתמיסת נחושת גופרתית. יישום כל אחד מהשינויים הללו הפחית באופן משמעותי את אירועי הזיהום, ואפשר להשתמש במכשירים האטומים באופן עקבי לניטור אורכי לאורך תוחלת החיים, אפילו בתנאים תומכי אריכות ימים (למשל, נוקאאוט של DAF-2) הדורשים ניטור במשך >45 יום. הפרוטוקול המתואר כאן כולל שני שינויים לפרוטוקול המקורי עבור יישומים ארוכי טווח שנועדו לשמור על ייבוש בארות עקבי ולמנוע התייבשות. ראשית, העומק הכולל של המכשיר הוגדל ב -2 מ"מ כדי להגדיל את היכולת לגבישי מים. במהלך ניסויים ארוכים, במיוחד בסביבה עם לחות נמוכה, מעט מדי גבישי מים במגש הובילו לייבוש של lmNGM. יחד עם גבישי מים נוספים, היה צורך להגדיל את נפח האגרוז שנוסף לבארות לאורך קצה המכשיר. בארות אלה נטו להתייבש תחילה בעקבות העמסת הבאר (קטע 6) ולהתכווץ. שימוש ב-14 מיקרוליטר אגרוז על הבארות הפנימיות היה נפח מספיק כדי למלא את הבארות לחלוטין מבלי ליצור את החלק העליון הכיפה הנובע ממילוי יתר של הבארות. הוספת 15 מיקרוליטר אגרוז לבארות החיצוניות סיפקה נפח מספיק שכאשר הבארות החלו להתייבש, הן התכווצו לרמה דומה ל-14 מיקרוליטר שנוספו בבארות הפנימיות.

אחת הסטיות הגדולות ביותר מהפרוטוקול המקורי הייתה להפוך את הסדר שבו המשתמש טוען את lmNGM (סעיף 6) ונחושת גופרתית (סעיף 7). במקור, נחושת גופרתית נוספה לחפיר הראשון, ואחריו מילוי הבארות עם lmNGM13. נצפה כי מילוי הבארות ב- lmNGM בהקדם האפשרי לאחר ניקוי פלזמה שיפר את ההיצמדות של lmNGM לקירות הבאר. המתנה ארוכה מדי לאחר ניקוי הפלזמה הביאה לבארות עם בועות וצמרות כיפות, מה שיכול להפריע לדמיון התולעים. מתן עדיפות למילוי הבארות על פני הוספת נחושת גופרתית חשוב במיוחד בעת הכנת מכשירים מרובים בו זמנית כדי להבטיח משטחי lmNGM עקביים ואיכותיים. החיסרון של מילוי הבארות תחילה הוא ששינוי פני השטח ההידרופיליים המיוצר על ידי שואב הפלזמה יישחק במידה ניכרת עד שהמשתמש יעבור להוסיף את הנחושת הגופרתית. נחושת גופרתית אינה זורמת בקלות דרך החפיר כאשר פני השטח הופכים פחות הידרופיליים, ולכן קשה להשיג כיסוי מלא. הוספת חומר ניקוי לתמיסת נחושת גופרתית כדי לשמש כחומר פעילי שטח משפרת את זרימת התמיסה דרך החפיר. פיק חוט פלטינה יכול לשמש גם כדי להנחות בעדינות את הנחושת הגופרתית דרך החפיר על ידי שבירת המתח בכל נקודה שבה הנחושת גופרתית מתקשה לזרום. יתר על כן, אם תמיסת הנחושת הגופרתית הייתה נשארת בחפיר, היא הייתה נשפכת בקלות לבארות ומזהמת את פני השטח של lmNGM בעת הטיית המגש. אופי תהליך ההעמסה הופך את זה לכמעט בלתי אפשרי לשמור על המכשיר בגובה מספיק לאורך כל הדרך כדי למנוע מנחושת לזהם תת-קבוצה של הבארות. כדי להסביר זאת, תמיסת הנחושת הגופרתית מוסרת מהחפיר (שלב 7.3), ושאריות הנחושת גופרתית שנותרו מאחור מספיקות כדי להרתיע את רוב התולעים מלברוח. הערה אחרונה על השימוש בנחושת גופרתית כמחסום מרתיע, חומרים דוחים מסוימים יכולים להשפיע על פנוטיפים הקשורים לגיל, כולל תוחלת חיים. השימוש בנחושת גופרתית בהתקנים מרובי בארות אלה נבדק על ידי Churgin et al.13 ונמצא כי אין לו השפעה ניכרת על תוחלת החיים או על ההתפתחות.

עדכונים קטנים אחרים לפרוטוקול מתמקדים בשיפור הצעדים שננקטו להכנת PDMS. שלב פירוק גז נוסף לאחר ערבוב בסיס PDMS וחומר ריפוי נוסף, שכן זהו תהליך שיוצר בועות רבות. הסרת רוב הבועות לפני הוספת התערובת לתבניות המכשיר ממזערת את הבועות שנותרו לאחר שלב פירוק הגז השני. כדי להבטיח שתחתית המכשיר תהיה שטוחה לחלוטין ואחידה, תכונה חשובה להדמיית צלחת שלמה, הונחה חתיכת זכוכית או אקריליק על החלק העליון של התבנית המלאה. שלב זה אינו חיוני - אם כי עדיין מועיל - עבור יישומים הבוחנים רק באר אחת בכל פעם, מכיוון שהמשתמש יכול להתאים ידנית את המיקוד עבור כל באר. לבסוף, ריפוי PDMS בטמפרטורה גבוהה יותר (55 ° C) היה הכרחי במיקום שבו גרסה זו של הפרוטוקול היה אופטימלי (טוסון, אריזונה, ארה"ב), בניגוד 40 ° C שצוין על ידי הפרוטוקול המקורי (אופטימיזציה בפילדלפיה, פנסילבניה, ארה"ב). זה מצביע על כך שהבדלים בין מיקומים (כגון אקלים או ריאגנטים מדויקים וציוד בשימוש) יכולים להשפיע על השלבים הספציפיים בפרוטוקול, כגון טמפרטורת הריפוי או טכניקות הייבוש, וכי ייתכן שיהיה צורך לייעל אותם בכל אתר. לדוגמה, לחות סביבתית משחקת תפקיד גדול בקביעת זמן הייבוש של הצלחות לאחר האיתור, וזה יכול להשתנות מאוד בין מיקומים או עונות.

באופן עקרוני, ניתן להשתמש במערכת התקנים מרובת בארות זו כדי לאסוף נתונים על כל פנוטיפ שניתן למדוד במיקרוסקופ סטנדרטי של שדה בהיר על לוחות פטרי - תוחלת חיים, תוחלת חיים, תנועה לא מגורה/מגורה, גודל וצורת גוף, גיאומטריית תנועה - עם היכולת הנוספת לעקוב אחר מדדים אלה עבור תולעים בודדות לאורך זמן. כפי שצוין במבוא, ישנן שיטות אחרות לרכישת נתונים בודדים לאורך כל החיים. מכשירי מיקרופלואידיקה28 או לוחות מרובי בארות29 מציעים את היכולת לעקוב אחר היסטוריית החיים של בעלי חיים בודדים, אך רק על ידי גידול התולעים במדיה נוזלית. סביבה נוזלית יכולה לשנות את תעתיק התולעים 10,11,30 ביחס למדיה מוצקה וגורמת לשינויים פיזיולוגיים והתנהגותיים מובהקים, כולל שחייה אפיזודית 31, הוצאת אנרגיה מוגברת 10,32 ועקה חמצונית מוגברת 10. המידה שבה ניתן להשוות ישירות בין תוחלת החיים ומדדים אחרים הקשורים להזדקנות בריאה בין מדיה נוזלית למוצקה אינה ברורה. התקנים מרובי בארות בתרבית מוצקה מאפשרים מעקב אחר תולעת בודדת בסביבה הדומה לתרבית קבוצתית סטנדרטית על לוחות פטרי. המבנה המעוגל של דופן המכשיר מאפשר הדמיה של תולעים בכל מקום בתוך הבאר, מה שהופך מכשירים אלה לתואמים, באופן עקרוני, עם כלים מתוחכמים יותר לניתוח תולעת יחידה, כגון Worm Tracker33.

היכולת לעקוב אחר בעלי חיים בודדים במהלך ניסוי במכשיר רב בארות מלווה במספר מגבלות. ראשית, אפילו עם פרוטוקול אופטימלי, מכשירים אלה דורשים זמן רב יותר להתקנה לכל חיה מאשר תרבית סטנדרטית על לוחות פטרי, ובכך מספקים נתונים של חיה אחת במחיר גודל המדגם הכולל. עם זאת, התולעים מבודדות גם לבארות בודדות, ומסירות חלק מהסיבוכים הקשורים למדידת תוחלת חיים אוטומטית, כגון זיהוי אוטומטי של בעלי חיים בודדים שמפסיקים לזוז בזמן שהם נוגעים זה בזה. אוטומציה יותר מאשר לוכדת מחדש את הזמן שאבד להתקנה המורכבת יותר ומספקת הזדמנות לסינון בתפוקה גבוהה יותר13,18. שנית, תנאי ניסוי שהתולעים סולדות מהם יותר מחפיר הנחושת הגופרתית, כגון גורמים חזקים המעוררים עקה (למשל, פרקוואט) או הגבלה תזונתית, יובילו לכך שהתולעים יברחו מהבארות אל תוך החפיר. שלישית, בעוד שהתקני PDMS מאפשרים מיקרוסקופיה של שדה בהיר ושדה אפל, חומר ה-PDMS נוטה להיות בעל פלואורסצנטיות רקע גבוהה ולא אחידה, האחרונה ככל הנראה כתוצאה מאבק או מיקרו-חלקיקים אחרים שמוטמעים ב-PDMS במהלך היציקה, מה שמגביל את היישום שלהם במיקרוסקופ פלואורסצנטי. לבסוף, שינוי הצבע שנצפה ב-PDMS עבור מכשירים שנעשה בהם שימוש חוזר במהלך ניסויים מרובים והירידה הקשורה בתוחלת החיים והעלייה בבריחה מצביעים על כך שרכיבי המדיה וכימיקלים אחרים שנוספו חודרים ל-PDMS עם הזמן. המידה שבה זה עשוי להשפיע על פנוטיפים מזדקנים או טיפולים תרופתיים נחקרת כעת. כפי שהוזכר קודם לכן, קיימת שיטה חלופית לתרבית תולעת בודדת הדומה למכשירי PDMS מרובי בארות, אך במקום זאת משתמשת במיקרו-מגשים הזמינים מסחרית לתרבית בעלי חיים מבודדים16. מיקרו-מגשים אלה עשויים מפוליסטירן, תוך הימנעות מהבעיה הפוטנציאלית של רכיבי מדיה עלוקות, ויש להם רקע פלואורסצנטי עקבי, המאפשר הדמיה פלואורסצנטית ישירה in vivo ישירות על הצלחת. בארות המגש הזעירות מוקפות גם בחומצה פלמיטית במקום הנחושת הגופרתית המשמשת בפרוטוקול המתואר כאן, שהיא מרתיעה יותר ומפחיתה את שבריר התולעים שעוזבות את הבארות שלהן, גם במקרה של חומרים מעוררי לחץ והגבלה תזונתית. יתרונות אלה מתממשים במחיר של יעילות אריזה נמוכה יותר של הבארות, שכן המגשים הזעירים מאפשרים תרבית מקסימלית של 96 תולעים במגש אחד, בניגוד לקיבולת של 240 תולעים של מכשירי PDMS. הפרטים של התוצאה הרצויה של ניסוי ישפיעו על אילו מערכות אלה יש להשתמש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R35GM133588 ל- G.L.S., פרס Catalyst של האקדמיה הלאומית לרפואה של ארצות הברית ל- G.L.S., קרן יוזמת הטכנולוגיה והמחקר של מדינת אריזונה המנוהלת על ידי מועצת העוצרים של אריזונה, והקרן הרפואית אליסון.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.5 lb weight CAP Barbell RP-002.5
Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in) Falken Design ACRYLIC-CL-3-8/1224 Large sheet cut to smaller sizes 
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Autoclavable squeeze bottle Nalgene 2405-0500
Bacto agar BD Difco 214030
Bacto peptone Thermo Scientific 211677
Basin, 25 mL VWR 89094-664 Disposable pipette basin 
Cabinet style vacuum desiccator  SP Bel-Art F42400-4001 Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber. 
CaCl2 Acros Organics 349615000
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) N2 Wildtype strain
Carbenicillin  GoldBio C-103-25
Centrifuge Beckman 360902
Cholesterol ICN Biomedicals Inc 101380
Compressed oxygen tank Airgas UN1072
CuSO4 Fisher Chemical C493-500
Dry bead bath incubator Fisher Scientific 11-718-2
Escherichia coli OP50  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) OP50 Standard labratory food for C. elegans
Ethanol Millipore ex0276-4
Floxuridine Research Products International F10705-1.0
Hybridization oven Techne 731-0177 Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice
Incubators Shel Lab 2020 20 °C incubator for maintaining worm strains and 37 °C incubator to grow bacteria 
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) GoldBio I2481C100
K2HPO4 Fisher Chemical P288-500
KH2PO4 Fisher Chemical P286-1
Kimwipes KimTech 34155 Task wipes
LB Broth, Lennox BD Difco 240230
Low melt agarose Research Products International A20070-250.0
MgSO4 Fisher Chemical M-8900
Microwave  Sharp R-530DK
Multichannel repeat pipette, 20–200 µL LTS EDP3 Rainin 17013800 The exact model used is no longer sold, a similar model's catalog number has been provided
NaCl Fisher Bioreagents BP358-1
Nunc OmniTray Thermo Scientific 264728 Clear polystyrene trays
Parafilm M Fisher Scientific 13-374-10 Double-wide (4 in)
Petri plate, 100 mM  VWR 25384-342
Petri plate, 60 mM  Fisher Scientific FB0875713A
Plasma cleaner Plasma Etch, Inc. PE-50
PLATINUM vacuum pump JB Industries DV-142N 
PolyJet 3D printer Stratasys  Objet500 Connex3 PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)
Shaking incubator Lab-Line 3526CC
smartSpatula LevGo, Inc. 17211 Disposable spatula
Superabsorbent polymer (AgSAP Type S) M2 Polymer Technologies Type S Referred to in main text as "water crystals"
SYLGARD 184 Silicone Elastomer base The Dow Chemical Company 2065622
SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent The Dow Chemical Company 2085925
Syringe filter (0.22 µm) Nest Scientific USA Inc.  380111
Syringe, 10 mL  Fisher Scientific 14955453
TWEEN 20 Thermo Scientific J20605-AP Detergent
Vacuum pump oil VWR 54996-082
VeroBlackPlus Stratasys  RGD875 Rigid 3D printing filament
Weigh boat Thermo Scientific WB30304 Large enough for PDMS mixture volume

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  2. Xian, B., et al. WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
  3. Rahman, M., et al. NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10, 16190 (2020).
  4. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  5. Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. Liu, X., Sun, Y. 13, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 13 295-321 (2021).
  6. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  7. Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9, 14340 (2019).
  8. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
  9. Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
  10. Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
  11. Çelen, İ, Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
  12. Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
  13. Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
  14. Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
  15. Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
  16. Espejo, L., et al. Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  18. Freitas, S. Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans. University of Arizona. , Tucson, USA. Master's thesis (2021).
  19. Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape. PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).
  20. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , (2013).
  21. Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
  22. Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental. microPublication Biology. 2020, (2020).
  23. Iannacone, M. J., et al. The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans. eLife. 6, 19837 (2017).
  24. McClanahan, P. D., et al. A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress. Scientific Reports. 10, 4140 (2020).
  25. Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).
  26. Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type. Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).
  27. Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  28. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  29. Lionaki, E., Tavernarakis, N. High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).
  30. Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction. The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).
  31. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).
  32. Hartman, J. H., et al. Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity. Scientific Reports. 8, 8359 (2018).
  33. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).

Tags

פסילה גיליון 190
תרבית ארוכת טווח וניטור של <em>Caenorhabditis elegans</em> מבודדים על מדיה מוצקה במכשירים מרובי בארות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gardea, E. A., DeNicola, D.,… More

Gardea, E. A., DeNicola, D., Freitas, S., Peterson, W., Dang, H., Shuck, K., Fang-Yen, C., Sutphin, G. L. Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices. J. Vis. Exp. (190), e64681, doi:10.3791/64681 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter