Summary
هذا بروتوكول مباشر لفحص غمد أوراق الشعير باستخدام الحد الأدنى من الكواشف ومعدات المختبرات الشائعة (بما في ذلك الهاتف الذكي الأساسي). والغرض من ذلك هو تصور عملية العدوى المبكرة لمرض الانفجار في المختبرات دون الوصول إلى معدات الفحص المجهري المتقدمة.
Abstract
إن فهم كيفية تفاعل النباتات ومسببات الأمراض ، وما إذا كان هذا التفاعل يبلغ ذروته في الدفاع أو المرض ، مطلوب لتطوير استراتيجيات أقوى وأكثر استدامة لصحة النبات. وقد أسفر التقدم في الأساليب التي تصور عينات مسببات الأمراض النباتية بشكل أكثر فعالية أثناء العدوى والاستعمار عن أدوات مثل فحص غمد أوراق الأرز ، والذي كان مفيدا في مراقبة العدوى وأحداث الاستعمار المبكرة بين الأرز والممرض الفطري ، Magnaporthe oryzae. يتسبب هذا العامل الممرض الحيوي النصفي في فقدان المرض الشديد في الأرز وأحاديات الفلقة ذات الصلة ، بما في ذلك الدخن والجاودار والشعير ، ومؤخرا القمح. عند إجراء فحص غمد الأوراق بشكل صحيح ، ينتج قسما نباتيا واضحا بصريا ، بسمك عدة طبقات ، مما يسمح للباحثين بإجراء تصوير الخلايا الحية أثناء هجوم العامل الممرض أو إنشاء عينات ثابتة ملطخة بميزات محددة. وقد تخلفت التحقيقات الخلوية التفصيلية في تفاعل الشعير و M. oryzae عن تلك الخاصة بمضيف الأرز ، على الرغم من الأهمية المتزايدة لهذه الحبوب كمصدر غذائي للحيوانات والبشر وكمشروبات مخمرة. تم الإبلاغ هنا عن تطوير مقايسة غمد أوراق الشعير لإجراء دراسات معقدة لتفاعلات M. oryzae خلال أول 48 ساعة بعد التلقيح. مقايسة غمد الأوراق ، بغض النظر عن الأنواع التي تتم دراستها ، حساسة ؛ يوجد بروتوكول يغطي كل شيء ، من ظروف نمو الشعير والحصول على غمد الأوراق ، إلى التلقيح والحضانة وتصوير العامل الممرض على أوراق النبات. يمكن تحسين هذا البروتوكول للفحص عالي الإنتاجية باستخدام شيء بسيط مثل الهاتف الذكي لأغراض التصوير.
Introduction
Magnaporthe oryzae ، فطر انفجار الأرز ، يصيب مجموعة متنوعة من محاصيل الحبوب ، بما في ذلك الشعير والقمح والأرز1. يسبب هذا العامل الممرض أمراضا مدمرة ويشكل تهديدا عالميا لهذه المحاصيل القيمة ، مما يتسبب في خسارة كاملة للمحاصيل إذا لم تتم السيطرة عليها. تركز العديد من المختبرات حول العالم على مرض انفجار الأرز بسبب تهديده العالمي وسماته كنموذج ممتاز للتفاعلات الفطرية النباتية2. لقد تم تسلسله بالكامل ، وتم تحديد علم الوراثة لدورته المعدية ، وخاصة الأحداث المبكرة ، 3,4. تبدأ دورة الحياة ببوغ ينبت على سطح الورقة ، مكونا بنية اختراق متخصصة تسمى appressorium. يخترق appressorium أنسجة الأوراق ، وتستمر العدوى مع تطور الآفات التي تبدأ عملية التبويض وانتشار المرض4. إن منع أي من هذه الأحداث المبكرة من شأنه أن يمنع هذا المرض المدمر بشكل كبير. وبالتالي ، ركزت معظم الأبحاث الحالية حول مرض الانفجار على خطوات العدوى المبكرة ، من الكونيديا النابتة التي تشكل مادة مضغوطة إلى تطوير الخيوط الغازية والمركب البيني الحيوي (BIC) 5.
وقد أجريت الكم الهائل من البحوث حول مرض الانفجار في الأرز، على الرغم من أن M. oryzae هو ممرض كبير لمجموعة متنوعة من المحاصيل، والسلالات المتطورة حديثا تظهر كتهديد عالمي للقمح6. في حين أن الأرز هو واحد من المحاصيل الأساسية الثلاثة الأولى المستخدمة لإطعام السكان ، إلى جانب القمح والذرة ، فإن الشعير هو رابع حبوب الحبوب من حيث علف الماشية وإنتاج البيرة7. مع نمو صناعة البيرة الحرفية ، تنمو القيمة الاقتصادية للشعير. هناك مزايا واضحة لاستخدام M. oryzae والشعير كنظام مرضي لدراسة مرض الأرومة. أولا ، هناك سلالات من M. oryzae تصيب الشعير فقط ، وكذلك السلالات التي يمكن أن تصيب أنواع العشب المتعددة. على سبيل المثال ، يصيب 4091-5-8 الشعير فقط في المقام الأول ، بينما يمكن أن يصيب Guy11 و 70-15 كلا من الشعير والأرز8. هذه السلالات متشابهة وراثيا ، وعملية العدوى قابلة للمقارنة9. ثانيا ، في ظل ظروف المختبر والدفيئة القياسية ، يكون نمو الشعير أسهل ، لأنه لا يحتوي على المتطلبات المعقدة للأرز (التحكم الموجز في درجة الحرارة ، الرطوبة العالية ، أطياف الضوء المحددة). هناك أيضا تحديات تصوير مع الأرز بسبب الكارهة للماء لسطح الورقة ، والذي لا يظهره الشعير10.
يقدم هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل أغلفة أوراق الشعير واستخدامها بفعالية للتحليل المجهري لمراحل العدوى المتعددة ، باستخدام لوازم المختبرات الشائعة وهاتف ذكي لجمع البيانات. هذه الطريقة لفحص غمد أوراق الشعير قابلة للتكيف مع المختبرات في جميع أنحاء العالم لأنها تتطلب الحد الأدنى من الإمدادات ، ومع ذلك توفر صورة واضحة للتفاعل المجهري بين العامل الممرض والخلايا القليلة الأولى التي يصيبها. في حين أن مقايسات الإمراضية ، مثل التلقيح بالرش أو القطيرات ، يمكن أن توفر رؤية كلية لقدرة العامل الممرض على تكوين الآفات ، فإن هذا الفحص يسمح للباحث بتصور خطوات محددة للعدوى المبكرة ، من أحداث ما قبل الاختراق إلى استعمار خلايا البشرة. علاوة على ذلك ، يمكن للباحثين بسهولة مقارنة العدوى بالفطريات البرية بالعدوى بطفرة منخفضة في الفوعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد المواد التجريبية
- تحضير أجار الشوفان (OMA) عن طريق مزج دقيق الشوفان حتى يصبح مسحوقا ناعما. أضف 25 جم من مسحوق الشوفان و 15 جم من أجار إلى 500 مل من ddH2O ، والأوتوكلاف في دورة الوسائط (بدلا من ذلك يغلى المزيج لمدة 20 دقيقة). صب الوسائط في أطباق بتري معقمة 60 مم.
ملاحظة: أنواع الوسائط الأخرى التي تحفز التبويض ، مثل V8 agar ، مقبولة لهذا البروتوكول. - مخزون مرشح اللوحة M. oryzae مباشرة على ألواح OMA باستخدام ملقط معقم ، والسماح لهم بتغطية اللوحة بأكملها (9-12 يوما). ضع الألواح في حاضنة النمو عند 25 درجة مئوية مع 12:12 ساعة نهار: دورات ليلية للمساعدة في تحفيز التبويض.
ملاحظة: تنمو بعض الطفرات بشكل أبطأ وتتطلب رعاية إضافية (على سبيل المثال ، الوسائط الكاملة أولا ، ثم نقلها إلى OMA) ، وقد تستغرق أسبوعا إضافيا لإنتاج ما يكفي من conidia. - ازرع بذور الشعير مباشرة (Hordeum vulgare Lacey) في وسط نمو رطب (على سبيل المثال ، وسائط تأصيص بدون تربة) مع 10-15 بذرة لكل وعاء 6 بوصات. ضع الأواني في صواني بها 1-2 بوصة من الماء.
- اضبط ظروف غرفة نمو الشعير على 22 درجة مئوية لمدة 12 ساعة (ضوء النهار) و 19 درجة مئوية لمدة 12 ساعة (مظلمة) عند رطوبة نسبية 60٪. استمر في الماء من القاع حتى لا تزعج البذور.
- تنمو الشعير حتى مرحلة الورقة الثانية ، لمدة 14 يوما تقريبا. باستخدام مقص معقم ، قم بقطع نبات الشعير فوق خط التربة مباشرة. باستخدام ملقط وشفرة حلاقة / مشرط ، قم بقص غمد الورقة الأولى المفتوحة طوليا بعناية ، وباستخدام الملقط ، قم بإزالته من قاعدة الورقة الثانية.
ملاحظة: نظف الأدوات (ملقط ، مشرط ، إلخ) قبل الاستخدام باستخدام 75٪ -80٪ إيثانول. الغمد هو طبقة البشرة الرقيقة التي توفر الارتباط من الورقة الأولى إلى الورقة الثانية (الورقة الثانية إلى الثالثة ، وما إلى ذلك ؛ انظر الشكل 1). - ضع الورقة الأولى بشكل مسطح في طبق بتري معقم 60 مم ، يحتوي على منشفة ورقية مبللة للحفاظ على الرطوبة داخل اللوحة. باستخدام المشرط ، اقطع غالبية الورقة الأولى بعيدا عن الغمد ، تاركا 0.5 بوصة فقط من أنسجة الورقة للتركيب.
- قم بلصق أنسجة الأوراق على قاع لوحة بتري.
ملاحظة: يتجعد الغمد ، لكن هذا مقبول لأن الغمد المجعد يحمل القطرة المخروطية بسهولة أكبر. - اجمع ألواح M. oryzae البالغة من العمر 9-12 يوما ، وأضف 0.5-2 مل من الماء المعقم إلى اللوحات. باستخدام حلقة تلقيح معقمة ، كشط الفطريات برفق لتحرير الكونيديا المرفقة. ماصة بعناية تعليق conidial في أنبوب الطرد المركزي الدقيقة التي تحتوي على قطعة صغيرة من القماش القطني لتصفية أي قطع كبيرة من mycelium من تعليق conidial.
ملاحظة: يمكن جمع الجراثيم في وقت مبكر من 7 أيام ، إذا كان النمو والأبواغ كافيين للوصول إلى تركيز البوغ المطلوب. لا يمكن أن يتأخر الجمع أكثر من 14 يوما إذا كان العمل مع طفرة وراثية بطيئة النمو - تركيز البوغ المطلوب هو 5 × 10 4 جراثيم لكل مل ، ولكن النطاق (1 × 10 4-1 × 10 5) مقبول. التركيز العالي جدا يجعل تصوير مواقع العدوى الفردية أمرا صعبا ؛ تمييع تركيز بوغ بالماء المعقم إذا لزم الأمر.
- ماصة بعناية تعليق conidial داخل غمد ورقة المدرفلة. ابدأ ب 25 ميكرولتر (يمكن زيادة حجم القطرة اعتمادا على حجم الغمد ، حتى 50 ميكرولتر).
ملاحظة: يوصى بإجراء ثلاث إلى خمس نسخ مكررة لكل سلالة متحولة أو خط شعير. من الشائع حدوث تلف أثناء عملية التلوين ، لذلك يوصى باستخدام نسخ غمد إضافية. - املأ أربع أو خمس أكواب سعة 500 مل ب ddH2O ، وقم بتسخينها حتى تتبخر (باستخدام الميكروويف أو لوح التسخين). توخ الحذر عند تحريك أكواب الماء الساخن. امسك غطاء طبق بتري فوق إحدى الكئوس البخارية لحبس الرطوبة داخل الطبق.
- قم بتكديس ألواح غمد الأوراق المصابة وأحيطها بالأكواب الساخنة المتبقية. هذا يخلق بيئة رطبة ورطبة ، مطلوبة لتنبت الجراثيم.
ملاحظة: توخ الحذر عند تبخير الأغطية لضمان عدم ملامسة الماء الساخن أو البخار للأغماد. - احم أغلفة الأوراق من الضوء ، وقم بتغطيتها بصندوق مطاطي أو بلاستيكي بلون صلب (أسود مفضل) ، واتركها لمدة 48 ساعة أو النقطة الزمنية المطلوبة للتصوير.
ملاحظة: صندوق الكرتون غير مناسب لأنه لا يحبس الرطوبة / الرطوبة ويمتص البخار من أكواب الماء الساخن. يعمل الحوض البلاستيكي ذو القفل بشكل جيد لاحتواء الرطوبة ، ويمكن تغطيته بقماش أسود أو حاوية داكنة أكبر لحجب الضوء.
2. عملية تلطيخ
- تحضير وصمة عار على النحو التالي: تحضير تخفيف جديد من 45 ٪ حمض الخليك وإضافة 0.1 ٪ v / v تريبان الأزرق. القسمة 1 مل من محلول الصبغة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. اضبط كتلة حرارية أو حمام مائي على 40 درجة مئوية.
- بعناية ، باستخدام ماكينة حلاقة أو مشرط ، قم بقطع غمد الورقة بعيدا عن الشريط. باستخدام الملقط ، ضع الغمد في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وتأكد من غمره بالكامل في محلول الصبغة. اترك 2 ساعة حتى تخترق الصبغة الورقة. تسخين العينات عند 40 درجة مئوية أثناء وقت عملية التلوين في كتلة حرارية أو حمام مائي لزيادة تغلغل الصبغة.
ملاحظة: تحاول الأغماد أن تطفو في أنبوب الطرد المركزي الصغير ؛ لمنع الجيوب غير الملوثة من أنسجة الأوراق ، املأ الأنابيب ، واغمر الأغماد ، وأغلق الأنبوب. لا تضع أغماد متعددة في نفس أنبوب الطرد المركزي الصغير. - اشطف أغلفة الأوراق بعناية في 60٪ جلسرين لإزالة الصبغة الزائدة. ثلاث شطف (كل منها في الجلسرين الطازج) كافية بشكل عام. احتفظ بالغمد في الجلسرين حتى يصبح جاهزا للتركيب على الشرائح.
3. عملية التركيب والتصوير
- ضع الغمد على شريحة زجاجية نظيفة وأضف بضع قطرات من 60٪ من الجلسرين. باستخدام مجهر تشريح وزوجين من الملقط ، قم بفك الغمد بعناية ، وترك المركز الملقح متجها لأعلى. أمسك الغمد مفتوحا بالملقط ، وضع غطاء الغطاء في الأعلى لمنع الغمد من التجعيد وسد موقع العدوى.
ملاحظة: غمد الورقة هش للغاية ، ويجب القيام بهذه الخطوات بعناية لمنع تلف الغمد. - أغلق غطاء الغطاء باستخدام طلاء الأظافر للتخزين طويل الأجل ، أو الشريط للتخزين على المدى القصير. راقب الشرائح تحت مجهر ضوئي مركب.
- التقط صورا أساسية باستخدام المجهر والهاتف الخلوي. هنا ، تم التقاط الصور باستخدام حامل محول الهاتف الخلوي وهاتف ذكي. بالنسبة لأجهزة Android ، اضبط تطبيق الكاميرا على الإعدادات التالية: إيقاف التشغيل ، وتعطيل Top Shot ، وتعطيل الضبط التلقائي للسطوع والظلال ، وضبط دقة الصورة على كاملة.
ملاحظة: يؤدي استخدام تطبيق الكاميرا على الهاتف إلى تقليل عمر البطارية بشكل أسرع من المعتاد ، لذلك يوصى باستخدام طاقة خارجية. - بمجرد تركيب الهاتف الخلوي على المجهر ، التقط صورة لمقياس ميكرومتر بهدف الحصول على البيانات. تم الحصول على البيانات في هذه الدراسة عند هدف هوائي 40x 0.65 NA ، وتم تركيب محول الهاتف على عين 10x. اضبط تكبير الهاتف على 2.5x ، وحافظ على تناسقه للحفاظ على حجم بكسل ثابت.
- يضم مركز الغمد أكبر تركيز للجراثيم ويصيب القمعية. لذلك ، استهدف 9-12 صورة لكل غمد للحصول على أرقام كبيرة للتحليل الإحصائي. يختلف عدد الجراثيم و appressoria بناء على تركيز الجراثيم المطبقة.
4. تقييم الصور وعدها باستخدام ImageJ (فيجي)
- انقل الصور إلى كمبيوتر يقوم بتشغيل ImageJ (فيجي). لفتح الصور، اسحب الملفات وأفلتها على شريط ImageJ.
- اضبط مقياس الصور عن طريق تحميل صورة ميكرومتر المرحلة ورسم خط مستقيم بين علامتين للمقياس. افتح Set Scale، واكتب المسافة المعروفة للخط الذي تم قياسه، واكتب وحدة المقياس. على الميكرومتر ، في هذا المثال ، كان أصغر خط 10 ميكرومتر. حدد مربع تعيين عام واضغط على موافق. جميع الصور اللاحقة التي تم تحميلها سيكون لها نفس المقياس.
- لحساب عدد الضغط، الجراثيم، أو كائنات أخرى، حدد أداة النقطة . بعد ذلك ، افتح مدير عائد الاستثمار. انقر فوق المفتاح T على لوحة المفاتيح لإضافة نقاط إلى القائمة. يمكن حفظ مناطق الاهتمام هذه إذا لزم الأمر وإعادة تحميلها على نفس الصورة.
- اعتمادا على الأهداف التجريبية ، قم بإجراء قياسات إضافية ، مثل طول البوغ وحجم appressoria وطول الأنبوب الجرثومي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عرض تصوير لسير العمل الأولي لهذه التقنية في الشكل 1. تم حصاد الأغماد من نباتات الشعير "لاسي" الحساسة البالغة من العمر 14 يوما (H. vulgare). تم حصاد الكونيديا من صفائح M. oryzae OMA المبوغة البالغة من العمر 10 أيام ، مع تعليق كونيدي معد باستخدام ddH2O المعقم لتركيز نهائي قدره 5 × 104 جراثيم لكل مل. تم تطبيق تعليق اللقاح مباشرة على أغلفة الأوراق ، والتي تم تثبيتها على ألواح بتري المعقمة. تم الاحتفاظ باللوحات في غرفة دافئة ورطبة لمدة 48 ساعة بدون ضوء. بعد فترة الحضانة ، كانت أغماد الأوراق ملطخة باللون الأزرق المثقب وأعدت للتصوير.
تم تصوير مواقع العدوى باستخدام محول مجهر الهاتف الذكي والهاتف الذكي. تم تسجيل ما لا يقل عن 10 صور لكل سلالة من سلالات M. oryzae المختبرة. تم تكرار التجربة ثلاث مرات لما لا يقل عن 30 صورة لكل سلالة فطرية. يوضح الشكل 2 أ النتائج التمثيلية لفحص غمد ناجح ، جنبا إلى جنب مع الصور غير الملوثة والمصبوغة بشكل غير صحيح كمرجع.
اعتمادا على الفرضية ، يمكن قياس هذه الصور وتحليلها بعدة طرق. في هذه التجربة ، بعد 48 ساعة من التلقيح ، تم حساب العدد الإجمالي للجراثيم الحية (الجراثيم النابتة) ، إلى جانب عدد appressoria وعدد الخلايا المصابة بنجاح. تم إنشاء مجموعة من 2000 سلالة من M. oryzae مطفرة عشوائيا في خلفية تصيب الشعير في المختبر. كشفت مقايسات الإمراضية باستخدام تلقيح الرش والإسقاط عن العديد من الطفرات ذات حجم الآفة المنخفض مقارنة بالنوع البري (النمط الظاهري الشائع لمتحولات M. oryzae )11. لتفكيك هذه الأنماط الظاهرية ، تم افتراض أن حجم الآفة المنخفض كان ناتجا عن تثبيط إحدى خطوات العدوى المبكرة (إنبات البوغ ، والتكوين القمعي ، وتشكيل ربط الاختراق ، واستعمار خلايا البشرة الأولي) ، والذي يتم اختباره بسهولة أكبر عن طريق فحص غمد الأوراق. تم تحديد مرشح واعد من مشروع الطفرات باستخدام جينة أمامية تسمى J99A12. لم يظهر هذا الطافر حساسية لظروف الأكسجين المتعطشة للنيتروجين أو التفاعلية أثناء الشاشة. خلال تجارب المتابعة ، أنتج J99A أعدادا كبيرة من appressoria على سطح كاره للماء ، لكنه أظهر حجم آفة أقل على الشعير الحي. عند اختباره باستخدام مقايسة الغمد ، نجح J99A في تطوير appressoria وأوتاد الاختراق ، التي اخترقت غمد الورقة ولكنها لم تنتج خيوط غازية بمجرد دخولها ، مما يشير إلى أن العدوى توقفت عند ربط الاختراق (الشكل 2 ب). تم تحديد الخلايا المصابة بنجاح من خلال وجود خيوط معدية داخل أنسجة غمد الورقة. مقارنة عدد appressoria مع عدد الخلايا المصابة قدمت نسبة مئوية من إصابة appressoria بنجاح. بالنسبة للنوع البري 4091-5-8 ، نجح 87٪ من appressoria في غزو الخلية واستعمارها ، بينما في J99A المتحور ، كان لدى 36٪ فقط من appressoria خيوط داخل الخلية12.
الشكل 1: أغماد الأوراق التي يتم حصادها من الشعير البالغ من العمر 10 أيام وإزالتها بعناية باستخدام أدوات تنظيفها بالإيثانول. يتم جمع Conidia ، ويتم ضبط التركيز إلى 0.5-1.0 x 105 لكل ملليلتر بالماء المعقم. يتم لصق الأغماد المعزولة داخل لوحة بتري 60 سم ، ويتم تحميل التعليق المخروطي في الغمد. يتم الاحتفاظ بالعينات الملقحة في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام ، مع أكواب من الماء الساخن للرطوبة. يتم تلوين العينات في 45٪ حمض الخليك + 0.1٪ تريبان أزرق لمدة 1-2 ساعة عند 40 درجة مئوية ، ثم تشطف في 60٪ جلسرين ثلاث مرات لمدة 48 ساعة بعد التلقيح. يتم تركيب العينات الملطخة وتصويرها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: النتائج التمثيلية من بروتوكول التلطيخ . (أ) يمكن أن تؤدي الانحرافات عن بروتوكول التلوين إلى نتائج دون المستوى الأمثل. تعمل الحرارة وحمض الأسيتيك على تليين أنسجة الأوراق بلطف. لا يزيل شطف ما بعد التلوين في 60٪ من الجلسرين البقع الزائدة فحسب ، بل يساعد أيضا في تقليل تشتت الضوء الناجم عن الورقة وتحسين جودة الصورة. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) صور تمثيلية توضح المتانة في هذا الفحص لرؤية الاختراق الفاشل ومحاولات العدوى اللاحقة ل J99A (رؤوس الأسهم) ، مقارنة بالمحاولات الناجحة ل 4091WT التي أدت إلى إنتاج خيوط غازية لأنسجة الأوراق (الأسهم). قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. تم التقاط جميع الصور بعد 48 ساعة من الإصابة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك العديد من المقايسات شائعة الاستخدام المتاحة لاختبار سلالات M. oryzae التي توفر رؤية على المستوى العياني لاستجابة عدوى متوافقة أو غير متوافقة ، مثل تلقيح الرش أو القطيرات ، واستخدام أنظمة التصنيف لتحديد أحجام الآفة13,14. اختبار شائع آخر ل M. oryzae هو اختبار قدرة العامل الممرض على تشكيل هيكل الاختراق المتخصص ، apppressorium15. الموصوفة هنا هي طريقة سهلة لمراقبة التغيرات في عمليات العدوى المبكرة بسرعة وكفاءة على المستوى الخلوي ، في نبات الشعير الأكثر سهولة. هذه الطريقة فريدة من نوعها ، من حيث أنها تستخدم معدات المختبرات العامة والهاتف الذكي لالتقاط البيانات. تلغي هذه الطريقة الحاجة إلى المجاهر المجهزة بالكاميرا والتي يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر ، مما يجعل هذا البروتوكول ميسور التكلفة لأي مختبر. باستخدام هذه الطريقة ، تمكنا من تحديد الخطوة التي توقفت عندها عدوى J99A الطافرة ، وهو سؤال لم تتمكن التجارب السابقة من توضيحه.
تم تصوير عملية عدوى M. oryzae في الأرز ، وخاصة استعمار خلايا البشرة القليلة الأولى ، بشكل جيد باستخدام بروتينات الفلورسنت ، والعلامات ، والأصباغ ، والتصوير متحد البؤر ، والفحص المجهريالمتقدم 16. هذه الأنواع من تجارب التصوير باهظة الثمن وتستغرق وقتا طويلا وتتطلب خبرة محددة. العديد من المختبرات ، باستخدام إعادة التركيب المتماثل ، قادرة على إنشاء طفرات جينية من M. oryzae لتحليل أدوار الجينات الفردية في دورة العدوى ، ولكن قد لا تتمكن من الوصول إلى المعدات والخبرات المتقدمة المطلوبة لاستكشاف بيولوجيا الخلية الأساسية. يهدف هذا البروتوكول إلى المساعدة في سد هذه الفجوة ، باستخدام مجهر ضوئي مركب وهاتف ذكي فقط لالتقاط الصور الرقمية وإنشاء مقاطع فيديو من نوع z-stack لأنسجة غمد الأوراق الثابتة. تتيح هذه الطريقة تصوير بضع طبقات من الخلايا في الأنسجة ، والتقاط الخيوط الفطرية الغازية لمدة تصل إلى 48 ساعة. غمد أوراق الأرز والشعير لها خصائص متشابهة. وهي ليست سوى بضع طبقات من الخلايا سميكة ولها عدد أقل من البلاستيدات الخضراء ، مما يسهل تصويرها. كما ذكر أعلاه ، فإن الشعير أقل كارها للماء وأسهل في النمو من الأرز ، ويمكن أن تسبب العديد من سلالات M. oryzae العدوى على الأرز والشعير ، مما يجعل هذه التجربة مقايضة سهلة لفحوصات الأرز الأكثر تعقيدا.
تتضمن بعض القيود على هذه الطريقة استخدام وظيفة الفيديو للهاتف الذكي لجمع بيانات الحقل z ، حيث أن الزيادة z لمعدل الإطارات غير معروفة. قيد آخر هو أنه يتطلب أنسجة ثابتة (وليس خلايا حية). ومع ذلك ، بسبب سرعة وسهولة البروتوكول ، يمكن التغلب على هذا القيد من خلال فحص نقاط زمنية مختلفة بعد الإصابة.
واحدة من أهم خطوات البروتوكول هي تلطيخ المناسب. يؤدي الشطف غير السليم إلى زيادة الصبغة في تحضير الشريحة ، مما يتسبب في تشبع الصبغة ، ويجعل الأنسجة الممرضة غير قابلة للتمييز عن أنسجة الأوراق. وفي الوقت نفسه ، يمنع نقص التلطيخ الأنسجة الممرضة من التناقض مع أنسجة الأوراق.
الطريقة المذكورة أعلاه قابلة للتكيف مع العديد من الأسئلة العلمية ، ويمكن استخدامها لتقييم الطفرات الفطرية ، وتقييم درجات مختلفة من المقاومة الوراثية في نباتات الشعير ، واختبار كفاءة طرق مكافحة الفطريات المطبقة سابقا. من الممكن أيضا توسيع هذه الطريقة لتشمل تفاعلات مسببات الأمراض النباتية الأخرى ، وخاصة أغلفة الأوراق أحادية الفلقة الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يقر المؤلفون بالتمويل من جائزة USDA-NIFA 2016-67013-24816.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , Springer. Cham. 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , Doctoral dissertation (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
