Summary
Bu, minimum reaktifler ve ortak laboratuvar ekipmanı (temel bir akıllı telefon dahil) kullanan bir arpa yaprağı kılıfı testinin basit bir protokolüdür. Amaç, gelişmiş mikroskopi ekipmanlarına erişimi olmayan laboratuvarlarda patlama hastalığının erken enfeksiyon sürecini görselleştirmektir.
Abstract
Bitkilerin ve patojenlerin nasıl etkileşime girdiğini ve bu etkileşimin savunma veya hastalıkla sonuçlanıp sonuçlanmadığını anlamak, bitki sağlığı için daha güçlü ve daha sürdürülebilir stratejiler geliştirmek için gereklidir. Enfeksiyon ve kolonizasyon sırasında bitki-patojen örneklerini daha etkili bir şekilde görüntüleyen yöntemlerdeki ilerlemeler, pirinç ve mantar patojeni Magnaporthe oryzae arasındaki enfeksiyon ve erken kolonizasyon olaylarının izlenmesinde yararlı olan pirinç yaprağı kılıfı testi gibi araçlar sağlamıştır. Bu hemi-biyotrofik patojen, pirinç ve darı, çavdar, arpa ve daha yakın zamanda buğday dahil olmak üzere ilgili monokotlarda ciddi hastalık kaybına neden olur. Yaprak kılıfı testi, doğru bir şekilde gerçekleştirildiğinde, araştırmacıların patojen saldırısı sırasında canlı hücre görüntülemesi yapmalarına veya belirli özellikler için boyanmış sabit örnekler oluşturmalarına olanak tanıyan birkaç kat kalınlığında, optik olarak net bir bitki bölümü verir. Arpa-M. oryzae etkileşimine ilişkin ayrıntılı hücresel araştırmalar, bu tahılın hayvanlar ve insanlar için bir besin kaynağı ve fermente içecekler olarak artan önemine rağmen, pirinç konağının gerisinde kalmıştır. Burada, aşılama sonrası ilk 48 saat boyunca M. oryzae etkileşimlerinin karmaşık çalışmaları için bir arpa yaprağı kılıfı testinin geliştirilmesi bildirilmiştir. Yaprak kılıfı testi, hangi türün çalışıldığına bakılmaksızın, hassastır; Arpa yetiştirme koşullarından yaprak kılıfı elde edilmesine, bitki yaprakları üzerindeki patojenin aşılanmasına, inkübasyonuna ve görüntülenmesine kadar her şeyi kapsayan bir protokoldür. Bu protokol, görüntüleme amacıyla akıllı telefon kadar basit bir şey kullanılarak yüksek verimli tarama için optimize edilebilir.
Introduction
Magnaporthe oryzae, pirinç patlama mantarı, arpa, buğday ve pirinç1 dahil olmak üzere çeşitli tahıl bitkilerini enfekte eder. Bu patojen yıkıcı hastalıklara neden olur ve bu değerli ürünler için dünya çapında bir tehdit oluşturur ve kontrol edilmezse tam ürün kaybına neden olur. Dünyadaki birçok laboratuvar, küresel tehdidi ve bitki-mantar etkileşimleri için mükemmel bir model olarak özellikleri nedeniyle pirinç patlama hastalığına odaklanmaktadır2. Tamamen sıralanmıştır ve enfektif döngüsünün genetiği, özellikle de erken olaylar, 3,4 olarak belirlenmiştir. Yaşam döngüsü, bir yaprak yüzeyinde çimlenen bir sporla başlar ve appressorium adı verilen özel penetrasyon yapısını oluşturur. Appressorium yaprak dokusuna nüfuz eder ve enfeksiyon, sporülasyon sürecini başlatan ve hastalık4'ü yayan lezyonların gelişimi ile devam eder. Bu erken olaylardan herhangi birini önlemek, bu yıkıcı hastalığı büyük ölçüde engelleyecektir. Sonuç olarak, patlama hastalığı ile ilgili en güncel araştırmalar, bir appressoryum oluşturan çimlenmiş konidiadan invaziv hiflerin ve biyotrofik ara yüzey kompleksinin (BIC) gelişimine kadar erken enfeksiyon adımlarına odaklanmıştır5.
M. oryzae çeşitli mahsuller için önemli bir patojen olmasına rağmen, patlama hastalığı üzerine çok sayıda araştırma pirinçte yapılmıştır ve yeni evrimleşmiş suşlar buğday6 için küresel bir tehdit olarak ortaya çıkmaktadır. Pirinç, buğday ve mısırla birlikte nüfusu beslemek için kullanılan ilk üç temel üründen biri iken, arpa hayvan yemi ve bira üretimi açısından dördüncü tahıl tanesidir7. Zanaat birası endüstrisi büyüdükçe, arpanın ekonomik değeri de artar. M. oryzae ve arpanın patlama hastalığını incelemek için bir patosistem olarak kullanılmasının belirgin avantajları vardır. İlk olarak, sadece arpayı enfekte eden M. oryzae suşlarının yanı sıra birden fazla çim türünü enfekte edebilen suşlar da vardır. Örneğin, 4091-5-8 öncelikle sadece arpayı enfekte ederken, Guy11 ve 70-15 hem arpa hem de pirinç8'i enfekte edebilir. Bu suşlar genetik olarak benzerdir ve enfeksiyon süreci karşılaştırılabilir9. İkincisi, standart laboratuvar ve sera koşullarında, pirincin karmaşık gereksinimlerine (özlü sıcaklık kontrolü, yüksek nem, spesifik ışık spektrumları) sahip olmadığı için arpanın yetiştirilmesi daha kolaydır. Arpanın10 göstermediği yaprak yüzeyinin hidrofobikliği nedeniyle pirinçle ilgili görüntüleme zorlukları da vardır.
Bu protokol, çoklu enfeksiyon aşamalarının mikroskobik analizi için arpa yaprağı kılıflarını izole etmek ve etkili bir şekilde kullanmak, ortak laboratuvar malzemeleri ve veri toplamak için bir akıllı telefon kullanmak için basit bir yöntem sunar. Arpa yaprağı kılıf testi için bu yöntem, minimum malzeme gerektirdiği için dünyadaki laboratuvarlar için uyarlanabilir ve yine de patojen ile enfekte ettiği ilk birkaç hücre arasındaki mikroskobik etkileşimin net bir resmini sağlar. Sprey veya damlacık aşılaması gibi patojenite testleri, patojenin lezyon oluşturma yeteneğinin makro bir görünümünü sağlayabilirken, bu tahlil araştırmacının penetrasyon öncesi olaylardan epidermal hücrelerin kolonizasyonuna kadar erken enfeksiyonun belirli adımlarını görselleştirmesine olanak tanır. Ayrıca, araştırmacılar vahşi tip mantar ile enfeksiyonu, virülansta azaltılmış bir mutant ile enfeksiyonla kolayca karşılaştırabilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Deney malzemelerinin hazırlanması
- Yulaf ezmesini ince bir toz haline gelene kadar karıştırarak yulaf ezmesi agarını (OMA) hazırlayın. 500 mL ddH2O'ya 25 g yulaf ezmesi tozu ve 15 g agar ekleyin ve ortam döngüsünde otoklav ekleyin (alternatif olarak 20 dakika kaynatın). Ortamı steril 60 mm Petri kaplarına dökün.
NOT: V8 agar gibi sporülasyona neden olan diğer ortam türleri bu protokol için kabul edilebilir. - Plaka M. oryzae filtresi, steril forseps kullanarak doğrudan OMA plakalarına stoklar ve tüm plakayı (9-12 gün) kaplamalarına izin verir. Plakaları, sporülasyonu indüklemeye yardımcı olmak için 12:12 saat gündüz: gece döngüleri ile 25 ° C'de bir büyüme inkübatörüne yerleştirin.
NOT: Bazı mutantlar daha yavaş büyür ve ek bakım gerektirir (örneğin, önce medyayı tamamlayın, sonra OMA'ya aktarın) ve yeterli konidia üretmek için bir hafta daha sürebilir. - Arpa (Hordeum vulgare Lacey) tohumlarını doğrudan nemli bir büyüme ortamında (örneğin, topraksız saksı ortamı) 6 inç saksı başına 10-15 tohumla ekin. Saksıları 1-2 inç su içeren tepsilere yerleştirin.
- Arpa büyüme odası koşullarını %60 bağıl nemde 12 saat (gün ışığı) için 22 °C ve 12 saat (karanlık) için 19 °C olarak ayarlayın. Tohumları rahatsız etmemek için alttan sulamaya devam edin.
- Arpaları ikinci yaprak aşamasına kadar, yaklaşık 14 gün boyunca büyütün. Steril makas kullanarak, arpa bitkisini toprak çizgisinin hemen üzerinde kesin. Forseps ve bir tıraş bıçağı / neşter kullanarak, uzunlamasına açık olan ilk yaprağın yaprak kılıfını dikkatlice kesin ve forsepsleri kullanarak ikinci yaprağın tabanından çıkarın.
NOT: Kullanmadan önce aletleri (forseps, neşter vb.) %75-%80 etanol ile temizleyiniz. Kılıf, birinciden ikinci yaprağa (ikinciden üçüncü yaprağa vb.) bağlanmayı sağlayan ince epidermis tabakasıdır; bkz. Şekil 1). - İlk yaprağı düz bir şekilde, plakanın içindeki nemi korumak için ıslak bir kağıt havlu içeren steril bir 60 mm Petri kabına yerleştirin. Neşteri kullanarak, ilk yaprağın çoğunluğunu kılıftan uzaklaştırın ve montaj için yaprak dokusunun sadece 0,5'ini bırakın.
- Yaprak dokusunu Petri plakasının altına bantlayın.
NOT: Kılıf kıvrılır, ancak kıvrılmış bir kılıf konidiyal damlacığı daha kolay tuttuğu için bu kabul edilebilir. - 9-12 günlük M. oryzae plakalarını toplayın ve plakalara 0.5-2 mL steril su ekleyin. Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, ekli konidiayı serbest bırakmak için miseli yavaşça kazıyın. Konidiyal süspansiyondan büyük miselyum parçalarını filtrelemek için konidiyal süspansiyonu küçük bir tülbent parçası içeren bir mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice pipetin.
NOT: Sporlar, istenen spor konsantrasyonuna ulaşmak için büyüme ve sporülasyon yeterliyse, 7 gün kadar erken bir sürede toplanabilir. Yavaş büyüyen bir genetik mutant ile çalışıyorsa, toplama 14 günden fazla gecikemez - İstenilen spor konsantrasyonu mL başına 5 x 10 4 spordur, ancak bir aralık (1 x 10 4-1 x 10 5) kabul edilebilir. Bir konsantrasyonun çok yüksek olması, bireysel enfeksiyon bölgelerinin görüntülenmesini zorlaştırır; Gerekirse spor konsantrasyonunu steril suyla seyreltin.
- Haddelenmiş yaprak kılıfının içindeki konidiyal süspansiyonu dikkatlice pipetin. 25 μL ile başlayın (damlacık boyutu, kılıfın boyutuna bağlı olarak 50 μL'ye kadar artırılabilir).
NOT: Her mutant suşun veya arpa hattının üç ila beş kopyasının yapılması önerilir. Boyama işlemi sırasında hasarın meydana gelmesi yaygındır, bu nedenle ek kılıf kopyaları önerilir. - Dört veya beş adet 500 mL beheri ddH2O ile doldurun ve buharlaşana kadar ısıtın (mikrodalga fırın veya ocak plakası kullanarak). Sıcak su kaplarını hareket ettirirken dikkatli olun. Petri kabının kapağını, tabağın içindeki nemi hapsetmek için buharda pişirilen beherlerden birinin üzerinde tutun.
- Enfekte yaprak kılıf plakalarını istifleyin ve kalan sıcak beherlerle çevreleyin. Bu, sporların çimlenmesi için gerekli olan nemli, nemli bir ortam yaratır.
NOT: Kapakları buharda pişirirken kılıflara sıcak su veya buhar temas etmemesi için dikkatli olun. - Yaprak kılıflarını ışıktan koruyun, düz renkli (siyah tercihli) bir kauçuk veya plastik kutu ile örtün ve 48 saat veya görüntüleme için istenen zaman noktasında bekletin.
NOT: Bir karton kutu uygun değildir, çünkü nemi / nemi kilitlemez ve sıcak su kaplarından buharı emer. Kilitlenen, plastik bir küvet nemi içermek için iyi çalışır ve ışığı engellemek için siyah kumaş veya daha büyük koyu bir kapla kaplanabilir.
2. Boyama işlemi
- Lekeyi aşağıdaki gibi hazırlayın:% 45 asetik asitten taze bir seyreltme hazırlayın ve% 0.1 v / v tripan mavisi ekleyin. Boya çözeltisinin 1 mL'sini mikrosantrifüj tüplerine aliquot. Bir ısı bloğunu veya su banyosunu 40 °C'ye ayarlayın.
- Dikkatlice, bir tıraş bıçağı veya neşter kullanarak, yaprak kılıfını banttan uzaklaştırın. Forseps kullanarak, kılıfı mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve boya çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun. Boyanın yaprağa nüfuz etmesi için 2 saat bekleyin. Boyanın penetrasyonunu artırmak için boyama işlemi sırasında numuneleri bir ısı bloğunda veya su banyosunda 40 °C'de ısıtın.
NOT: Kılıflar mikro santrifüj tüpünde yüzmeye çalışır; lekesiz yaprak dokusu ceplerini önlemek için tüpleri doldurun, kılıfları batırın ve tüpü kapatın. Aynı mikro santrifüj tüpüne birden fazla kılıf koymayın. - Ekstra boyayı çıkarmak için yaprak kılıflarını% 60 gliserol içinde dikkatlice durulayın. Üç durulama (her biri taze gliserolde) genellikle yeterlidir. Kılıfı slaytlara monte etmeye hazır olana kadar gliserol içinde tutun.
3. Montaj ve görüntüleme işlemi
- Kılıfı temiz bir cam slayda yerleştirin ve birkaç damla% 60 gliserol ekleyin. Diseksiyon mikroskobu ve iki çift forseps kullanarak, aşılanmış merkezi yukarı bakacak şekilde bırakarak kılıfı dikkatlice açın. Kılıfı forsepslerle açık tutun ve kılıfın kıvrılmasını ve enfeksiyon bölgesini tıkamasını önlemek için kapağı üstüne yerleştirin.
NOT: Yaprak kılıfı çok kırılgandır ve kılıfın zarar görmesini önlemek için bu adımların dikkatle yapılması gerekir. - Uzun süreli depolama için oje veya kısa süreli depolama için bant kullanarak kapak kapağını kapatın. Slaytları bileşik ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
- Mikroskop ve cep telefonu kullanarak temel görüntüler çekin. Burada, görüntüler bir cep telefonu adaptörü montajı ve bir akıllı telefon ile çekildi. Android cihazlar için, kamera uygulamasını aşağıdaki ayarlara ayarlayın: flaş kapalı, Top Shot'ı devre dışı bırakın, parlaklık ve gölgelerin otomatik olarak ayarlanmasını devre dışı bırakın ve fotoğraf çözünürlüğünü tam olarak ayarlayın.
NOT: Telefondaki kamera uygulamasını kullanmak pil ömrünü normalden daha hızlı azaltır, bu nedenle harici güç kullanılması önerilir. - Cep telefonu mikroskop üzerine monte edildikten sonra, verileri elde etmek için kullanılacak olan bir ölçek mikrometresinin görüntüsünü alın. Bu çalışmadaki veriler 40x 0.65 NA hava hedefinde elde edildi ve telefon adaptörü 10x oküler üzerine monte edildi. Telefonun yakınlaştırmasını 2,5x'e ayarlayın ve sabit bir piksel boyutunu korumak için tutarlı tutun.
- Kılıfın merkezi, en büyük spor konsantrasyonunu barındırır ve appressoria'yı enfekte eder; Bu nedenle, istatistiksel analiz için önemli sayılar elde etmek için her kılıfın 9-12 görüntüsünü hedefleyin. Spor ve appressoria sayısı, uygulanan sporların konsantrasyonuna bağlı olarak değişir.
4. ImageJ (FIJI) kullanarak görüntü değerlendirme ve sayma
- Görüntüleri ImageJ (FIJI) çalıştıran bir bilgisayara aktarın. Görüntüleri açmak için dosyaları ImageJ çubuğuna sürükleyip bırakın.
- Sahne alanı mikrometre görüntüsünü yükleyerek ve ölçek için iki işaret arasında düz bir çizgi çizerek görüntülerin ölçeğini ayarlayın. Set Ölçeği'ni açın, ölçülen çizgi için Bilinen Mesafe'yi yazın ve ölçeğin birimini yazın. Mikrometrede, bu örnekte, en küçük çizgi 10 μm idi. Global Ayarla kutusunu işaretleyin ve Tamam'a basın. Yüklenen sonraki tüm görüntüler aynı ölçeğe sahip olacaktır.
- Appressoria, sporlar veya diğer nesneleri saymak için Nokta aracını seçin. Ardından, YG Yöneticisi'ni açın. Listeye nokta eklemek için klavyedeki T tuşunu tıklatın. Bu ilgi çekici bölgeler gerekirse kaydedilebilir ve aynı görüntüye yeniden yüklenebilir.
- Deneysel hedeflere bağlı olarak, spor uzunluğu, appressoria boyutu ve germ tüpü uzunluğu gibi ek ölçümler yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu teknik için ilk iş akışının bir tasviri Şekil 1'de gösterilmiştir. Kılıflar 14 günlük duyarlı "Lacey" arpa bitkilerinden (H. vulgare) toplandı. Konidia, 10 günlük sporlaştırıcı M. oryzae OMA plakalarından, mL başına 5 x 104 sporun nihai konsantrasyonu için steril ddH2O kullanılarak hazırlanan konidiyal bir süspansiyonla toplandı. İnokulum süspansiyonu, steril Petri plakalarına sabitlenen yaprak kılıflarına doğrudan uygulandı. Plakalar ışıksız 48 saat boyunca sıcak, nemli bir odada tutuldu. Kuluçka dönemini takiben, yaprak kılıfları tripan mavisi ile boyandı ve görüntüleme için hazırlandı.
Enfeksiyon bölgeleri bir akıllı telefon ve akıllı telefon mikroskop adaptörü kullanılarak görüntülendi. Test edilen M. oryzae suşlarının her biri için en az 10 görüntü kaydedildi. Deney, her mantar suşu için en az 30 görüntü için üç kez tekrarlandı. Şekil 2A , başarılı bir kılıf testinin temsili sonuçlarını, referans için lekesiz ve yanlış boyanmış görüntülerle birlikte göstermektedir.
Hipoteze bağlı olarak, bu görüntüler çok çeşitli şekillerde ölçülebilir ve analiz edilebilir. Bu deney için, aşılama sonrası 48 saatte, toplam canlı spor sayısı (çimlenmiş sporlar), appressoria sayısı ve başarılı bir şekilde enfekte olmuş hücrelerin sayısı ile birlikte sayıldı. Laboratuvarda, arpa bulaştıran bir arka planda rastgele mutajenize edilmiş 2.000 M. oryzae suşundan oluşan bir koleksiyon oluşturuldu. Sprey ve damla aşılamaları kullanılarak yapılan patojenite analizleri, vahşi tipe ( M. oryzae mutantları için ortak bir fenotip) kıyasla lezyon boyutunun azaldığı birçok mutant ortaya çıkarmıştır11. Bu fenotipleri birbirinden ayırmak için, azalmış lezyon boyutunun, yaprak kılıfı testi ile en kolay şekilde test edilen erken enfeksiyon adımlarından birinin (spor çimlenmesi, baskıcı oluşumu, penetrasyon mandalı oluşumu, ilk epidermal hücre kolonizasyonu) inhibisyonundan kaynaklandığı varsayılmıştır. Mutajenez projesinden umut verici bir aday, J99A12 adlı ileri bir genetik kullanılarak tanımlandı. Bu mutant, ekran sırasında azot açlığı çeken veya reaktif oksijen koşullarına duyarlılık göstermedi. Takip deneyleri sırasında, J99A hidrofobik bir yüzeyde önemli sayıda appressoria üretti, ancak canlı arpada lezyon boyutunda azalma gösterdi. Kılıf testi kullanılarak test edildiğinde, J99A, yaprak kılıfına nüfuz eden, ancak içeri girdikten sonra invaziv hifler üretmeyen appressoria ve penetrasyon mandallarını başarıyla geliştirdi, böylece enfeksiyonun penetrasyon mandalında durduğunu düşündürdü (Şekil 2B). Başarılı bir şekilde enfekte olmuş hücreler, yaprak kılıfının dokusu içinde enfektif hiflerin varlığı ile tanımlanmıştır. Appressoria sayısını enfekte olmuş hücrelerin sayısıyla karşılaştırmak, appressoria'yı başarılı bir şekilde enfekte etme yüzdesini sağlamıştır. Vahşi tip 4091-5-8 için, appressoria'nın% 87'si hücreyi başarılı bir şekilde istila etti ve kolonize ederken, mutant J99A'da, appressoria'nın sadece% 36'sında hücre12'nin içinde hipha vardı.
Resim 1: 10 günlük arpadan toplanan ve etanol içinde temizlenmiş aletlerle dikkatlice çıkarılan yaprak kılıfları. Conidia toplanır ve konsantrasyon steril su ile mililitre başına 0.5-1.0 x 105'e ayarlanır. İzole edilmiş kılıflar 60 cm'lik bir Petri plakasının içine bantlanır ve konidiyal süspansiyon kılıfa yüklenir. Aşılanan numuneler oda sıcaklığında, karanlıkta, nem için sıcak su kapları ile tutulur. Numuneler, 40 ° C'de 1-2 saat boyunca% 45 asetik asit +% 0.1 tripan mavisi içinde boyanır, daha sonra aşılama sonrası 48 saat boyunca% 60 gliserol içinde üç kez durulanır. Lekeli numuneler monte edilir ve görüntülenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Boyama protokolünden temsili sonuçlar. (A) Boyama protokolünden sapmalar optimal olmayan sonuçlara neden olabilir. Isı ve asetik asit, yaprak dokusunu hafifçe yumuşatmaya yarar. % 60 gliserol içindeki boyama sonrası durulamalar sadece fazla lekeyi çıkarmakla kalmaz, aynı zamanda yaprağın neden olduğu ışık saçılımını azaltmaya ve görüntü kalitesini iyileştirmeye yardımcı olur. Ölçek çubukları = 50 μm. (B) Yaprak dokusuna (oklar) invaziv hiflerin üretilmesiyle sonuçlanan 4091WT'nin başarılı girişimlerine kıyasla, J99A'nın (ok uçları) başarısız penetrasyonunu ve müteakip enfeksiyon girişimlerini görmek için bu tahlildeki sağlamlığı gösteren temsili görüntüler. Ölçek çubukları = 50 μm. Tüm görüntüler enfeksiyondan 48 saat sonra çekildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sprey veya damlacık aşılamaları gibi uyumlu veya uyumsuz bir enfeksiyon yanıtının makroskopik düzeyde bir görselini sağlayan M. oryzae suşlarını test etmek için yaygın olarak kullanılan birçok tahlil ve lezyon boyutlarını ölçmek için derecelendirme sistemlerinin kullanımı13,14 vardır. M. oryzae için bir başka yaygın tahlil, patojenin özel penetrasyon yapısını, apppressorium15'i oluşturma yeteneğini test etmektir. Burada tarif edilen, daha kolay arpa bitkisinde, erken enfeksiyon süreçlerindeki değişiklikleri hücresel düzeyde hızlı ve verimli bir şekilde gözlemlemek için kolay bir yöntemdir. Bu yöntem, genel laboratuvar ekipmanı ve veri yakalama için bir akıllı telefon kullanması nedeniyle benzersizdir. Bu yöntem, kamera donanımlı ve bilgisayar kontrollü mikroskoplara olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, bu protokolü herhangi bir laboratuvar için uygun fiyatlı hale getirir. Bu yöntemi kullanarak, mutant J99A enfeksiyonunun hangi aşamada durdurulduğunu belirleyebildik, önceki deneylerin açıklığa kavuşturamadığı bir soru.
M. oryzae'nin pirinçteki enfeksiyon süreci, özellikle ilk birkaç epidermal hücrenin kolonizasyonu, floresan proteinleri, belirteçler, boyalar, konfokal görüntüleme ve gelişmiş mikroskopi16 kullanılarak iyi görüntülenmiştir. Bu tür görüntüleme deneyleri pahalıdır, zaman alıcıdır ve özel uzmanlık gerektirir. Homolog rekombinasyon kullanan birçok laboratuvar, bireysel genin enfeksiyon döngüsündeki rollerini analiz etmek için M. oryzae'nin genetik mutantlarını oluşturabilir, ancak altta yatan hücre biyolojisini keşfetmek için gereken gelişmiş ekipman ve uzmanlığa erişemeyebilir. Bu protokol, dijital görüntüleri yakalamak ve sabit yaprak kılıf dokularının z-stack tipi videolarını oluşturmak için yalnızca bileşik bir ışık mikroskobu ve bir akıllı telefon kullanarak bu boşluğu kapatmaya yardımcı olmayı amaçlamaktadır. Bu yöntem, dokuya birkaç hücre katmanının görüntülenmesini sağlar ve invaziv mantar hiflerini 48 saate kadar yakalar. Pirinç ve arpanın yaprak kılıfı benzer özelliklere sahiptir; Sadece birkaç hücre tabakası kalınlığındadırlar ve daha az kloroplasta sahiptirler, bu da onları görüntülemeyi kolaylaştırır. Yukarıda belirtildiği gibi, arpa pirinçten daha az hidrofobiktir ve büyümesi daha kolaydır ve birçok M. oryzae suşu pirinç ve arpa üzerinde enfeksiyona neden olabilir, bu da bu deneyi daha karmaşık pirinç tahlilleri için kolay bir takas haline getirir.
Bu yöntemin birkaç sınırlaması, kare hızı için z-artışı bilinmediğinden, z-alanı verilerini toplamak için akıllı telefonun video işlevini kullanmayı içerir. Diğer bir sınırlama, sabit doku gerektirmesidir (canlı hücreler değil). Bununla birlikte, protokolün hızı ve kolaylığı nedeniyle, enfeksiyon sonrası çeşitli zaman noktaları incelenerek bu sınırlamanın üstesinden gelinebilir.
Protokolün en önemli adımlarından biri uygun boyamadır. Yanlış durulama, slayt hazırlığında aşırı boyaya neden olur, boya doygunluğuna neden olur ve patojen dokuyu yaprak dokusundan ayırt edilemez hale getirir. Bu arada, az boyama, patojen dokunun yaprak dokusuna karşı kontrast oluşturmasını önler.
Yukarıda belirtilen yöntem birçok bilimsel soruya uyarlanabilir ve mantar mutantlarını değerlendirmek, arpa bitkilerinde çeşitli derecelerde genetik direnci değerlendirmek ve daha önce uygulanan mantar kontrol yöntemlerinin verimliliğini test etmek için kullanılabilir. Bu yöntemi diğer bitki-patojen etkileşimlerine, özellikle de diğer monokot yaprak kılıflarına genişletmek de mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, USDA-NIFA ödülü 2016-67013-24816'dan fon sağladığını kabul etmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , Springer. Cham. 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , Doctoral dissertation (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
