Summary
Detta är ett enkelt protokoll för en kornbladmantelanalys med minimala reagens och vanlig laboratorieutrustning (inklusive en grundläggande smartphone). Syftet är att visualisera den tidiga infektionsprocessen av blastsjukdom i laboratorier utan tillgång till avancerad mikroskopiutrustning.
Abstract
Att förstå hur växter och patogener interagerar, och om den interaktionen kulminerar i försvar eller sjukdom, krävs för att utveckla starkare och mer hållbara strategier för växtskydd. Framsteg inom metoder som mer effektivt avbildar växtpatogenprover under infektion och kolonisering har gett verktyg som risbladsmantelanalysen, som har varit användbar vid övervakning av infektion och tidiga koloniseringshändelser mellan ris och svamppatogenen, Magnaporthe oryzae. Denna hemi-biotrofa patogen orsakar allvarlig sjukdomsförlust i ris och relaterade monocots, inklusive hirs, råg, korn och nyligen vete. Bladmantelanalysen, när den utförs korrekt, ger en optiskt klar växtsektion, flera lager tjock, vilket gör det möjligt för forskare att utföra levande cellavbildning under patogenattack eller generera fasta prover färgade för specifika egenskaper. Detaljerade cellulära undersökningar av korn-M. oryzae-interaktionen har släpat efter risvärdens, trots den växande betydelsen av detta spannmål som livsmedelskälla för djur och människor och som fermenterade drycker. Här rapporteras utvecklingen av en analys av kornbladsmantel för invecklade studier av M. oryzae-interaktioner under de första 48 timmarna efter inokuleringen. Bladmantelanalysen, oavsett vilken art som studeras, är känslig; Förutsatt är ett protokoll som täcker allt, från korntillväxtförhållanden och erhållande av en bladmantel, till ympning, inkubation och avbildning av patogenen på växtblad. Detta protokoll kan optimeras för screening med hög genomströmning med något så enkelt som en smartphone för bildändamål.
Introduction
Magnaporthe oryzae, risblastsvampen, infekterar ett sortiment av spannmålsgrödor, inklusive korn, vete och ris1. Denna patogen orsakar förödande sjukdomar och utgör ett världsomspännande hot mot dessa värdefulla grödor, vilket orsakar fullständig förlust av grödor om den inte kontrolleras. Många laboratorier runt om i världen fokuserar på risblastsjukdom på grund av dess globala hot och dess attribut som en utmärkt modell för växt-svampinteraktioner2. Det har sekvenserats fullständigt, och genetiken i dess infektionscykel, särskilt de tidiga händelserna, har fastställts 3,4. Livscykeln börjar med en spore som spirer på en bladyta och bildar den specialiserade penetrationsstrukturen som kallas appressorium. Appressoriet tränger in i bladvävnaden, och infektionen fortsätter med utvecklingen av lesioner som startar sporuleringsprocessen och sprider sjukdom4. Att förhindra någon av dessa tidiga händelser skulle drastiskt hämma denna förödande sjukdom. Följaktligen har den senaste forskningen om blastsjukdom varit inriktad på de tidiga infektionsstegen, från de grodda konidierna som bildar ett appressorium till utvecklingen av invasiva hyfer och det biotrofa gränssnittskomplexet (BIC)5.
Den stora mängden forskning om blastsjukdom har utförts i ris, även om M. oryzae är en betydande patogen för en mängd olika grödor, och nyutvecklade stammar framträder som ett globalt hot mot vete6. Medan ris är en av de tre bästa stapelgrödorna som används för att mata befolkningen, tillsammans med vete och majs, är korn det fjärde spannmålskornet när det gäller djurfoder och ölproduktion7. När hantverksölindustrin växer, så gör det ekonomiska värdet av korn. Det finns tydliga fördelar med att använda M. oryzae och korn som ett patosystem för att studera blast sjukdom. För det första finns det stammar av M. oryzae som bara infekterar korn, liksom stammar som kan infektera flera gräsarter. Till exempel infekterar 4091-5-8 främst endast korn, medan Guy11 och 70-15 kan infektera både korn och ris8. Dessa stammar är genetiskt lika, och infektionsprocessen är jämförbar9. För det andra, under vanliga laboratorie- och växthusförhållanden är korn lättare att odla, eftersom det inte har de komplicerade kraven på ris (kortfattad temperaturkontroll, hög luftfuktighet, specifika ljusspektra). Det finns också avbildningsutmaningar med ris på grund av bladytans hydrofobicitet, som korn inte uppvisar10.
Detta protokoll presenterar en enkel metod för att isolera och effektivt utnyttja kornbladsmantlar för mikroskopisk analys av flera infektionssteg, med hjälp av vanliga laboratorietillbehör och en smartphone för datainsamling. Denna metod för analysen av kornbladmanteln är anpassningsbar för laboratorier över hela världen eftersom den kräver minimala leveranser och ändå ger en tydlig bild av den mikroskopiska interaktionen mellan patogenen och de första cellerna som den infekterar. Medan patogenicitetsanalyser, såsom en spray- eller droppinokulering, kan ge en makrovy av patogenens förmåga att bilda lesioner, tillåter denna analys forskaren att visualisera specifika steg av tidig infektion, från prepenetrationshändelser till kolonisering av epidermala celler. Vidare kan forskare enkelt jämföra infektion med vildtypsvampen med infektion med en mutant minskad virulens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av experimentellt material
- Förbered havregrynagar (OMA) genom att blanda havregryn tills det är ett fint pulver. Tillsätt 25 g havregrynspulver och 15 g agar till 500 mlddH2Ooch autoklav på mediecykeln (alternativt koka upp i 20 minuter). Häll mediet i sterila 60 mm petriskålar.
OBS: Andra medietyper som inducerar sporulering, såsom V8-agar, är acceptabla för detta protokoll. - Plate M. oryzae filtrerar direkt på OMA-plattorna med sterila pincett och låter dem täcka hela plattan (9-12 dagar). Placera plattorna i en tillväxtinkubator vid 25 °C med 12:12 h dag:nattcykler för att inducera sporulering.
OBS: Vissa mutanter växer långsammare och kräver ytterligare vård (t.ex. komplett media först, sedan en överföring till OMA), och kan ta ytterligare en vecka för att producera tillräckligt med konidier. - Plantera kornfrön (Hordeum vulgare Lacey) direkt i ett fuktigt tillväxtmedium (t.ex. jordfritt krukväxt) med 10-15 frön per 6 tums kruka. Lägg krukorna i brickor med 1-2 i vatten.
- Ställ in kornets tillväxtkammare på 22 °C under 12 timmar (dagsljus) och 19 °C under 12 timmar (mörkt) vid 60 % relativ luftfuktighet. Fortsätt att vattna från botten för att inte störa fröna.
- Odla kornet tills det andra bladstadiet, ungefär i 14 dagar. Skär kornplantan strax ovanför jordlinjen med steril sax. Skär försiktigt bladmanteln på det första bladet som är öppet i längdriktningen med pincett och ta bort det från basen av det andra bladet med hjälp av pincetten.
OBS: Rengör verktygen (pincett, skalpell, etc.) före användning med 75% -80% etanol. Manteln är det tunna epidermisskiktet som ger fästet från det första till det andra bladet (andra till tredje bladet, etc.; se figur 1). - Lägg det första bladet platt i en steril 60 mm petriskål, innehållande en våt pappershandduk för att bibehålla fuktigheten inuti plattan. Använd skalpellen, skär majoriteten av det första bladet bort från manteln och lämna endast 0,5 i bladvävnaden för montering.
- Tejpa bladvävnaden på botten av Petri-plattan.
OBS: Manteln lockar, men detta är acceptabelt eftersom en krökt mantel håller den konidiala droppen lättare. - Samla 9-12 dagar gamla M. oryzae-plattor och tillsätt 0,5-2 ml sterilt vatten till plattorna. Skrapa försiktigt myceliet med en steril inokuleringsslinga för att frigöra den bifogade konidien. Pipettera försiktigt in den konidiala suspensionen i ett mikrocentrifugrör som innehåller en liten bit ostduk för att filtrera bort alla stora bitar av mycelium från konidialsuspensionen.
OBS: Sporer kan samlas in så tidigt som 7 dagar, om tillväxt och sporulering är tillräckliga för att nå önskad sporkoncentration. Insamlingen kan försenas högst 14 dagar om man arbetar med en långsamt växande genetisk mutant - Den önskade sporkoncentrationen är 5 x 10 4 sporer per ml, men ett intervall (1 x 10 4-1 x 10 5) är acceptabelt. För hög koncentration gör avbildning av enskilda infektionsställen utmanande; späd sporkoncentrationen med sterilt vatten om det behövs.
- Pipettera försiktigt den konidiala suspensionen inuti den rullade bladmanteln. Börja med 25 μL (droppstorleken kan ökas beroende på mantelns storlek, upp till 50 μL).
OBS: Det rekommenderas att utföra tre till fem replikat av varje mutantstam eller kornlinje. Det är vanligt att skador uppstår under färgningsprocessen, därför rekommenderas ytterligare mantelreplikat. - Fyll fyra eller fem 500 ml bägare med ddH2O och värm tills det ångas (med en mikrovågsugn eller kokplatta). Var försiktig när du flyttar varmvattenbägarna. Håll locket på petriskålen över en av de ångande bägarna för att fånga fukt inuti plattan.
- Stapla de infekterade bladmantelplattorna och omge dem med de återstående heta bägarna. Detta skapar en fuktig, fuktig miljö som krävs för att sporerna ska gro.
OBS: Var försiktig när du ångar locken för att säkerställa att inget varmt vatten eller ånga vidrör mantlarna. - Skydda bladmantlarna från ljus, täck med en enfärgad (svart föredragen) gummi- eller plastlåda och låt sitta i 48 timmar eller önskad tidpunkt för avbildning.
OBS: En kartong är inte lämplig eftersom den inte låser in fukten/fuktigheten och absorberar ångan från varmvattenbägarna. Ett låsbart plastkar fungerar bra för att innehålla fuktigheten, och det kan täckas med svart tyg eller en större mörk behållare för att blockera ljuset.
2. Färgning process
- Förbered fläcken enligt följande: Förbered en ny utspädning av 45% ättiksyra och tillsätt 0,1% v / v trypan blue. Alikvot 1 ml av färglösningen i mikrocentrifugrör. Ställ in ett värmeblock eller vattenbad på 40 °C.
- Skär försiktigt bladmanteln bort från tejpen med en rakhyvel eller skalpell. Använd pincett och placera manteln i mikrocentrifugröret och se till att den är helt nedsänkt i färglösningen. Låt 2 timmar för färgämnet att tränga in i bladet. Värm proverna vid 40 °C under färgningsprocessen i ett värmeblock eller vattenbad för att öka färgämnets penetration.
OBS: Mantlarna försöker flyta i mikrocentrifugröret; För att förhindra ofärgade fickor av bladvävnad, fyll rören, sänk ner mantlarna och stäng röret. Lägg inte flera mantlar i samma mikrocentrifugrör. - Skölj bladslidorna försiktigt i 60% glycerol för att ta bort extra färgämne. Tre sköljningar (vardera i färsk glycerol) är i allmänhet tillräckliga. Håll manteln i glycerol tills den är klar att monteras på objektglas.
3. Monterings- och bildprocess
- Placera manteln på en ren glasskiva och tillsätt några droppar 60% glycerol. Använd ett dissekerande mikroskop och två par pincett, rulla försiktigt ut manteln och lämna det inokulerade mitten uppåt. Håll manteln öppen med pincetten och placera täckglaset ovanpå för att förhindra att manteln krullar och blockerar infektionsstället.
OBS: Bladmanteln är mycket ömtålig, och dessa steg måste göras med försiktighet för att förhindra skador på manteln. - Försegla täckglaset med nagellack för långvarig förvaring eller tejp för kortvarig förvaring. Observera bilderna under ett sammansatt ljusmikroskop.
- Ta grundläggande bilder med hjälp av ett mikroskop och en mobiltelefon. Här togs bilder med ett mobiltelefonadapterfäste och en smartphone. För Android-enheter, justera kameraprogrammet till följande inställningar: blinka av, inaktivera Top Shot, inaktivera automatisk justering av ljusstyrka och skuggor och ställ in fotoupplösningen till full.
OBS: Att använda kameraprogrammet på telefonen minskar batteriets livslängd snabbare än vanligt, så att ha extern ström rekommenderas. - När mobiltelefonen är monterad på mikroskopet, ta en bild av en skalmikrometer med målet som kommer att användas för att förvärva data. Data i denna studie förvärvades vid ett 40x 0,65 NA-luftmål, och telefonadaptern monterades på en 10x okulär. Justera telefonens zoom till 2,5x och håll den konsekvent för att bibehålla en konstant pixelstorlek.
- I mitten av manteln finns den största koncentrationen av sporer och infekterar appressoria; Sikta därför på 9-12 bilder av varje mantel för att få betydande siffror för statistisk analys. Antalet sporer och appressoria varierar beroende på koncentrationen av sporer som appliceras.
4. Bildbedömning och räkning med ImageJ (FIJI)
- Överför bilderna till en dator som kör ImageJ (FIJI). För att öppna bilderna, dra och släpp filerna till ImageJ-fältet.
- Ställ in skalan på bilderna genom att läsa in scenmikrometerbilden och rita en rak linje mellan två markeringar för skalan. Öppna Ange skala, skriv in känt avstånd för den uppmätta linjen och skriv in enheten för skalan. På mikrometern, i detta exempel, var den minsta linjen 10 μm. Markera rutan Ställ in global och tryck OK . Alla efterföljande bilder som laddas kommer att ha samma skala.
- Om du vill räkna appressoria, sporer eller andra objekt väljer du punktverktyget . Öppna sedan ROI-hanteraren. Klicka på T-tangenten på tangentbordet för att lägga till punkter i listan. Dessa intressanta regioner kan sparas vid behov och laddas om på samma bild.
- Beroende på experimentella mål, gör ytterligare mätningar, såsom sporlängd, appressoria storlek och bakterierörslängd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En bild av det ursprungliga arbetsflödet för den här tekniken visas i figur 1. Mantlarna skördades från 14 dagar gamla mottagliga "Lacey" kornplantor (H. vulgare). Konidierna skördades från 10 dagar gamla sporulerande M. oryzae OMA-plattor, med en konidialsuspension framställd med sterilddH2Oför en slutlig koncentration av 5 x 104 sporer per ml. Inokulumsuspensionen applicerades direkt på bladmantlarna, som fästes på sterila petriskållor. Plattorna förvarades i en varm, fuktig kammare i 48 timmar utan ljus. Efter inkubationsperioden färgades bladmantlarna med trypanblått och förbereddes för avbildning.
Infektionsställen avbildades med hjälp av en smartphone och smartphone-mikroskopadapter. Minst 10 bilder registrerades för var och en av de testade stammarna av M. oryzae. Experimentet upprepades tre gånger för minst 30 bilder för varje svampstam. Figur 2A visar de representativa resultaten av en framgångsrik mantelanalys, tillsammans med ofärgade och felaktigt färgade bilder som referens.
Beroende på hypotesen kan dessa bilder kvantifieras och analyseras på en mängd olika sätt. För detta experiment, vid 48 h efter inokulering, räknades det totala antalet levande sporer (groddsporer), tillsammans med antalet appressoria och antalet framgångsrikt infekterade celler. En samling av 2,000 slumpmässigt mutageniserade M. oryzae-stammar i en korninfekterande bakgrund genererades i laboratoriet. Patogenicitetsanalyser med spray- och droppinokuleringar avslöjade många mutanter med minskad lesionsstorlek jämfört med den vilda typen (en vanlig fenotyp för M. oryzae-mutanter )11. För att reta isär dessa fenotyper antogs det att den reducerade lesionsstorleken orsakades av hämning av ett av de tidiga infektionsstegen (sporspiring, appressorialbildning, penetrationspinnbildning, initial epidermal cellkolonisering), som lättast testas via bladmantelanalysen. En lovande kandidat från mutagenesprojektet identifierades med hjälp av en framåtriktad genetisk med namnet J99A12. Denna mutant visade inte känslighet för vare sig kvävehungrande eller reaktiva syreförhållanden under skärmen. Under uppföljningsexperiment producerade J99A ett betydande antal appressoria på en hydrofob yta, men visade minskad lesionsstorlek på levande korn. Vid testning med mantelanalysen utvecklade J99A framgångsrikt appressoria och penetrationspinnar, som trängde in i bladmanteln men inte producerade invasiva hyfer en gång inuti, vilket tyder på att infektionen stannade vid penetrationspinnen (figur 2B). Framgångsrikt infekterade celler identifierades genom närvaron av infektiösa hyfer inuti bladmantelns vävnad. Att jämföra antalet appressoria med antalet infekterade celler gav en procentandel av framgångsrikt infekterande appressoria. För vildtyp 4091-5-8 invaderade och koloniserade 87% av appressoria framgångsrikt cellen, medan i mutanten J99A hade endast 36% av appressoria hyfer inuti cellen12.
Figur 1: Bladslidor skördade från 10 dagar gammalt korn och försiktigt avlägsnade med verktyg rengjorda i etanol. Conidia samlas in och koncentrationen justeras till 0,5-1,0 x 105 per milliliter med sterilt vatten. De isolerade mantlarna tejpas inuti en 60 cm Petri-platta och konidialupphängningen laddas i manteln. De inokulerade proverna förvaras vid rumstemperatur, i mörker, med bägare med varmt vatten för fuktighet. Proverna färgas i 45% ättiksyra + 0,1% trypanblått i 1-2 timmar vid 40 °C och sköljs sedan i 60% glycerol tre gånger i 48 timmar efter inokulering. Färgade prover monteras och avbildas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa resultat från färgningsprotokollet. (A) Avvikelser från färgningsprotokollet kan resultera i suboptimala resultat. Värmen och ättiksyran tjänar till att försiktigt mjukna bladvävnaden. Sköljningarna efter färgning i 60% glycerol tar inte bara bort överflödig fläck, utan hjälper till att minska ljusspridningen som orsakas av bladet och förbättra bildkvaliteten. Skalstreck = 50 μm. (B) Representativa bilder som visar robustheten i denna analys för att se misslyckad penetration och efterföljande infektionsförsök av J99A (pilspetsar), jämfört med framgångsrika försök med 4091WT som resulterade i produktion av invasiva hyfer till bladvävnaden (pilar). Skalstänger = 50 μm. Alla bilder togs 48 timmar efter infektion. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns många vanliga analyser tillgängliga för att testa M. oryzae-stammar som ger en makroskopisk bild av ett kompatibelt eller inkompatibelt infektionssvar, såsom spray- eller droppinokuleringar, och användningen av klassificeringssystem för att kvantifiera lesionsstorlekarna13,14. En annan vanlig analys för M. oryzae är att testa patogenens förmåga att bilda sin specialiserade penetrationsstruktur, apppressorium15. Här beskrivs en enkel metod för att snabbt och effektivt observera förändringar i tidiga infektionsprocesser på cellnivå, i den mer facila kornväxten. Denna metod är unik genom att den använder allmän laboratorieutrustning och en smartphone för datainsamling. Denna metod förnekar behovet av kamerautrustade och datorstyrda mikroskop, vilket gör detta protokoll överkomligt för alla laboratorier. Med hjälp av denna metod kunde vi identifiera vid vilket steg mutant J99A-infektion stoppades, en fråga som tidigare experiment inte har kunnat klargöra.
Infektionsprocessen av M. oryzae i ris, särskilt kolonisering av de första epidermala cellerna, har avbildats väl med hjälp av fluorescerande proteiner, markörer, färgämnen, konfokal avbildning och avancerad mikroskopi16. Dessa typer av avbildningsexperiment är dyra, tidskrävande och kräver specifik expertis. Många laboratorier, som använder homolog rekombination, kan skapa genetiska mutanter av M. oryzae för att analysera enskilda geners roller i infektionscykeln, men kanske inte har tillgång till den avancerade utrustning och expertis som krävs för att utforska den underliggande cellbiologin. Detta protokoll är avsett att hjälpa till att överbrygga detta gap genom att endast använda ett sammansatt ljusmikroskop och en smartphone för att fånga digitala bilder och generera videor av z-stack-typ av fasta bladmantelvävnader. Denna metod gör det möjligt att avbilda några celllager i vävnaden och fånga de invasiva svamphyferna i upp till 48 timmar. Bladmanteln av ris och korn har liknande egenskaper; De är bara några celllager tjocka och har mindre kloroplaster, vilket gör dem lättare att avbilda. Som nämnts ovan är korn mindre hydrofobt och lättare att odla än ris, och många stammar av M. oryzae kan orsaka infektion på ris och korn, vilket gör detta experiment till ett enkelt byte för de mer komplicerade risanalyserna.
Några begränsningar med denna metod inkluderar att använda smarttelefonens videofunktion för att samla in z-fältdata, eftersom z-inkrementet för bildhastigheten är okänt. En annan begränsning är att det kräver fast vävnad (inte levande celler). På grund av protokollets snabbhet och lätthet kan denna begränsning dock övervinnas genom att undersöka olika tidpunkter efter infektion.
Ett av de viktigaste stegen i protokollet är korrekt färgning. Felaktig sköljning orsakar överskott av färgämne i glidberedningen, vilket orsakar färgmättnad och gör patogenvävnaden oskiljbar från bladvävnaden. Under tiden förhindrar underfärgning patogenvävnaden från att kontrastera mot bladvävnaden.
Den ovan nämnda metoden är anpassningsbar till många vetenskapliga frågor och kan användas för att bedöma svampmutanter, bedöma olika grader av genetisk resistens i kornväxter och testa effektiviteten hos tidigare tillämpade svampkontrollmetoder. Det är också möjligt att utvidga denna metod till andra växtpatogeninteraktioner, särskilt andra monocotbladmantlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner finansiering från USDA-NIFA-utmärkelsen 2016-67013-24816.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996 (2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84 (2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , Springer. Cham. 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188 (2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , Doctoral dissertation (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675 (2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
