Summary
Este é um protocolo simples de um ensaio de bainha de folha de cevada usando reagentes mínimos e equipamentos de laboratório comuns (incluindo um smartphone básico). O objetivo é visualizar o processo de infecção precoce da doença blástica em laboratórios sem acesso a equipamentos avançados de microscopia.
Abstract
Entender como plantas e patógenos interagem, e se essa interação culmina em defesa ou doença, é necessário para desenvolver estratégias mais fortes e sustentáveis para a saúde das plantas. Avanços em métodos que capturam amostras de fitopatógenos de forma mais eficaz durante a infecção e colonização produziram ferramentas como o ensaio da bainha foliar do arroz, que tem sido útil no monitoramento da infecção e dos eventos de colonização precoce entre o arroz e o patógeno fúngico, Magnaporthe oryzae. Este patógeno hemibiotrófico causa severa perda de doenças em arroz e monocotiledôneas relacionadas, incluindo milheto, centeio, cevada e, mais recentemente, trigo. O ensaio de bainha foliar, quando realizado corretamente, produz uma seção opticamente clara da planta, com várias camadas de espessura, o que permite aos pesquisadores realizar imagens de células vivas durante o ataque do patógeno ou gerar amostras fixas coradas para características específicas. Investigações celulares detalhadas sobre a interação cevada-M. oryzae têm ficado atrás daquelas do hospedeiro arroz, apesar da crescente importância deste grão como fonte de alimento para animais e humanos e como bebidas fermentadas. Relata-se aqui o desenvolvimento de um ensaio de bainha foliar de cevada para estudos intrincados de interações de M. oryzae durante as primeiras 48 h pós-inoculação. O ensaio da bainha foliar, independentemente da espécie estudada, é delicado; É fornecido um protocolo que abrange tudo, desde as condições de crescimento da cevada e obtenção de uma bainha foliar, até a inoculação, incubação e imagem do patógeno nas folhas das plantas. Esse protocolo pode ser otimizado para triagem de alto rendimento usando algo tão simples quanto um smartphone para fins de imagem.
Introduction
Magnaporthe oryzae, o fungo da brusone do arroz, infecta uma variedade de culturas de grãos, incluindo cevada, trigo e arroz1. Este patógeno causa doenças devastadoras e representa uma ameaça mundial para essas valiosas culturas, causando perda completa de safra se não for controlado. Muitos laboratórios ao redor do mundo se concentram na doença da brusone do arroz devido à sua ameaça global e seus atributos como um excelente modelo para interações planta-fungos2. Foi completamente sequenciada, e a genética de seu ciclo infeccioso, particularmente os eventos iniciais, foi estabelecida 3,4. O ciclo de vida começa com um esporo germinando na superfície da folha, formando a estrutura de penetração especializada chamada apressório. O apressório penetra no tecido foliar e a infecção continua com o desenvolvimento de lesões que iniciam o processo de esporulação e disseminação da doença4. Prevenir qualquer um desses eventos iniciais inibiria drasticamente essa doença devastadora. Consequentemente, a maioria das pesquisas atuais sobre a doença blástica tem se concentrado nas etapas iniciais da infecção, desde os conídios germinados formando um apressório até o desenvolvimento das hifas invasivas e do complexo interfacial biotrófico (BIC)5.
A vasta quantidade de pesquisas sobre a brusone tem sido conduzida em arroz, embora M. oryzae seja um patógeno significativo para uma variedade de culturas, e cepas recém-evoluídas estejam emergindo como uma ameaça global ao trigo6. Enquanto o arroz é uma das três principais culturas básicas usadas para alimentar a população, juntamente com o trigo e o milho, a cevada é o quarto grão de cereal em termos de ração animal e produção de cerveja7. À medida que a indústria da cerveja artesanal cresce, cresce também o valor econômico da cevada. Existem vantagens distintas do uso de M. oryzae e cevada como um patossistema para estudar a doença blástica. Primeiro, existem cepas de M. oryzae que infectam apenas cevada, bem como cepas que podem infectar várias espécies de gramíneas. Por exemplo, 4091-5-8 infecta principalmente apenas cevada, enquanto Guy11 e 70-15 podem infectar cevada e arroz8. Essas cepas são geneticamente semelhantes e o processo de infecção é comparável9. Em segundo lugar, sob condições padrão de laboratório e estufa, a cevada é mais fácil de cultivar, pois não tem os requisitos complicados do arroz (controle conciso de temperatura, alta umidade, espectros de luz específicos). Há também desafios de imagem com o arroz devido à hidrofobicidade da superfície foliar, que a cevada não apresenta10.
Este protocolo apresenta um método simples para isolar e utilizar efetivamente bainhas foliares de cevada para análise microscópica de múltiplos estágios de infecção, utilizando material laboratorial comum e um smartphone para coleta de dados. Este método para o ensaio da bainha da folha de cevada é adaptável para laboratórios em todo o mundo, pois requer suprimentos mínimos, e ainda fornece uma imagem clara da interação microscópica entre o patógeno e as primeiras células que ele infecta. Enquanto ensaios de patogenicidade, como a inoculação por spray ou gotícula, podem fornecer uma visão macro da capacidade do patógeno de formar lesões, este ensaio permite ao pesquisador visualizar etapas específicas da infecção precoce, desde eventos de pré-penetração até a colonização de células epidérmicas. Além disso, os pesquisadores podem facilmente comparar a infecção com o fungo do tipo selvagem à infecção com um mutante reduzido em virulência.
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Protocol
1. Preparação de materiais experimentais
- Prepare o ágar aveia (OMA) misturando a aveia até obter um pó fino. Adicionar 25 g de aveia em pó e 15 g de ágar a 500 mL de ddH2O e autoclave em ciclo de meio (alternativamente, deixe ferver por 20 min). Despeje o meio em placas de Petri estéreis de 60 mm.
NOTA: Outros tipos de meios que induzem esporulação, como ágar V8, são aceitáveis para este protocolo. - A placa M. oryzae filtra diretamente nas placas OMA usando pinças estéreis e permite que cubram toda a placa (9-12 dias). Coloque as placas em uma incubadora de crescimento a 25 °C com ciclos dia:noite de 12:12 h para ajudar a induzir a esporulação.
NOTA: Alguns mutantes crescem mais lentamente e requerem cuidados adicionais (por exemplo, mídia completa primeiro, depois uma transferência para o OMA), e podem levar uma semana adicional para produzir conídios suficientes. - Plante diretamente sementes de cevada (Hordeum vulgare Lacey) em um meio de crescimento úmido (por exemplo, meio de vaso sem solo) com 10-15 sementes por vaso de 6 polegadas. Coloque as panelas em bandejas com 1-2 em água.
- Defina as condições da câmara de crescimento da cevada como 22 °C por 12 h (luz do dia) e 19 °C por 12 h (escuro) com 60% de umidade relativa. Continue a regar do fundo para não perturbar as sementes.
- Cultivar a cevada até o estágio de segunda folha, aproximadamente por 14 dias. Usando tesoura estéril, corte a planta de cevada logo acima da linha do solo. Usando pinça e um barbeador/bisturi, corte cuidadosamente a bainha foliar da primeira folha que está aberta longitudinalmente e, usando a pinça, retire-a da base da segunda folha.
OBS: Limpe as ferramentas (pinças, bisturi, etc.) antes de usar com etanol 75%-80%. A bainha é a fina camada da epiderme que fornece a fixação da primeira à segunda folha (segunda à terceira folha, etc.; ver Figura 1). - Coloque a primeira folha plana em uma placa de Petri estéril de 60 mm, contendo uma toalha de papel molhada para manter a umidade dentro da placa. Com o bisturi, corte a maior parte da primeira folha longe da bainha, deixando apenas 0,5 pol do tecido foliar para montagem.
- Tape o tecido foliar no fundo da placa de Petri.
NOTA: A bainha se enrola, mas isso é aceitável, pois uma bainha enrolada segura a gota de conídio com mais facilidade. - Coletar placas de M. oryzae com 9-12 dias de idade e adicionar 0,5-2 mL de água estéril às placas. Usando uma alça de inoculação estéril, raspe suavemente o micélio para liberar os conídios anexados. Pipetar cuidadosamente a suspensão de conídios para um tubo de microcentrífuga contendo um pequeno pedaço de pano de queijo para filtrar quaisquer pedaços grandes de micélio da suspensão de conídios.
NOTA: Os esporos podem ser coletados a partir de 7 dias, se o crescimento e a esporulação forem suficientes para atingir a concentração de esporos desejada. A coleta pode ser adiada no máximo 14 dias se trabalhar com um mutante genético de crescimento lento - A concentração de esporos desejada é de 5 x 10 4 esporos por mL, mas um intervalo (1 x 10 4-1 x 10 5) é aceitável. Uma concentração muito alta torna a imagem de locais de infecção individuais desafiadores; Diluir a concentração de esporos com água estéril, se necessário.
- Pipetar cuidadosamente a suspensão conidial dentro da bainha de folhas laminadas. Comece com 25 μL (o tamanho da gota pode ser aumentado dependendo do tamanho da bainha, até 50 μL).
NOTA: Recomenda-se realizar de três a cinco réplicas de cada cepa mutante ou linha de cevada. É comum que ocorram danos durante o processo de coloração, portanto, réplicas adicionais da bainha são recomendadas. - Encha quatro ou cinco copos de 500 mL com ddH2O e aqueça até cozinhar no vapor (usando um micro-ondas ou placa de aquecimento). Tenha cuidado ao mover os copos de água quente. Segure a tampa da placa de Petri sobre um dos copos fumegantes para reter a umidade dentro do prato.
- Empilhe as placas de bainha de folhas infectadas e envolva-as com os copos quentes restantes. Isso cria um ambiente úmido e úmido, necessário para que os esporos germinem.
NOTA: Tenha cuidado ao cozinhar as tampas para garantir que nenhuma água quente ou vapor toque nas bainhas. - Proteja as bainhas das folhas da luz, cubra com uma caixa de borracha ou plástico de cor sólida (preto preferencial) e deixe descansar por 48 h ou o tempo desejado para a obtenção de imagens.
NOTA: Uma caixa de papelão não é adequada porque não trava a umidade/umidade e absorve o vapor dos copos de água quente. Uma cuba de plástico com trava funciona bem para conter a umidade, e pode ser coberta com tecido preto ou um recipiente escuro maior para bloquear a luz.
2. Processo de coloração
- Prepare a mancha da seguinte forma: prepare uma diluição fresca de ácido acético a 45% e adicione 0,1% v/v de azul de tripano. Alíquota 1 mL da solução corante em tubos de microcentrífuga. Ajuste um bloco de calor ou banho-maria para 40 °C.
- Com cuidado, usando uma navalha ou bisturi, corte a bainha de folhas longe da fita. Usando pinças, coloque a bainha no tubo da microcentrífuga e certifique-se de que ela esteja completamente submersa na solução do corante. Aguarde 2 h para que o corante penetre na folha. Aquecer as amostras a 40 °C durante o tempo de processo de coloração em bloco térmico ou banho-maria para aumentar a penetração do corante.
OBS: As bainhas tentam flutuar no tubo da microcentrífuga; Para evitar bolsas de tecido foliar sem manchas, preencha os tubos, submerja as bainhas e feche o tubo. Não coloque várias bainhas no mesmo tubo de microcentrífuga. - Enxágue cuidadosamente as bainhas das folhas em glicerol a 60% para remover o corante extra. Três enxaguamentos (cada um em glicerol fresco) são geralmente suficientes. Mantenha a bainha em glicerol até que esteja pronta para montar em lâminas.
3. Processo de montagem e geração de imagens
- Coloque a bainha em uma lâmina de vidro limpa e adicione algumas gotas de glicerol a 60%. Com o uso de um microscópio dissecante e dois pares de pinças, desenrole cuidadosamente a bainha, deixando o centro inoculado voltado para cima. Mantenha a bainha aberta com a pinça e coloque a lamínula por cima para evitar que a bainha se enrole e bloqueie o local da infecção.
OBS: A bainha foliar é muito frágil, e essas etapas precisam ser feitas com cuidado para evitar danos à bainha. - Sele a tampa usando esmalte para armazenamento de longo prazo ou fita para armazenamento de curto prazo. Observe as lâminas sob um microscópio de luz composta.
- Tire imagens básicas usando um microscópio e um telefone celular. Aqui, as imagens foram feitas com um adaptador de celular e um smartphone. Para dispositivos Android, ajuste o aplicativo da câmera para as seguintes configurações: flash desligado, desativar Top Shot, desativar o ajuste automático de brilho e sombras e definir a resolução da foto como total.
NOTA: Usar o aplicativo da câmera no telefone diminui a vida útil da bateria mais rápido do que o normal, portanto, é recomendável ter energia externa. - Uma vez que o celular é montado no microscópio, tire uma imagem de um micrômetro de escala com o objetivo que será usado para adquirir os dados. Os dados deste estudo foram adquiridos em uma objetiva de ar de 40x 0,65 NA, e o adaptador de telefone foi montado em uma ocular de 10x. Ajuste o zoom do telefone para 2,5x e mantenha-o consistente para manter um tamanho de pixel constante.
- O centro da bainha abriga a maior concentração de esporos e apressórios infectantes; Portanto, busque-se de 9 a 12 imagens de cada bainha para obter números significativos para análise estatística. O número de esporos e apressórios varia de acordo com a concentração de esporos aplicados.
4. Avaliação e contagem de imagens utilizando ImageJ (FIJI)
- Transfira as imagens para um computador executando o ImageJ (FIJI). Para abrir as imagens, arraste e solte os arquivos na barra do ImageJ.
- Defina a escala das imagens carregando a imagem do micrômetro do estágio e desenhando uma linha reta entre duas marcações para a escala. Abra Definir Escala, digite a Distância Conhecida para a linha medida e digite a unidade para a escala. No micrômetro, neste exemplo, a menor linha era de 10 μm. Marque a caixa Definir Global e pressione OK. Todas as imagens subsequentes carregadas terão a mesma escala.
- Para contar apressórios, esporos ou outros objetos, selecione a ferramenta Ponto . Em seguida, abra o Gerenciador de ROI. Clique na tecla T no teclado para adicionar pontos à lista. Essas regiões de interesse podem ser salvas, se necessário, e recarregadas na mesma imagem.
- Dependendo dos objetivos experimentais, faça medições adicionais, como comprimento dos esporos, tamanho dos apressórios e comprimento do tubo germinativo.
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Representative Results
Uma representação do fluxo de trabalho inicial para essa técnica é exibida na Figura 1. As bainhas foram colhidas de plantas de cevada (H. vulgare) suscetíveis aos 14 dias de idade. Os conídios foram colhidos de placas de OMA esporulantes de M. oryzae com 10 dias de idade, com uma suspensão de conídios preparada com ddH2O estéril para uma concentração final de 5 x 104 esporos por mL. A suspensão de inóculo foi aplicada diretamente nas bainhas foliares, as quais foram fixadas em placas de Petri estéreis. As placas foram mantidas em câmara quente e úmida por 48 h sem luz. Após o período de incubação, as bainhas foliares foram coradas com azul de tripano e preparadas para obtenção de imagens.
Os locais de infecção foram fotografados usando um adaptador de microscópio de smartphone e smartphone. Um mínimo de 10 imagens foram registradas para cada uma das cepas testadas de M. oryzae. O experimento foi repetido três vezes para um mínimo de 30 imagens para cada cepa fúngica. A Figura 2A mostra os resultados representativos de um ensaio bem-sucedido com bainha, juntamente com imagens não coradas e inadequadamente coradas para referência.
Dependendo da hipótese, essas imagens podem ser quantificadas e analisadas de várias maneiras. Para este experimento, 48 h após a inoculação, o número total de esporos vivos (esporos germinados) foi contado, juntamente com o número de apressórios e o número de células infectadas com sucesso. Uma coleção de 2.000 cepas de M. oryzae mutagenizadas aleatoriamente em um fundo infectante de cevada foi gerada no laboratório. Ensaios de patogenicidade usando inoculações por spray e gota revelaram muitos mutantes com tamanho de lesão reduzido em comparação com o tipo selvagem (um fenótipo comum para mutantes de M. oryzae )11. Para separar esses fenótipos, hipotetizou-se que o tamanho reduzido da lesão fosse causado pela inibição de uma das etapas iniciais da infecção (germinação de esporos, formação apressória, formação de pinos de penetração, colonização inicial de células epidérmicas), que é mais facilmente testada através do ensaio de bainha foliar. Um candidato promissor do projeto de mutagênese foi identificado usando uma genética avançada chamada J99A12. Este mutante não mostrou sensibilidade a condições de falta de nitrogênio ou oxigênio reativo durante a tela. Durante os experimentos de acompanhamento, J99A produziu um número significativo de apressórios em uma superfície hidrofóbica, mas exibiu tamanho reduzido da lesão em cevada viva. Quando testado usando o ensaio da bainha, o J99A desenvolveu com sucesso apressórios e pinos de penetração, que penetraram na bainha foliar, mas não produziram hifas invasoras uma vez em seu interior, sugerindo que a infecção parou no pino de penetração (Figura 2B). Células infectadas com sucesso foram identificadas pela presença de hifas infectantes no interior do tecido da bainha foliar. A comparação entre o número de apressórios e o número de células infectadas forneceu uma porcentagem de apressórios infectados com sucesso. Para o tipo selvagem 4091-5-8, 87% dos apressórios invadiram e colonizaram a célula com sucesso, enquanto no mutante J99A, apenas 36% dos apressórios apresentaram hifas no interior da célula12.
Figura 1: Bainhas foliares colhidas de cevada com 10 dias de idade e cuidadosamente removidas com ferramentas limpas em etanol. Os conídios são coletados e a concentração é ajustada para 0,5-1,0 x10,5 por mililitro com água estéril. As bainhas isoladas são coladas dentro de uma placa de Petri de 60 cm, e a suspensão conídica é carregada na bainha. As amostras inoculadas são mantidas à temperatura ambiente, no escuro, com copos de água quente para umidade. As amostras são coradas em ácido acético a 45% + azul de tripano a 0,1% por 1-2 h a 40 °C e, em seguida, lavadas em glicerol a 60% três vezes por 48 h pós-inoculação. Amostras coradas são montadas e fotografadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados representativos do protocolo de coloração. (A) Desvios do protocolo de coloração podem resultar em resultados subótimos. O calor e o ácido acético servem para suavizar suavemente o tecido foliar. Os enxaguantes pós-coloração em glicerol a 60% não só removem o excesso de mancha, mas ajudam a reduzir a dispersão de luz causada pela folha e melhoram a qualidade da imagem. Barras de escala = 50 μm. (B) Imagens representativas mostrando a robustez neste ensaio para ver a penetração falhada e as tentativas de infecção subsequentes de J99A (pontas de setas), em comparação com tentativas bem-sucedidas de 4091WT que resultaram na produção de hifas invasoras para o tecido foliar (setas). Barras de escala = 50 μm. Todas as imagens foram obtidas 48 h após a infecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Existem muitos ensaios comumente utilizados disponíveis para testar cepas de M. oryzae que fornecem uma visão em nível macroscópico de uma resposta infecciosa compatível ou incompatível, como inoculações em spray ou gotículas, e o uso de sistemas de classificação para quantificar o tamanho das lesões13,14. Outro ensaio comum para M. oryzae é testar a capacidade do patógeno de formar sua estrutura de penetração especializada, o apressório15. Descrito aqui é um método fácil para observar mudanças nos processos de infecção precoce de forma rápida e eficiente em nível celular, na planta de cevada mais fácil. Este método é único, na medida em que utiliza equipamentos gerais de laboratório e um smartphone para captura de dados. Este método elimina a necessidade de microscópios equipados com câmera e controlados por computador, tornando este protocolo acessível para qualquer laboratório. Usando esse método, conseguimos identificar em qual etapa a infecção mutante J99A foi interrompida, uma questão que experimentos anteriores não conseguiram esclarecer.
O processo de infecção de M. oryzae em arroz, particularmente a colonização das primeiras células epidérmicas, tem sido bem avaliado usando proteínas fluorescentes, marcadores, corantes, imagens confocais e microscopia avançada16. Esses tipos de experimentos de imagem são caros, demorados e exigem conhecimentos específicos. Muitos laboratórios, usando recombinação homóloga, são capazes de criar mutantes genéticos de M. oryzae para analisar os papéis do gene individual no ciclo de infecção, mas podem não ter acesso ao equipamento avançado e à experiência necessária para explorar a biologia celular subjacente. Este protocolo destina-se a ajudar a preencher esta lacuna, usando apenas um microscópio de luz composto e um smartphone para capturar imagens digitais e gerar vídeos do tipo z-stack de tecidos fixos da bainha foliar. Este método permite obter imagens de algumas camadas de células no tecido, capturando as hifas fúngicas invasivas por até 48 horas. A bainha foliar do arroz e da cevada tem características semelhantes; Eles têm apenas algumas camadas de células com espessura e menos cloroplastos, tornando-os mais fáceis de imaginar. Como dito acima, a cevada é menos hidrofóbica e mais fácil de cultivar do que o arroz, e muitas cepas de M. oryzae podem causar infecção no arroz e na cevada, tornando este experimento uma troca fácil para os ensaios de arroz mais complicados.
Algumas limitações desse método incluem o uso da função de vídeo do smartphone para coletar dados de campo z, já que o incremento z para a taxa de quadros é desconhecido. Outra limitação é que requer tecido fixo (não células vivas). No entanto, devido à rapidez e facilidade do protocolo, essa limitação poderia ser superada examinando vários momentos pós-infecção.
Uma das etapas mais cruciais do protocolo é a coloração adequada. O enxágue inadequado causa excesso de corante no preparo das lâminas, causando saturação do corante e tornando o tecido patógeno indistinguível do tecido foliar. Enquanto isso, a subcoloração impede que o tecido patogênico contraste com o tecido foliar.
O método acima mencionado é adaptável a muitas questões científicas, e pode ser usado para avaliar mutantes fúngicos, avaliar vários graus de resistência genética em plantas de cevada e testar a eficiência de métodos de controle fúngico aplicados anteriormente. Também é possível estender este método para outras interações planta-patógeno, particularmente outras bainhas foliares de monocotiledôneas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem o financiamento do prêmio USDA-NIFA 2016-67013-24816.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Cell phone | Pixel 4A | Any smartphone with a rear facing camera that can be mounted in an a holder will suffice. | |
| Cell phone Microscope adapter | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63&sr=8-2 -spons&psc=1&spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscope | AmScope | FM690TC | 40x–2500x Trinocular upright epi-fluorescence microscope |
| Oatmeal old fashioned rolled oats | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 &hvadid=312253390021&hvpos= &hvnetw=g&hvrand=98212627704 6839544&hvpone=&hvptwo=&hvq mt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint =&hvlocphy=9007494&hvtargid =pla-568492637928&psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| Rectangular coverglass | Corning | CLS2975245 | |
| Slides, microscope | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Stage micrometer | OMAX | A36CALM7 | 0.1 mm and 0.01 mm Microscope calibration slide |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
References
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