Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

חקירת ביולוגיה ומטבוליזם של שומן בז' באמצעות מערכת ההפעלה CRISPR SunTag-p65-HSF1

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64849
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Obesity and Comorbidities Research Center, State University of Campinas, 2Department of Structural and Functional Biology, Institute of Biology, State University of Campinas
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מציג את השימוש ב-CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) באדיפוציטים (AdipoSPH) כאסטרטגיה חלופית לווירוס הקשור לאדנו (AAV) לחקר ביולוגיה של שומן בז'. הזרקת In vivo של sgRNA נושא AAV המכוונת לגן האנדוגני Prdm16 מספיקה כדי לגרום להתפתחות שומן בז' ולשפר את תוכנית הגן התרמוגני.

Abstract

טכנולוגיית CRISPR (ראשי תיבות של Clustered regular interspaced short palindromic repeats) חוללה מהפכה בביולוגיה, וכלים עדכניים יושמו הרבה מעבר לעריכה הגנטית שתוארה במקור. מערכת הפעלת CRISPR (CRISPRa) משלבת את חלבון Cas9 (dCas9) הבלתי פעיל קטליטית עם מודולי שעתוק נפרדים כדי לגרום לביטוי גנים אנדוגניים. SunTag-p65-HSF1 (SPH) היא טכנולוגיית CRISPRa שפותחה לאחרונה המשלבת רכיבים של מתווכי הפעלה סינרגטיים (SAMs) עם מפעילי SunTag. מערכת זו מאפשרת ביטוי יתר של גנים בודדים או מרובים על ידי תכנון RNA חד-מנחה מותאם אישית (sgRNA). במחקר זה, עכבר SPH שפותח בעבר שימש ליצירת עכבר מותנה המבטא SPH באדיפוציטים (שושלת adiponectin Cre), בשם AdipoSPH. כדי לגרום לפנוטיפ שומן לבן עד בז' (השחמה), הוזרק וירוס הקשור לאדנו (AAV) הנושא sgRNA המכוון לגן האנדוגני Prdm16 (גורם שעתוק מבוסס היטב הקשור להתפתחות שומן חום ובז') לרקמת השומן הלבן המפשעה (iWAT). מודל עכבר זה גרם לביטוי של Prdm16 אנדוגני והפעיל את תוכנית הגן התרמוגני. יתר על כן, ביטוי יתר של Prdm16 המושרה על ידי SPH במבחנה שיפר את צריכת החמצן של אדיפוציטים בצבע בז', פנוסקופיה של התוצאות של מודל עכבר מהונדס קודם של Prdm16. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר מודל עכבר רב-תכליתי, חסכוני וחסכוני בזמן לחקר ביולוגיה של רקמת שומן.

Introduction

אדיפוציטים בצבע בז' (או בריט) הם אדיפוציטים המבטאים חלבון 1 (UCP1) ועשירים במיטוכונדריה השוכנים במחסני רקמת השומן הלבנה (WAT). שומן בז' יוצא מתת-קבוצה של אבות אדיפוציטים או אדיפוציטים לבנים בוגרים בתגובה לחשיפה לקור ולגירויים אחרים 1,2. אדיפוציטים בצבע בז' יכולים להמיר אנרגיה לחום באופן תלוי UCP1 או עצמאי3. ללא קשר לתפקוד התרמוגני, שומן בז 'יכול גם לשפר את הבריאות המטבולית באמצעים אחרים, כגון הפרשת אדיפוקינים ופעילויות אנטי דלקתיות ואנטי פיברוטיות. מחקרים בעכברים ובבני אדם הראו כי השראת שומן בז' משפרת את רמת הגלוקוז בכל הגוף ואת הומאוסטזיס השומנים3. עם זאת, למרות שהידע שלנו על ביולוגיה של שומן בז' התפתח במהירות בשנים האחרונות, רוב היתרונות המטבוליים שלו והמנגנונים הקשורים אליו עדיין אינם מובנים במלואם.

חזרות פלינדרומיות קצרות מקובצות במרווחים קבועים (CRISPR) תוארו לראשונה בתאים איקריוטים ככלי המסוגל ליצור שבר דו-גדילי (DSB) באתר מסוים בגנום באמצעות פעילות הנוקלאז של חלבון Cas9 4,5. Cas9 מונחה על ידי RNA סינתטי חד-מנחה (sgRNA) כדי להתמקד באזור גנומי מסוים, מה שמוביל ל-DNA DSB. בנוסף לשימוש בנוקלאז Cas9 למטרות עריכה, טכנולוגיית CRISPR-Cas9 התפתחה לשימוש ככלי לוויסות גנים ספציפילרצף 6. הפיתוח של חלבון Cas9 לא פעיל קטליטית (dCas9) והקשר של מודולי שעתוק המסוגלים לשפר ביטוי גנים הולידו כלי הפעלת CRISPR (CRISPRa). מספר מערכות CRISPRa התפתחו, כגון VP647,8, מתווך הפעלה סינרגטית (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 ו-SunTag-p65-HSF1 (SPH)14, המשלב את הרכיבים של מפעילי SAM ו-SunTag. לאחרונה הוכח כי הביטוי המושרה של גנים נוירוגניים בנוירובלסטים N2a ובאסטרוציטים ראשוניים גבוה יותר באמצעות SPH בהשוואה למערכות CRISPRaאחרות 14, מה שמדגים SPH ככלי CRISPRa מבטיח.

כאן, ניצלנו עכבר SPH14 שפותח בעבר כדי ליצור מודל עכבר מותנה המבטא SPH במיוחד באדיפוציטים באמצעות שושלת אדיפונקטין Cre (AdipoSPH). באמצעות וירוס הקשור לאדנו (AAV) הנושא את ה-gRNA המכוון לגן האנדוגני Prdm16, השחמה (המרה מלבן לבז') של WAT מפשעתי (iWAT) הושרה כדי להגביר את הביטוי של תוכנית הגנים התרמוגניים. יתר על כן, ביטוי יתר של Prdm16 במבחנה שיפר את צריכת החמצן. לכן, פרוטוקול זה מספק מודל עכבר SPH רב-תכליתי לחקר מנגנוני התפתחות שומן בז' ברקמת השומן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למדריך אוניברסיטת קמפינאס לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (פרוטוקול CEUA #5810-1/2021).

1. שיבוט מולקולרי

  1. תכנון רנ"א מנחה יחיד (sgRNAs)
    1. תכנן sgRNA להפעלת CRISPR באמצעות CHOPCHOP, הזמין ב- https://chopchop.cbu.uib.no/, או כל כלי מתאים אחר. השתמש בפרמטרים הבאים כדי לתכנן sgRNA המכוון לגן Prdm16: יעד: Prdm16; בתוך: Mus musculus; שימוש: Crispr/Cas9; עבור: הפעלה.
      הערה: תכנן sgRNA עבור כל אזור עניין המתפרש על פני אזור 200 bp במעלה הזרם של התחלת תמלול (TSS). לדוגמה, sgRNA המכוון Prdm16 המשמש במחקר זה קושר 154 bp במעלה הזרם של TSS.
    2. הוסף שלוחות ל-sgRNA כך שיתאימו לאתר הגבלת SacI בעמוד השדרה הווקטורי pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (ראה טבלת חומרים). כולל: 5'- (N20)AGCT-3' (N = נוקלאוטידים). לדוגמה, הרצף המכוון לגן Prdm16 הוא 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAAGGGG-3', ועם שלוחות הוא 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.
    3. השג את רצף המשלים ההפוך sgRNA 3' באמצעות הכלי הזמין ב- https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. לדוגמה, רצף sgRNA 3' המכוון לגן Prdm16 הוא 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTTCCCC-5'.
  2. חישול אוליגונוקלאוטידים משלימים חד-גדיליים
    1. הוסף 1 μL מכל אוליגונוקלאוטיד חד-גדילי 5' ו-3' (ריכוז מלאי: 100 μM), 1 μL של חיץ ליגאז T4, 0.5 μL של T4 polynucleotide kinase (PNK) (1 × 104 יחידות/מ"ל), ו-6.5 μL של H2O לנפח תגובה סופי של 10 μL. אנאל את האוליגונוקלאוטידים החד-גדיליים המשלימים באמצעות תרמוסייקלר בתנאים הבאים: 37°C למשך 30°C ו-95°C למשך 5 דקות, ולאחר מכן קצב ירידה של 5°C/min.
      הערה: האנזים PNK מסופק עם מאגר PNK ואינו מכיל מספיק ATP הדרוש לתגובת הזרחן (ראה טבלת חומרים). כדי לפשט את התגובה, השתמש במאגר ליגאז T4 (במקום במאגר PNK). חיץ ליגאז T4 מספק את הכמות המתאימה (1 mM ATP) של פוספט לתגובת הזרחון. אנזים PNK מספק זרחן סופי של 5' של אוליגונוקלאוטידים לתגובת הקשירה שלאחר מכן.
  3. קשירה של אוליגונוקלאוטידים sgRNA מחושלים
    1. הוסף 25 ng של פלסמיד pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry ל-2 μL של אוליגונוקלאוטידים sgRNA מחושלים, 1 μL של אנזים SacI, 2 μL של 10x T4 DNA ligase buffer, 1 μL של T4 DNA ligase (1-3 u/μL) (ראה טבלת חומרים), ו-H2O לנפח תגובה סופי של 10 μL.
    2. בצע קשירה על ידי דגירה של תערובת התגובה באמצעות thermocycler בתנאים הבאים: 15 מחזורים של 37 ° C במשך 5 דקות ו 25 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן להחזיק ב 4 ° C.
  4. טרנספורמציה ואחריה תגובת שרשרת פולימראז מושבה (PCR)
    1. הפוך את תאי E. coli DH10B המוסמכים (ראה טבלת חומרים) עם 4 μL של מוצר הקשירה באמצעות שוק חום (42 ° C עבור 45 שניות) ולהפיץ על צלחת אגר המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין.
    2. אשר מושבות שעברו טרנספורמציה לפי PCR מושבה באמצעות תערובת האב PCR (ראה טבלת חומרים). בחר את המושבה וערבב עם 5 μL של תערובת מאסטר, 0.1 μL של פריימר אוניברסלי (ריכוז מלאי: 100 μM), 0.1 μL של פריימר הפוך sgRNA (ריכוז מלאי: 100 μM) (טבלה 1), ו 5 μL של H 2 O. הפעל את ה- PCR באמצעות thermocycler בתנאים הבאים: דנטורציה ראשונית (94 ° C למשך2דקות), לאחר מכן 35 מחזורים של דנטורציה (94 ° C עבור 20 שניות), חישול (60 ° C עבור 30 שניות), הארכה (72 ° C עבור 30 שניות), ושלב התארכות סופי (72 ° C במשך 5 דקות). פתור את ה- DNA באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז (1.5%) במאגר 0.5x TAE במתח של 90 וולט למשך 30 דקות.
      הערה: שיבוטים חיוביים נותנים להקה של ~280 bp.
    3. שלח דוגמאות חיוביות לריצוף Sanger באמצעות פריימר אוניברסלי (טבלה 1, קובץ משלים 1).
  5. טיהור פלסמיד
    1. לטהר את הפלסמיד משיבוט חיובי באמצעות ערכת טיהור פלסמיד (ראה טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: לטהר את הפלסמיד באמצעות שרף החלפת אניון או ערכה אחרת המתאימה לשימוש בהעברת תאים.
    2. לדגור על השיבוט החיובי (12 שעות ב-37°C עם טלטול ב-200 סל"ד) באמצעות מדיום גידול חיידקים סטנדרטי המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין.
    3. צנטריפוגה את תאי החיידק ב 6,000 × גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. בצע את השלבים הבאים בהתאם להוראות הערכה של היצרן.

2. אריזת AAV

הערה: אריזות AAV בוצעו על פי פרסומים קודמים15,16 עם שינויים קלים.

  1. צלחת 293T תאים (ראה טבלת חומרים) בבקבוק2 בגודל 175 ס"מ (זריעה 5 × 106 תאים לצלוחית) באמצעות 25 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 ו-95% לחות עד שהתאים מגיעים למפגש של 50%-70%.
  2. יש לערבב 14 μL של פוליאתילנימין (1 מיקרוגרם/μL) עם 1 מ"ל של 150 mM NaCl. ערבבו את שלושת הפלסמידים הדרושים לייצור AAV ביחס מולארי של 1:1:1 (כלומר, 17.7 מיקרוגרם של pAdDeltaF6, 7.9 מיקרוגרם של AAV2/8 (ראו טבלת חומרים), ו-5.9 מיקרוגרם של sgRNA משובט משלב 1 ב-1 מ"ל של 150 מילימטר NaCl. מעבירים את הפוליאתילנימין:תערובת NaCl טיפה אחר טיפה לצינור המכיל את ה- DNA (תערובת של פלסמידים) ודגרים במשך 20 דקות ב 25 מעלות צלזיוס.
    הערה: pAdDeltaF6 הוא פלסמיד עוזר ו-pCapsid pAAV2/8 הוא פלסמיד אריזה המבטא שכפול (Rep) וקפסיד (capsid) גנים. שני פלסמידים נחוצים לייצור AAV.
  3. לפני הטרנספקציה, להחליף את מדיום גידול התאים עם 18 מ"ל של DMEM המכיל 1% FBS ו L-alanyl-L-גלוטמין (0.5 גרם / ליטר). הוסף 2 מ"ל של תערובת פוליאתילנימין:DNA לכל בקבוק תרבית ודגר על התאים באינקובטור CO 2 (37 ° C, 5% CO2, 95% לחות).
  4. לאחר 5 שעות, להוסיף 5 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS ו- L-alanyl-L-גלוטמין (0.5g / L).
  5. לאחר 3 ימי דגירה, מנתקים את התאים מבקבוק התרבית באמצעות מגרד תאים. אספו את תאי 293T מ-10 (175 ס"מ2) צלוחיות תרבית תאים לתוך צינורות חרוטיים של 50 מ"ל והוסיפו DMEM (ראו טבלת חומרים) עד 30 מ"ל.
  6. מוסיפים 3 מ"ל כלורופורם לכל צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל את תאי 293T ומערבבים באמצעות מערבל מערבולת במהירות גבוהה במשך 5 דקות. להשעות מחדש את התאים על ידי הוספת 7.6 מ"ל של 5 M NaCl ומערבולת לזמן קצר. צנטריפוגה בעוצמה של 3,000 × גרם ו-4°C למשך 5 דקות.
  7. מעבירים את הפאזה המימית לצינור חרוטי חדש ומוסיפים 9.4 מ"ל של 50% (v/v) פוליאתילן גליקול (PEG) 8000. מערבבים עם מערבל מערבולת במהירות גבוהה במשך 10 שניות ומניחים את הדגימות על קרח למשך שעה.
  8. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם ב-4°C למשך 30 דקות. מוציאים את הסופרנאטנט ומניחים לגלולה להתייבש למשך 10 דקות.
  9. מוסיפים 1.4 מ"ל HEPES (50 mM, pH 8) ומערבבים במשך 5 דקות באמצעות מערבל במהירות גבוהה. הוסף 3.5 μL של 1 M MgCl2, 14 μL של DNase I (20 יחידות / μL), ו 1.4 μL של RNase A (10 מיקרוגרם / μL). יש לדגור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, ולאחר מכן להעביר את הדגימות לצינורות חדשים של 1.5 מ"ל (700 מיקרוליטר בכל צינור).
  10. הוסף 700 μL של כלורופורם לכל צינור 1.5 מ"ל וערבב באמצעות מערבל במהירות גבוהה במשך 10 שניות. צנטריפוגה ב-3,000 × גרם ב-4°C למשך 5 דקות ומעבירים את הפאזה המימית לצינור חדש. חזור על שלב זה 3x.
  11. יש לאדות את הכלורופורם למשך 30 דקות בארון בטיחות ביולוגית. לאחר מכן, להעביר 300 μL של הפאזה המימית לתוך צינור אולטרה צנטריפוגה 0.5 מ"ל (ראה טבלה של חומרים). סובבו את המסנן בטמפרטורה של 14,000 × גרם ב-25°C למשך 5 דקות. הסר את הזרימה וסובב שוב את המסנן עד שכל אמצעי האחסון יעבור דרך המסנן.
  12. שטפו את המסנן על ידי הוספת 300 μL של מלח חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbecco וערבבו את התמיסות על ידי פיפט. צנטריפוגה את המסנן למשך 5 דקות ב-14,000 × גרם ב-25°C. חזור על שלב כביסה זה 4x.
  13. צנטריפוגה את המסנן למשך 8 דקות בטמפרטורה של 14,000 × גרם ב-25°C. הניחו את המסנן הפוך לתוך צינור חדש, וסובבו במשך 2 דקות בטמפרטורה של 1,000 × גרם ב-25°C.

3. טיטרציה של AAV על ידי qPCR

  1. הכינו עקומה סטנדרטית לטיטרציה AAV וקבעו את הטיטר AAV על פי המחקר המקורי של Fripont et al.15.

4. הזרקת In vivo של AAV לרקמת השומן הלבן המפשעה (iWAT)

  1. יש להפריד בין הכלים והציוד הכירורגי הדרושים לניתוח ולעקר אותם בהתאם להמלצות לכל חומר ספציפי.
  2. מרדימים את העכבר עם 100 מ"ג / ק"ג קטמין ו 10 מ"ג / ק"ג xylazine על ידי הזרקה intraperitoneal. אשר את ההרדמה על ידי הפעלת לחץ נמרץ על הכף והזנב ובדיקת רפלקס. יש למרוח משחה על עיני העכבר כדי למנוע יובש בעיניים במהלך הניתוח.
  3. מניחים את העכבר המרדים במצב שכיבה ומגלחים אזור קטן באגפים, פרוקסימלי למפרקי הירך להזרקות iWAT, עם מכונת גילוח. יש למרוח קרם depilatory במשך 5 דקות. יש להסיר שאריות קרם עם מים כדי למנוע כוויות בעור.
  4. לחטא את העור באמצעות שלושה סבבים לסירוגין של החלת פתרון חיטוי (פובידון-יוד) על העור עם גזה נקייה ו 70% אלכוהול. יש להשליך את הגזה לאחר כל שימוש.
  5. בצע יישום סופי של פתרון חיטוי על העור. לאחר מכן, בצע חתך של 1-2 ס"מ עם מספריים מעוקרים באזור הפרוקסימלי של המפרקים, והחזק את העור פתוח באמצעות מלקחיים כדי לחשוף את מחסן השומן. ניתן למצוא את ה- WAT מחובר לעור משני הצדדים, המשתרע מההתחלה על הגב ומטה לכיוון האשכים.
    הערה: יש להשתמש בווילונות כדי למנוע זיהום במהלך ניתוח או הליכי תפרים.
  6. באמצעות מלקחיים, דרך החתך, משכו בעדינות את מחסן השומן כלפי מעלה כדי לוודא שההזרקה נמצאת במיקום ובעומק הנכונים.
    הערה: היזהר שלא להסיר את הרקמה ממיקומה המקורי.
  7. מלא את מזרק המיקרוליטר (מד: 33; סגנון נקודה: 4; זווית: 12; אורך: 10) (ראה טבלת חומרים) ב- 2.5 μL (5.6 × 1010 גנומים נגיפיים [VG]/μL) של AAV (המכיל את sgRNA המכוון לגן האנדוגני Prdm16). הכנס בזהירות את המחט בזווית של 30°-45° לתוך iWAT. חזור על הזריקה 5x למיקומים שונים של הרקמה כדי להדביק הומוגנית את כל כרית השומן iWAT. נפח כולל של 15 μL מומלץ להדביק את iWAT.
    הערה: עומק החדרת המזרק תלוי בעובי המשקעים של כרית השומן. השתמש בטכניקה ללא מגע כדי לצייר את ההזרקה.
  8. סגור את חתך העור המגולח באמצעות 4/0 תפרי מונופילמנט. הניחו את העכבר על כרית חום עד להכרה חוזרת. עקוב אחר בעל החיים כל 10-15 דקות עד שהוא מתאושש לחלוטין. לאחר שהחיה חוזרת להכרה, שימו לב לפרופיל המוטורי, שאמור להיות ליניארי וללא סימני מצוקה או כאב.
  9. בצע בקרת כאב לאחר הניתוח בתוך 48 שעות לאחר הניתוח על ידי מתן tramadol hydrochloride (5 מ"ג / ק"ג) intraperitoneally במשך 3 ימים (2x / day).
    הערה: שימו לב לסימני מצוקה ואי נוחות ועקבו אחר צריכת המים והמזון. תן מינון יעיל של משכך כאבים באופן מונע, רצוי לפני או בתחילת הניתוח.
  10. שמור את העכבר בכלוב עם גישה חופשית למזון ומים במהלך תקופת הריפוי. לאחר תקופת הריפוי, המשך להרדים את העכבר. במחקר זה, המתת חסד בוצעה על ידי מנת יתר של חומרי הרדמה בהזרקה (intraperitoneal) מ פי 3 מינון השראת (300-360 מ"ג / ק"ג קטמין הידרוכלוריד + 30-40 מ"ג / ק"ג קסילזין הידרוכלוריד) ואחריו עריפת ראש.
    הערה: מומלץ מאוד להחזיק את בעלי החיים בכלובים נפרדים עד להחלמה מלאה מההרדמה.

5. התמיינות חוץ גופית של תאי כלי דם סטרומליים (SVFs) לאדיפוציטים בצבע בז'

  1. בצע בידוד וציפוי של SVFs ראשוניים מה- iWAT של עכברי AdipoSPH על פי Aune et al.17. זרעי SVF שמקורם בעכברי AdipoSPH iWAT לצלחת בעלת 6 בארות המכילה תווך שלם (DMEM המכיל 3.1 גרם/ליטר גלוקוז, 0.5 גרם/ליטר L-אלניל-L-גלוטמין, 10% FBS ו-2.5% P/S) למשך 1-2 שעות.
    הערה: מקטע SVF מכיל תערובת של סוגי תאים שונים. בשלב זה, לא ניתן להגדיר את מספר תאי האב זרע המעוררים אדיפוציטים.
  2. שואפים את המדיום, שוטפים את הבאר 2x באמצעות מלח חוצץ פוספט (1x PBS), ומחליפים במדיום שלם טרי. לדגור על התאים ב 37 ° C, 5% CO2, 95% לחות עד התאים מגיעים 70%-80% מפגש.
  3. השראת התמיינות (יום 0) על-ידי טיפול בתאים עם מדיום האינדוקציה (טבלה 2).
    הערה: קוקטייל התרופות של מדיום האינדוקציה נחוץ לשיפור התמיינות האדיפוציט בצבע בז' ולביטוי תוכנית הגן התרמוגנית17.
  4. לאחר יומיים (יום 2), החלף את אמצעי האינדוקציה באמצעי התחזוקה (טבלה 2).
  5. לאחר יומיים (יום 4), החלף את אמצעי התחזוקה באמצעי תחזוקה טריים (טבלה 2) למשך יומיים עד שלושה.
  6. שנה את מדיום התחזוקה כל 48 שעות עד שהפרדיפוציטים מתמיינים במלואם לאדיפוציטים (בדרך כלל 6 ימים לאחר הוספת מדיום האינדוקציה). ניתן לצפות באדיפוציטים בוגרים באמצעות מיקרוסקופ אור, שכן התאים המתמיינים נראים עמוסים בטיפות שומנים.

6. זיהום AAV במבחנה של SVFs

הערה: SVFs שמקורם בעכברי AdipoSPH iWAT היו נגועים ב-sgRNA-Prdm16 נושא AAV כפי שתואר קודם לכן על ידי Wang et al.18 עם כמה שינויים.

  1. לגדל את התאים על צלחת תרבית 6 בארות עם מדיום מלא עד שהתאים מגיעים 70%-80% מפגש, כפי שתואר קודם לכן בשלבים 5.1-5.3.
  2. ערבבו 5.6 ×10 10 VG/μL של sgRNA-Prdm16 נושא AAV עם 2 מ"ל של ברומיד בינוני מלא והקסדימתרין ברומיד (8 מיקרוגרם/מ"ל) (ראו טבלת חומרים). התמירו את התאים על ידי החלפת המדיום השלם והוספת המדיום השלם המכיל AAV. לדגור על התאים המומרים במשך 12 שעות ב 37 ° C, 95% לחות, ו 5% CO2.
  3. לפצל ולזרוע את התאים כמתואר בשלב 5 להתרבות תאים והתמיינות לאדיפוציטים בצבע בז'.
    הערה: עבור בדיקת צריכת חמצן, זרע 4.0 × 104 תאים (משלב 6.2) לכל באר עם מדיום אינדוקציה בצלחת תרבית תאים של 24 בארות. השלבים הבאים של התפשטות והתמיינות תאים מבוצעים כמתואר בשלב 5. בדיקת צריכת החמצן מבוצעת כאשר התאים מגיעים למפגש של 80%-100% והם ממוינים לחלוטין, כפי שדווח קודם לכן19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עכברי AdipoSPH פותחו על ידי גידול זני עכברי SPH ו- Adipoq-Cre. שני זני העכבר היו על רקע היברידי C57BL6J-DBA/2J (על פי הספק המסחרי; ראה טבלת חומרים). שושלת עכברי SPH תוארה במקור על ידי Zhou et al.14.

התפתחות אדיפוציט In vivo בצבע בז' באמצעות ביטוי יתר של Prdm16 בתיווך AdipoSPH
כדי להעריך את יכולתו של המודל המתואר במחקר זה לפתח אדיפוציטים בצבע בז' in vivo, הוזרק ה-AAV הנושא את הגן sgRNA המכוון ל-Prdm16 לתוך iWAT של עכברי AdipoSPH. Prdm16 הוא גורם שעתוק מבוסס היטב הקובע התפתחות ותפקוד אדיפוציט בצבע בז'20,21. חשוב להזכיר שכאן בחרנו ב-sgRNA שנבדק ואומת בעבר ומכוון לגן האנדוגני Prdm1614. AAV הנושא sgRNA ריק שימש כבקרה. 10 ימים לאחר הזרקת AAV, iWAT נקצר לצורך ניתוחים היסטולוגיים וניתוח ביטוי גנים (איור 1A). כצפוי, תמונות אימונופלואורסצנטיות של iWAT מעכברי AdipoSPH הדגימו את הביטוי של dCas9 הן בקבוצת הביקורת והן בקבוצת Prdm16 (איור 1B). נוסף על כך, ביטוי mCherry אישר את ההצלחה של זיהום AAV ב-iWAT הן בקבוצת הביקורת והן בקבוצת Prdm16 (איור 1B). ביטוי Prdm16 המושרה על ידי SPH גרם בבירור להצטברות נרחבת של אדיפוציטים מרובי בז' לתוך iWAT (איור 1B). יתר על כן, PCR כמותי (qPCR) חשף ביטוי מוגבר של Prdm16 ושל תוכנית הגנים התרמוגניים (Ucp1, Cox8b, Ppargc1a ו-Cidea) בקבוצת Prdm16 בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 1C).

קידום התפתחות אדיפוציט בז' ושיפור צריכת החמצן במבחנה על ידי ביטוי יתר של Prdm16 בתיווך AdipoSPH
לאחר מכן, נבדקה התאמתו של מודל זה לחקר ביולוגיה של אדיפוציט בז ' במבחנה . לשם כך, קדם-אדיפוציטים שמקורם ב-iWAT של עכברי AdipoSPH הומרו עם AAV הנושא את רצף sgRNA המכוון ל-Prdm16. שבעה ימים לאחר ההתמיינות, אדיפוציטים בצבע בז' שימשו לניתוח ביטוי גנים וצריכת חמצן (איור 2A). sgRNA ריק שימש כבקרה. ראוי לציין כי הסרת קודון STOP על ידי רקומבינאז CRE והפעלת מכונות SPH היו תחת שליטתו של מקדם / משפר אדיפונקטין, וכתוצאה מכך הפעלת הגן האנדוגני Prdm16 באדיפוציטים בוגרים. ניתוח ביטוי גנים אישר את הביטוי המוגבר של הגן האנדוגני Prdm16 והגנים התרמוגניים בקבוצת ביטוי היתר Prdm16 בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 2B). כדי לאשר שהאדיפוציטים בצבע בז' המושרה על ידי SPH היו תרמוגניים מבחינה פונקציונלית, בוצעה בדיקת ספירומטריה ברזולוציה גבוהה על האדיפוציטים הראשוניים. ניתוח ופירוש נתוני הספירומטריה בוצע כמתואר לאחרונה22. ביטוי Prdm16 המושרה על ידי SPH הביא לצריכת חמצן בסיסית ומקסימלית גבוהה יותר מאשר בתאי ביקורת (איור 2C). חשוב לציין שהנתונים הצביעו על נשימה בלתי מצומדת מוגברת (אוליגומיצין-לא רגיש) בקבוצת Prdm16 בהשוואה לזו שבקבוצת הביקורת (איור 2C, טבלה 3). יחד, תוצאות אלה גילו כי ביטוי המושרה על ידי SPH של Prdm16 אנדוגני משחזר את פנוטיפ ההשחמה ומשפר את שיעורי צריכת החמצן שנצפו בעכברי Prdm16 Tg קונבנציונליים.

Figure 1
איור 1: התפתחות שומן בז' על-ידי הזרקה של נגיף הקשור לאדנו (AAV) המכוון לגן Prdm16 אנדוגני לתוך רקמת שומן לבן מפשעתי (iWAT) של עכברי AdipoSPH. (A) המחשה סכמטית של העיצוב הניסיוני in vivo בצבע בז' אדיפוציט (נוצר באמצעות Biorender.com). (B) תמונות היסטולוגיות (המטוקסילין ואוזין [H&E] צביעה) של iWAT. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C) PCR כמותי (qPCR) של Prdm16 וגנים תרמוגניים (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α ו-Cidea; n = 3). הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. *p < 0.05; **p < 0.01 עבור Prdm16 לעומת בקרה (CTR) על ידי מבחן t של סטודנט לא מזווג. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: התמיינות אדיפוציט בז' המושרה על ידי SPH על-ידי ביטוי יתר של Prdm16. (A) המחשה סכמטית של התכנון הניסיוני של אדיפוציט בז' במבחנה (נוצר באמצעות Biorender.com). (B) ביטוי גנים יחסי של Prdm16 וגנים תרמוגניים (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α ו-Cidea; n = 3). (C) קצב צריכת חמצן (OCR), n = 6. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. *p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001 עבור Prdm16 לעומת בקרה (CTR) על ידי (B) מבחן t של סטודנט לא מזווג ו- (C) מדידה חוזרת דו-כיוונית ANOVA, ואחריה מבחן Tukey. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: ריצוף Sanger של Prdm16 sgRNA. (A) איור סכמטי המדגים את היישור של אוליגונוקלאוטידים משלימים חד-גדיליים מסוג Prdm16. (B) ריצוף Sanger של Prdm16 sgRNA באמצעות פריימר אוניברסלי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

גן מינים קדימה הפוך
ביטוי גנים צרפת עכבר CAGCACGGTGAAGCCATTC GCGTGCATCCGCTTGTG
צרפת עכבר TCTCAGCCGGCTTAATGACTG GGCTTGCATTCTGACCTTCAC
Ppargc1a עכבר AGCCGTGACCACTGACAACGAG GCTGCATGGTTCTGAGTGCTAAG
קוקס8ב עכבר GAACCATGAAGCCAACGACT GCGAAGTTCACAGTGGTTCC
צ'ידאה עכבר ATCACAACTGGCCTGGTTACG TACTACCCGGTGTCCATTTCT
36ב4 עכבר TCCAGGCTTTGGGCATCA CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA
שיבוט מולקולרי רצף sgRNA Prdm16 עכבר CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG CCCCTTTTCAGCGCAGCTCG
פריימר אוניברסלי עכבר GAGGGCCTATTTCCC
ATGATTCCTTCATAT

טבלה 1: רצפי פריימר ששימשו במחקר.

בינוני הרכב
מדיום שלם מדיום עיט מעובד (DMEM) של Dulbecco עם L-גלוטמין
10% מסרום בקר עוברי (FBS)
2.5% פניצילין/סטרפטומיצין
אמצעי אינדוקציה מדיום שלם
אינדומתצין, ריכוז סופי 125 מיקרומטר (0.125 מיליון מלאי באתנול). הערה: יש לחמם אינדומתצין ל-90°C למשך 10 שניות כדי להתמוסס.
אינסולין, ריכוז סופי 20 ננומטר (1 מ"ג במלאי, הוסף 1 מיקרוליטר HCl למסיסה (5.73 מ"ג/מ"ל). יש לאחסן את המלאי בטמפרטורה של -20°C.
דקסמתזון, ריכוז סופי 2 מק"ג/מ"ל (2 מ"ג/מ"ל מלאי באתנול)
3-איזובוטיל-1-מתיל-קסנטין (IBMX), ריכוז סופי 500 מיקרומטר (0.25 מ' מלאי ב-0.5 מ' קו"ש)
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3), ריכוז סופי 1 ננומטר (מלאי 10 מיקרומטר, ממיס T3 ב-1 M HCl ו-EtOH 1:4 במלאי).
רוזיגליטזון, ריכוז סופי 1 מיקרוגרם/מ"ל (1 מ"ג/מ"ל מלאי באתנול)
אמצעי תחזוקה מדיום שלם
אינסולין, ריכוז סופי 20 ננומטר (1 מ"מ מלאי). יש להוסיף 1 μL של HCl כדי להמיס (5.73 מ"ג/מ"ל).
רוזיגליטזון, ריכוז סופי 1 מיקרוגרם/מ"ל (1 מ"ג/מ"ל מלאי באתנול)

טבלה 2: הרכב המדיה ששימשה במחקר.

פרמטרים CTR PRDM16 ערך p
ללא צריכת חמצן במיטוכונדריה (pMoles/min/μg protein) 8.19 ± 1.40 10.80 ± 1.83 0.01
נשימה בסיסית (pMoles/min/μg protein) 28.82 ± 5.20 52.58 ± 13.73 0.001
נשימה מקסימלית (pMoles/min/μg protein) 63.81 ± 9.80 122.94 ± 22.31 < 0.001
קיבולת נשימה רזרביות (pMoles/min/μg protein) 35.98 ± 11.09 70.36 ± 26.06 0.006
אוליגו לא רגיש (pMoles/min/μg protein) 8.27 ± 2.29 15.85 ± 5.48 0.005
אוליגו רגיש (pMoles/min/μg חלבון) 20.54 ± 5.68 36.72 ± 14.79 0.016
יעילות הצימוד 71.28 ± 1.51 69.84 ± 3.05 0.163
RCR תאים 7.70 ± 1.46 7.75 ± 2.43 0.485

טבלה 3: פרמטרים נשימתיים של אדיפוציטים בצבע בז' המושרה על ידי SPH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אחד היישומים השימושיים ביותר של טכנולוגיית CRISPR הוא חקירת תפקוד גנים באמצעות הפעלת גנים אנדוגניים באמצעות מערכות CRISPRa6. SPH הוא CRISPRa רב עוצמה שתואר במקור כגורם להמרה של אסטרוציטים לנוירונים פעילים על ידי התמקדות במספר גנים נוירוגניים14. במחקר זה, AdipoSPH הוכח ככלי מתאים לחקר הביולוגיה של שומן בז' על ידי הפעלת הביטוי של Prdm16 אנדוגני באדיפוציטים. ביטוי יתר של Prdm16 המושרה על ידי SPH באדיפוציטים מוביל להפעלת תוכנית הגן התרמוגנית וגורם לפנוטיפ הבראונינג, פנוסקופיה של עכברים טרנסגניים קודמים (Tg) Prdm16 מודל23. Prdm16 נבחר במחקר זה כיעד להשראת אדיפוציטים בצבע בז' בהתבסס על התפקיד המרכזי של גורם שעתוק זה בוויסות התמיינות שומן חום ובז', כמו גם ויסות תוכנית הגנים התרמוגניים (למשל, שיפור ביטוי Ucp1) באדיפוציטים ממוינים. עם זאת, המודל הנוכחי מאפשר ביטוי יתר של כל גן אנדוגני על פי שיקול דעתם של החוקרים ומטרת המחקר.

מודלים טרנסגניים מסורתיים החוקרים את הביולוגיה של רקמת השומן מסתמכים על התפתחות מכרסמים מהונדסים גנטית המבטאים יתר על המידה טרנסגן תחת שליטתו של מקדם/משפר המוגבל לאדיפוציטים (לדוגמה, Fabp4 או אדיפונקטין)24. למרות שהטכנולוגיה הנוכחית האיצה את קצב הפיתוח של מודלים אלה, העלויות והזמן לפתח אותם הם עדיין בעיה נפוצה שחווה הקהילה המדעית. לעומת זאת, AdipoSPH הוא מודל זול יותר ורב-תכליתי יותר לגישות רווח של פונקציה מאשר עכברי Tg מסורתיים. יתר על כן, AdipoSPH מתאים היטב לחקר RNA ארוך שאינו מקודד ואיזופורמים של תעתוק, שאינם מתאימים במיוחד למודלים של עכברי Tg.

AdipoSPH מציג גם מספר יתרונות בחקירת ביולוגיה של רקמת שומן בהשוואה למתן פשוט של AAV, גישה חלופית עכשווית לניסויי רווח של תפקוד25. ראשית, AAV המועבר לרקמת השומן מקדם ביטוי יתר על ידי החדרת מספר עותקים של טרנסגן. לעומת זאת, הפעלת SPH של גנים אנדוגניים מייצגת מנגנון פעולה טבעי יותר. שנית, טרנסגנים המועברים על ידי AAV (באמצעות מקדמים מכוננים) בדרך כלל גורמים לביטוי יתר שלהם ב"כל סוג תא" בתוך המיקרו-סביבה של רקמת השומן. לעומת זאת, ביטוי המושרה על ידי AdipoSPH של גנים אנדוגניים מוגבל לאדיפוציטים. שלישית, גודל האריזה (~ 4.5kb) הוא מגבלה אופיינית של AAV עבור טרנסגניםמסוימים 26. עם זאת, sgRNA נושא AAV דורש אסטרטגיית שיבוט פשוטה וקלה עבור 20 נוקלאוטידים מותאמים אישית. לבסוף, מתן AAV בדרך כלל מגיע למחזור הדם המערכתי ומדביק רקמות ואיברים אחרים. למרות שחלק מה-AAV מכילים מיקרו-רנ"א כדי למתן את הביטוי של טרנסגנים ברקמות מסוימות, כגון הכבד והלב25, אסטרטגיה זו אינה יכולה למנוע זיהום AAV ברקמות ואיברים אחרים. לעומת זאת, ביטוי המושרה על ידי AdipoSPH של גנים אנדוגניים מוגבל לאדיפוציטים, אפילו בהתחשב בדליפה מסוימת של AAV לתוך מחזור הדם. לפיכך, AdipoSPH הוא גם מודל מתאים לניהול מערכתי של sgRNA נושא AAV וחקירת ויסות רקמת השומן של הומאוסטזיס אנרגיה בכל הגוף.

למרות מודל AdipoSPH מציע כמה יתרונות, יש לו מגבלות שחשוב לשקול. AAV היא כיום הפלטפורמה הנפוצה ביותר למשלוח in vivo של sgRNA. עם זאת, כמה אתגרים בייצור AAV ובעיות אימונולוגיות נותרו בלתי פתורים26,27. יתר על כן, כמויות שונות והתפלגויות שונות של AAV מוזרק ברחבי רקמת השומן גורמות לשונות תוך ובין-רקמתית של ביטוי גנים. אנו רואים כי שיבוט וקטור sgRNA, ייצור AAV וניהול הומוגני של AAV לתוך iWAT הם צעדים קריטיים להצלחת פרוטוקול זה. לבסוף, sgRNA שונים מפעילים באופן ייחודי את הביטוי של גנים אנדוגניים במערכת SPH14. ההמלצה העיקרית היא לתכנן ולבדוק שלושה עד חמישה רצפי sgRNA בטווח של 200 bp במעלה הזרם מאתר התחלת השעתוק (TSS) של הגן המעניין. לכן, הגדרת רצף sgRNA הטוב ביותר עבור גן מטרה דורשת בדרך כלל בדיקות מבחנה מייגעות לפני ניסויים in vivo.

AdipoSPH הוא גם מודל אטרקטיבי לחקר היבטים אחרים של ביולוגיה של רקמת שומן. לדוגמה, אדיפוציטים מקדמים הפרשת אדיפוקינים רבים28,29; עם זאת, ההשפעות של רוב המולקולות הללו על כל הגוף עדיין אינן מובנות. AdipoSPH הוא מודל מתאים לטיפול בבעיה זו על ידי ביטוי יתר של גנים אנדוגניים בודדים או מרובים באדיפוציטים בוגרים וחקירת ההשפעות המקומיות או המערכתיות שלהם. לפיכך, AdipoSPH הוא כלי ייחודי לחקר הביולוגיה והפיזיולוגיה של רקמת השומן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים לתמיכה שקיבלו מ- Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, עבור הדור של עכברי AdipoSPH, המעבדה לאינמונומטבוליזם ואיתות התא, והמכון הלאומי למדע וטכנולוגיה בנושא פוטוניקה יישומית לביולוגיה של התא (INFABIC) עבור כל התמיכה הניסויית. אנו מודים לתמיכה הכספית מקרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3',5-Triiodo-L-thyronine Sigma-Aldrich T2877
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I5879
AAVpro 293T Cell Line Takarabio 632273
Amicon Ultra Centrifugal Filter Merckmillipore UFC510008 100 KDa
Dexamethasone Sigma-Aldrich D1756
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) Corning 10-017-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement Gibco 10565-018 high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) Sigma-Aldrich D8662
Excelta Self-Opening Micro Scissors Fisher Scientific 17-467-496
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F2442
Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) Fisher Scientific 08-100-241
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122
Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-940
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
HEPES Sigma-Aldrich H3375-25G
Hexadimethrine bromide (Polybrene) Sigma-Aldrich H9268
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378
Insulin Sigma-Aldrich I9278
LigaFast Rapid DNA Ligation System Promega M8225
Maxiprep purification kit  Qiagen 12162
Microliter syringe Hamilton 80308 Model 701
NEB 10-beta/Stable  New England Biolabs C3019H E. coli competent cells
pAAV2/8  Addgene  112864
pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry Addgene  91947
pAdDeltaF6  Addgene  112867
PEG 8000 Sigma-Aldrich 89510
Penicillin/streptomycin Gibco 15140-122
Polyethylenimine Sigma-Aldrich 23966 Linear, MW 25000
Povidone-iodine Rioquímica 510101303 Antiseptic
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408
SacI enzyme New England Biolabs R0156
Surgical Design Premier Adson Forceps Fisher Scientific 22-079-741
Syringe Hamilton 475-40417
T4 DNA Ligase Promega M180B
T4 DNA ligase buffer  New England Biolabs B0202S
T4 PNK enzyme kit New England Biolabs M0201S
Tramadol Hydrochloride SEM 43930
Vidisic Gel  Bausch + Lomb  99620

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
  2. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  3. Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  5. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
  7. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  8. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  9. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  10. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  12. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  13. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
  14. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
  15. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
  16. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).
  17. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
  18. Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
  19. Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).
  20. Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
  21. Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
  22. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
  23. Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
  24. Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
  25. Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
  26. Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  27. Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
  28. Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
  29. Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 191 רקמת שומן תרמוגנזה מטבוליזם קריספר
חקירת ביולוגיה ומטבוליזם של שומן בז' באמצעות מערכת ההפעלה CRISPR SunTag-p65-HSF1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Valdivieso-Rivera, F. B., de… More

Valdivieso-Rivera, F. B., de Oliveira Furino, V., Sponton, C. H. Investigation of Beige Fat Biology and Metabolism Using the CRISPR SunTag-p65-HSF1 Activation System. J. Vis. Exp. (191), e64849, doi:10.3791/64849 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter