Summary
Denne protokollen presenterer bruk av CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) i adipocytter (AdipoSPH) som en alternativ strategi til adenoassosiert virus (AAV) for å undersøke beige fettbiologi. In vivo injeksjon av AAV-bærende sgRNA rettet mot det endogene Prdm16-genet er tilstrekkelig til å indusere beige fettutvikling og forbedre det termogene genprogrammet.
Abstract
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) teknologi har ført til en revolusjon i biologi, og nyere verktøy har blitt brukt langt utover den opprinnelig beskrevne genredigering. CRISPR-aktiveringssystemet (CRISPRa) kombinerer det katalytisk inaktive Cas9 (dCas9) proteinet med distinkte transkripsjonsmoduler for å indusere endogent genuttrykk. SunTag-p65-HSF1 (SPH) er en nylig utviklet CRISPRa-teknologi som kombinerer komponenter av synergistiske aktiveringsformidlere (SAMs) med SunTag-aktivatorene. Dette systemet tillater overekspresjon av enkle eller flere gener ved å designe et tilpasset enkeltveis RNA (sgRNA). I denne studien ble en tidligere utviklet SPH mus brukt til å generere en betinget mus som uttrykker SPH i adipocytter (adiponektin Cre avstamning), kalt AdipoSPH. For å indusere en hvit-til-beige fett () fenotype, ble et adenoassosiert virus (AAV) som bærer sgRNA rettet mot det endogene Prdm16-genet (en veletablert transkripsjonsfaktor relatert til brun og beige fettutvikling) injisert i det inguinale hvite fettvevet (iWAT). Denne musemodellen induserte uttrykket av endogen Prdm16 og aktiverte det termogene genprogrammet. Videre forbedret in vitro SPH-indusert Prdm16-overekspresjon oksygenforbruket av beige adipocytter, og fenokopierte resultatene fra en tidligere Prdm16 transgen musemodell. Dermed beskriver denne protokollen en allsidig, kostnadseffektiv og tidseffektiv musemodell for å undersøke fettvevsbiologi.
Introduction
Beige (eller brite) adipocytter er frakoblingsprotein 1 (UCP1) -uttrykkende og mitokondrierike adipocytter som ligger i hvite fettvev (WAT) depoter. Beige fett kommer fra en delmengde av adipocytprogenitorer eller modne hvite adipocytter som respons på kald eksponering og andre stimuli 1,2. Beige adipocytter kan konvertere energi til varme på en UCP1-avhengig eller uavhengig måte3. Uavhengig av sin termogene funksjon, kan beige fett også forbedre metabolsk helse på andre måter, for eksempel sekresjon av adipokiner og antiinflammatoriske og antifibrotiske aktiviteter. Studier på mus og mennesker har vist at induksjon av beige fett forbedrer hele kroppen glukose og lipid homeostase3. Men selv om vår kunnskap om beige fettbiologi har utviklet seg raskt de siste årene, er de fleste av dens metabolske fordeler og relaterte mekanismer fortsatt ikke fullt ut forstått.
Klyngede regelmessig interspacede korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) ble først beskrevet i eukaryote celler som et verktøy som er i stand til å generere et dobbeltstrengbrudd (DSB) på et bestemt sted i genomet gjennom nukleaseaktiviteten til Cas9-proteinet 4,5. Cas9 styres av et syntetisk enkeltveis RNA (sgRNA) for å målrette mot en bestemt genomisk region, noe som fører til en DNA DSB. I tillegg til å bruke nukleasen Cas9 til redigeringsformål, har CRISPR-Cas9-teknologien utviklet seg til å bli brukt som et sekvensspesifikt genreguleringsverktøy6. Utviklingen av et katalytisk inaktivt Cas9-protein (dCas9) og assosiasjonen av transkripsjonsmoduler som er i stand til å forbedre genuttrykk, har gitt opphav til CRISPR-aktiveringsverktøy (CRISPRa). Flere CRISPRa-systemer har dukket opp, for eksempel VP647,8, synergistisk aktiveringsmekler (SAM) 9, SunTag10,11, VPR12,13 og SunTag-p65-HSF1 (SPH) 14, som kombinerer komponentene til SAM- og SunTag-aktivatorer. Det har nylig blitt vist at det induserte uttrykket av nevrogene gener i N2a-neuroblaster og primære astrocytter er høyere ved bruk av SPH sammenlignet med andre CRISPRa-systemer14, noe som demonstrerer SPH som et lovende CRISPRa-verktøy.
Her benyttet vi oss av en tidligere utviklet SPH mus14 for å generere en betinget musemodell som uttrykker SPH spesifikt i adipocytter ved bruk av adiponektin Cre-avstamningen (AdipoSPH). Ved å bruke et adenoassosiert virus (AAV) som bærer gRNA rettet mot det endogene Prdm16-genet, ble (hvit til beige konvertering) av inguinal WAT (iWAT) indusert for å øke ekspresjonen av det termogene genprogrammet. Videre økte in vitro Prdm16-overekspresjon oksygenforbruket. Derfor gir denne protokollen en allsidig PH-musemodell for å utforske mekanismene for beige fettutvikling i fettvev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrestudier ble utført i samsvar med University of Campinas Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (protokoll CEUA #5810-1/2021).
1. Molekylær kloning
- Design av single guide RNA (sgRNAer)
- Design sgRNA for CRISPR-aktivering ved hjelp av CHOPCHOP, tilgjengelig på https://chopchop.cbu.uib.no/, eller et annet egnet verktøy. Bruk følgende parametere for å designe sgRNA rettet mot Prdm16-genet: Mål: Prdm16; I: Muskulus; Bruk: Crispr/Cas9; For: Aktivering.
MERK: Design sgRNA for hver region av interesse spredt over en 200 bp oppstrøms transkripsjon startsted (TSS) region. For eksempel binder sgRNA rettet mot Prdm16 brukt i denne studien 154 bp oppstrøms for TSS. - Legg til overheng til sgRNA for å matche SacI-begrensningsstedet i vektorryggraden pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry (se materialfortegnelse). Inkluder: 5'- (N20)AGCT-3' (N = nukleotider). For eksempel er sekvensen rettet mot Prdm16-genet 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3', og med overheng er 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'.
- Få 3' sgRNA omvendt komplementsekvens ved hjelp av verktøyet som er tilgjengelig på https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html. For eksempel er 3' sgRNA-sekvensen rettet mot Prdm16-genet 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'.
- Design sgRNA for CRISPR-aktivering ved hjelp av CHOPCHOP, tilgjengelig på https://chopchop.cbu.uib.no/, eller et annet egnet verktøy. Bruk følgende parametere for å designe sgRNA rettet mot Prdm16-genet: Mål: Prdm16; I: Muskulus; Bruk: Crispr/Cas9; For: Aktivering.
- Annealing av enkeltstrengede komplementære oligonukleotider
- Tilsett 1 μL av hvert 5' og 3' enkeltstrenget oligonukleotid (stamkonsentrasjon: 100 μM), 1 μL T4-ligasebuffer, 0,5 μL T4-polynukleotidkinase (PNK) (1 × 104 enheter/ml) og 6,5 μLH2O-volumtil et endelig reaksjonsvolum på 10 μL. Anneal de komplementære enkeltstrengede oligonukleotidene ved bruk av en termosyklist under følgende forhold: 37 °C i 30 minutter og 95 °C i 5 minutter, etterfulgt av en nedtrappingshastighet på 5 °C/min.
MERK: PNK-enzymet leveres med PNK-buffer og inneholder ikke nok ATP som kreves for fosforyleringsreaksjonen (se materialtabellen). For å forenkle reaksjonen, bruk T4-ligasebufferen (i stedet for PNK-buffer). T4 ligasebuffer gir riktig mengde (1 mM ATP) fosfat for fosforyleringsreaksjonen. PNK-enzymet gir 5' endefosforylering av oligonukleotider for den påfølgende ligeringsreaksjonen.
- Tilsett 1 μL av hvert 5' og 3' enkeltstrenget oligonukleotid (stamkonsentrasjon: 100 μM), 1 μL T4-ligasebuffer, 0,5 μL T4-polynukleotidkinase (PNK) (1 × 104 enheter/ml) og 6,5 μLH2O-volumtil et endelig reaksjonsvolum på 10 μL. Anneal de komplementære enkeltstrengede oligonukleotidene ved bruk av en termosyklist under følgende forhold: 37 °C i 30 minutter og 95 °C i 5 minutter, etterfulgt av en nedtrappingshastighet på 5 °C/min.
- Ligering av annealed sgRNA oligonukleotider
- Tilsett 25 ng plasmid pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry til 2 μL annealed sgRNA oligonukleotider, 1 μL SacI enzym, 2 μL 10x T4 DNA ligasebuffer, 1 μL T4 DNA-ligase (1-3 u / μL) (se materialtabell) og H2O til et endelig reaksjonsvolum på 10 μL.
- Utfør ligering ved å inkubere reaksjonsblandingen ved hjelp av en termosyklist under følgende forhold: 15 sykluser på 37 °C i 5 minutter og 25 °C i 5 minutter, etterfulgt av holding ved 4 °C.
- Transformasjon etterfulgt av kolonipolymerasekjedereaksjon (PCR)
- Transformer de kompetente E. coli DH10B-cellene (se materialfortegnelse) med 4 μL av ligeringsproduktet ved hjelp av varmesjokk (42 °C i 45 s) og spred på en agarplate inneholdende 100 μg / ml ampicillin.
- Bekreft transformerte kolonier ved koloni-PCR ved bruk av PCR-masterblandingen (se materialfortegnelse). Velg kolonien og bland med 5 μL masterblanding, 0,1 μL universalprimer (lagerkonsentrasjon: 100 μM), 0,1 μL sgRNA reversprimer (lagerkonsentrasjon: 100 μM) (tabell 1) og 5 μL H 2 O. Kjør PCR ved hjelp av en termosyklist under følgende forhold: innledende denaturering (94 ° C i2minutter), etterfulgt av 35 sykluser med denaturering (94 °C i 20 s), glødning (60 °C i 30 s), forlengelse (72 °C i 30 s) og et siste forlengelsestrinn (72 °C i 5 minutter). Løs DNA ved hjelp av agarose (1,5%) gelelektroforese i 0,5x TAE-buffer ved 90 V i 30 minutter.
MERK: Positive kloner gir et bånd på ~ 280 bp. - Send inn positive prøver for Sanger-sekvensering med universell primer (tab 1, tilleggsfil 1).
- Plasmid rensing
- Rens plasmidet fra en positiv klon ved hjelp av et plasmidrensesett (se materialfortegnelsen), i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Rens plasmidet ved hjelp av anionbytterharpiks eller et annet sett som er egnet for bruk i celletransfeksjon. - Inkuber den positive klonen (12 timer ved 37 °C ved risting ved 200 o / min) ved hjelp av et standard bakterievekstmedium som inneholder 100 μg / ml ampicillin.
- Sentrifuger bakteriecellene ved 6000 × g i 10 minutter ved 4 °C. Følg de neste trinnene i henhold til produsentens settinstruksjoner.
- Rens plasmidet fra en positiv klon ved hjelp av et plasmidrensesett (se materialfortegnelsen), i henhold til produsentens instruksjoner.
2. AAV-emballasje
MERK: AAV-pakking ble utført i henhold til tidligere publikasjoner15,16 med mindre modifikasjoner.
- Plate 293T-celler (se materialfortegnelse) i en 175 cm2 kolbe (såing 5 × 106 celler per kolbe) ved bruk av 25 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) inneholdende 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (P / S). Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 og 95 % fuktighet til cellene når 50 % -70 % samløp.
- Bland 14 mikroliter polyetylenimin (1 μg/μL) med 1 ml 150 mM NaCl. Bland de tre plasmidene som kreves for AAV-produksjon i et 1:1:1 molforhold (dvs. 17,7 μg pAdDeltaF6, 7,9 μg AAV2/8 (se materialfortegnelse) og 5,9 μg klonet sgRNA fra trinn 1 i 1 ml på 150 mM NaCl. Overfør polyetylenimin:NaCl-blandingen dråpe for dråpe til røret som inneholder DNA (blanding av plasmider) og inkuber i 20 minutter ved 25 °C.
MERK: pAdDeltaF6 er et hjelperplasmid og pCapsid pAAV2 / 8 er et emballasjeplasmid som uttrykker replikasjon (Rep) og Capsid (cap) gener. Begge plasmidene er nødvendige for å produsere AAV. - Før transfeksjon, erstatt cellevekstmediet med 18 ml DMEM inneholdende 1% FBS og L-alanyl-L-glutamin (0,5 g / L). Tilsett 2 ml av polyetylenimin:DNA-blandingen til hver kulturkolbe og inkuber cellene i en CO 2 -inkubator (37 ° C, 5% CO2, 95% fuktighet).
- Etter 5 timer, tilsett 5 ml DMEM supplert med 10% FBS og L-alanyl-L-glutamin (0,5 g / L).
- Etter 3 dager med inkubasjon, løsne cellene fra kulturkolben ved hjelp av en celleskraper. Samle 293T-cellene fra 10 (175 cm2) cellekulturflasker i 50 ml koniske rør og tilsett DMEM (se materialtabellen) opp til 30 ml.
- Tilsett 3 ml kloroform til hvert 50 ml koniske rør som inneholder 293T-cellene og bland med en virvelblander ved høy hastighet i 5 minutter. Resuspender cellene ved å legge til 7,6 ml 5 M NaCl og virvel kort. Sentrifuge ved 3000 × g og 4 °C i 5 minutter.
- Overfør den vandige fasen til et nytt konisk rør og tilsett 9,4 ml 50% (v / v) polyetylenglykol (PEG) 8000. Bland med en virvelblander på høy hastighet i 10 s og legg prøvene på is i 1 time.
- Sentrifuge ved 3000 × g ved 4 °C i 30 minutter. Fjern supernatanten og la pelleten tørke i 10 minutter.
- Tilsett 1,4 ml HEPES (50 mM, pH 8) og bland i 5 minutter med en virvelblander ved høy hastighet. Tilsett 3,5 μL av 1 M MgCl2, 14 μL DNase I (20 enheter / μL) og 1,4 μL RNase A (10 μg / μL). Inkuber i et vannbad på 37 °C i 20 minutter, og overfør deretter prøvene til nye 1,5 ml rør (700 μL i hver tube).
- Tilsett 700 μL kloroform til hvert 1,5 ml rør og bland med en hvirvelblander ved høy hastighet i 10 s. Sentrifuge ved 3000 × g ved 4 °C i 5 minutter og overføre vannfasen til et nytt rør. Gjenta dette trinn 3x.
- Fordamp kloroformen i 30 minutter i et biosikkerhetsskap. Deretter overføres 300 μL av den vandige fase til et 0,5 ml ultrasentrifugeringsrør (se materialtabell). Spinn filteret ved 14 000 × g ved 25 °C i 5 minutter. Fjern gjennomstrømningen og roter filteret igjen til hele volumet har passert gjennom filteret.
- Vask filteret ved å tilsette 300 μL Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) og bland oppløsningene ved pipettering. Sentrifuger filteret i 5 minutter ved 14 000 × g ved 25 °C. Gjenta dette vasketrinnet 4x.
- Sentrifuger filteret i 8 minutter ved 14 000 × g ved 25 °C. Plasser filteret opp ned i en ny tube, og spinn i 2 min ved 1000 × g ved 25 °C.
3. Titrering av AAV ved qPCR
- Klargjøre en standardkurve for AAV-titrering og bestemme AAV-titer i henhold til den opprinnelige studien til Fripont et al.15.
4. In vivo injeksjon av AAV i hvitt fettvev (iWAT)
- Separat kirurgiske verktøy og forsyninger som trengs for kirurgi og steriliser dem som anbefalt for hvert enkelt materiale.
- Bedøv musen med 100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazin ved intraperitoneal injeksjon. Bekreft anestesi ved å legge kraftig press på pote og hale og sjekke om refleks. Påfør salve på musens øyne for å unngå øyetørrhet under operasjonen.
- Plasser den bedøvede musen i liggende stilling og barber et lite område på flankene, proksimalt for hofteleddene for iWAT-injeksjoner, med en barbermaskin. Påfør hårfjerningskrem i 5 min. Fjern gjenværende krem med vann for å unngå hudforbrenning.
- Desinfiser huden ved hjelp av tre alternerende runder med påføring av antiseptisk løsning (povidon-jod) på huden med en ren gasbind og 70% alkohol. Kast gasbindet etter hver bruk.
- Utfør en endelig påføring av en antiseptisk løsning på huden. Deretter gjør du et 1-2 cm snitt med sterilisert saks i det proksimale området av leddene, og hold huden åpen ved hjelp av tang for å avsløre fettdepotet. WAT kan bli funnet festet til huden på begge sider, som strekker seg fra begynnelsen på ryggen og ned mot testisene.
MERK: Bruk gardiner for å unngå forurensning under kirurgi eller suturprosedyrer. - Bruk tang, gjennom snittet, trekk fettdepotet forsiktig oppover for å sikre at injeksjonen er på riktig sted og dybde.
MERK: Vær forsiktig så du ikke fjerner vevet fra sin opprinnelige plassering. - Fyll mikrolitersprøyten (måler: 33; punktstil: 4; vinkel: 12; lengde: 10) (se materialfortegnelse) med 2,5 μL (5,6 × 1010 virale genomer [VG]/μL) av AAV (som inneholder sgRNA rettet mot det endogene Prdm16-genet). Stikk kanylen forsiktig i vinkel 30°-45° inn i iWAT. Gjenta injeksjonen 5x på forskjellige steder i vevet for å infisere hele iWAT-fettputen homogent. Et totalt volum på 15 μL anbefales for å infisere iWAT.
MERK: Dybden på innsetting av sprøyten avhenger av tykkelsen på fettputeavsetningen. Bruk berøringsfri teknikk til å trekke opp injeksjonen. - Lukk det barberte hudsnittet med 4/0 monofilamentsuturer. Plasser musen på en varmepute til bevisstheten er gjenvunnet. Overvåk dyret hver 10-15 min til det gjenoppretter helt. Etter at dyret gjenvinner bevisstheten, må du observere den lokomotoriske profileringen, som skal være lineær og ikke ha tegn på nød eller smerte.
- Utfør postoperativ smertekontroll innen 48 timer etter operasjonen ved å administrere tramadolhydroklorid (5 mg/kg) intraperitonealt i 3 dager (2x/dag).
MERK: Se etter tegn på nød og ubehag og overvåk vann- og matinntaket. Gi en effektiv dose smertestillende på en forebyggende måte, helst før eller i begynnelsen av operasjonen. - Hold musen i et bur med fri tilgang til mat og vann i helbredelsesperioden. Etter helbredelsesperioden, fortsett å avlive musen. I denne studien ble eutanasi utført ved en overdose injiserbare anestetika (intraperitoneal) fra 3x induserende dose (300-360 mg/kg ketaminhydroklorid + 30-40 mg/kg xylazinhydroklorid) etterfulgt av halshugging.
MERK: Det anbefales sterkt å holde dyrene plassert i individuelle bur til de er helt gjenopprettet fra anestesi.
5. In vitro differensiering av stromale vaskulære celler (SVF) til beige adipocytter
- Utfør isolering og plating av primære SVFer fra iWAT av AdipoSPH mus i henhold til Aune et al.17. Frø SVFs avledet fra AdipoSPH mus iWAT i en 6-brønns plate som inneholder komplett medium (DMEM inneholdende 3,1 g / L glukose, 0,5 g / L L-alanyl-L-glutamin, 10% FBS og 2,5% P / S) i 1-2 timer.
MERK: SVF-fraksjonen inneholder en blanding av forskjellige celletyper. På dette trinnet er det ikke mulig å definere antall frøede stamceller som gir opphav til adipocytter. - Aspirer mediet, vask brønnen 2x med fosfatbufret saltvann (1x PBS), og erstatt med friskt komplett medium. Inkuber cellene ved 37 °C, 5% CO2, 95% fuktighet til cellene når 70% -80% konfluens.
- Indusere differensiering (dag 0) ved å behandle cellene med induksjonsmediet (tabell 2).
MERK: Medikamentcocktailen av induksjonsmediet er nødvendig for å forbedre beige adipocytdifferensiering og for ekspresjon av det termogene genprogrammet17. - Etter 2 dager (dag 2) erstattes induksjonsmidlet med vedlikeholdsmediet (tabell 2).
- Etter 2 dager (dag 4) erstattes vedlikeholdsmediet med nytt vedlikeholdsmedium (tabell 2) i 2 til 3 dager.
- Bytt vedlikeholdsmedium hver 48. time til preadipocytter er fullstendig differensiert til adipocytter (vanligvis 6 dager etter tilsetning av induksjonsmedium). Eldre adipocytter kan observeres ved hjelp av lysmikroskopi, da de differensierte cellene ser ut til å være lastet med lipiddråper.
6. In vitro AAV-infeksjon av SVF
MERK: SVF-er avledet fra AdipoPH-mus iWAT ble infisert med AAV-bærende sgRNA-Prdm16 som tidligere beskrevet av Wang et al.18 med noen få modifikasjoner.
- Dyrk cellene på en 6-brønns kulturplate med komplett medium til cellene når 70% -80% samløp, som tidligere beskrevet i trinn 5.1-5.3.
- Bland 5,6 × 1010 VG/μL AAV-bærende sgRNA-Prdm16 med 2 ml komplett medium og heksadimetrinbromid (8 μg/ml) (se materialfortegnelse). Transdusere cellene ved å erstatte hele mediet og tilsette hele mediet som inneholder AAV. Inkuber de transduserte cellene i 12 timer ved 37 °C, 95 % fuktighet og 5 % CO2.
- Splitt og frø cellene som beskrevet i trinn 5 for celleproliferasjon og differensiering til beige adipocytter.
MERK: For oksygenforbruksanalysen, frø 4,0 × 104 celler (fra trinn 6,2) per brønn med induksjonsmedium i en 24-brønns cellekulturplate. De påfølgende trinnene av celleproliferasjon og differensiering utføres som beskrevet i trinn 5. Oksygenforbruksanalysen utføres når cellene når 80% -100% sammenløp og er fullt differensiert, som tidligere rapportert19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AdipoSPH mus ble utviklet av avl SPH og Adipoq-Cre musestammer. Begge musestammene var i en hybrid C57BL6J-DBA/2J bakgrunn (ifølge den kommersielle leverandøren; se materialtabell). PH-muselinjen ble opprinnelig beskrevet av Zhou et al.14.
In vivo beige adipocyttutvikling gjennom AdipoSPH-mediert Prdm16-overekspresjon
For å evaluere kapasiteten til modellen beskrevet i denne studien for å utvikle beige adipocytter in vivo, ble AAV som bærer sgRNA rettet mot Prdm16-genet injisert i iWAT hos AdipoPH-mus. Prdm16 er en veletablert transkripsjonsfaktor som bestemmer beige adipocytts utvikling og funksjon20,21. Det er viktig å nevne at vi her valgte et tidligere testet og validert sgRNA rettet mot det endogene Prdm16-genet14. AAV med tomt sgRNA ble brukt som kontroll. 10 dager etter AAV-injeksjon ble iWAT høstet for histologiske analyser og genekspresjonsanalyser (figur 1A). Som forventet viste immunfluorescensbilder av iWAT fra AdipoPH-mus uttrykket av dCas9 i både kontroll- og Prdm16-gruppene (figur 1B). I tillegg bekreftet mCherry-uttrykket suksessen til AAV-infeksjon av iWAT i både kontroll- og Prdm16-gruppene (figur 1B). SPH-indusert Prdm16-uttrykk induserte tydelig en utbredt akkumulering av multilokulære beige adipocytter til iWAT (figur 1B). Videre viste kvantitativ PCR (qPCR) økt ekspresjon av Prdm16 og det termogene genprogrammet (Ucp1, Cox8b, Ppargc1a og Cidea) i Prdm16-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (figur 1C).
Fremme av utvikling av beige adipocytter og forbedring av oksygenforbruk in vitro ved AdipoSPH-mediert Prdm16-overekspresjon
Deretter ble egnetheten til denne modellen for å studere beige adipocytbiologi in vitro undersøkt. Til dette formål ble preadipocytter avledet fra iWAT hos AdipoPH-mus transdusert med AAV som bærer sgRNA-sekvensen rettet mot Prdm16. Syv dager etter differensiering ble beige adipocytter brukt til analyse av genuttrykk og oksygenforbruk (figur 2A). Tomt sgRNA ble brukt som kontroll. Det er verdt å merke seg at fjerning av STOP-kodon ved CRE-rekombinase og aktivering av PH-maskiner var under kontroll av adiponektinpromotoren / forsterkeren, noe som resulterte i aktivering av det endogene Prdm16-genet i modne adipocytter. Genekspresjonsanalyse bekreftet det økte uttrykket av det endogene Prdm16-genet og termogene gener i Prdm16-overekspresjonsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen (figur 2B). For å bekrefte at de SPH-induserte beige adipocytter var funksjonelt termogene, ble det utført høyoppløselig respirometrianalyse på de primære adipocytter. Respirometridataanalysen og tolkningen ble utført som nylig beskrevet22. SPH-indusert Prdm16-ekspresjon resulterte i høyere basalt og maksimalt oksygenforbruk enn i kontrollceller (figur 2C). Det er viktig at dataene indikerte forbedret ukoblet respirasjon (oligomycin-insensitiv) i Prdm16-gruppen sammenlignet med kontrollgruppen (figur 2C, tabell 3). Samlet viste disse resultatene at SPH-indusert ekspresjon av endogen Prdm16 rekapitulerer bruningsfenotypen og forbedrer oksygenforbruket observert i konvensjonelle Prdm16 Tg-mus.
Figur 1 Beige fettutvikling ved injeksjon av adenoassosiert virus (AAV) rettet mot endogent Prdm16-gen i inguinalt hvitt fettvev (iWAT) hos AdipoSPH mus. (A) Skjematisk illustrasjon av in vivo beige adipocytt eksperimentell design (laget ved hjelp av Biorender.com). (B) Histologiske (hematoksylin og eosin [H&E]-farging) bilder av iWAT. Skala bar = 50 μm. (C) Kvantitativ PCR (qPCR) av Prdm16 og termogene gener (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α og Cidea; n = 3). Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01 for Prdm16 versus kontroll (CTR) ved uparet Student t-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: SPH-indusert beige adipocyttdifferensiering ved Prdm16-overuttrykk. (A) Skjematisk illustrasjon av in vitro beige adipocytt eksperimentell design (laget ved hjelp av Biorender.com). (B) Relativ genekspresjon av Prdm16 og termogene gener (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α og Cidea; n = 3). (C) Oksygenforbruk (OCR), n = 6. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM. *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001 for Prdm16 versus kontroll (CTR) ved (B) uparret Student t-test og (C) toveis gjentatte målinger ANOVA, etterfulgt av Tukeys test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Sanger-sekvensering av Prdm16 sgRNA. (A) Skjematisk illustrasjon som viser justeringen av enkeltstrengede komplementære Prdm16-oligonukleotider. (B) Sanger-sekvensering av Prdm16 sgRNA ved bruk av universell primer. Klikk her for å laste ned denne filen.
| Gen | Art | Fremover | Omvendt | |||||
| Genuttrykk | Prdm16 | mus | CAGCACGGTGAAGCCATTC | GCGTGCATCCGCTTGTG | ||||
| UCP1 | mus | TCTCAGCCGGCTTAATGACTG | GGCTTGCATTCTGACCTTCAC | |||||
| Ppargc1a | mus | AGCCGTGACCACTGAACGAACGAG | GCTGCATGGTTCTGAGTGCTAAG | |||||
| Cox8b | mus | GAACCATGAAGCCAACGACT | GCGAAGTTCAGTCAGTGGTTCC | |||||
| Cidea | mus | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTCCATTTCT | |||||
| 36B4 | mus | TCCAGGCTTTGGGCATCA | CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA | |||||
| Molekylær kloning | sgRNA Prdm16-sekvens | mus | CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG | CCCCTTTTCAGCGCAGCTCG | ||||
| universell primer | mus | GAGGGCCTATTTCCC ATGATTCCTTCATAT |
||||||
Tabell 1: Primersekvenser brukt i studien.
| Middels | Komposisjon | |||
| Komplett medium | Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med L-glutamin | |||
| 10% av føtal bovint serum (FBS) | ||||
| 2,5% av penicillin / streptomycin | ||||
| Induksjonsmedium | Komplett medium | |||
| Indometacin, endelig konsentrasjon 125 μM (0,125 M lager i etanol). MERK: Indometacin må varmes opp til 90 °C i 10 sekunder for å bli oppløst. | ||||
| Insulin, endelig konsentrasjon 20 nM (1 mM stam, tilsett 1 μL HCl for å oppløseliggjøre (5,73 mg/ml). Oppbevares på lager ved -20 °C. | ||||
| Deksametason, endelig konsentrasjon 2 μg/ml (2 mg/ml etanol) | ||||
| 3-isobutyl-1-metylxanthin (IBMX), endelig konsentrasjon 500 μM (0,25 M bestand i 0,5 M KOH) | ||||
| 3,3',5-Triiodo-L-tyronin (T3), endelig konsentrasjon 1 nM (10 μM stam, oppløs T3 i 1 M HCl og EtOH 1:4 til lager). | ||||
| Rosiglitazon, endelig konsentrasjon 1 μg/ml (1 mg/ml etanolbestand) | ||||
| Medium for vedlikehold | Komplett medium | |||
| Insulin, endelig konsentrasjon 20 nM (1 mM stam). Tilsett 1 μL HCl for å solubilisere (5,73 mg / ml). | ||||
| Rosiglitazon, endelig konsentrasjon 1 μg/ml (1 mg/ml etanolbestand) | ||||
Tabell 2: Sammensetning av medier brukt i studien.
| Parametere | CTR | PRDM16 | p-verdi | ||
| Ingen mitokondrielt oksygenforbruk (pMoles/min/μg protein) | 8,19 ± 1,40 | 10,80 ± 1,83 | 0.01 | ||
| Basalrespirasjon (pMoles/min/μg protein) | 28,82 ± 5,20 | 52,58 ± 13,73 | 0.001 | ||
| Maksimal respirasjon (pMoles/min/μg protein) | 63,81 ± 9,80 | 122,94 ± 22,31 | < 0,001 | ||
| Ekstra respirasjonskapasitet (pMoles/min/μg protein) | 34.98 ± 11.09 | 70.36 ± 26.06 | 0.006 | ||
| Oligo ufølsom (pMoles/min/μg protein) | 8,27 ± 2,29 | 15,85 ± 5,48 | 0.005 | ||
| Oligosensitiv (pMoles/min/μg protein) | 20.54 ± 5,68 | 36,72 ± 14,79 | 0.016 | ||
| Kobling effektivitet | 71,28 ± 1,51 | 69,84 ± 3,05 | 0.163 | ||
| Celle RCR | 7,70 ± 1,46 | 7,75 ± 2,43 | 0.485 | ||
Tabell 3: Respiratoriske parametere for SPH-induserte beige adipocytter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En av de mest nyttige ikke-redigeringsapplikasjonene til CRISPR-teknologi er undersøkelsen av genfunksjon gjennom aktivering av endogene gener ved bruk av CRISPRa-systemer6. SPH er en kraftig CRISPRa som opprinnelig ble beskrevet for å indusere omdannelsen av astrocytter til aktive nevroner ved å målrette flere nevrogene gener14. I denne studien ble AdipoSPH vist å være et egnet verktøy for å undersøke beige fettbiologi ved å aktivere uttrykket av endogen Prdm16 i adipocytter. SPH-indusert Prdm16-overekspresjon i adipocytter fører til aktivering av det termogene genprogrammet og induserer bruningsfenotypen, fenokopiering av en tidligere transgen (Tg) Prdm16-musmodell23. Prdm16 ble valgt i denne studien som mål for å indusere beige adipocytter basert på den sentrale rollen til denne transkripsjonsfaktoren i regulering av brun og beige fettdifferensiering, samt regulering av det termogene genprogrammet (f.eks. Forbedring av Ucp1-uttrykk) i differensierte adipocytter. Likevel tillater dagens modell overekspresjon av ethvert endogent gen etter forskernes skjønn og målet med studien.
Tradisjonelle transgene modeller som undersøker fettvevsbiologi er avhengige av utvikling av genetisk modifiserte gnagere som overuttrykker et transgen under kontroll av en promotor / forsterker begrenset til adipocytter (for eksempel Fabp4 eller adiponektin)24. Selv om dagens teknologi har akselerert tempoet i utviklingen av disse modellene, er kostnadene og tiden for å utvikle dem fortsatt et vanlig problem som oppleves av det vitenskapelige samfunn. I motsetning til dette er AdipoSPH en billigere og mer allsidig modell for gain-of-function-tilnærminger enn tradisjonelle Tg-mus. Videre er AdipoSPH godt egnet for å studere lange ikke-kodende RNA- og transkripsjonsisoformer, som ikke er spesielt egnet for Tg-musmodeller.
AdipoSPH presenterer også flere fordeler ved å undersøke fettvevsbiologi sammenlignet med enkel administrering av AAV, en nåværende alternativ tilnærming for gain-of-function-eksperimenter25. For det første fremmer AAV levert til fettvev overekspresjon ved å introdusere flere kopier av et transgen. I motsetning til dette representerer PH-aktiveringen av endogene gener en mer naturlig virkningsmekanisme. For det andre vil transgener levert av AAV (ved hjelp av konstitutive promotorer) normalt resultere i overekspresjon i "hvilken som helst celletype" i fettvevets mikromiljø. I motsetning til dette er AdipoSPH-indusert ekspresjon av endogene gener begrenset til adipocytter. For det tredje er emballasjestørrelsen (~4,5 kb) en typisk begrensning av AAV for noen transgener26. AAV-bærende sgRNA krever imidlertid en enkel og enkel kloningsstrategi for tilpassede 20 nukleotider. Til slutt når AAV-administrasjon vanligvis systemisk sirkulasjon og infiserer andre vev og organer. Selv om noen AAV-er inneholder mikroRNA for å redusere ekspresjonen av transgener i bestemte vev, som lever og hjerte25, kan denne strategien ikke forhindre AAV-infeksjon i andre vev og organer. AdipoSPH-indusert ekspresjon av endogene gener er derimot begrenset til adipocytter, selv med tanke på en viss lekkasje av AAV til systemisk sirkulasjon. Dermed er AdipoSPH også en egnet modell for systemisk administrering av AAV-bærende sgRNA og undersøkelse av fettvevsregulering av helkroppsenergihomeostase.
Selv om AdipoPH-modellen gir noen fordeler, har den begrensninger som er viktige å vurdere. AAV er i dag den vanligste plattformen for in vivo levering av sgRNA. Noen utfordringer i AAV-industrien og immunologiske problemstillinger er imidlertid fortsatt uløste 26,27. Videre resulterer ulike mengder og fordelinger av injisert AAV gjennom fettvev i intra- og intervevsvariabilitet av genuttrykk. Vi anser at sgRNA-vektorkloning, AAV-produksjon og homogen administrering av AAV i iWAT er kritiske skritt for å lykkes med denne protokollen. Til slutt aktiverer forskjellige sgRNA tydelig uttrykket av endogene gener i PH-systemet14. Hovedanbefalingen er å designe og teste tre til fem sgRNA-sekvenser innen 200 bp oppstrøms for transkripsjonsstartstedet (TSS) av genet av interesse. Derfor krever definisjon av den beste sgRNA-sekvensen for et målgen vanligvis arbeidskrevende in vitro-analyser før in vivo-eksperimenter.
AdipoSPH er også en attraktiv modell for å undersøke andre aspekter av fettvevsbiologi. For eksempel fremmer adipocytter sekresjonen av mange adipokiner28,29; Imidlertid forblir helkroppseffektene av de fleste av disse molekylene dårlig forstått. AdipoSPH er en egnet modell for å løse dette problemet ved å overuttrykke enkle eller flere endogene gener i modne adipocytter og undersøke deres lokale eller systemiske effekter. Dermed er AdipoSPH et unikt verktøy for å studere biologi og fysiologi av fettvev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker støtten mottatt fra Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, for genereringen av AdipoPH-mus, Inmmunometabolism and Cell Signaling Laboratory, og National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology (INFABIC) for all eksperimentell støtte. Vi takker den økonomiske støtten fra Sao Paulo Research Foundation (FAPESP): 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
References
- Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
- Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
- Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
- Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
- Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
- Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103 (2020).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118 (2020).
- Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
- Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
- Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
- Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
- Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
- Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
- Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
- Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828 (2020).
