Summary
이 프로토콜은 베이지색 지방 생물학을 조사하기 위한 아데노 관련 바이러스(AAV)에 대한 대체 전략으로 지방 세포(AdipoSPH)에서 CRISPR SunTag-p65-HSF1(SPH)의 사용을 제시합니다. 내인성 Prdm16 유전자를 표적으로 하는 AAV 운반 sgRNA의 생체 내 주입은 베이지색 지방 발달을 유도하고 열 발생 유전자 프로그램을 향상시키기에 충분합니다.
Abstract
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기술은 생물학에 혁명을 일으켰으며, 최근의 도구는 원래 기술된 유전자 편집을 훨씬 뛰어넘어 적용되었습니다. CRISPR 활성화(CRISPRa) 시스템은 촉매 비활성 Cas9(dCas9) 단백질과 별개의 전사 모듈을 결합하여 내인성 유전자 발현을 유도합니다. SunTag-p65-HSF1(SPH)은 최근에 개발된 CRISPRa 기술로, 시너지 활성화 매개체(SAM)의 구성 요소와 SunTag 활성제를 결합합니다. 이 시스템은 맞춤형 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 설계하여 단일 또는 다중 유전자의 과발현을 허용합니다. 본 연구에서는 이전에 개발된 SPH 마우스를 사용하여 AdipoSPH라는 이름의 지방세포(adiponectin Cre lineage)에서 SPH를 발현하는 조건부 마우스를 생성하였다. 흰색에서 베이지색의 지방(갈변) 표현형을 유도하기 위해 내인성 Prdm16 유전자(갈색 및 베이지색 지방 발달과 관련된 잘 확립된 전사 인자)를 표적으로 하는 sgRNA를 운반하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 사타구니 백색 지방 조직(iWAT)에 주입했습니다. 이 마우스 모델은 내인성 Prdm16의 발현을 유도하고 열 발생 유전자 프로그램을 활성화시켰다. 또한, 시험관 내 SPH 유도 Prdm16 과발현은 베이지색 지방세포의 산소 소비를 향상시켜 이전 Prdm16 형질전환 마우스 모델의 결과를 표현화했습니다. 따라서 이 프로토콜은 지방 조직 생물학을 조사하기 위한 다재다능하고 비용 효율적이며 시간 효율적인 마우스 모델을 설명합니다.
Introduction
베이지색(또는 브라이트) 지방세포는 백색 지방 조직(WAT) 저장소 내에 존재하는 단백질 1(UCP1) 발현 및 미토콘드리아가 풍부한 지방세포의 결합을 해제합니다. 베이지색 지방은 저온 노출 및 기타 자극에 대한 반응으로 지방 세포 전구체 또는 성숙한 백색 지방 세포의 하위 집합에서 나옵니다 1,2. 베이지색 지방세포는 UCP1 의존적 또는 독립적인 방식으로 에너지를 열로 변환할 수 있다3. 열 발생 기능에 관계없이 베이지색 지방은 아디포카인 분비, 항염증 및 항섬유화 활동과 같은 다른 수단을 통해 대사 건강을 개선할 수도 있습니다. 생쥐와 인간을 대상으로 한 연구에 따르면 베이지색 지방을 유도하면 전신 포도당과 지질 항상성이 향상되는 것으로 나타났다3. 그러나 베이지색 지방 생물학에 대한 우리의 지식은 최근 몇 년 동안 빠르게 발전했지만 대부분의 대사 이점과 관련 메커니즘은 아직 완전히 이해되지 않았습니다.
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic repeats(CRISPR)는 Cas9 단백질 4,5의 뉴클레아제 활성을 통해 게놈의 특정 부위에서 이중 가닥 절단(DSB)을 생성할 수 있는 도구로서 진핵 세포에서 처음 설명되었습니다. Cas9은 합성 단일 가이드 RNA(sgRNA)에 의해 유도되어 특정 게놈 영역을 표적으로 하여 DNA DSB를 유도합니다. CRISPR-Cas9 기술은 편집 목적으로 뉴클레아제 Cas9을 사용하는 것 외에도 서열 특이적 유전자 조절 도구로 사용되도록 발전했습니다6. 촉매 비활성 Cas9 단백질(dCas9)의 개발과 유전자 발현을 향상시킬 수 있는 전사 모듈의 결합으로 인해 CRISPR 활성화(CRISPRa) 도구가 탄생했습니다. SAM과 SunTag 활성제의 구성 요소를 결합한 VP647,8, 시너지 활성화 매개체(SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 및 SunTag-p65-HSF1(SPH)14와 같은 여러 CRISPRa 시스템이 등장했습니다. 최근 N2a 신경아세포와 일차 성상교세포에서 신경성 유전자의 유도 발현이 다른 CRISPRa 시스템에 비해 SPH를 사용하는 것이 더 높다는 것이 입증되었으며14, 이는 SPH가 유망한 CRISPRa 도구임을 입증한다.
여기서, 우리는 이전에 개발된 SPH 마우스(14 )를 활용하여 아디포넥틴 Cre 계통(AdipoSPH)을 사용하여 지방세포에서 SPH를 특이적으로 발현하는 조건부 마우스 모델을 생성하였다. 내인성 Prdm16 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 운반하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 사용하여 사타구니 WATT(iWAT)의 갈변(흰색에서 베이지색으로의 전환)을 유도하여 열 발생 유전자 프로그램의 발현을 증가시켰습니다. 또한, 시험관내 Prdm16 과발현은 산소 소비를 향상시켰다. 따라서 이 프로토콜은 지방 조직 내에서 베이지색 지방 발달 메커니즘을 탐색하기 위한 다목적 SPH 마우스 모델을 제공합니다.
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Protocol
동물 연구는 캄피나스 대학교 실험실 동물 관리 및 사용 가이드(프로토콜 CEUA #5810-1/2021)에 따라 수행되었습니다.
1. 분자 복제
- 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 설계
- https://chopchop.cbu.uib.no/ 에서 구할 수 있는 CHOPCHOP 또는 기타 적절한 도구를 사용하여 CRISPR 활성화를 위한 sgRNA를 설계합니다. 다음 파라미터를 사용하여 Prdm16 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 설계합니다: 표적: Prdm16; 에서: Mus musculus; 사용: Crispr/Cas9; 대상: 활성화.
참고: 200bp 업스트림 전사 시작 부위(TSS) 영역에 걸쳐 분산된 각 관심 영역에 대한 sgRNA를 설계합니다. 예를 들어, 이 연구에 사용된 Prdm16을 표적으로 하는 sgRNA는 TSS의 상류에서 154bp에 결합합니다. - 벡터 백본 pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry의 SacI 제한 부위와 일치하도록 sgRNA에 돌출부를 추가합니다( 재료 표 참조). 포함: 5'-(N20)AGCT-3'(N = 뉴클레오티드). 예를 들어, Prdm16 유전자를 표적으로 하는 서열은 5'-CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3'이고, 오버행이 있는 서열은 5'-CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'이다.
- https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html 에서 사용할 수 있는 도구를 사용하여 3' sgRNA 역보체 서열을 얻습니다. 예를 들어, Prdm16 유전자를 표적으로 하는 3' sgRNA 서열은 3'-TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'이다.
- https://chopchop.cbu.uib.no/ 에서 구할 수 있는 CHOPCHOP 또는 기타 적절한 도구를 사용하여 CRISPR 활성화를 위한 sgRNA를 설계합니다. 다음 파라미터를 사용하여 Prdm16 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 설계합니다: 표적: Prdm16; 에서: Mus musculus; 사용: Crispr/Cas9; 대상: 활성화.
- single-stranded complementary oligonucleotides의 어닐링
- 각각 5' 및 3' 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(스톡 농도: 100μM) 1μL, T4 리가제 완충액 1μL, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK)(1 ×10 4 units/mL) 0.5μL,H2O6.5μL를 최종 반응 부피 10μL에 추가합니다. 37°C에서 30분, 95°C에서 5분 동안 반응한 후 5°C/min의 램프 다운 속도를 제공합니다.
참고: PNK 효소는 PNK 완충액과 함께 제공되며 인산화 반응에 필요한 충분한 ATP를 포함하지 않습니다( 재료 표 참조). 반응을 단순화하려면 T4 리가아제 완충액(PNK 완충액 대신)을 사용하십시오. T4 리가아제 완충제는 인산화 반응을 위한 포스페이트의 적절한 양(1 mM ATP)을 제공한다. PNK 효소는 후속 결찰 반응을 위해 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 인산화를 제공합니다.
- 각각 5' 및 3' 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(스톡 농도: 100μM) 1μL, T4 리가제 완충액 1μL, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK)(1 ×10 4 units/mL) 0.5μL,H2O6.5μL를 최종 반응 부피 10μL에 추가합니다. 37°C에서 30분, 95°C에서 5분 동안 반응한 후 5°C/min의 램프 다운 속도를 제공합니다.
- 어닐링된 sgRNA 올리고뉴클레오티드의 결찰
- 플라스미드 pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry 25 ng을 어닐링된 sgRNA 올리고뉴클레오티드 2 μL, SacI 효소 1 μL, 10x T4 DNA 리가제 완충액 2 μL, T4 DNA 리가제 1 μL (1-3 u/μL) ( 재료 표 참조) 및 H2O를 10 μL의 최종 반응 부피에 추가합니다.
- 다음 조건 하에서 열순환기를 사용하여 반응 혼합물을 인큐베이션함으로써 결찰을 수행한다: 5분 동안 37°C 및 5분 동안 25°C의 15 사이클, 이어서 4°C에서 유지.
- 형질전환 후 콜로니 중합효소 연쇄 반응(PCR)
- 열충격(45초 동안 42°C)을 사용하여 결찰 산물 4μL로 적격한 대장균 DH10B 세포( 재료 표 참조)를 변형하고 100μg/mL 암피실린이 포함된 한천 플레이트에 뿌립니다.
- PCR 마스터 믹스를 사용하여 콜로니 PCR로 형질전환된 콜로니를 확인합니다( 재료 표 참조). 콜로니를 선택하고 5 μL의 마스터 믹스, 0.1 μL의 범용 프라이머 (스톡 농도: 100 μM), 0.1 μL의 sgRNA 역방향 프라이머 (스톡 농도: 100 μM) (표 1) 및 5 μL의H2O와 혼합합니다. 다음 조건에서 thermocycler를 사용하여 PCR을 실행합니다. 초기 변성(94°C에서 2분), 변성(20초 동안 94°C), 어닐링(30초 동안 60°C), 연장(30초 동안 72°C) 및 최종 신장 단계(5분 동안 72°C)의 35주기가 이어집니다. 90 V에서 30분 동안 0.5x TAE 완충액 중 아가로스(1.5%) 겔 전기영동을 사용하여 DNA를 분해합니다.
참고: 양성 클론은 ~280bp의 밴드를 제공합니다. - 양성 제출amp범용 프라이머를 사용한 Sanger 염기서열 분석을 위한 파일(표 1, 보충 파일 1).
- 플라스미드 정제
- 제조업체의 지침에 따라 플라스미드 정제 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 양성 클론에서 플라스미드를 정제합니다.
참고: 음이온 교환 수지 또는 세포 형질감염에 사용하기에 적합한 다른 키트를 사용하여 플라스미드를 정제합니다. - 100μg/mL 암피실린을 함유한 표준 박테리아 성장 배지를 사용하여 양성 클론(37°C에서 200rpm으로 진탕하면서 12시간)을 배양합니다.
- 박테리아 세포를 6,000 × g 에서 4 °C에서 10 분 동안 원심 분리합니다. 제조업체의 키트 지침에 따라 다음 단계를 따르십시오.
- 제조업체의 지침에 따라 플라스미드 정제 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 양성 클론에서 플라스미드를 정제합니다.
2. AAV 포장
참고: AAV 포장은 이전 간행물15,16에 따라 약간의 수정을 가하여 수행되었습니다.
- 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)을 포함하는 25mL의 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)을 사용하여 175cm2 플라스크(플라스크당 5 ×10 6개 세포 시딩)에서 293T 세포(재료 표 참조). 세포가 50%-70% 합류점에 도달할 때까지 37°C, 5%CO2 및 95% 습도에서 배양합니다.
- 14μL의 폴리에틸렌이민(1μg/μL)과 1mL의 150mM NaCl을 혼합합니다. AAV 생산에 필요한 3개의 플라스미드를 1:1:1 몰비(즉, 17.7μg의 pAdDeltaF6, 7.9μg의 AAV2/8( 재료 표 참조) 및 5.9μg의 150mM NaCl 1mL에 1단계로부터 클로닝된 sgRNA로 혼합합니다. 폴리에틸렌이민:NaCl 혼합물을 DNA (플라스미드 혼합물)가 들어있는 튜브에 한 방울씩 옮기고 25 °C에서 20 분 동안 배양합니다.
참고: pAdDeltaF6는 헬퍼 플라스미드이고 pCapsid pAAV2/8은 복제(Rep) 및 캡시드(cap) 유전자를 발현하는 패키징 플라스미드입니다. 두 플라스미드 모두 AAV를 생산하는 데 필요합니다. - 형질감염 전에 세포 성장 배지를 1% FBS와 L-알라닐-L-글루타민(0.5g/L)이 포함된 DMEM 18mL로 교체합니다. 폴리에틸렌이민:DNA 혼합물 2mL를 각 배양 플라스크에 넣고 CO2 배양기(37°C, 5%CO2, 95% 습도)에서 세포를 배양합니다.
- 5시간 후 10% FBS와 L-알라닐-L-글루타민(0.5g/L)이 보충된 DMEM 5mL를 추가합니다.
- 배양 3일 후, 세포 스크레이퍼를 사용하여 배양 플라스크에서 세포를 분리합니다. 10개(175cm2) 세포 배양 플라스크에서 293T 세포를 50mL 원뿔형 튜브에 수집하고 최대 30mL의 DMEM(재료 표 참조)을 추가합니다.
- 293T 세포가 들어 있는 각 50mL 원뿔형 튜브에 3mL의 클로로포름을 넣고 볼텍스 믹서를 사용하여 5분 동안 고속으로 혼합합니다. 7.6mL의 5M NaCl을 추가하고 잠시 소용돌이하여 세포를 재현탁합니다. 3,000 × g 및 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리.
- 수성상을 새로운 원뿔형 튜브로 옮기고 9.4mL의 50%(v/v) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 8000을 추가합니다. 소용돌이 믹서로 고속으로 10 초 동안 혼합하고 샘플을 1 시간 동안 얼음에 놓습니다.
- 4°C에서 3,000× g 에서 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠릿을 10분 동안 건조시킵니다.
- 1.4mL의 HEPES(50mM, pH 8)를 넣고 볼텍스 믹서를 사용하여 고속으로 5분 동안 혼합합니다. 3.5μL의 1MMgCl2, 14μL의 DNase I(20단위/μL) 및 1.4μL의 RNase A(10μg/μL)를 추가합니다. 37°C 수조에서 20분 동안 배양한 다음 샘플을 새 1.5mL 튜브(각 튜브당 700μL)로 옮깁니다.
- 각 1.5mL 튜브에 클로로포름 700μL를 넣고 볼텍스 믹서를 사용하여 고속으로 10초 동안 혼합합니다. 4°C에서 3,000× g 에서 5분 동안 원심분리하고 수성상을 새로운 튜브로 옮깁니다. 이 단계를 3회 반복합니다.
- 생물 안전 캐비닛에서 30분 동안 클로로포름을 증발시킵니다. 그런 다음 수성 상 300 μL를 0.5 mL 초원심분리 튜브로 옮깁니다( 재료 표 참조). 필터를 25°C에서 14,000× g 에서 5분 동안 돌립니다. 플로우 스루를 제거하고 전체 볼륨이 필터를 통과할 때까지 필터를 다시 돌립니다.
- 300μL의 Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS)을 첨가하여 필터를 세척하고 피펫팅으로 용액을 혼합합니다. 필터를 25°C에서 14,000× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 이 세척 단계를 4회 반복합니다.
- 필터를 25°C에서 14,000× g 에서 8분 동안 원심분리합니다. 필터를 새 튜브에 거꾸로 놓고 25°C에서 1,000× g 에서 2분 동안 회전시킵니다.
3. qPCR에 의한 AAV의 적정
- AAV 적정을 위한 표준 곡선을 준비하고 Fripont et al.15의 원래 연구에 따라 AAV 역가를 결정합니다.
4. 사타구니 백색 지방 조직(iWAT)에 AAV의 생체 내 주입
- 수술에 필요한 수술 도구와 용품을 분리하여 각 특정 재료에 권장하는 대로 멸균합니다.
- 복강내 주사로 100mg/kg 케타민과 10mg/kg 자일라진으로 마우스를 마취합니다. 발과 꼬리에 격렬한 압력을 가하고 반사를 확인하여 마취를 확인하십시오. 수술 중 눈이 건조하지 않도록 마우스의 눈에 연고를 바르십시오.
- 마취된 마우스를 앙와위 자세로 놓고 면도기로 iWAT 주사를 위해 고관절 근위부에 있는 옆구리의 작은 부위를 면도합니다. 5 분 동안 제모 크림을 바릅니다. 피부 화상을 방지하기 위해 물로 잔여 크림을 제거하십시오.
- 깨끗한 거즈와 70 % 알코올로 피부에 소독액 (포비돈 요오드)을 3 회 번갈아 가며 피부를 소독하십시오. 사용 후에는 거즈를 버리십시오.
- 피부에 소독액을 최종 도포하십시오. 그런 다음 관절의 근위 부위에 멸균 된 가위로 1-2cm 절개를하고 집게를 사용하여 피부를 열어 지방 저장소를 노출시킵니다. WAT는 양쪽 피부에 부착되어 있으며 뒤쪽의 처음부터 고환쪽으로 뻗어 있습니다.
알림: 수술이나 봉합 절차 중 오염을 방지하기 위해 커튼을 사용하십시오. - 집게를 사용하여 절개를 통해 지방 저장소를 위쪽으로 부드럽게 당겨 주사가 올바른 위치와 깊이에 있는지 확인합니다.
알림: 티슈를 원래 위치에서 제거하지 않도록 주의하십시오. - 마이크로리터 주사기(게이지: 33, 포인트 스타일: 4, 각도: 12, 길이: 10)(재료 표 참조)에 AAV(내인성 Prdm16 유전자를 표적으로 하는 sgRNA 포함)의 2.5μL(5.6 ×10 10 바이러스 게놈[VG]/μL)을 채웁니다. 바늘을 iWAT에 30°-45° 각도로 조심스럽게 삽입합니다. 조직의 다른 위치에 주사를 5회 반복하여 전체 iWAT 지방 패드를 균질하게 감염시킵니다. iWAT를 감염시키기 위해 총 부피 15μL가 권장됩니다.
알림: 주사기의 삽입 깊이는 지방 패드 침전물의 두께에 따라 다릅니다. 노터치 기술을 사용하여 주사를 그립니다. - 4/0 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 면도한 피부 절개 부위를 닫습니다. 의식이 회복될 때까지 마우스를 열 패드에 올려 놓습니다. 완전히 회복 될 때까지 10-15 분마다 동물을 모니터링하십시오. 동물이 의식을 회복 한 후, 선형이어야하고 고통이나 통증의 징후가 없어야하는 운동 프로파일 링을 관찰하십시오.
- 수술 후 48시간 이내에 트라마돌 염산염(5mg/kg)을 3일(2회/일) 복강 투여하여 수술 후 통증 조절을 시행합니다.
알림: 고통과 불편함의 징후를 관찰하고 물과 음식 섭취량을 모니터링하십시오. 효과적인 용량의 진통제를 선제적 방식으로, 가급적이면 수술 전이나 수술 시작 시에 투여하십시오. - 치유 기간 동안 음식과 물을 자유롭게 이용할 수있는 새장에 마우스를 보관하십시오. 치유 기간이 지나면 마우스를 안락사시킵니다. 본 연구에서는 유도 용량의 3배(300-360mg/kg 케타민 염산염 + 30-40mg/kg 자일라진 염산염)의 주사 가능한 마취제를 과다 투여한 후 참수하여 안락사를 시행하였다.
알림: 마취에서 완전히 회복될 때까지 동물을 개별 케이지에 보관하는 것이 좋습니다.
5. 기질 혈관 세포(SVF)를 베이지색 지방세포로 시험 관 내 분화
- Aune et al.17에 따라 AdipoSPH 마우스의 iWAT에서 1차 SVF의 분리 및 도금을 수행합니다. AdipoSPH 마우스 iWAT에서 파생된 종자 SVF를 완전한 배지(3.1g/L 포도당, 0.5g/L L-알라닐-L-글루타민, 10% FBS 및 2.5% P/S를 포함하는 DMEM)를 포함하는 6웰 플레이트에 1-2시간 동안.
참고: SVF 분획에는 다양한 세포 유형의 혼합물이 포함되어 있습니다. 이 단계에서, 지방 세포를 발생시키는 시드 된 전구 세포의 수를 정의하는 것은 불가능하다. - 배지를 흡인하고, 인산염 완충 식염수(1x PBS)를 사용하여 웰을 2배 세척하고, 새로운 완전 배지로 교체한다. 세포가 70%-80% 합류도에 도달할 때까지 37°C, 5%CO2, 95% 습도에서 세포를 배양합니다.
- 유도 배지로 세포를 처리하여 분화(0일째)를 유도한다(표 2).
참고: 유도 배지의 약물 칵테일은 베이지색 지방세포 분화를 향상시키고 열발생 유전자 프로그램의 발현을 위해 필요하다17. - 2일 후(2일째), 유도 배지를 유지 배지로 교체한다(표 2).
- 2일 후(4일차) 2-3일 동안 유지 관리 매체를 새로운 유지 관리 매체(표 2)로 교체합니다.
- 지방전구세포가 지방세포로 완전히 분화될 때까지 48시간마다 유지 배지를 교체합니다(일반적으로 유도 배지 첨가 후 6일). 성숙한 지방 세포는 분화된 세포에 지질 방울이 가득 차 있는 것처럼 보이기 때문에 광학 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다.
6. SVF의 시험관 내 AAV 감염
참고: AdipoSPH 마우스 iWAT에서 파생된 SVF는 이전에 Wang et al.18 에 의해 설명된 바와 같이 몇 가지 수정을 통해 AAV 운반 sgRNA-Prdm16에 감염되었습니다.
- 5.1-5.3단계에서 앞서 설명한 대로 세포가 70%-80% 합류에 도달할 때까지 완전한 배지를 사용하여 6웰 배양 플레이트에서 세포를 성장시킵니다.
- 5.6 ×10 VG/μL의 AAV 운반 sgRNA-Prdm16을 2mL의 완전 배지 및 헥사디메트린 브로마이드(8μg/mL)와 혼합합니다(재료 표 참조). 완전한 배지를 교체하고 AAV를 포함하는 완전한 배지를 추가하여 세포를 형질도입합니다. 형질도입된 세포를 37°C, 95% 습도 및 5% CO2에서12시간 동안 인큐베이션한다.
- 세포 증식 및 베이지색 지방세포로의 분화를 위해 단계 5에 기재된 바와 같이 세포를 분절하고 시딩한다.
참고: 산소 소비 분석을 위해, 24-웰 세포 배양 플레이트에서 유도 배지를 사용하여 웰당 4.0 ×10 4 세포(단계 6.2로부터)를 시드합니다. 세포 증식 및 분화의 후속 단계는 단계 5에 기재된 바와 같이 수행된다. 산소 소비량 분석은 이전에 보고된 바와 같이 세포가 80%-100% 합류에 도달하고 완전히 분화될 때 수행된다19.
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Representative Results
AdipoSPH 마우스는 SPH 및 Adipoq-Cre 마우스 균주를 육종하여 개발되었습니다. 두 마우스 균주 모두 하이브리드 C57BL6J-DBA/2J 배경에 있었습니다(상용 공급업체에 따름, 재료 표 참조). SPH 마우스 계통은 원래 Zhou et al.14에 의해 설명되었습니다.
AdipoSPH 매개 Prdm16 과발현을 통한 생체 내 베이지 지방세포 발달
생체 내에서 베이지색 지방세포를 발달시키기 위해 본 연구에 기술된 모델의 능력을 평가하기 위해, Prdm16 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 운반하는 AAV를 AdipoSPH 마우스의 iWAT에 주입하였다. Prdm16은 베이지색 지방세포 발달 및 기능을 결정하는 잘 확립된 전사 인자입니다20,21. 여기서 우리는 내인성 Prdm16 유전자14를 표적으로 하는 이전에 테스트되고 검증된 sgRNA를 선택했다는 점을 언급하는 것이 중요합니다. 빈 sgRNA를 운반하는 AAV를 대조군으로 사용하였다. AAV 주사 후 10일째에 조직학적 및 유전자 발현 분석을 위해 iWAT를 수확했습니다(그림 1A). 예상한 바와 같이, AdipoSPH 마우스로부터의 iWAT의 면역형광 이미지는 대조군 및 Prdm16 그룹 모두에서 dCas9의 발현을 입증하였다(도 1B). 또한, mCherry 발현은 대조군과 Prdm16 그룹 모두에서 iWAT의 AAV 감염의 성공을 확인했습니다(그림 1B). SPH 유도 Prdm16 발현은 다발성 베이지색 지방세포가 iWAT에 광범위하게 축적되도록 명확하게 유도했습니다(그림 1B). 또한, 정량적 PCR(qPCR)은 대조군에 비해 Prdm16 그룹에서 Prdm16 및 열발생 유전자 프로그램(Ucp1, Cox8b, Ppargc1a 및 Cidea)의 발현이 증가한 것으로 나타났습니다(그림 1C).
베이지색 지방세포 발달 촉진 및 AdipoSPH 매개 Prdm16 과발현에 의한 in vitro 산소 소비 향상
다음으로, 시험관 내에서 베이지색 지방세포 생물학을 연구하기 위한 이 모델의 적합성을 조사하였다. 이를 위해 AdipoSPH 마우스의 iWAT에서 유래한 지방전구세포를 Prdm16을 표적으로 하는 sgRNA 서열을 운반하는 AAV로 형질도입하였다. 분화 후 7일째에 베이지색 지방세포를 유전자 발현 및 산소 소비량 분석에 사용했습니다(그림 2A). 빈 sgRNA를 대조군으로 사용하였다. CRE 재조합효소에 의한 STOP 코돈의 제거 및 SPH 기계의 활성화가 아디포넥틴 프로모터/인핸서의 제어 하에 있었고, 그 결과 성숙한 지방세포에서 내인성 Prdm16 유전자가 활성화되었다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 유전자 발현 분석 결과 대조군에 비해 Prdm16 과발현 군에서 내인성 Prdm16 유전자 및 열발생 유전자의 발현 증가를 확인할 수 있었다(도 2B). SPH로 유도된 베이지색 지방세포가 기능적으로 열발생성임을 확인하기 위해 1차 지방세포에 대해 고해상도 호흡기 분석을 수행했습니다. 호흡 측정 데이터 분석 및 해석은 최근 기술된바와 같이 수행되었다 22. SPH에 의해 유도된 Prdm16 발현은 대조군 세포에서보다 더 높은 기저 및 최대 산소 소비를 초래했습니다(그림 2C). 중요하게도, 데이터는 대조군과 비교하여 Prdm16 그룹에서 향상된 비결합 호흡(올리고마이신 민감성)을 나타냅니다(그림 2C, 표 3). 종합하면, 이러한 결과는 내인성 Prdm16의 SPH 유도 발현이 갈변 표현형을 요약하고 기존 Prdm16 Tg 마우스에서 관찰된 산소 소비율을 향상시킨다는 것을 보여주었습니다.
그림 1: 내인성 Prdm16 유전자를 표적으로 하는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 AdipoSPH 마우스의 사타구니 백색 지방 조직(iWAT)에 주입하여 베이지색 지방 발달. (A) 생체 내 베이지색 지방세포 실험 설계의 개략도(Biorender.com 를 사용하여 생성됨). (B) iWAT의 조직학적(헤마톡실린 및 에오신 [H&E] 염색) 이미지. 스케일 바 = 50 μm. (c) Prdm16 및 열 발생 유전자 (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α 및 Cidea; n = 3)의 정량적 PCR (qPCR). 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. *p < 0.05; **짝을 이루지 않은 스튜던트 t-검정에 의한 Prdm16 대 대조군(CTR)에 대한 p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Prdm16 과발현에 의한 SPH 유도 베이지색 지방세포 분화. (A) 시험관 내 베이지색 지방세포 실험 설계의 개략도(Biorender.com 를 사용하여 작성). (B) Prdm16 및 열 발생 유전자 (Ucp1, Cox8b, Ppargc1α 및 Cidea; n = 3)의 상대적 유전자 발현. (C) 산소 소비율(OCR), n=6. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. *p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001 Prdm16 대 대조군(CTR) (B) 짝을 이루지 않은 스튜던트 t-검정 및 (C) 양방향 반복 측정 ANOVA에 이어 Tukey 검정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: Prdm16 sgRNA의 Sanger 염기서열분석. (A) 단일 가닥 상보적 Prdm16 올리고뉴클레오티드의 정렬을 보여주는 개략도. (B) 범용 프라이머를 사용한 Prdm16 sgRNA의 Sanger 시퀀싱. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
| 유전자 | 종 | 전달 | 후진 | |||||
| 유전자 발현 | 프디엠16 | 마우스 | CAGCACGGTGAAGCCATTC | GCGTGCATCCGCTTGTG | ||||
| UCP1 | 마우스 | TCTCAGCCGGCTTAATGACTG | GGCTTGCATTCTGACCTTCAC | |||||
| 파파르그씨1a | 마우스 | AGCCGTGACCACTGACAACGAG | GCTGCATGGTTCTGAGTGCTAAG | |||||
| 콕스8b | 마우스 | GAACCATGAAGCCAACGACT | GCGAAGTTCACAGTGGTTCC | |||||
| 시데아 | 마우스 | ATCACAACTGGCCTGGTTACG | TACTACCCGGTGTCCATTTCT | |||||
| 36나4 | 마우스 | TCCAGGCTTTGGGCATCA | CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA | |||||
| 분자 클로닝 | sgRNA Prdm16 서열 | 마우스 | CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG | CCCCTTTTCAGCGCAGCTCG | ||||
| 유니버셜 프라이머 | 마우스 | GAGGGCCTATTTCCC ATGATTCCTTCATAT |
||||||
표 1: 연구에 사용된 프라이머 서열.
| 보통 | 구성 | |||
| 완전한 매체 | Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)과 L-글루타민 함유 | |||
| 소태아혈청(FBS) 10% | ||||
| 페니실린/스트렙토마이신 2.5% | ||||
| 유도 매체 | 완전한 매체 | |||
| 인도메타신, 최종 농도 125 μM (에탄올 중 0.125 M 스톡). 참고: 인도메타신은 용해되기 위해 10초 동안 90°C로 가열되어야 합니다. | ||||
| 인슐린, 최종 농도 20nM(1mM 스톡, 1μL의 HCl을 추가하여 가용화(5.73mg/mL)합니다. 재고는 -20 °C에서 보관하십시오. | ||||
| 덱사메타손, 최종 농도 2μg/mL(에탄올 중 2mg/mL 스톡) | ||||
| 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX), 최종 농도 500 μM(0.5 M KOH 중 0.25 M 스톡) | ||||
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine(T3), 최종 농도 1nM(10μM 스톡, T3를 1M HCl 및 EtOH 1:4에 용해). | ||||
| 로시글리타존, 최종 농도 1μg/mL(에탄올 중 1mg/mL 스톡) | ||||
| 유지 보수 매체 | 완전한 매체 | |||
| 인슐린, 최종 농도 20 nM (1 mM 스톡). 1μL의 HCl을 추가하여 가용화합니다(5.73mg/mL). | ||||
| 로시글리타존, 최종 농도 1μg/mL(에탄올 중 1mg/mL 스톡) | ||||
표 2: 연구에 사용된 배지의 구성.
| 매개 변수 | 클릭률 | PRDM16 시리즈 | p-값 | ||
| 미토콘드리아 산소 소비량 없음(pMoles/min/μg 단백질) | 8.19 ± 1.40 | 10.80 ± 1.83 | 0.01 | ||
| 기초 호흡(pMoles/min/μg 단백질) | 28.82 ± 5.20 | 52.58 ± 13.73 | 0.001 | ||
| 최대 호흡(pMoles/min/μg 단백질) | 63.81 ± 9.80 | 122.94 ± 22.31 | < 0.001 | ||
| 예비 호흡 용량(pMoles/min/μg 단백질) | 34.98 ± 11.09 | 70.36 ± 26.06 | 0.006 | ||
| 올리고 둔감성(pMoles/min/μg 단백질) | 8.27 ± 2.29 | 15.85 ± 5.48 | 0.005 | ||
| 올리고 민감성(pMoles/min/μg 단백질) | 20.54 ± 5.68 | 36.72 ± 14.79 | 0.016 | ||
| 커플링 효율 | 71.28 ± 1.51 | 69.84 ± 3.05 | 0.163 | ||
| 셀 RCR | 7.70 ± 1.46 | 7.75 ± 2.43 | 0.485 | ||
표 3: SPH 유도 베이지색 지방세포의 호흡 매개변수.
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Discussion
CRISPR 기술의 가장 유용한 비편집 응용 분야 중 하나는 CRISPRa 시스템을 사용하여 내인성 유전자의 활성화를 통한 유전자 기능의 조사입니다6. SPH는 강력한 CRISPRa로, 원래 여러 신경성 유전자를 표적으로 삼아 성상교세포를 활성 뉴런으로 전환시키는 것으로 기술되었다14. 이 연구에서 AdipoSPH는 지방 세포에서 내인성 Prdm16의 발현을 활성화하여 베이지색 지방 생물학을 조사하는 데 적합한 도구임이 입증되었습니다. 지방 세포에서 SPH-유도된 Prdm16 과발현은 열 발생 유전자 프로그램의 활성화를 유도하고, 갈변 표현형을 유도하여, 이전의 형질전환(Tg) Prdm16 마우스 모델을 표현복사한다23. Prdm16은 갈색 및 베이지색 지방 분화를 조절하는 이 전사 인자의 중심 역할과 분화된 지방 세포에서 열 발생 유전자 프로그램(예: Ucp1 발현 향상)의 조절을 기반으로 베이지색 지방세포를 유도하기 위한 표적으로 이 연구에서 선택되었습니다. 그럼에도 불구하고, 현재의 모델은 연구자의 재량과 연구의 목적에 따라 내인성 유전자의 과발현을 허용한다.
지방 조직 생물학을 조사하는 전통적인 형질전환 모델은 지방 세포(예: Fabp4 또는 아디포넥틴)에 국한된 프로모터/인핸서의 제어 하에 이식 유전자를 과발현하는 유전자 변형 설치류의 발달에 의존합니다24. 현재 기술로 인해 이러한 모델의 개발 속도가 빨라졌지만 이를 개발하는 데 드는 비용과 시간은 여전히 과학계에서 경험하는 일반적인 문제입니다. 대조적으로, AdipoSPH는 기존 Tg 마우스보다 기능 획득 접근 방식을 위한 더 저렴하고 다재다능한 모델입니다. 또한, AdipoSPH는 Tg 마우스 모델에 특히 적합하지 않은 긴 비암호화 RNA 및 전사체 동형을 연구하는 데 매우 적합합니다.
AdipoSPH는 또한 기능 획득 실험에 대한 현재의 대안적 접근법인 AAV의 단순 투여와 비교하여 지방 조직 생물학을 조사하는 데 몇 가지 이점을 제시한다25. 첫째, 지방 조직에 전달된 AAV는 이식 유전자의 여러 사본을 도입하여 과발현을 촉진합니다. 대조적으로, 내인성 유전자의 SPH 활성화는 보다 자연스러운 작용 기전을 나타냅니다. 둘째, AAV에 의해 전달되는 이식 유전자(구성적 프로모터 사용)는 일반적으로 지방 조직 미세 환경 내의 "모든 세포 유형"에서 과발현을 초래합니다. 대조적으로, 내인성 유전자의 AdipoSPH 유도 발현은 지방 세포로 제한됩니다. 셋째, 패키징 크기(~4.5kb)는 일부 이식유전자26에 대한 AAV의 전형적인 한계이다. 그러나 AAV 운반 sgRNA는 맞춤형 20개 뉴클레오티드를 위한 간단하고 쉬운 클로닝 전략이 필요합니다. 마지막으로, AAV 투여는 전형적으로 전신 순환계에 도달하여 다른 조직 및 기관을 감염시킨다. 일부 AAV는 간과 심장과 같은 특정 조직에서 이식유전자의 발현을 완화하기 위해 microRNA를 함유하고 있지만25), 이 전략은 다른 조직 및 기관에서의 AAV 감염을 예방할 수 없다. 대조적으로, 내인성 유전자의 AdipoSPH 유도 발현은 AAV가 전신 순환계로 일부 누출되는 것을 고려하더라도 지방 세포로 제한됩니다. 따라서 AdipoSPH는 AAV 운반 sgRNA의 전신 투여 및 전신 에너지 항상성의 지방 조직 조절 조사에도 적합한 모델입니다.
AdipoSPH 모델은 몇 가지 장점을 제공하지만 고려해야 할 중요한 제한 사항이 있습니다. AAV는 현재 sgRNA의 생체 내 전달을 위한 가장 일반적인 플랫폼입니다. 그러나 AAV 제조 및 면역학적 문제의 일부 문제는 해결되지 않은 상태로 남아 있습니다26,27. 또한, 지방 조직 전체에 걸쳐 주입된 AAV의 양과 분포가 다르기 때문에 유전자 발현의 조직 내 및 조직 간 가변성이 발생합니다. 우리는 sgRNA 벡터 클로닝, AAV 생산 및 iWAT로의 AAV의 균질한 투여가 이 프로토콜의 성공을 위한 중요한 단계라고 생각합니다. 마지막으로, 상이한 sgRNA는 SPH 시스템14에서 내인성 유전자의 발현을 뚜렷하게 활성화시킨다. 주요 권장 사항은 관심 유전자의 전사 시작 부위(TSS) 업스트림 200bp 내에서 3-5개의 sgRNA 서열을 설계하고 테스트하는 것입니다. 따라서 표적 유전자에 대한 최상의 sgRNA 서열을 정의하려면 일반적으로 생체 내 실험 전에 힘든 in vitro 분석이 필요합니다.
AdipoSPH는 또한 지방 조직 생물학의 다른 측면을 조사하기 위한 매력적인 모델입니다. 예를 들어, 지방세포는 수많은 아디포카인의 분비를 촉진한다28,29; 그러나 이러한 분자의 대부분이 전신에 미치는 영향은 아직 잘 알려져 있지 않습니다. AdipoSPH는 성숙한 지방 세포에서 단일 또는 다중 내인성 유전자를 과발현하고 이들의 국소 또는 전신 효과를 조사하여 이 문제를 해결하는 데 적합한 모델입니다. 따라서 AdipoSPH는 지방 조직의 생물학 및 생리학을 연구하기 위한 독특한 도구입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp, AdipoSPH 마우스 생성, Inmmunometabolism and Cell Signaling Laboratory, INFABIC(National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology)의 모든 실험 지원에 감사드립니다. 상파울루 연구 재단 (FAPESP)의 재정 지원에 감사드립니다 : 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | T2877 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| AAVpro 293T Cell Line | Takarabio | 632273 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter | Merckmillipore | UFC510008 | 100 KDa |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX™ supplement | Gibco | 10565-018 | high concentrations of glucose, amino acids, and vitamins |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Excelta Self-Opening Micro Scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fisherbrand Cell Scrapers (100 pk) | Fisher Scientific | 08-100-241 | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-25G | |
| Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LigaFast Rapid DNA Ligation System | Promega | M8225 | |
| Maxiprep purification kit | Qiagen | 12162 | |
| Microliter syringe | Hamilton | 80308 | Model 701 |
| NEB 10-beta/Stable | New England Biolabs | C3019H | E. coli competent cells |
| pAAV2/8 | Addgene | 112864 | |
| pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry | Addgene | 91947 | |
| pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 23966 | Linear, MW 25000 |
| Povidone-iodine | Rioquímica | 510101303 | Antiseptic |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| SacI enzyme | New England Biolabs | R0156 | |
| Surgical Design Premier Adson Forceps | Fisher Scientific | 22-079-741 | |
| Syringe | Hamilton | 475-40417 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M180B | |
| T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| T4 PNK enzyme kit | New England Biolabs | M0201S | |
| Tramadol Hydrochloride | SEM | 43930 | |
| Vidisic Gel | Bausch + Lomb | 99620 |
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