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Implante de Cânula Intracraniana para Infusões Seriadas de Células T com Receptor de Antígeno Quimérico Quimérico (CAR) em Camundongos

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DOI:

10.3791/64886

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24 de fevereiro de 2023

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1Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Center for Data Driven Discovery in Biomedicine, Children’s Hospital of Philadelphia, 3Division of Neurosurgery, Children’s Hospital of Philadelphia, 4Ben Towne Center for Childhood Cancer Research, Seattle Children’s Research Institute, 5Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital, University of Washington

Neste artigo

Resumo

Os tumores do sistema nervoso central (SNC) são a principal causa de morte relacionada ao câncer em crianças, e as terapias loco-regionais baseadas em imunidade estão sendo cada vez mais testadas para pacientes em ensaios clínicos. Este protocolo descreve métodos de implante de cânula locorregional em camundongos para avaliação pré-clínica de infusões imunoterápicas direcionadas a tumores do SNC.

Resumo

Os tumores pediátricos do SNC são responsáveis pela maioria das mortes relacionadas ao câncer em crianças e têm prognóstico ruim, apesar dos avanços na quimioterapia e radioterapia. Como muitos tumores carecem de tratamentos eficazes, há uma necessidade crucial de desenvolver opções terapêuticas mais promissoras, como imunoterapias; o uso de terapia com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) direcionada contra tumores do SNC é de particular interesse. Alvos de superfície celular como B7-H3, IL13RA2 e o disialogangliosídeo GD2 são altamente expressos na superfície de vários tumores pediátricos e adultos do SNC, aumentando a oportunidade de usar a terapia com células T CAR contra esses e outros alvos de superfície. Para avaliar a liberação locorregional repetida de células CAR T em modelos murinos pré-clínicos, foi estabelecido um sistema de cateteres de demora que recapitula cateteres de demora atualmente em uso em ensaios clínicos em humanos. Ao contrário da entrega estereotáxica, o sistema de cateter de demora permite a dosagem repetida sem o uso de múltiplas cirurgias. Este protocolo descreve a colocação intratumoral de uma cânula guia fixa que tem sido usada para testar com sucesso infusões seriadas de células T CAR em modelos murinos ortotópicos de tumores cerebrais pediátricos. Após injeção ortotópica e enxerto das células tumorais em camundongos, a colocação intratumoral de uma cânula guia fixa é completada em um aparelho estereotáxico e fixada com parafusos e resina acrílica. As cânulas de tratamento são então inseridas através da cânula guia fixa para entrega repetida de células T CAR. A colocação estereotáxica da cânula guia pode ser ajustada para entregar células CAR T diretamente no ventrículo lateral ou em outros locais do cérebro. Esta plataforma oferece um mecanismo confiável para o teste pré-clínico de infusões intracranianas repetidas de células T CAR e outras novas terapêuticas para esses tumores pediátricos devastadores.

Introdução

Apesar das melhorias na quimioterapia, radioterapia e cirurgia, os tumores do sistema nervoso central (SNC) são a neoplasia maligna mais letal empediatria1, ressaltando a necessidade importante de novas abordagens com resultados mais bem-sucedidos. Com avanços significativos no campo da imunoterapia, abordagens de terapia celular adotiva (TCA) têm mostrado resultados promissores em vários tipos de câncer, especialmente neoplasiashematológicas2. A terapia com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR), um tipo específico de ACT, aproveita a capacidade natural do sistema imunológico de reconhecer e matar células nocivas, redirecionando a especificidade das células T para gerar células T direcionadas ao tumor3. A terapia com células CAR T tem demonstrado sucesso substancial no tratamento de leucemias e linfomas4, tornando-se uma abordagem imunoterapêutica promissora e encorajando sua investigação em tumores sólidos. No entanto, até o momento, a terapia com células CAR T em tumores sólidos tem alcançado pouco sucesso clínico e enfrenta muitos desafios, como penetração tumoral ineficiente, antígenos alvo limitados e omicroambiente tumoral supressor5.

Ensaios clínicos recentes começaram a avaliar a terapia com células T CAR para tumores pediátricos do SNC, fornecendo provas de conceito e evidências precoces da atividade de células T em relatos preliminares 6,7,8. Enquanto a maioria dos dados pré-clínicos iniciais se concentrava na liberação intravenosa das células T CAR, evidências pré-clínicas recentes sugeriram a superioridade do parto loco-regional no SNC9,10, que também tem sido utilizado com sucesso em vários ensaios clínicos 6,7,8,11 . Estudos pré-clínicos até o momento que incorporaram a liberação locorregional de células CAR T no SNC se basearam em uma única dose intracraniana de células CAR T liberadas estereotaticamente9,10. Entretanto, ensaios clínicos em humanos têm exigido infusões repetidas de células CAR T no SNC 6,7,8,11, ressaltando a necessidade de avaliar múltiplas infusões repetidas no desenvolvimento pré-clínico. O objetivo deste procedimento é testar com sucesso infusões seriadas de células T CAR usando um cateter em modelos murinos ortotópicos de tumores cerebrais pediátricos. A vantagem dessa técnica é evitar múltiplos procedimentos cirúrgicos para proporcionar tratamentos intra-SNC repetidos. As cânulas têm sido usadas principalmente para amostragem de microdiálise de neurotransmissores e liberação de substâncias neuroativas em neurociência e pesquisa comportamental em roedores12, com relatos limitados de seu uso para a administração de terapêuticas anticâncer. Com base nos relatos anteriores, este protocolo usa um sistema de cânula de habitação estereotaticamente colocado para entregar células CAR T em modelos murinos de xenoenxerto de tumores do SNC. O protocolo pode ser utilizado para testar terapêuticas adicionais em modelos murinos de distúrbios neurológicos ou neuro-oncológicos, e pode ser útil para testar novas terapêuticas em que ultrapassar a barreira hematoencefálica é crítico para a eficácia.

Protocolo

Todos os procedimentos do protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Infantil da Filadélfia (IAC 19-000907), que é credenciado pela AAALAC. Este estudo utilizou camundongos NOD scid gama (NSG) com 6-12 semanas de idade com tumores de xenoenxerto ortotópicos; no entanto, o protocolo pode ser utilizado em qualquer cepa de camundongo. Camundongos NSG foram alojados em condições de barreira estéril e a cirurgia foi realizada em cabines de biossegurança estéreis. Quando material humano, como células tumorais ou células T, está sendo usado, os procedimentos e o manuseio devem ser concluídos em gabinetes de biossegurança ABSL-2.

1. Preparando o mouse para a cirurgia

  1. Anestesiar o camundongo em uma câmara de indução com isoflurano (2-4%) a uma taxa de fluxo de oxigênio de 1 L/min até atingir um plano adequado de anestesia (aproximadamente 5 min).
  2. Pesar o rato utilizando uma balança com uma aproximação de 0,1 g e administrar buprenorfina (1 mg/kg) por via subcutânea de libertação lenta (SR) ou outro analgésico.
    OBS: A buprenorfina SR proporciona analgesia por 72 horas.
  3. Faça a barba no topo da cabeça do rato usando cortadores elétricos ou agentes depilatórios.
  4. Use uma espátula para abrir suavemente a parte inferior do braço estereotáxico e insira a cânula guia usando pinças. Aperte o parafuso no braço para fixar a cânula de modo que aproximadamente 1/2 a 2/3 da porção plástica branca da cânula fique saliente do fundo da abertura, juntamente com todo o comprimento metálico de 5 mm da cânula.
  5. Insira e prenda os dentes superiores do mouse na barra de mordida do aparelho estereotáxico. Puxe o cone do nariz para frente e aperte-o, garantindo que o rato está a inalar isoflurano.
  6. Monte o mouse sobre o aparelho estereotáxico aquecido usando manguitos auriculares ou barras auriculares, evitando pressão excessiva.
    NOTA: A bandeja aquecida deve ter um termômetro retal inserido, e a bandeja de aquecimento deve se ajustar para manter uma temperatura corporal normal do mouse durante o procedimento.
  7. Aplique pomada oftálmica estéril em ambos os olhos usando um aplicador com ponta de algodão.
  8. Limpe o local cirúrgico com iodopovidona em uma almofada ou aplicador, seguido de uma compressa de álcool. Execute esta etapa três vezes no total.
  9. Antes de iniciar o procedimento, realizar uma pinça dos dedos dos pés com pinça para avaliar se há sedação adequada.

2. Procedimento cirúrgico

OBS: Todos os aspectos do procedimento cirúrgico utilizam instrumental esterilizado e técnicas assépticas. Os camundongos continuam sob anestesia com isoflurano (2-4%) durante todo o procedimento, aproximadamente 10-20 min.

  1. Pegue suavemente o couro cabeludo entre as orelhas com pinças. Com tesoura estéril, corte o couro cabeludo levantado paralelo ao crânio e remova um retalho oval de pele (0,75-1 cm de comprimento) para expor o crânio.
    NOTA: A tesoura é preferida em relação a um bisturi para proporcionar uma abertura limpa e oval e evitar danos desnecessários à pele e aos tecidos circundantes.
  2. Afaste a fáscia usando um bisturi ou cotonetes com ponta de algodão e uma pelota de algodão hemostático para ajudar a retardar o sangramento excessivo, conforme necessário.
    NOTA: Usar o lado de madeira de uma ponta de algodão estéril também pode afastar a fáscia e ajudar a evitar sangramento excessivo.
  3. Identificar os pontos de referência bregma e lambda, as respectivas marcas anteriores e posteriores no crânio onde as placas cranianas seencontram13.
    NOTA: A identificação pode ser aumentada limpando a parte superior do crânio exposto com peróxido de hidrogênio.
  4. Marque suavemente o crânio usando um bisturi para criar uma superfície para o acrílico fixar. A pontuação deve incluir várias linhas lineares de aproximadamente 0,5-1 cm de comprimento em ângulos de 90° entre si.
  5. Usando o braço estereotáxico, localize a cânula para o ponto de interesse (bregma ou lambda). Uma vez localizada, eleve a ponta da cânula de 1 a 2 mm acima da superfície do crânio e mova-se para as coordenadas desejadas. Para injeções intratumorais, este utiliza as mesmas coordenadas A/P e M/L que a colocação do tumor.
  6. No crânio exposto, longe da área onde a cânula entrará, faça dois orifícios de parafuso com uma agulha 18G ou uma broca cirúrgica. Certifique-se de que os orifícios estejam espaçados para incluir espaço suficiente para a cânula. Usando uma broca, torça através dos orifícios do parafuso até que eles peguem no crânio. Insira e prenda dois parafusos nos orifícios usando uma chave de fenda de ponta plana. Em seguida, puxe suavemente os parafusos para cima para garantir que eles estejam presos.
    NOTA: Não insira os parafusos até que eles estejam nivelados com o crânio, ou eles podem danificar o cérebro do rato por baixo. Deixe pelo menos um espaço de 1-2 mm entre o parafuso e o crânio.
  7. Usando uma agulha 18 G ou broca cirúrgica, perfure o crânio nas coordenadas identificadas para criar um orifício para a cânula a ser inserida.
  8. Usando o braço estereotáxico, abaixe a cânula até a coordenada D/V desejada.
    OBS: A coordenada D/V do implante da cânula precisa levar em conta o comprimento de projeção do manequim e das cânulas de tratamento, podendo ser mais superficial que a injeção ortotópica de células tumorais (Figura 1).
  9. Em uma placa de porcelana de 12 poços, preencha um poço com pó de resina acrílica (aproximadamente 0,3 g) e 10-15 gotas (aproximadamente 0,5-0,75 mL) de líquido de resina acrílica. Isso produz um material viscoso de cor branca. Retirar a mistura para uma seringa de 1 mL e usá-la para revestir e cobrir o crânio, preenchendo os espaços ao redor da cânula e parafusos.
    NOTA: O material viscoso endurece em cimento com o tempo, por isso esta etapa deve ser concluída imediatamente após a mistura.
  10. Enquanto o cimento ainda estiver maleável, solte o parafuso no braço estereotáxico e use uma espátula na abertura na parte inferior para liberar suavemente a cânula do suporte e retrair lentamente o braço estereotáxico para cima para longe do mouse.
  11. Quando o cimento estiver completamente seco, insira a cânula simulada na cânula guia e fixe-a firmemente girando no sentido horário.
  12. Uma vez concluído o procedimento, coloque o camundongo de volta em sua gaiola doméstica aquecida para monitorar cuidadosamente, garantindo a recuperação adequada e registrando quaisquer observações pós-procedimento, incluindo que o camundongo recuperou totalmente a consciência, antes de retornar à colônia.
    NOTA: Geralmente recomenda-se colocar apenas metade da gaiola em uma almofada de aquecimento para permitir que o animal se mova para o lado mais frio para evitar o superaquecimento.
  13. Administrar analgésicos adicionais conforme necessário se os ratos apresentarem comportamentos indicativos de dor no pós-operatório, como meloxicam 5 mg/kg administrado por via subcutânea uma vez ao dia por até 3 dias.

3. Preparação das células T CAR

  1. Medir a concentração de células T CAR pré-transfectadas usando um contador de células.
  2. Centrifugar células T pré-transfectadas a 200 x g por 5 min à temperatura ambiente (TR).
  3. Aspirar o sobrenadante usando uma pipeta de Pasteur estéril em um sistema de aspiração a vácuo e ressuspender o pellet em solução salina tamponada com fosfatae (PBS) até a concentração desejada. Os volumes de entrega típicos são de 2-5 μL. As doses celulares típicas são de 0,5-5 x 106 células.

4. Infusões de células T CAR

  1. Prepare a cânula de tratamento alimentando a parte superior através de um pequeno pedaço de tubo de PKG.
  2. Encha a seringa de tratamento com a suspensão de células T CAR e insira-a através da outra extremidade do tubo de PKG, o suficiente para cobrir a parte superior da cânula de tratamento.
  3. Anestesiar o camundongo com isoflurano (2-4%) a uma taxa de fluxo de oxigênio de 1 L/min.
  4. Estabilize a cânula guia usando pinça na base e, em seguida, desaparafuse cuidadosamente e remova a cânula simulada, permitindo o acesso à cânula guia.
    NOTA: Uma configuração estereotáxica não é necessária, mas pode ser usada para estabilizar a cabeça para tratamento.
  5. Infundir as células T CAR durante 1 min e manter a cânula de tratamento no lugar durante mais 1 minuto após a cessação da perfusão.
  6. Remova a cânula de tratamento e rosqueie a cânula manequim firmemente de volta no lugar.
  7. Administrar meloxicam subcutâneo (5 mg/kg) para controle opcional da dor.

Resultados

Implante bem-sucedido de cânula no SNC de camundongos
Camundongos com canulação bem-sucedida possuem uma cânula guia segura, que não interfere nas atividades de vida diária (Figura 2A) e que pode facilmente passar por uma cânula de tratamento e fornecer líquido sem resistência (Figura 2B). Em nossa experiência, a maioria das cânulas permanece no local por mais de 4 semanas, embora 0-25% possa ser deslocada ao longo do tempo. A verificação do posicionamento correto pode ser confirmada com o corante azul de Evans injetado na cânula. Por exemplo, uma cânula inserida no ventrículo lateral mostra o corante azul de Evans por todo o sistema ventricular enquanto percorre o líquido cefalorraquidiano, confirmando o correto posicionamento (Figura 2C). Cânulas inseridas no tumor mostram corante azul de Evans no local da implantação do tumor.

Entrega efetiva de células CAR T no SNC para o tratamento de tumores de xenoenxerto.
A eficácia do sistema de cânula intracraniana e a eficácia terapêutica das células CAR T em modelos murinos podem ser medidas através de uma variedade de mecanismos, incluindo imagens bioluminescentes e sobrevida global. Células T CAR direcionadas à GPC2 foram testadas contra meduloblastoma murino e glioma difuso da linha média, modelos 7316-4509 e 7316-3058, respectivamente, usando dosagem repetida de células CAR T através do sistema de cânula intracraniana indicado14. A colocação e enxertia do tumor ortotópico foram confirmadas por imagem bioluminescente, e as cânulas foram colocadas no leito tumoral usando as mesmas coordenadas que o posicionamento do tumor ortotópico. Os tratamentos consistiram de infusões de células T GPC2 CAR uma a duas vezes por semana durante 2-4 semanas, totalizando quatro a seis doses. Após o tratamento, a terapia com células T CAR direcionada por GPC2 induziu regressão tumoral significativa no modelo de meduloblastoma 7316-4509 (p < 0,01) (Figura 3A) e sobrevida significativamente prolongada no glioma talâmico difuso da linha média 7316-3058 (p < 0,05) (Figura 3B)14.

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Figura 1: Cânula guia com manequim de projeção e cânulas de tratamento. (A) Cânula guia com cânula de projeção de 0,5 mm e manequim de projeção de 2 mm no lugar. (B) Cânula guia com cânula de projeção de 0,5 mm e cânula de tratamento de projeção de 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Sistema de liberação da cânula de tratamento para doses repetidas de células CAR T . (A) Cânula implantada em crânio de camundongo com tampa no lugar quando não estiver em uso. (B) Infusão de células CAR T em um tumor pontino através da cânula de tratamento enquanto o camundongo está sob anestesia. (C) Verificação da colocação da cânula no ventrículo lateral com corante azul de Evans. O corante foi inserido através da cânula, seguido de eutanásia e excisão cerebral, com corante presente em todos os ventrículos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: As células T CAR direcionadas por GPC2 medeiam respostas antitumorais e prolongam a sobrevida em tumores cerebrais pediátricos in vivo. (A) Quantificação da bioluminescência do xenoenxerto de meduloblastoma ortotópico do grupo 4 7316-4509 tratado com células T de RNAm direcionadas para GPC2 ou CD19. As doses são indicadas pelas setas no gráfico. Dados apresentados como média com DP, n = 9-11 camundongos por braço. (B) Sobrevida global de camundongos implantados com xenoenxerto talâmico DMG 7316-3058 tratados com seis doses repetidas de 2 x 106 células T CAR. As doses são indicadas pelas setas no gráfico. n = 7 camundongos por braço. **p < 0,01; *p < 0,05; ns = não significante. Esse valor foi reproduzido com permissão de Foster et al.14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

A terapia com células T CAR revolucionou o tratamento de cânceres hematológicos e apresenta valor promissor no tratamento de tumores sólidos cerebrais6,7,8. Este protocolo foi desenhado para permitir a avaliação pré-clínica da liberação loco-regional de células T CAR para o tratamento de tumores pediátricos do SNC. O sistema de cânula replica um reservatório de Ommaya ou Rickham, um sistema de cateter intraventricular atualmente em uso em ensaios clínicos em andamento de terapia com células CAR T em tumores pediátricos do SNC6,7,8, ressaltando a relevância e o potencial translacional desses métodos. Este sistema permite a entrega repetida de células CAR T que ultrapassam a barreira hematoencefálica, novamente semelhante aos métodos que estão sendo empregados em ensaios clínicos em andamento. O parto loco-regional pode proporcionar máxima eficácia no SNC9 e também pode reduzir o risco de toxicidades sistêmicas associadas ao tráfico de circulação15. Enquanto a administração estereotáxica pode fornecer uma única dose no SNC, a vantagem desse sistema é a oportunidade de fornecer várias doses repetidas em um local especificado no SNC sem a necessidade de múltiplas cirurgias. As limitações deste procedimento incluem um local de entrega fixo sem a capacidade de mudar de local ou fazer ajustes uma vez que a cânula está no lugar, e o potencial de deslocamento da cânula.

Uma etapa crítica desse protocolo é o implante da cânula guia fixa em uma coordenada D/V que leva em consideração a projeção das cânulas de tratamento. A cânula de tratamento irá se projetar além da ponta da cânula guia e, portanto, deve-se tomar cuidado para garantir que a colocação resulte na entrega de células CAR T para a região de interesse. Os comprimentos de projeção da cânula de tratamento podem ser personalizados e, na experiência do autor, 0,5 mm é um comprimento de projeção útil. Esse comprimento garante que o terapêutico não permaneça na cânula guia no momento da dispensação, mas também não requer ajuste significativo das coordenadas D/V da cânula guia para a região de interesse. Um passo adicional importante neste protocolo é o tempo em que a cânula de tratamento é deixada no local após a infusão de células T CAR. A cânula de tratamento deve ser mantida no local por pelo menos 1 min após o término da infusão, para evitar vazamentos e a perda da liberação loco-regional da terapia com células CAR T.

A solução de problemas desse método é simples, com a maioria das complicações envolvendo dificuldade em remover a cânula simulada ou inserir a cânula de tratamento na cânula guia fixa, provavelmente devido ao sangue seco no interior da cânula guia. Isso pode ser facilmente resolvido passando suavemente a cânula simulada através da cânula guia até que haja menos resistência e os detritos tenham sido removidos. A resina acrílica pode ocasionalmente se deslocar do crânio, resultando na perda do sistema de cânula. Em nossa experiência, isso geralmente é limitado pela pontuação do crânio com um bisturi e a colocação de dois parafusos. Além disso, todos os itens da gaiola que possam acidentalmente aplicar força à cânula enquanto o mouse está se movendo são removidos, como cabanas de enriquecimento de mouse específicas com pequenas aberturas.

Em conclusão, descreve-se aqui um protocolo para a inserção de um sistema de cânula em modelos murinos de tumores do SNC para a entrega repetida de células CAR T. A colocação da cânula pode ser ajustada para vários locais de parto loco-regionais, testando a eficácia de diferentes locais de parto. Além disso, esse sistema pode ser usado para terapêuticas adicionais além das células CAR T para avaliar a eficácia ao ultrapassar a barreira hematoencefálica, e também pode ser útil para a avaliação da terapêutica em modelos murinos de distúrbios não oncológicos.

Divulgações

A JBF detém uma patente relacionada a imunoterapias dirigidas ao glipican 2 (GPC2). Todos os outros autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

O financiamento para este trabalho foi fornecido pela Matthew Larson Foundation, Grayson Saves Foundation, Hyundai Hope on Wheels Young Investigator Award, Kortney Rose Foundation, National Institutes of Health NCI K12 CA076931-19 e 1K08CA263179-01, e pelo Departamento de Defesa W81XWH-21-1-0221.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulhas BD de 18 G511097 cubode metal de 1 1/2 polegada
Resina acrílica líquidaLang Dental B1323 
Pó de resina acrílicaLang Dental B1323 
Toalhetes com álcoolBD326895
Centrifuge 5240Eppendorf5420000040Centrifuge 
Cotonetes com ponta de algodãoPuritan826-WCLargura do cabo = 2,11 mm (0,083), Largura da cabeça = 1,27 mm (0,050), Comprimento do cabo = 147,62 mm (5,812), Comprimento total = 152,4 mm (6), Comprimento da cabeça = 12,7 mm (0,500)
Suporte de broca P1 Technologies DH-1 Suporte de broca para D56-D70 
Broca P1 Technologies D58 1,07 mm 
Cânula fictícia P1 Technologies C315DCS-5/SPC Configuração: Pequena capitalização;   Comprimento: Corte 5,00 mm abaixo do pedestal; Projeção: 0,50 mm 
Chave de fenda de ponta chata P1 Technologies SD-80 Chave de fenda 
Fórceps GraefeFerramentas de Ciência Fina11051-10Guia de Fórceps
Cânula P1 Technologies C315GS-5/SPC Configuração: altura do pedestal de 5,00 mm; Comprimento: Corte 5,00 mm abaixo do pedestal 
Pellets de algodão hemostáticos com epinefrina racêmicaPascal 1151602 
Kit de contador de células automatizado MOXI Z Mini Contador de célulasMoxiMXZ001
NOD  scid  camundongos gama (NSG)Jackson Laboratory5557machos e fêmeas de 6 a 12 semanas de idade
Pipeta PasteurVWR14673-043
Tubulação PKG P1 Technologies C313CT Diâmetro: 0,58 mm x 1,27 mm 
Prato de porcelana de 12 poçosFlinn ScientificAP6064 
Bisturi de iodopovidonaMedline MDS093943
Instrumentode Precisão Mundial50-822-457Bisturi Descartável, no.10, estéril, 10/caixa, Cabo de Plástico com Parafusos de Régua de 6
" P1 Technologies 0-80 X 3/32 2,4 mm   
Quadro Estereotáxico David Kopf Instruments 940 Instrumento Estereotáxico Modelo 940 para Pequenos Animais com Console de Display Digital 
Tesoura fina para estudantesFine Science Tools91460-12
Tesoura Cânula de tratamento P1 Technologies C315IS-5/SPC 33GA;   Configuração: Padrão interno; Comprimento: Corte 5,00 mm abaixo do pedestal; Projeção: 0,50 mm   
Seringas de tratamento Hamilton879085 & micro; L, Seringa Especial de Agulha Cimentada Modelo 75 (SN), 75SN/22/0.5"/PT3 
Vactrap XL Sistema de VácuoFoxx Life Sciences305-4401-FLS

Referências

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