Artigo de método

Desenvolvimento e Otimização de um Modelo Organoide Derivado de Pacientes com Carcinoma Hepatocelular Humano para Identificação de Alvos Potenciais e Descoberta de Drogas

DOI:

10.3791/65785

⸱

18 de agosto de 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Affiliated Cancer Hospital and Institute of Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Center for Cancer Research and Translational Medicine, School of Basic Medical Sciences, Guangzhou Medical University, 3Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou Medical University, 4Department of Hepatobiliary Surgery, Affiliated Cancer Hospital, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fornecemos uma visão abrangente e refinamento dos protocolos existentes para a formação de organoides de carcinoma hepatocelular (CHC), abrangendo todas as etapas do cultivo de organoides. Esse sistema serve como um modelo valioso para a identificação de potenciais alvos terapêuticos e a avaliação da efetividade de candidatos a fármacos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O carcinoma hepatocelular (CHC) é um tumor altamente prevalente e letal em todo o mundo e sua descoberta tardia e a falta de agentes terapêuticos específicos eficazes requerem mais pesquisas sobre sua patogênese e tratamento. Os organoides, um novo modelo que se assemelha muito ao tecido tumoral nativo e pode ser cultivado in vitro, têm despertado interesse significativo nos últimos anos, com numerosos relatos sobre o desenvolvimento de modelos organoides para câncer de fígado. Neste estudo, otimizamos com sucesso o procedimento e estabelecemos um protocolo de cultura que permite a formação de organoides de CHC de maior tamanho com condições estáveis de passagem e cultura. Descrevemos de forma abrangente cada etapa do procedimento, cobrindo todo o processo de dissociação tecidual do CHC, plaqueamento organoide, cultura, passagem, criopreservação e ressuscitação, e fornecemos precauções detalhadas neste artigo. Esses organoides exibem similaridade genética com os tecidos originais do CHC e podem ser utilizados para diversas aplicações, incluindo a identificação de potenciais alvos terapêuticos para tumores e subsequente desenvolvimento de drogas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O carcinoma hepatocelular (CHC), um tumor prevalente e extensamentediverso1, tem recebido considerável atenção na comunidade médica. A presença de plasticidade de linhagem e heterogeneidade substancial no CHC sugere que células tumorais originadas de vários pacientes e mesmo lesões distintas dentro de um mesmo paciente podem manifestar características moleculares e fenotípicas diferentes, apresentando obstáculos formidáveis no avanço de abordagens terapêuticas inovadoras2,3,4,5. Consequentemente, é imperiosa a necessi....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tecidos biopsiados por humanos foram obtidos do respectivo paciente no Hospital e Instituto de Câncer Afiliado da Universidade de Medicina de Guangzhou, e consentimento informado foi obtido dos pacientes. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.

1. Estabelecimento de organoides de CHC derivados do paciente a partir de amostras cirúrgicas

NOTA: O estabelecimento dos organoides de CHC engloba várias etapas, nomeadamente dissociação tecidual, plaqueamento organoide, cultura, passagem, criopreserva e r....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ao implementar o procedimento supracitado, a emergência de esferoides organoides do CHC é tipicamente observável em um período de 3 dias (Figura 1). A Figura 1A,B mostra o organoide estabelecido do CHC, que prontamente desenvolve esferoides compactos caracterizados por bordas arredondadas e citosol permeável no dia inicial de estabelecimento. Durante o crescimento dos organoides HCC, o uso de diferentes concentrações de BME teve diferentes efeit.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Um benefício notável dos modelos organoides derivados do paciente reside em sua capacidade de replicar fielmente as características biológicas dos tumores, abrangendo a estrutura do tecido e a paisagem genômica. Esses modelos demonstram um notável nível de acurácia e refletem efetivamente a heterogeneidade e a progressão dos tumores, mesmo durante longos períodos decultivo6,8,9. Através da utilização deste refinado protocolo de .......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82122048; 82003773; 82203380) e pela Fundação de Pesquisa Básica e Aplicada de Guangdong (2023A1515011416).

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
[Leu15]-gastrina I humanoMerckG9145
1.5 mL MicrotubosMerckAXYMCT150LC
A8301 (inibidor de TGF&beta)Tocris Bioscience2939
B27 Suplemento (503), menos vitamina AThermo Fisher Scientific12587010
B-27 Suplemento (503), sem soroThermo Fisher Scientific
BMP7Peprotech120-03P
Filtro de célula tamanho 100 μ mMerckCLS352360
CHIR99021MerckSML1046
Collagenase DMerck11088858001
Corning  Costar Ultra-LowMerckCLS3473
Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Placas de vários poços, embaladas individualmente, estéreisCorning3473
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Placas de vários poços, embaladas individualmente, estéreisCorning3471
Cultrex Organoid HarvestingSolution R& D SYSTEMS3700-100-01Solução de colheita de organoides
Cultrex Fator de Crescimento Reduzido BME, Tipo 2 PathClear (BME)Merck3533-005-02
DAPTMerckD5942
DexametasonaMerckD4902
DMSOMerckC6164
DNaseIMerckDN25
Dulbecco's Modified Eagle Medium / Ham F-12Thermo Fisher Scientific12634028Advanced DMEM / F-12
Earle ' s solução salina balanceada (EBSS)Thermo Fisher Scientific24010043
FórcepsN/AN/A
ForskolinTocris Bioscience1099
GlutaMAX suplementoThermo Fisher Scientific35050061
HEPES, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Leica DM6 B Microscópio Motorizado de FluorescênciaSuplemento LeicaN/A
N2 (1003)Thermo Fisher Scientific17502048
N-acetilcisteínaMerckA0737-5MG
NicotinamidaMerckN0636
Nunc 15 mL Tubos de Centrífuga Cônicos Estéreis de PolipropilenoThermo Fisher Scientific339651
Nunc 50 mL Polipropileno Cônico Estéril Tubos de centrífugaThermo Fisher Scientific339653
Penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
humano recombinante EGFPeprotechAF-100-15
Humano recombinante FGF10Peprotech100-26
Humano recombinante FGF19Peprotech100-32
Humano recombinante HGFPeprotech100-39
Cabeça humana recombinantePeprotech120-10C
Inibidor de Rho quinase Y-27632 dicloridratoMerckY0503
R-spodin1-meio condicionado(Broutier et al.)N/ASecreção de linhas celulares
Tesoura cirúrgicaN/AN/A
Espécime cirúrgico do tumor removido dos pacientes do CHCHospital afiliado do câncer e instituto da universidade médica de GuangzhouN/A
TNFαPeprotech315-01A
Enzima TrypLE Express (1x), sem vermelho de fenolThermo Fisher Scientific12604013Meio condicionado por Wnt-3a substituto de tripsina
(Broutier et al.)N/ASecreção de linhagens celulares
17504044

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 400 (10360), 1345-1362 (2022).
  2. Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A. Tumour evolution in hepatocellular carcinoma. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Patient Derived OrganoidsOrganoid CultureTissue DissociationOrganoid PlatingOrganoid PassagingOrganoid CryopreservationTherapeutic Target IdentificationTumor Spheroids

Artigos relacionados