Fornecemos uma visão abrangente e refinamento dos protocolos existentes para a formação de organoides de carcinoma hepatocelular (CHC), abrangendo todas as etapas do cultivo de organoides. Esse sistema serve como um modelo valioso para a identificação de potenciais alvos terapêuticos e a avaliação da efetividade de candidatos a fármacos.
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Artigo de método
Desenvolvimento e Otimização de um Modelo Organoide Derivado de Pacientes com Carcinoma Hepatocelular Humano para Identificação de Alvos Potenciais e Descoberta de Drogas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O carcinoma hepatocelular (CHC) é um tumor altamente prevalente e letal em todo o mundo e sua descoberta tardia e a falta de agentes terapêuticos específicos eficazes requerem mais pesquisas sobre sua patogênese e tratamento. Os organoides, um novo modelo que se assemelha muito ao tecido tumoral nativo e pode ser cultivado in vitro, têm despertado interesse significativo nos últimos anos, com numerosos relatos sobre o desenvolvimento de modelos organoides para câncer de fígado. Neste estudo, otimizamos com sucesso o procedimento e estabelecemos um protocolo de cultura que permite a formação de organoides de CHC de maior tamanho com condições estáveis de passagem e cultura. Descrevemos de forma abrangente cada etapa do procedimento, cobrindo todo o processo de dissociação tecidual do CHC, plaqueamento organoide, cultura, passagem, criopreservação e ressuscitação, e fornecemos precauções detalhadas neste artigo. Esses organoides exibem similaridade genética com os tecidos originais do CHC e podem ser utilizados para diversas aplicações, incluindo a identificação de potenciais alvos terapêuticos para tumores e subsequente desenvolvimento de drogas.
Introdução
O carcinoma hepatocelular (CHC), um tumor prevalente e extensamentediverso1, tem recebido considerável atenção na comunidade médica. A presença de plasticidade de linhagem e heterogeneidade substancial no CHC sugere que células tumorais originadas de vários pacientes e mesmo lesões distintas dentro de um mesmo paciente podem manifestar características moleculares e fenotípicas diferentes, apresentando obstáculos formidáveis no avanço de abordagens terapêuticas inovadoras2,3,4,5. Consequentemente, é imperiosa a necessi....
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Protocolo
Tecidos biopsiados por humanos foram obtidos do respectivo paciente no Hospital e Instituto de Câncer Afiliado da Universidade de Medicina de Guangzhou, e consentimento informado foi obtido dos pacientes. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.
1. Estabelecimento de organoides de CHC derivados do paciente a partir de amostras cirúrgicas
NOTA: O estabelecimento dos organoides de CHC engloba várias etapas, nomeadamente dissociação tecidual, plaqueamento organoide, cultura, passagem, criopreserva e r....
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Resultados
Ao implementar o procedimento supracitado, a emergência de esferoides organoides do CHC é tipicamente observável em um período de 3 dias (Figura 1). A Figura 1A,B mostra o organoide estabelecido do CHC, que prontamente desenvolve esferoides compactos caracterizados por bordas arredondadas e citosol permeável no dia inicial de estabelecimento. Durante o crescimento dos organoides HCC, o uso de diferentes concentrações de BME teve diferentes efeit.......
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Discussão
Um benefício notável dos modelos organoides derivados do paciente reside em sua capacidade de replicar fielmente as características biológicas dos tumores, abrangendo a estrutura do tecido e a paisagem genômica. Esses modelos demonstram um notável nível de acurácia e refletem efetivamente a heterogeneidade e a progressão dos tumores, mesmo durante longos períodos decultivo6,8,9. Através da utilização deste refinado protocolo de .......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82122048; 82003773; 82203380) e pela Fundação de Pesquisa Básica e Aplicada de Guangdong (2023A1515011416).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| [Leu15]-gastrina I humano | Merck | G9145 | |
| 1.5 mL Microtubos | Merck | AXYMCT150LC | |
| A8301 (inibidor de TGF&beta) | Tocris Bioscience | 2939 | |
| B27 Suplemento (503), menos vitamina A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Suplemento (503), sem soro | Thermo Fisher Scientific | ||
| BMP7 | Peprotech | 120-03P | |
| Filtro de célula tamanho 100 μ m | Merck | CLS352360 | |
| CHIR99021 | Merck | SML1046 | |
| Collagenase D | Merck | 11088858001 | |
| Corning Costar Ultra-Low | Merck | CLS3473 | |
| Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Placas de vários poços, embaladas individualmente, estéreis | Corning | 3473 | |
| Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Placas de vários poços, embaladas individualmente, estéreis | Corning | 3471 | |
| Cultrex Organoid Harvesting | Solution R& D SYSTEMS | 3700-100-01 | Solução de colheita de organoides |
| Cultrex Fator de Crescimento Reduzido BME, Tipo 2 PathClear (BME) | Merck | 3533-005-02 | |
| DAPT | Merck | D5942 | |
| Dexametasona | Merck | D4902 | |
| DMSO | Merck | C6164 | |
| DNaseI | Merck | DN25 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium / Ham F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | Advanced DMEM / F-12 |
| Earle ' s solução salina balanceada (EBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24010043 | |
| Fórceps | N/A | N/A | |
| Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
| GlutaMAX suplemento | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES, 1 M | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| Leica DM6 B Microscópio Motorizado de Fluorescência | Suplemento Leica | N/A | |
| N2 (1003) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-acetilcisteína | Merck | A0737-5MG | |
| Nicotinamida | Merck | N0636 | |
| Nunc 15 mL Tubos de Centrífuga Cônicos Estéreis de Polipropileno | Thermo Fisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Polipropileno Cônico Estéril Tubos de centrífuga | Thermo Fisher Scientific | 339653 | |
| Penicilina/estreptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| humano recombinante EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Humano recombinante FGF10 | Peprotech | 100-26 | |
| Humano recombinante FGF19 | Peprotech | 100-32 | |
| Humano recombinante HGF | Peprotech | 100-39 | |
| Cabeça humana recombinante | Peprotech | 120-10C | |
| Inibidor de Rho quinase Y-27632 dicloridrato | Merck | Y0503 | |
| R-spodin1-meio condicionado | (Broutier et al.) | N/A | Secreção de linhas celulares |
| Tesoura cirúrgica | N/A | N/A | |
| Espécime cirúrgico do tumor removido dos pacientes do CHC | Hospital afiliado do câncer e instituto da universidade médica de Guangzhou | N/A | |
| TNFα | Peprotech | 315-01A | |
| Enzima TrypLE Express (1x), sem vermelho de fenol | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Meio condicionado por Wnt-3a substituto de tripsina |
| (Broutier et al.) | N/A | Secreção de linhagens celulares |
Referências
- Vogel, A., Meyer, T., Sapisochin, G., Salem, R., Saborowski, A. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 400 (10360), 1345-1362 (2022).
- Craig, A. J., von Felden, J., Garcia-Lezana, T., Sarcognato, S., Villanueva, A. Tumour evolution in hepatocellular carcinoma. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology.
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Reimpressões e permissões
