Este protocolo descreve procedimentos para isolar núcleos de alta qualidade de ilhotas pancreáticas de primatas não humanos congelados para uso em sequenciamento simultâneo de RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC, preservando a fração citosólica em massa para análises metabolômicas das mesmas amostras.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Preparação de ilhotas fetais de primatas não humanos congelados para sequenciamento combinado de RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC e metabolômica em massa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Um desafio em estudos que usam tecido coletado de várias coortes é evitar efeitos de lote ao se preparar para experimentos multiômicos em larga escala, como sequenciamento combinado de RNA de célula única e metabolômica. O método no estudo atual utiliza ilhotas pancreáticas congeladas de primatas fetais não humanos coletados ao longo de um período de dois anos para entrada em ensaios de sequenciamento de RNA de núcleo único e sequenciamento ATAC. A fração citosólica gerada durante a extração nuclear foi retida para eletroforese capilar a jusante e subsequente quantificação de metabólitos. Este método permite a análise em massa de metabólitos que contribuem para a mudança das paisagens transcriptômicas e epigenômicas em condições experimentais. É aplicável a muitos tipos de tecidos e maximiza a quantidade de informações que podem ser extraídas de amostras que não estão prontamente disponíveis. À medida que a contribuição do metabolismo para o estabelecimento da identidade celular por meio de modificações epigenéticas se torna mais apreciada, técnicas que permitem identificar a contribuição de metabólitos em tipos celulares específicos são oportunas e necessárias.
Introdução
As ilhotas pancreáticas de Langerhans são críticas para o gerenciamento da tolerância à glicose ao longo da vida. A falha em ajustar adequadamente os níveis de glicose no sangue por meio do hormônio redutor de glicose, insulina, ou do hormônio de aumento da glicose, glucagon, resulta em Diabetes Mellitus1. Fatores de risco modificáveis para minimizar o risco de diabetes incluem exercícios e dieta. Além disso, está ficando claro que a dieta materna durante a gravidez também tem efeito sobre a suscetibilidade da prole ao diabetes na idade adulta 2,3
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
A recuperação das ilhotas foi conduzida de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Centro Nacional de Pesquisa de Primatas do Oregon (ONPRC) e da Oregon Health and Science University e foi aprovada pelo ONPRC IACUC. O ONPRC cumpre a Lei de Bem-Estar Animal e os Regulamentos aplicados pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) e a Política do Serviço de Saúde Pública sobre Cuidados Humanos e Uso de Laboratório. O protocolo aqui foi aplicado a ilhotas de macacos Rhesus fetais que foram necropsiados no dia gestacional 145 (a gestação do macaco Rhesus é tipicamente de 173-17....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A qualidade das saídas de sequenciamento é altamente dependente da qualidade da entrada nuclear. O blebbing nuclear e os danos à membrana nuclear externa resultarão em contaminação ambiental de RNA e DNA na análise, o que introduzirá ruído nos dados. Um extrato nuclear puro terá evidência mínima de núcleos encapsulados com componentes citoplasmáticos (Figura 2A) ou superdigestão, evidenciada por núcleos estourados (Figura 2B). Uma entrada nuclear ideal conterá n.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Historicamente, os métodos de isolamento nuclear para sequenciamento de RNA e ATAC de núcleo único utilizaram tampões contendo detergentes incompatíveis com cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS), uma técnica comum usada para quantificação de metabólitos16,17. O protocolo atual permite a combinação de técnicas transcriptômicas e metabolômicas a partir do mesmo preparo de amostra usando um detergente suave para frac.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a toda a equipe da Oregon Health Sciences University por cuidar da colônia de primatas não humanos e pela aquisição de tecidos. Além disso, a Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics forneceu conhecimento técnico e consultoria em design experimental. O DTC foi apoiado por uma bolsa de pré-doutorado F31 do NIH / NIDK (1F31DK135164). PK foi apoiado pelo NIH / NIDDK (1R01DK128187). MG foi apoiado por um prêmio de mérito VA (I01 BX005399), o NIH / NIDDK (1R01DK135032, 1R01DK128187) e o JDRF (2-SRA-2024-1455-SB). O trabalho no Oregon National Primate Research Center (ONPRC) foi apoiado pela P51OD01109....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Injetor de cânula de cérebro de rato 33 G | Protech International | 8IC315IS5SPC | Para canulação de ducto e inflação de pâncreas |
| Penicilina/Estreptomicina | Fisher | 15-140-122 | Para mídia RT |
| FBS | Millipore/Sigma | F4135-500ML | Para mídia RT |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11-875-135 | Para mídia RT |
| Colagenase P | Sigma Aldrich | 11213865001 | Para digestão do pâncreas |
| Bovine Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | Para meio RT e isolamento |
| Dextrose | Fisher | D16-1 | A concentração final será de 2,8 mM |
| Cloreto de cálcio | Fisher | C4901-500G | A concentração final será de 0,5 mM |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | Final a concentração será de 10 mM |
| de Albumina de Soro Bovino (BSA) Fração 5 | Research Products International | A30075100 | A concentração final será de 0,5 mg/mL |
| Dulbecco's Modified Eagle | Medium Gibco | 11966025 | Para colher ilhotas |
| 20x Nuclei Buffer | 10X Genomics | 2000153/2000207 | |
| Digitonina (5%) | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | A digitonina pode precisar ser aquecida a 65 &graus; C para dissolver precipitado branco |
| MACS SmartStrainers (30 µ M) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| MACS BSA Stock Solution (10%) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | i8896 | Prepare um estoque de 10% usando a solução |
| cloridrato de Trizma de água MilliQ, pH 7,5 | Sigma Aldrich | T2319-1L | |
| Solução de cloreto de sódio, 5 M | Sigma Aldrich | S6546-1L | |
| Solução de Cloreto de Magnésio, 1 M | Sigma Aldrich | M1028-100mL | |
| Protetor Sigma Inibidor de Rnase | Sigma Aldrich | 3335402001 | |
| DTT | Research Products International | D11000-5.0 | |
| Pilões de pellets descartáveis sem Rnase | Fisher Scientific | 12-141-368 | |
| Tween 20 | Biorreagentes Fisher | BP337-500 | Prepare um stock a 20% utilizando MilliQ água |
| sem nuclease | Promega | PR-P1193 | |
| DNA LoBind Tubes (5 mL) | Eppendorf | 30108310 | |
| Cryovials (1,5 mL) | VWR | 20170-225 | |
| Posi-Click Tubes (0,6 mL) | Denville | C-2177 | |
| Trypan Blue (0,4%) | Thermo Fisher Scientific | T-10282 | |
| Corrediças de contagem de células de câmara dupla | Bio-Rad | 1450011 | |
| MiiliQ | Millipore/Sigma | 7003/05/10/15 | |
| Filtro de corte de 5 kDa | HMT Metabolome Technologies | ||
| Padrões internos | HMT Metabolome Technologies | ||
| P10, P20, P200 e P1000 Pipetas | Eppendorf | 2231000602 | |
| Ponteiras de Pipeta, 10 µ L | VWR | 76322-528 | |
| Ponteiras de Pipeta, 1000 µ L | Thermo Fisher Scientific | 21-236-2A | |
| Ponteiras de Pipeta, 20 µ L | Genesee Scientific | 23-404 | |
| Ponteiras de Pipeta, 200 µ L | USA Scientific | 1120-8810 | |
| Microscópio de Contraste de Fase | Olympus | BX41-PH-B | |
| Contador de Células Automatizado Countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Allegra X-30R Centrífuga | Beckman-Coulter | B06315 | |
| RNase-ZAP | Sigma Aldrich | R2020 |
Referências
- Christensen, A. A., Gannon, M. The beta cell in type 2 diabetes. Curr Diab Rep. 19 (9), 81(2019).
- Elsakr, J. M., Gannon, M. Developmental programming of the pancreatic islet by. Trends Dev Biol. 10, 79-95 (2017).
- Salzberg, L.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
