Extração e Detecção de Geosmina e 2-Metilisoborneol em Água e Peixes usando Sondas de Extração Sortiva de Alta Capacidade e GC-MS

Resumo

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho totalmente automatizado para a extração de geosmina e 2-metilisoborneol de tecidos de peixes ricos em água e lipídios. O método permite a detecção precoce dessas moléculas antes que atinjam os limiares de odor. São fornecidos dados representativos de um ambiente de aquicultura.

Resumo

A geosmina e o 2-metilisoborneol são compostos orgânicos voláteis de origem microbiana que ocorrem frequentemente em sistemas de aquicultura de recirculação e conferem odores e sabores desagradáveis aos peixes, mesmo em concentrações extremamente baixas. Os métodos analíticos existentes para esses compostos em peixes lutam para atingir um rendimento de amostra suficiente e muitas vezes não são automatizados, exigindo uma extensa preparação prática. Desenvolvemos métodos para analisar geosmina e 2-metilisoborneol de tecidos de água e peixes, respectivamente, usando uma sonda de metal com uma fase de extração sortiva de alta capacidade. Uma detecção robusta e quantitativa foi alcançada a partir de tecidos aquáticos e de peixes, com limites mínimos de detecção de 1,2 ng/L para geosmina e 1,1 ng/L para 2-metilisoborneol da água e 18,1 ng/kg e 13,6 ng/kg, respectivamente, do tecido de peixe. Essas concentrações estavam bem abaixo dos limites de detecção humana. Assim, concluímos que esses métodos poderiam detectar geosmina e 2-metilisoborneol antes que se tornassem perceptíveis aos seres humanos. Em contraste com outras técnicas de extração sortiva de alta capacidade, como a extração sortiva de barra de agitação, essa técnica é totalmente automatizável, melhorando drasticamente o rendimento e evitando erros de manuseio manual, enquanto o design durável da sonda evita a quebra, como é comum com a fibra de microextração em fase sólida (SPME). Este método é adequado para monitoramento de odorantes em todas as configurações de qualidade da água, bem como para a detecção de compostos de sabor estranho em matrizes sólidas e semissólidas.

Introdução

A geosmina (GSM) e o 2-metilisoborneol (MIB) ocorrem naturalmente na água e nos solos como subprodutos do metabolismo microbiano ^1,2. Embora geralmente não sejam perigosos para o meio ambiente ou para a saúde humana, eles conferem odores e sabores desagradáveis "terrosos" e "lamacentos" à água, que são perceptíveis mesmo em concentrações extremamente baixas, tão baixas quanto 10 e 20 ng/L para GSM e MIB, respectivamente ^3,4. Como tal, a presença desses odores reduz a qualidade percebida da água e é altamente indesejável na maioria dos contextos. Nas vias navegáveis interiores, os odores reduzem o apelo aos visitantes e podem provocar reclamações às autoridades ambientais⁵, enquanto na água potável os odores conferem um cheiro e sabor desagradáveis que os consumidores consideram inaceitáveis⁶. De fato, muitos países impuseram limites regulatórios aos níveis de odor na água potável, com a China estipulando 10 ng/L como a concentração máxima de GSM permitida⁷.

Os sistemas de aquicultura de recirculação (RASs) estão se tornando cada vez mais importantes na indústria da aquicultura como meio de produção de peixes. Esses sistemas operam em terra e reutilizam continuamente a água, reduzindo assim o impacto ambiental, mas é necessária uma filtragem extensiva da água do RAS para manter as condições ideais para a criação de peixes. Os biofiltros de leito móvel são colonizados por micróbios devido à abundância de nutrientes nas fezes dos peixes e na ração não consumida⁸. Esses micróbios são benéficos para a remoção de resíduos nitrogenados e excesso de nutrientes; no entanto, algumas espécies podem produzir GSM, MIB e outros odores⁴. Esses odores então vazam para a água e são absorvidos pela carne do peixe, onde podem conferir características desagradáveis de odor e sabor que os consumidores consideram censuráveis. Os valores limite de odor na carne de peixe dependem da espécie, mas os valores para o salmão do Atlântico, uma espécie comum em RASs, são de 44 a 500 ng/kg para GSM e >900 ng/kg para MIB⁴. Por conseguinte, os operadores de RAS devem monitorizar regularmente as concentrações de GSM e MIB nos seus sistemas para garantir que estas não atinjam níveis problemáticos⁴. Os peixes afetados podem ser purgados de compostos de sabor estranho antes da colheita para recuperar a qualidade do filé; no entanto, este é um processo caro que exige que a instalação interrompa a recirculação de água e, em vez disso, flua água nova pelo sistema por 10 a 14 dias⁹. Dado que o GSM e o MIB apresentam um problema persistente e economicamente dispendioso em uma ampla gama de indústrias, faz sentido reavaliar e melhorar os métodos analíticos de detecção. Idealmente, os operadores de RAS devem ser capazes de monitorar tanto a água RAS para identificar o aumento das concentrações de GSM e MIB antes que se tornem problemáticas, quanto os tecidos de peixes para determinar se e em que medida os níveis de GSM e MIB afetaram a qualidade do produto.

A maioria dos métodos para a detecção de GSM e MIB usa cromatografia gasosa (GC) com um espectrômetro de massa (MS) ou detector de ionização de chama (FID) para separação e detecção, mas a forma como os odores são inicialmente extraídos da matriz aquosa varia muito, com muitos métodos publicados¹⁰. O fato de uma variedade tão grande de métodos ter sido testada e, de fato, ainda estar em uso rotineiro mostra o fato de que cada um tem desvantagens significativas. Essas desvantagens incluem a necessidade de um grande tamanho de amostra e grandes volumes de solvente, como na extração líquido-líquido (LLE), baixa sensibilidade e interferência de água, como em métodos baseados em headspace, ou problemas extensos com transporte e contaminação do sistema, como em purga e armadilha (P e T).

A extração sortiva abrange uma variedade de técnicas de extração em que uma fase sortiva sólida pode ser usada para extrair odores do headspace acima de uma amostra ou da própria amostra por imersão direta¹⁰. Essas técnicas são compatíveis com volumes de amostra menores do que outras técnicas, não requerem solventes e normalmente não são severamente afetadas pela interferência da água. No entanto, a forma mais comum de extração sortiva, a microextração em fase sólida (SPME), utiliza apenas um pequeno volume de fase sortiva com baixa capacidade de analitos, o que limita a eficiência da extração. Além disso, as fibras quebradiças envolvidas podem ser danificadas ou quebradas¹¹, interrompendo os fluxos de trabalho. A extração sortiva da barra de agitação (SBSE) supera essas dificuldades com um volume de fase maior e design mais durável, mas não é facilmente automatizável, exigindo transferência manual de barras de agitação para amostras e de amostras para tubos de dessorção térmica¹². No contexto da triagem rotineira de água, onde o alto rendimento é crucial, essa falta de automação é uma barreira significativa.

O objetivo do nosso método é melhorar os métodos mencionados acima no que diz respeito ao rendimento da amostra e à capacidade geral de extração sortiva. Assim, desenvolvemos uma técnica usando sondas de extração sortiva de alta capacidade (HCSE), combinando a alta capacidade de analito e robustez do SBSE com a seleção de fase e automação do SPME para a análise quantitativa e de alto rendimento de GSM e MIB. Com algumas modificações, a técnica pode ser aplicada tanto em amostras de água quanto em amostras de tecido de peixe homogeneizado. Aqui, descrevemos o protocolo na íntegra e apresentamos dados de validação demonstrando que ele é reprodutível, linear e altamente sensível. Embora as amostras de aquicultura sejam usadas para fins de demonstração aqui, o protocolo é adequado para monitorar odores em uma ampla variedade de tipos de amostras, incluindo águas, solos e vários alimentos. Graças à automação total, o protocolo é particularmente benéfico onde se espera que o número de amostras seja alto.

Protocolo

As amostras de peixes foram coletadas de animais que já foram abatidos para consumo humano. Por conseguinte, não foi necessária qualquer autorização ética.

1. Preparação de calibração e padrões internos

1. Preparação do padrão de calibração
   1. Preparar a solução-mãe C1 adicionando 10 μL de geosmina e solução de 2-metilisoborneol (100 μg/ml) a um balão volumétrico de 100 ml e enchendo até ao volume com metanol de qualidade LC-MS. A solução resultante conterá cada analito a 10 μg/L (ppb).
   2. Preparar os padrões de calibração adicionando a solução-mãe C1 no volume indicado no quadro 1 a um balão volumétrico de 100 ml e enchendo até ao volume com água desionizada.
   3. Faça novos padrões de calibração diariamente, pois são extremamente perecíveis.
      NOTA: É importante preparar essas soluções de estoque frescas todos os dias.
2. Preparação do padrão interno
   1. Preparar a solução-mãe (I1) adicionando 10 mg de 2-isopropil-3-metoxipirazina (IPMP) (>98% puro) a um balão volumétrico de 1 L cheio até o volume com metanol de grau LC-MS, perfazendo um estoque de 10 mg/L.
   2. Pipetar 100 μL da solução I1 para um balão volumétrico de 100 mL e encher até o volume com água deionizada para obter a solução I2 (10 μg/L). Crave 50 μL em cada frasco de amostra para atingir uma concentração final de 100 ng/L.

2. Análise da água

1. Preparação da amostra
   1. Coloque um frasco de 20 ml para cada água sample sendo analisado na bandeja de amostras.
   2. Usando uma balança calibrada, pesar e colocar 2,5 g de NaCl em cada frasco de amostra superior de crimpagem de 20 mL.
      NOTA: A adição de sal aumenta a transferência do MIB e da geosmina da água para o headspace.
   3. Usando uma pipeta ou dispensador de frasco, adicione 5 mL da amostra de água a cada frasco de amostra de 20 mL de crimpagem.
   4. Pipetar 50 μL da solução de padrão interno I2 para cada amostra, padrão de calibração e quaisquer amostras de QA/QC, incluindo brancos.
   5. Coloque a tampa em cima do frasco e sele-a com uma ferramenta de crimpagem do frasco para minimizar a perda de analitos.
   6. Processe apenas 1-2 amostras de cada vez e sele rapidamente cada frasco depois de concluído para minimizar a perda de analitos voláteis.
2. Extração de analitos (água)
   1. Coloque a bandeja de amostra no suporte da bandeja do amostrador automático.
   2. Para preparar um método de instrumento, abra o programa do instrumento e clique no Editor de Métodos.
      1. Crie um novo método inserindo os seguintes parâmetros no editor de métodos (deixando outros parâmetros em seus valores padrão):
      2. Em 'Pré-amostragem', defina o Tempo de Agitação do Frasco para 10 min para permitir que os analitos se dividam da água para o headspace.
      3. Em 'Sampling', defina a temperatura de incubação para 65 °C, o tempo de incubação para 30 min e a velocidade do agitador para 400 rpm.
      4. Certifique-se de que a 'sonda HiSorb de lavagem' esteja ativada; caso contrário, a matriz de amostra residual pode contaminar o sistema.
      5. Em 'Dessorção da sonda', ajuste o tempo de dessorção para 15 min e atemperatura de dessorção D para 270 °C.
      6. Nas configurações do purgador, defina a temperatura baixa do purgador para 25 °C e o 'fluxo dividido' para 8 mL/min.
   3. Execute o método do amostrador automático em conjunto com o método GC-MS pressionando o botão Iniciar em cada um dos respectivos programas.

3. Análise de tecido de peixe

1. Preparação da amostra
   1. Coloque um frasco de 20 ml para cada peixe sample sendo analisado na bandeja de amostras.
   2. Homogeneizar o tecido do peixe usando um processador de alimentos disponível comercialmente.
   3. Usando uma balança calibrada, pesar 1,00 g de tecido de peixe homogeneizado em cada frasco.
   4. Pipete 5 mL de solução saturada de NaCl em cada frasco para injetáveis.
   5. Pipetar 100 μL da solução de padrão interno I2 para cada amostra, amostra de calibração e quaisquer amostras de QA/QC.
   6. Coloque uma tampa em cima do frasco e feche com a ferramenta de crimpagem do frasco.
   7. Prepare apenas 1-2 amostras de cada vez para reduzir a perda de compostos semivoláteis e voláteis.
2. Extração de analitos (peixes)
   1. Coloque a bandeja de amostra no suporte da bandeja do amostrador automático.
   2. Prepare um método de instrumento da seguinte maneira (deixando outros parâmetros em seus valores padrão).
      NOTA: o tempo de agitação do frasco para injetáveis de pré-amostragem e a temperatura de incubação diferem da Seção 2.2.2.
      1. Em 'Pré-amostragem', defina o tempo de agitação do frasco para injetáveis para 20 min.
      2. Em 'Sampling', defina a temperatura de incubação para 80 °C, o tempo de incubação para 30 min e a velocidade do agitador para 400 rpm.
      3. Certifique-se de que a 'sonda HiSorb de lavagem' esteja ativada, caso contrário, a matriz de amostra residual pode contaminar o sistema.
      4. Em 'Dessorção da sonda', defina o tempo de dessorção para 15 min e a temperatura de dessorção para 270 °C.
      5. Nas configurações do purgador, ajuste a temperatura baixa do purgador para 25 °C e divida o fluxo para 8 mL/min.
         NOTA: Uma etapa de pré-amostragem mais longa e quente é necessária aqui devido à maior afinidade de MIB e GSM para tecidos de peixes ricos em lipídios em comparação com a água.
   3. Execute o método do amostrador automático em conjunto com o método GC-MS pressionando o botão Iniciar em cada um dos respectivos programas.

4. Separação e detecção usando GC-MS

1. Use os mesmos parâmetros GC-MS para métodos de água e tecido de peixe.
2. Certifique-se de que o GC esteja equipado com uma coluna de 5MS, 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm e seja fornecido com gás portador de hélio ultrapuro. Defina a taxa de fluxo do portador para 2 mL / min.
3. Prepare um programa de forno GC da seguinte forma: Uma temperatura inicial de 60 °C, mantida por 3 min, depois uma rampa de temperatura de 10 °C/min a 100 °C, depois 20 °C/min a 190 °C, depois 30 °C/min a 280 °C, com um tempo de espera final de 2 min. O tempo total de execução é definido como 16,5 min.
4. Defina a linha de transferência entre GC e MS para 280 °C e a fonte de íons e o quádruplo para 250 °C e 200 °C, respectivamente.
5. Para detecção de MS no modo de varredura, use uma faixa de varredura de m/z 50-350.
6. Para operação de monitoramento de íons (SIM) selecionado, use quantificação e confirmação de íons, respectivamente, de m / z 95 e 107 para MIB, m / z 137 e 152 para IPMP e m / z 112 e 55 para GSM.
   NOTA: Muitos pacotes de software de cromatografia apresentam seleção automática de pico, mas é altamente recomendável revisar manualmente a seleção de pico em busca de erros.

Resultados

Otimização de métodos

Vários experimentos foram conduzidos para garantir que o método seja otimizado, incluindo uma avaliação de transferência, otimização do tempo de dessorção da sonda, uma avaliação de padrão interno, uma avaliação da fase da sonda, uma avaliação de linearidade e repetibilidade e cálculo do limite de detecção do método.

Avaliação de reporte

Começamos nosso experimento com uma temperatura de dessorção da sonda de 250 °C. Padrões de calibração foram elaborados, conforme mostrado na Tabela 1. Para avaliar o transporte, analisamos os padrões GSM e MIB a 20 ng/L e, em seguida, procedemos, em ordem, a uma execução dos parâmetros GC-MS sem injetar nada na coluna (coluna em branco), uma dessorção da armadilha de foco sem transferir nada do injetor (purgador em branco), um aquecimento do injetor sem inserir uma sonda (injetor em branco), e uma dessorção da sonda sem amostragem prévia (sonda em branco). Menos de 1% de carryover foi observado no branco da coluna, no blank do purgador e no branco do injetor, mas no branco da sonda, o carryover foi de 9,35% e 3,77% para GSM e MIB, respectivamente (Tabela 2). Portanto, determinamos que houve uma transferência significativa de GSM na sonda PDMS nas condições usadas.

Otimização do tempo de dessorção

Tendo identificado o transporte na sonda PDMS, procuramos resolver isso ajustando a temperatura de dessorção da sonda. Espera-se que uma temperatura de dessorção da sonda mais alta aumente a taxa de dessorção do analito da sonda, de modo que a dessorção seja mais completa ao final do tempo de dessorção da sonda de 15 minutos. No entanto, uma temperatura mais alta também pode promover a quebra do analito e, portanto, afetar negativamente a sensibilidade. Temperaturas mais altas também podem danificar materiais sorventes, portanto, temperaturas acima de 280 °C devem ser evitadas. O transporte de GSM foi significativo na temperatura de dessorção da sonda de 250 ° C, mas isso reduziu substancialmente para bem abaixo do limite de aceitabilidade de 5% quando 270 ° C foi usado (Figura 1). Essa melhoria foi alcançada sem perda de sensibilidade, com as áreas de pico produzidas para a análise inicial não sendo menores a 270 ° C do que para temperaturas de dessorção de sonda mais baixas (Figura 1). Isso indica que qualquer aumento na decomposição do analito é insignificante.

Uso de padrão interno

O composto 2-isopropil-3-metoxipirozina tem sido amplamente empregado como padrão interno durante a detecção de GSM e MIB¹³. Comparamos as concentrações calculadas de GSM e MIB com as concentrações enriquecidas conhecidas, com e sem correção do padrão interno. A recuperação sem correção do padrão interno foi pobre, com concentrações calculadas em 60% das concentrações enriquecidas conhecidas (Figura 2). Em contraste, com a correção do padrão interno aplicada, a recuperação foi muito boa, na região de 100%. Assim, aplicamos a correção do padrão interno em todas as análises futuras.

Seleção de fase

Nas análises SPME, a faixa ampla de carbono (CWR) e/ou divinil benzeno (DVB) são frequentemente adicionados ao PDMS para melhorar a sensibilidade, mas isso aumenta o custo. Procuramos comparar sondas somente PDMS com sondas trifásicas (DVB/CWR/PDMS), considerando que o aumento do volume de fase da sonda provavelmente melhorará a sensibilidade em relação às fibras SPME. Os dados de recuperação para PDMS e sondas trifásicas (Figura 3) ilustram um desempenho amplamente semelhante entre os dois tipos de sondas, com recuperações ligeiramente mais próximas de 100% com as sondas PDMS. Assim, dado o desempenho ligeiramente superior e custos reduzidos, realizamos todas as análises futuras com sondas PDMS. Deve-se notar que, uma vez que a sonda coleta analitos do headspace e não por contato direto com a matriz da amostra, a cinética de partição GSM / MIB para o material da fase não deve diferir entre amostras de água e peixes.

Validação do método

Uma série de calibração cobrindo seis concentrações de analitos em água de 1 a 100 ng/L foi analisada (Figura 4). Excelente linearidade foi alcançada, com r² de 0,9999 para GSM e 0,9999 para MIB. O erro padrão de regressão foi de 0,43 e 0,37 para GSM e MIB, respectivamente. Isso indica que o método é adequado para análises quantitativas na faixa avaliada. Determinamos a repetibilidade de oito réplicas de padrões de laboratório contendo GSM e MIB a 40 ng/L em água. Os valores de RSD foram de 6,3% para GSM e 4,8% para MIB, demonstrando notável reprodutibilidade dos resultados. Essas repetições foram analisadas em três lotes separados em dias diferentes, demonstrando ainda mais a precisão do método. Portanto, o HCSE com análise GC-MS é um método quantitativo e confiável.

Limites mínimos de detecção (MDL)

O MDL foi calculado de acordo com o protocolo¹⁴ da EPA dos EUA usando água enriquecida (n = 10) ou amostras de peixes enriquecidos (n = 11). O método de extração e detecção de GSM e MIB na água produziu limites de detecção de 1,2 ng/L para GSM e 1,1 ng/L para MIB. Esses MDLs estavam muito abaixo dos valores de limiar de odor humano de aproximadamente 10 e 20 ng/L, respectivamente. Assim, o método proposto pode detectar com confiança e quantitativamente o acúmulo dessas moléculas odoríferas antes que atinjam os limiares sensoriais humanos. Os limites de detecção para a extração e detecção de GSM e MIB de peixes produziram limites de 18,1 ng/kg para GSM e 13,6 ng/kg para MIB.

Análise de amostras de água da aquicultura

Foram analisadas amostras de água retiradas de sete sistemas de aquicultura de recirculação, com cinco repetições (sistema 3) ou três repetições (todos os outros sistemas) avaliadas para cada um. Todos, exceto um dos sistemas de aquicultura de recirculação analisados, continham geosmina e MIB em concentrações acima de nosso MDL (Figura 5), indicando um problema potencial com a qualidade da água. No entanto, observamos que, em todos os casos, o MIB estava bem abaixo do limite de odor humano de 20 ng/L, enquanto apenas um sistema excedeu o limite de odor GSM de 10 ng/L (sistema 1, concentração GSM = 12,69 ng/L). Embora tenhamos detectado GSM e MIB no sistema 3, notamos que a concentração de MIB cai abaixo de nossos MDLs calculados e, portanto, a concentração não pode ser quantificada com confiança. O método demonstrou uma precisão impressionante em todos os sistemas, apesar do uso de amostras de água do mundo real com muito pouca variação na concentração calculada entre as amostras replicadas em cada sistema (Figura 5).

Análise de tecidos de peixes

O tecido do peixe, rico em lipídios, confere um forte efeito de matriz que impede a extração de GSM e MIB durante este método. Por esse motivo, mudanças sutis são feitas no método para aumentar a eficiência da extração, incluindo uma temperatura de incubação mais alta (80 °C) e um tempo de incubação mais longo (20 min) em comparação com o método de extração de água. Os tecidos dos peixes foram previamente analisados para determinar as concentrações de fundo GSM e MIB. Essas mesmas amostras foram então enriquecidas com uma quantidade conhecida de GSM e MIB e analisadas em triplicata para determinar a porcentagem de recuperação e precisão (Figura 6).

Figura 1: Efeito da temperatura de dessorção da sonda no transporte. (A) Um padrão de laboratório contendo GSM e MIB a 20 ng/L foi analisado em uma das três temperaturas de dessorção da sonda em triplicata, com áreas de pico médias. Cada sonda foi posteriormente dessorvida mais duas vezes na temperatura inicial para avaliar o transporte com resultados em (B) (GSM) e (C) (MIB). A transferência é expressa como área de pico como uma porcentagem da área de pico inicial. As barras de erro representam o desvio padrão em três réplicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Uso do padrão interno. Comparação de dados de recuperação de dados corrigidos versus não corrigidos para padrões analíticos a 15 ou 40 ng/L, com extração apenas por sondas PDMS. As concentrações das amostras foram corrigidas com o uso de IPMP como padrão interno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 3: Recuperação do analito. Dados de recuperação para padrões analíticos de GSM (esquerda) e MIB (direita) a 15 ng/L, com extração por sondas somente PDMS ou trifásicas (PDMS, DVB, CWR). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Curvas de calibração analítica. Regressões lineares de curvas de calibração para GSM (linha sólida, r² de 0,9999; S=0,37) e MIB (linha tracejada, r² de 0,9999; S=0,37). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Aplicação de água para aquicultura. Concentrações de (A) GSM e (B) MIB em amostras de água colhidas de sete sistemas de aquicultura (n ≥ 3 para cada sistema). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 6:  Aplicação de tecido de peixe. Concentrações de GSM e MIB de duas amostras de peixes enriquecidas com GSM e MIB (F1 e F2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome da solução	Volume de estoque C1 adicionado	Volume total	Concentração resultante
Estoque C1	10ul	100ml	10 ug/ml
Cal 1	10 ul	100 ml	1 ng/L
Cal 2	20 ul	100 ml	2ng/L
Cal 5	50 ul	100 ml	5 ng/L
Cal 10	100 ul	100 ml	10 ng/L
Cal 20	200 ul	100 ml	20 ng/L
Cal 50	500 ul	100 ml	50 ng/L
Cal 100	1000 ul	100 ml	100 ng/L
Cal 200	2000 ul	100ml	200 ng/L

Tabela 1: Padrões de calibração. Os padrões de geosmina e 2-MIB são todos feitos de CRM47525 solução de geosmina e 2-metilisoborneol (100 μg/mL) em metanol que foi diluída em uma solução estoque C1 (10 μg/ml) em metanol.

Análise	Transferência (%)
	GSM	MIB
Execução do GC	0.04	0.08
Dessorção de armadilha	0.09	0
Dessorção de entrada	0	0
Reabsorção de sonda	9.35	3.77

Tabela 2: Avaliação de transferência de sonda. Transferência após extração, dessorção e análise por GC-MS de um padrão laboratorial contendo GSM e MIB a 20 ng/l, com padrão interno IPMP a 30 ng/l. As descrições das análises são dadas em 2.2.1.

Discussão

GSM e MIB são compostos de sabor estranho que ocorrem em uma ampla gama de configurações de monitoramento de água, e a demanda por capacidade de teste é alta. Além disso, GSM e MIB são perceptíveis para humanos em níveis vestigiais. Um sistema analítico ideal deve, portanto, combinar alta sensibilidade com alto rendimento para produzir grandes volumes de dados de qualidade. Demonstramos nas seções anteriores que a extração com sondas HCSE fornece sensibilidade superior ao necessário.

O design robusto das sondas HCSE evita quebras, um problema que pode interromper os fluxos de trabalho do SPME. Após a otimização do método, não tivemos dificuldades com a contaminação ou transferência do sistema, que são problemas comuns com as metodologias P e T. A maior contribuição para o alto rendimento deste método, no entanto, sem dúvida, veio da plataforma de amostrador automático usada. Com esse sistema, a análise continuou 24 horas por dia, com intervenção manual necessária para fornecer amostras apenas para a bandeja de amostras. Isso contrasta com outros métodos de extração sortiva de alta capacidade, como o SBSE, que requerem operação manual. Embora o SPME seja geralmente totalmente automatizado, a taxa de transferência é limitada, pois a incubação da próxima amostra pode, normalmente, começar apenas quando a amostra anterior for injetada na coluna GC. Supondo que o tempo do ciclo do GC seja curto, o GC pode, portanto, ficar ocioso enquanto a próxima amostra conclui a extração. Com nosso método, várias amostras podem ser submetidas a pré-amostragem e extração simultaneamente, de modo que o tempo de inatividade do GC seja minimizado. Assim, conseguimos processar 1,8 amostras por hora por sistema.

Demonstramos MDLs de 1,2 e 1,1 ng/L para GSM e MIB, respectivamente, superando em muito a sensibilidade necessária. Embora outras técnicas, como P e T, LLE, SBSE e SPME, possam atingir MDLs mais baixos sob certas circunstâncias¹¹, esses aumentos na sensibilidade são de valor prático limitado e não justificam a perda das vantagens das sondas HCSE descritas acima. Além disso, algumas dessas técnicas exigem grandes volumes de amostra, com aumentos concomitantes na geração de resíduos e nos custos de transporte. Para LLE, os volumes de amostra estão tipicamente na faixa de 200 - 500 mL ^15,16,17, enquanto para SPME, SBSE e P e T, os valores típicos são 10 - 100 mL 18,19,20,21,22. Excelente reprodutibilidade foi observada com valores de RSD de 6,34% e 4,82% para GSM e MIB, respectivamente. Esses valores são amplamente semelhantes aos encontrados em outros métodos¹¹ e, em particular, superam os RSDs nos métodos SPME publicados^23,24. Novamente, nossos baixos valores de RSD foram alcançados com volumes de amostra de apenas 5 mL, inferiores à grande maioria das técnicas de extração publicadas. Assim, estamos confiantes de que as sondas HCSE fornecem sensibilidade e reprodutibilidade suficientes, juntamente com um amplo conjunto de benefícios que combinam os melhores aspectos de todas as alternativas proeminentes em um único método simples, totalmente automatizado e sustentável.

Geosmina e 2-metilisoborneol são compostos lipofílicos, o que representa um desafio para os cientistas que tentam extrair esses compostos do tecido rico em lipídios para análise. Portanto, ajustamos nossas condições de pré-amostragem, usando um procedimento de pré-amostragem mais longo e quente, para conduzir mais analitos da matriz da amostra para o headspace. Tendo feito esses ajustes, determinamos que o método funcionou bem para analisar GSM e MIB em tecidos de peixes. Deve-se notar que, para amostras com teor de lipídios muito alto, pode ser necessário reduzir a massa da amostra usada, por exemplo, para 0,50 g. Isso evita que os lipídios formem uma vedação completa na parte superior da água, impedindo que os analitos atinjam o headspace.

Este método usa princípios de equilíbrio para extrair analitos do headspace de uma amostra. Embora usemos amostras de água e peixes da aquicultura aqui, acreditamos que o método é aplicável à extração de odor de qualquer matriz sólida ou líquida que possa ser homogeneizada e acomodada em um frasco de amostragem de 20 mL. Exemplos de aplicações incluem monitoramento de águas e solos ambientais, testes de água potável e testes de alimentos como frutas e vegetais ou vida aquática não cultivada em fazendas. Na agricultura, GSM e MIB são freqüentemente encontrados em solos úmidos e podem conferir sabores estranhos às culturas cultivadas neles², portanto, tanto os solos quanto as culturas podem ser testados por meio de nosso método para monitorar os níveis de odor como forma de controle de qualidade e / ou para diagnosticar a origem de queixas malcheirosas. Muitas águas ambientais, como rios e lagos, experimentam picos sazonais na concentração de odor devido à proliferação de algas²⁵, e esse método oferece um meio altamente sensível e de alto rendimento de monitorar a extensão desses picos. Este método também é adequado para pesquisas acadêmicas, por exemplo, para medir a taxa de produção de odor por microrganismos²⁶ ou para examinar a relação entre as concentrações de odor na água e nos tecidos animais²⁷. Outros grupos de pesquisa usaram o processo HCSE para extrair de uma variedade de tipos de amostras, como bebidas alcoólicas²⁸, carne de carneiro²⁹, azeite³⁰, meios de cultura de células humanas³¹ e pistache³². Esses estudos foram direcionados a outros analitos ou são estudos de perfil não direcionados e, portanto, não foram otimizados para a análise de GSM e MIB, mas são apresentados aqui, pois oferecem insights gerais sobre a preparação de vários tipos de amostras para extração de sondas HCSE.

Embora o método da água descrito seja provavelmente aplicável a todas as amostras de água ou à base de água com modificações mínimas, a aplicação a outras amostras sólidas ou semissólidas pode exigir alguma alteração específica da matriz na preparação da amostra (ponto 3.1) e na extração do analito (ponto 3.2). Embora não seja possível cobrir todos os cenários de amostragem aqui, oferecemos as seguintes considerações. (1) As amostras sólidas devem ser homogeneizadas em um pó fino por meio de ralagem, moagem ou mistura para garantir a representatividade e fornecer a área de superfície máxima possível para a saída de analitos. (2) Amostras sólidas com baixo teor de lipídios podem não exigir a adição de água ou sal - ou seja, pode ser suficiente pesar 1,00 g em um frasco para injetáveis e tampa. Isso permitirá uma transferência mais direta de analitos da amostra para o headspace, sem uma transferência intermediária da matriz da amostra para a água adicionada. No entanto, isso reduzirá a eficácia da agitação. Os analistas devem realizar experimentos para determinar a técnica ideal de preparação de amostras para sua matriz de amostras. (3) Matrizes diferentes terão afinidades diferentes para GSM e MIB. Portanto, diferentes temperaturas de incubação serão necessárias para atingir o equilíbrio do analito em tempo hábil. No entanto, algumas matrizes podem ser quimicamente alteradas pelo calor, de modo que as interferências são produzidas por reações químicas em altas temperaturas. Novamente, experimentos são necessários para determinar a temperatura de incubação ideal para um determinado tipo de amostra (nota: Amostras com alto teor de umidade nunca devem ser incubadas acima de 90 ° C para evitar que os frascos se quebrem com a pressão de vapor da água fervente).

Desenvolvemos métodos para a detecção de geosmina e 2-metilisoborneol em água e tecido de peixe. Testes em padrões de laboratório confirmam que os métodos são quantitativos e reprodutíveis, enquanto a aplicação em amostras do mundo real (água de sistemas de aquicultura de recirculação, tecidos de peixes derivados de tais sistemas) demonstra desempenho mesmo no contexto de amostras complexas e sujas. Embora tenhamos aplicado nossos métodos a amostras de aquicultura, sugerimos que eles sejam adequados para monitoramento GSM e MIB em uma ampla gama de tipos de amostras, incluindo água e materiais sólidos ou semissólidos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pipeta 0,5-10uL	Nichipet Air	A21405581
1000uL pontas de pipeta	VWR	76322-154
100-1000uL pipeta	eppendorf	285612
frasco de vidro 100mL	VWR	76008-704
10-100uL pipeta	Nichipet Air	A20814031
10-100uL Pontas de pipeta	mega	24502-18
Ponteiras de pipeta de 10xL	VWR	76322-132
Copos de vidro de 20mL	VWR	10754-698
2-Isopropil-3-metoxipirazina	TCI	I0577	Padrão interno
40 ml Frasco de vidro âmbar tipo-1 (borossilicato)	Empresa de amostragem ambiental	0040-0400-QC	Frasco de amostragem de água
5mL Ponta de pipeta	VistaLab tecnologias	4058-5102
Balance	VWR	VWR-124B2
Centri 360	Markes	U-CENTRI-1691	Amostrador automático
Chromeleon Versão 7.3	Software Thermo Scientific		GC-MS
Armadilha de focagem	Markes	U-T12ME-2S
Cromatógrafo a gás, Trace 1310	Thermo Scientific	14800403
Coluna GC	Thermo Scientific	26098-1420	TG-5MS
Geosmina e solução de 2-metilisoborneol	SIGMA-ALDRICH ou MilliporeSigma	CRM47525
frasco de Headspace, 20 mL	Markes	C-VCC20
HiSorb alça	Markes	C-HH-6
HiSorb tampa do injetor	Markes	C-HSPCCS
HiSorb revestimento para injetor	Markes	U-LINER-HISORB
Sonda HiSoRB, PDMS, versão curta	Markes	H1-XXABC
HiSorb	Markes	C-HSPCCS
Colher
Espectrómetro de massa, ISQ 7000	Thermo Scientific	ISQ7K-NOVPI
Metanol	VWR produtos químicos	BDH1135-4LP
Metanol, Optima LC-MS grau	Fisher-scientific	A456-4
O-rings tamanho 201	Marcas	U-COV201	Para tampa do injetor HiSorb e armazenamento HiSorb
Pipetador automático Ovation (100-5000uL)	Tecnologias VistaLab	213626
Luvas de Exame Livres de Pó Roxo Nitrile-Xtra	Kimtech	50602-54
Cloreto de sódio ( sal)	Produtos químicos VWR	BDH9286-2.5K
Adaptador de comutação (pipetador automático)	CUI INC	SMI10-5
Ferramenta de crimpagem de frascos	Markes	U-HSVCR
Decapper de frascos	Markes	U-HSVDC
Barcos de pesagem	Grainger	8AG69