Aqui, fornecemos detalhes sobre a realização da secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) via perfusão através da vasculatura de camundongos com um pâncreas intacto como uma técnica adicional para avaliar a função pancreática endócrina com redução de possíveis fatores de confusão.
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Artigo de método
Secreção de insulina estimulada por glicose via perfusão através da vasculatura de camundongos com pâncreas intacto
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os métodos atuais para secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS) em roedores envolvem perifusão ex vivo ou incubação estática de ilhotas pancreáticas e fatias pancreáticas. A perfusão ex vivo e a incubação estática permitem que várias amostras sejam coletadas rapidamente com eficiência. No entanto, esses procedimentos sujeitam as ilhotas a traumas, hipóxia intermitente e redução da sinalização parácrina da insulina, os quais podem afetar o GSIS. Esses efeitos negativos podem ser minimizados por meio da perfusão através da vasculatura de camundongos com um pâncreas intacto, o que fornece outro método de comparação para os diferentes modelos GSIS. A espinha dorsal desse procedimento de perfusão envolvia i) ligadura do vaso para isolar o pâncreas e ii) canulação da vasculatura pancreática. Esse modelo envolveu sete pontos de ligadura e duas canulações. A vasculatura perfundida resultante incluiu a aorta abdominal inferior, a artéria celíaca e mesentérica superior, as tributárias ramificadas e a veia porta.
O perfusato foi introduzido na vasculatura a ~ 2 mL / min por meio de uma bomba peristáltica para o tubo PE-50 que canula a aorta abdominal inferior. Os perfusato percorreram a vasculatura isolada e foram coletados pela veia porta por meio de canulação com tubo PE-30. O perfusato foi coletado em intervalos de 3 minutos em rodadas de 30 minutos para cada solução de perfusato de 2,6 mM de glicose, 16,8 mM de glicose e 2,6 mM de glicose com 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) em tampão de bicarbonato Krebs-Ringer (KRB, 16 mM HEPES e 0,1% BSA, pH 7,4). A solução IBMX foi precedida por uma solução normal de glicose de 2,6 mM como um ciclo de lavagem. O tempo total foi de ~1 h para o procedimento cirúrgico e 2 h para a coleta de perfusato. Os perfusato foram congelados até que um ELISA fosse realizado para medir a secreção de insulina.
Esta lista de métodos espera fornecer uma base processual detalhada para a medição da secreção de insulina através da perfusão do pâncreas através da vasculatura, o que permitirá aos pesquisadores realizar a perfusão intacta do pâncreas com sucesso em seus laboratórios.
Introdução
A quantificação e compreensão da função das células beta foi realizada principalmente por meio de perifusão ex vivo, incubação estática e, mais recentemente, por meio de fatias pancreáticas. Embora esses procedimentos permitam a avaliação de ilhotas isoladas, os dois primeiros podem colocar as ilhotas em estressores que afetam sua capacidade de funcionar. Em um estudo de Rosenberg et al., ilhotas caninas isoladas usando métodos padrão mostraram aumento da apoptose de células beta, o que foi evidenciado pela perda da membrana basal, aparecimento de núcleos picnóticos e corpos apoptóticos1. Este estudo coincide com outro relato sobre o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas, onde alterações morfológicas representando apoptose foram demonstradas logo após o isolamento das ilhotas 2,3. O aumento da apoptose das células beta levou à redução da liberação de insulina dessas ilhotas, apoiando o conceito de que o isolamento das ilhotas as predispõe a danos e comprometimento funcional.
Além da apoptose, a vasculatura é perdida com o isolamento das ilhotas, levando ao transporte prejudicado de nutrientes, metabólitos e hormônios 4,5. Essa limitação levou a alternativas como o transplante das células das ilhotas para o olho para manter alguma forma de vasculatura e inervação6. A mudança na arquitetura da vasculatura durante o isolamento das ilhotas também cria uma ilhota mais compacta, diferente do esperado in vivo 7,8.
Para aumentar as diferenças anatômicas, o comportamento das ilhotas incubadas estaticamente difere do pâncreas perfundido isolado. Para ilhotas incubadas estaticamente com baixa glicose, 77% do total de insulina liberada (3,31 ng de um total de 4,34 ng) parecia estar presente nos primeiros 30 minutos e pouco no período de tempo seguinte. Isso contrasta fortemente com o pâncreas perfundido isolado em baixas concentrações de glicose, onde houve praticamente zero liberação de insulina em todos os pontos de tempo (<1,8 ng no total) 9. Embora mais pesquisas devam ser feitas para elucidar completamente essa diferença em baixas concentrações de glicose, essa diferença nos dados pode representar vazamento de células hipóxicas moribundas, que foi posteriormente examinada por meio de incubação estática de monocamadas de células de ilhotas. No entanto, essas diferenças entre os métodos atuais e os ambientes in vivo podem causar validade externa prejudicada (Tabela 1).
Além de causar hipóxia, tanto a perifusão ex vivo quanto a incubação estática envolvem a cultura e a separação das ilhotas do pâncreas em placas de cultura de tecidos para mantê-las em estado suspenso. Durante esse processo, a colagenase é tipicamente perfundida através do ducto pancreático para permitir a dissociação do tecido pancreático. A colagenase se liga às fibrilas de colágeno e as desfaz com a ajuda de proteases neutras, gelatinases e proteases pancreáticas endógenas. Juntas, essas proteases continuam a digerir até que as ilhotas sejam liberadas de sua matriz extracelular e ligações de células acinares. O equilíbrio dessa mistura de proteases produz resultados variados tanto na pureza quanto na funcionalidade das ilhotas isoladas10. A eficácia da colagenase também depende de características animais como cepa, idade, peso e status de diabetes. O uso dessas proteases em conjunto com características específicas de animais pode prejudicar as ilhotas pancreáticas durante o processo de isolamento. Ao administrar colagenase, essas proteases também ativam enzimas proteolíticas pancreáticas endógenas que auxiliam na digestão da membrana basal. No entanto, o controle da ativação endógena da enzima pancreática ainda não é possível; assim, isso pode desempenhar um papel nos danos às ilhotas durante o processo de cultivo 11,12,13. Um relatório de Edmonton mostrou atividade de protease endógena afetando o rendimento do isolamento das ilhotas, uma vez que atingiu um nível de atividade enzimática suficiente para isolamento14,15.
As técnicas atuais de infusão de colagenase (intraductal) demonstraram também penetrar no interior das ilhotas, levando a uma possível fragmentação das ilhotas e, portanto, a baixos rendimentos das ilhotas16. Em um estudo de Balamurugan et al., a colagenase foi observada localizada em ilhotas e tecido acinar dentro do pâncreas de camundongo infundido, levando a intensa inflamação e ativação de vias apoptóticas17. As ilhotas que sobreviveram à fase de isolamento também mostraram capacidade reduzida de liberar insulina.
Além disso, outros fatores como estresse mecânico durante a preparação das ilhotas e necrose induzida por hipóxia durante a cultura desempenham um papel no funcionamento das ilhotas18. Essas características podem influenciar a viabilidade da ilhota ao isolar o pâncreas e, portanto, a função resultante.
Além do isolamento e avaliação das ilhotas por meio de perifusão ex vivo e incubação estática, as ilhotas em fatias pancreáticas vivas são outro método ex vivo usado para medir as respostas das células endócrinas19. Neste sistema, evita-se o estresse químico dos procedimentos de isolamento das ilhotas. Além disso, o microambiente das ilhotas permanece intacto, permitindo o estudo da fisiologia das ilhotas mais próximo de seu estado in vivo 20. Semelhante à perifusão ex vivo e à incubação estática, este é um método que continuará a desempenhar um papel importante na aquisição de conhecimento do pâncreas. No entanto, algumas limitações incluem estresse mecânico durante a geração de fatias, bem como a falta de uma visão holística geral de um pâncreas intacto para patologia e fisiologia. O corte representa uma região particular dentro do pâncreas, o que diminui sua generalização devido à diminuição do tamanho da amostra e visão limitada21.
Este isolamento de ilhotas e outros métodos são acompanhados por vários pontos de estressores que podem ser impostos às ilhotas. Estresse mecânico, hipóxia, hiperatividade da protease e visão limitada desempenham um papel no rendimento das ilhotas resultante e na validade externa geral. Esses fatores podem ser reduzidos por meio da perfusão do pâncreas através da vasculatura dos camundongos, o que minimiza todos os estressores acima, além de permitir o exame dos efeitos de outros secretagogos e agentes farmacológicos presentes no organismo devido à manutenção da integridade celular22. Estudos anteriores mostraram o impacto do fluxo sanguíneo das ilhotas nos níveis plasmáticos de insulina23; Por sua vez, moléculas vasoativas como peptídeos de angiotensina e agonistas simpáticos, que alteram o fluxo sanguíneo das ilhotas, alterariam a função das ilhotas e a liberação de insulina24,25. A perfusão do pâncreas permitiria uma avaliação mais aprofundada de como essas e outras moléculas diferentes podem afetar a resposta das células endócrinas. Este sistema espera permitir um maior avanço conceitual de nossa compreensão da biologia endócrina do pâncreas na presença de diafonia em seu microambiente natural com uma vasculatura e inervação intactas. Além disso, a perfusão do pâncreas intacto neste protocolo permite o isolamento do órgão, reduzindo potenciais fatores de confusão de outros órgãos como o fígado, que elimina a insulina da circulação, quando comparado à perfusão de todo o camundongo. A perfusão de todo o camundongo permitiria a redução da técnica cirúrgica; No entanto, ainda exigiria a coleta do perfusato através de um vaso após o pâncreas e antes de atingir o fígado - provavelmente a veia porta. A coleta da veia porta continuaria a necessitar de canulação. Embora a perfusão total do camundongo forneça o benefício de etapas cirúrgicas reduzidas, haveria limitações devido aos fatores de confusão criados por órgãos como rins e pulmões que produzem peptídeos de angiotensina. No entanto, esta seria uma nova abordagem que poderia ser útil ao examinar os efeitos de moléculas vasoativas produzidas a partir de outros órgãos nas ilhotas pancreáticas, que é a principal prioridade.
A perfusão de pâncreas total foi realizada com sucesso no passado por outros 7,22,26. Neste protocolo atualizado, o uso de camundongos representa um desafio técnico maior devido à sua anatomia menor em comparação com os ratos. No entanto, este procedimento demonstra com sucesso a viabilidade deste protocolo, demonstrando um perfil secretor de insulina bem caracterizado do pâncreas intacto de 3 camundongos independentes.
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Protocolo
Todas as pesquisas realizadas em roedores estão em conformidade com as diretrizes do Joslin Diabetes Research Center (número de aprovação 22-01).
1. Começo
- Administre anestesia.
- Injete camundongos normoglicêmicos em jejum (Flox / Cre 53-74 semanas de idade M / F usado em experimentos) com mistura de cetamina / xilazina (~ 75 mg / kg de mistura de cetamina HCl) administrada por via intramuscular através de uma das coxas traseiras por meio de agulha 28 G para eutanásia.
NOTA: O uso de camundongos normoglicêmicos em jejum é importante para reduzir os efeitos da cetamina; no entanto, um anestésico pode ser substituído. - Certifique-se de que o mouse esteja devidamente anestesiado, beliscando a parte posterior do pé com uma pinça para verificar o reflexo.
NOTA: A falta de reflexo é denotada pela falta de movimento da perna comprimida. - Administre pomada oftálmica estéril nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia e prevenir úlceras de córnea.
- Injete camundongos normoglicêmicos em jejum (Flox / Cre 53-74 semanas de idade M / F usado em experimentos) com mistura de cetamina / xilazina (~ 75 mg / kg de mistura de cetamina HCl) administrada por via intramuscular através de uma das coxas traseiras por meio de agulha 28 G para eutanásia.
- Proteja o assunto.
- Certifique-se de que o mouse esteja seguro e permaneça no lugar durante o procedimento, que este experimento conclui por meio de ímãs presos a elásticos que se conectam aos membros com os ímãs presos a uma placa magnética.
- Limpe o local da incisão.
- Certifique-se de que o mouse seja pulverizado com etanol a 70% para evitar a contaminação do cabelo do mouse,
NOTA: Raspar o mouse permitiria menos chance de contaminação do pelo.
- Certifique-se de que o mouse seja pulverizado com etanol a 70% para evitar a contaminação do cabelo do mouse,
- Faça a incisão.
- Usando uma pinça / pinça, aperte 2-3 cm do ânus e corte para cima enquanto perfura o peritônio com uma tesoura curva.
- Crie uma incisão diagonal da linha média até as costelas e a porção lateral do mouse.
- Crie uma incisão idêntica no lado oposto.
NOTA: O objetivo é criar uma visão adequada da cavidade abdominal próximo ao reto até o diafragma
2. Ligadura
- Ligue a artéria gástrica.
- Mova os intestinos para a direita do animal com pinças / dedos rombos. Levante o estômago para localizar a artéria e a veia gástrica.
NOTA: Artéria e veia gástrica identificadas através da visualização de vasos que vão do esôfago inferior ao estômago superior. - Pegue uma sutura 7-0 (sem agulha) e coloque-a sob a artéria gástrica usando uma pinça romba em preparação para a ligadura.
- Crie um nó de cirurgião e garanta uma ligadura adequada por meio de um nó firme.
NOTA: O tipo de nó não é importante; A prevenção do fluxo sanguíneo pode ser determinada por meio de uma mudança de cor do órgão ligado para uma aparência mais pálida ou remoção do órgão e monitoramento da expulsão de sangue do ponto de ligação. A ligadura da artéria gástrica garante que não haja influência do conteúdo gástrico. Isso também reduz o vazamento para os vasos gástricos e direciona o perfusato para a artéria celíaca.
- Mova os intestinos para a direita do animal com pinças / dedos rombos. Levante o estômago para localizar a artéria e a veia gástrica.
- Ligue os vasos renais esquerdos.
- Repita as etapas 2.1.1-2.1.3 para os vasos renais esquerdos.
- Identifique os vasos renais esquerdos visualizando os vasos vermelhos brilhantes e roxos escuros que se conectam ao rim esquerdo. Esta etapa evita o vazamento para os vasos renais e redireciona o perfusato para a artéria celíaca.
- Repita as etapas 2.1.1-2.1.3 para os vasos renais esquerdos.
- Ligue a aorta abdominal superior.
- Repita as etapas 2.1.1 a 2.1.3.
- Identifique a aorta abdominal superior visualizando o vaso vermelho brilhante da linha média com vasos ramificados da artéria celíaca, artéria mesentérica superior e vasos renais esquerdos. Realize a ligadura superior à artéria celíaca para reduzir o vazamento pela aorta abdominal superior e garantir o fluxo para a artéria celíaca e, eventualmente, para o pâncreas.
- Repita as etapas 2.1.1 a 2.1.3.
- Ligue os vasos renais direitos.
- Mova os intestinos para a esquerda do animal. Aperte o tecido / gordura ao redor do rim direito como alavanca para identificar os vasos renais direitos.
- Repita as etapas 2.1.1 a 2.1.3.
- Identifique os vasos renais direitos visualizando os vasos roxos/vermelhos escuros (ambas as veias renais direitas com uma artéria embaixo que não é visível) conectadas ao rim direito com conexão à veia cava inferior e à aorta abdominal. Esta etapa é paralela à etapa 2.2 com os vasos renais esquerdos, permitindo maior isolamento do pâncreas; no entanto, desconfie da proximidade desse vaso com a veia cava inferior.
- Ligue a porção abdominal da veia cava inferior.
- Identifique a porção abdominal da veia cava inferior através da visualização de um vaso roxo maior com uma conexão ramificada com a veia renal direita.
- Repita as etapas 2.1.1 a 2.1.3.
NOTA: Esta etapa reduz os potenciais fatores de confusão do sangue que passa para a veia porta, onde o perfusato será coletado.
- Ligue a aorta abdominal inferior, antes da bifurcação (Figura 1)
- Repita as etapas 2.1.1 a 2.1.3.
- Após a ligadura pouco antes da bifurcação, coloque um fio de sutura sob a aorta 0,5 cm ou mais acima do primeiro nó. Use este fio de sutura para amarrar a canulação no lugar.
- Use o espaço entre o fio de sutura e a sutura ligada para inserir o tubo para canulação. Essa ligadura garante que o perfusato suba pela aorta abdominal inferior em direção à artéria celíaca.
- Ligue a veia porta (Figura 2)
- Mova os intestinos para a esquerda do animal para permitir a visualização adequada da veia porta.
- Crie uma incisão no diafragma e nas costelas para criar mais espaço, conforme necessário, para visualizar a veia porta e para tração apropriada para ligadura e canulação.
- Ligue o vaso o mais superior possível (mais próximo do fígado) para garantir espaço para canulação posterior.
- Coloque uma segunda sutura inferior à primeira, mas acima do pâncreas. O passo 2.7.2 fará com que o sujeito faleça. Além disso, esta etapa é importante para permitir que o perfusato seja coletado e evitar um possível refluxo superior ao ponto de canulação.
3. Canulação
- Canular a aorta abdominal inferior.
- Faça uma incisão de 0,5-1,5 mm com uma tesoura na aorta abdominal inferior entre o nó inferior e a sutura superior.
- Usando o nó mais baixo como alavanca, insira o tubo na aorta através do corte até atingir a sutura mais superior; tome cuidado para não rasgar.
- Amarre a sutura mais superior em um nó para travar o tubo no lugar.
NOTA: Esta etapa permite que o perfusato entre no sistema incluso. Com as ligaduras instaladas, o perfusato deve viajar do ponto de entrada na aorta abdominal inferior até a artéria celíaca e, em seguida, os vasos pancreáticos, terminando com a veia porta hepática, onde o perfusato pode ser coletado.
- Canular a veia porta.
- Crie uma incisão de 0,5-1 mm na veia porta logo após a veia porta deixar o pâncreas.
- Segurando o nó superior como alavanca com uma pinça romba em uma mão, insira o tubo na veia porta usando uma pinça para segurar o tubo com a outra mão.
- Use a segunda sutura para amarrar o tubo no lugar, se possível.
NOTA: Esta etapa é o ponto final do sistema fechado onde o perfusato deve sair com o impacto do pâncreas no fluido presente.
4. Coleta
- Realize a perfusão.
- Antes de colocar o tubo da aorta abdominal inferior, certifique-se de que o sistema de perfusão começou com o perfusato fluindo na velocidade desejada (~ 2 mL / min).
NOTA: O perfusato deve drenar da canulação da veia porta para um tubo de coleta. Um tubo de reação em cadeia da polimerase (PCR) pode ser usado para facilitar o armazenamento. As soluções de perfusato usadas aqui são 2,6 mM de glicose com 1,2 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 16,8 mM de glicose e 2,6 mM de glicose com 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) em tampão de bicarbonato Krebs-Ringer (KRB, 16 mM HEPES e 0,1% BSA, pH 7,4). A solução de perfusato começou com uma solução de baixa glicose para alta glicose, de volta para baixa glicose e terminou com uma solução IBX para controle.
- Antes de colocar o tubo da aorta abdominal inferior, certifique-se de que o sistema de perfusão começou com o perfusato fluindo na velocidade desejada (~ 2 mL / min).
- Colete o perfusato.
- Colete o perfusato em intervalos de 30 minutos em tubos de PCR (tubos substituídos a cada 3 minutos).
- Após cada intervalo de 30 minutos, troque a solução.
- Realize um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) com as amostras. Isso pode ser feito posteriormente se armazenado adequadamente.
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Resultados
Os resultados após o ELISA devem demonstrar secreção de insulina do pâncreas do camundongo em uma extensão dependente dos níveis de glicose do perfusato. Devido à novidade desse procedimento em camundongos, a análise do resultado e seu sucesso depende da comparação com vários outros ensaios de um pâncreas de camundongos perfundidos. Uma resposta bifásica da insulina a altas concentrações de glicose é considerada fisiológica, conforme avaliado em seres humanos e com métodos de perifusão de...
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Discussão
O protocolo descrito acima visa criar um sistema fechado composto pelo pâncreas intacto, duas entradas (artéria celíaca e mesentérica superior) e uma saída (veia porta hepática). Todos os outros vasos são ligados para evitar vazamentos quando o perfusato é transportado, bem como para garantir o isolamento do próprio pâncreas com seu microambiente. As etapas de ligadura neste protocolo também permitem o fluxo do perfusato através do pâncreas sem viajar para outros órgãos que podem confund...
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Divulgações
Os autores não relatam conflitos de interesse.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Christopher Cahill, Jennifer Hollister-Lock, Drs. Susan Bonner-Weir, Kanako Iwasaki, Francesko Hela e Priscila Carapeto pela consulta útil, assistência técnica e orientação ao longo deste projeto. Esta pesquisa foi financiada pela bolsa NIDDK R01 DK132535.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Oxigenador de membrana de fibra | Aparelho de Harvard | 73-3757 | Permite que o oxigênio entre no perfusato |
| Almofada de aquecimento | Braintree científico | 39OM | |
| Cetamina/xilazina | Patterson Veterinário | 78908598 | |
| Quadro magnético | Braintree científico | 39OM | |
| Ímãs com elásticos | Braintree científico | 39OM | |
| Microscopia | N/A | N/A | Nenhuma empresa específica |
| Tanque de oxigênio | N/A | N/A | Nenhuma empresa específica |
| Tubos de PCR | ThermoFisher/Invitrogen | AM12225 | Usado para coleta de perfusato |
| Tubo PE-30 | Braintree científico | PE30 | |
| Tubo PE-50 | Braintree científico | PE50 | |
| Bomba peristáltica | N/A | N/A | Nenhuma empresa específica |
| Ferramentas cirúrgicas | N/A | N/A | Nenhuma empresa específica |
| Sutura | N/A | N/A | Nenhuma empresa específica |
Referências
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Reimpressões e permissões
