O branqueamento iterativo amplia a multiplicidade com o uso da automação de coloração para instalações principais

Resumo

Aqui, descrevemos a aplicação do método Iterative Bleaching Extends Multiplicity (IBEX) utilizando corantes de tecidos automatizados disponíveis comercialmente e considerações de otimização para o uso de reagentes baseados em amplificação de sinal de tiramida.

Resumo

O Iterative Bleaching Extends Multiplicity (IBEX) é uma técnica de imagem de fluorescência multi-rodada baseada em amplificação de sinal de tiramida (TSA) altamente sensível que permite o exame detalhado de várias biomoléculas de proteína em uma única amostra de tecido por meio de branqueamento repetido, recoloração e co-registro de imagem. Apesar de sua crescente adoção para gerar imunocoloração altamente multiplexada, a implementação do IBEX de forma automatizada por meio da implantação em instalações centrais oferece inúmeros benefícios, incluindo maior rendimento, reprodutibilidade e eficiência geral da equipe do laboratório. Aqui, demonstramos a aplicação bem-sucedida do IBEX em duas plataformas de coloração automática amplamente utilizadas e discutimos importantes considerações de otimização para o projeto do painel usando reações baseadas em TSA para amostras de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE). Isso inclui a metodologia para testar a sensibilidade de recuperação anticorpo-antígeno, uma consideração importante para o projeto do painel IBEX ao determinar a sequência de desenvolvimento de anticorpos. Além disso, mostramos abordagens de imagem downstream utilizando scanners de lâmina inteira disponíveis comercialmente e ilustramos o alinhamento e a análise de qualidade usando software de fenotipagem celular disponível comercialmente. Por meio de descrições detalhadas dessas metodologias e vídeos que as acompanham, pretendemos destacar a versatilidade e facilidade do IBEX, oferecendo orientação prática para que as principais instalações de patologia integrem o IBEX em suas plataformas de coloração automatizadas existentes.

Introdução

O Iterative Bleaching Extends Multiplicity (IBEX) é um avanço significativo na imuno-histoquímica fluorescente multi-redonda altamente sensível baseada em TSA, permitindo a visualização detalhada e a quantificação de inúmeras biomoléculas em uma única amostra de tecido. Ao empregar ciclos repetidos de branqueamento e recoloração, o IBEX permite o exame de ambientes celulares complexos com profundidade e clareza incomparáveis, tornando-o uma ferramenta poderosa no campo da imunocoloração e imagens multiplexadas ^1,2.

Muitas entidades acadêmicas, governamentais e industriais hospedam instalações de patologia central dedicadas a apoiar uma gama diversificada de metodologias de pesquisa baseadas em tecidos destinadas a gerar conjuntos de dados morfomoleculares qualitativos e quantitativos. Esses núcleos são recursos críticos, fornecendo serviços especializados baseados em tecidos que permitem que os laboratórios de pesquisa terceirizem processos complexos e trabalhosos de patologia molecular e consultem diretamente os patologistas no desenho do estudo, desenvolvimento de ensaios e interpretação de dados. Para garantir a consistência e reduzir a variabilidade entre os experimentos, essas instalações centrais contam rotineiramente com instrumentos automatizados de autocorantes disponíveis comercialmente, projetados para realizar protocolos de coloração padronizados com alta reprodutibilidade e eficiência³.

Embora os coradores automáticos tenham se tornado a espinha dorsal da imunocoloração em instalações centrais, permitindo alto rendimento e resultados consistentes, eles ainda não foram adaptados para acomodar avanços mais recentes como o IBEX. Além disso, a necessidade de conhecimento especializado em design de painéis, particularmente ao usar reagentes baseados em amplificação de sinal de tiramida (TSA)⁴, adiciona uma camada adicional de complexidade, limitando a adoção mais ampla do IBEX em fluxos de trabalho de pesquisa de rotina. Como resultado, os pesquisadores que desejam aproveitar os recursos de imagem multiplexada de alta resolução do IBEX podem muitas vezes ser limitados pelo equipamento existente de suas instalações principais. Essa lacuna entre técnicas inovadoras de imagem e as realidades práticas das operações das instalações centrais destaca uma barreira para a adoção mais ampla do IBEX na pesquisa acadêmica. Este trabalho visa abordar essa barreira, demonstrando a aplicação bem-sucedida do IBEX em plataformas comuns de autocoloração, com foco no uso de reagentes à base de TSA usando tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE). Primeiro, discutimos as etapas necessárias para construir um painel IBEX usando corantes à base de TSA e a aplicação de cobertura desses painéis a dois diferentes corantes automáticos disponíveis comercialmente. Juntos, eles oferecem orientação prática sobre testes de sensibilidade de recuperação de antígeno-anticorpo, discutindo as principais considerações para otimizar o design do painel e fornecendo um método alternativo para alinhamento do painel usando software comercial que pode estar disponível e por meio de laboratórios de patologia principais.

Protocolo

1. Construção de painéis IBEX com corantes à base de TSA

NOTA: Sempre use uma nova preparação de anticorpos e corantes e armazene a 4 ° C quando não estiver em uso.

1. Teste de sensibilidade à recuperação de antígeno
   1. Preparação de slides
      1. Use um micrótomo para coletar três seções seriadas para cada anticorpo para testar o mesmo tecido embutido em FFPE em três lâminas separadas e carregadas positivamente.
      2. Rotule as lâminas com o anticorpo a ser testado, juntamente com o número de ciclos de recuperação de antígeno a serem testados: 1 ciclo, 3 ciclos e 6 ciclos.
      3. Seque as lâminas durante a noite em temperatura ambiente. Se estiver trabalhando apenas com marcadores de superfície, asse as lâminas a 60 ^oC por pelo menos 20 min para amolecer a cera. Se estiver trabalhando com marcadores nucleares, asse as lâminas a 60 ^oC durante a noite.
   2. Prepare o programa no corador automático para o número diferente de ciclos, garantindo que haja três etapas de lavagem entre cada etapa. Consulte a Tabela 1 para exemplos de protocolos para testes de 1, 3 e 6 ciclos.
      NOTA: Para cada anticorpo individual, garanta um tempo consistente para a etapa do anticorpo e a aplicação do corante TSA.
      Para aplicação de corante à base de TSA, uma alternativa para permitir que o corante permaneça por 3-10 min em temperatura ambiente é permitir que o corante incube por 20 min a 37 °C.
   3. Carregue as amostras no corador automático e execute o protocolo para o número de ciclos associado.
   4. Repita este processo das etapas 1.1.1 a 1.1.3 para cada anticorpo individual a ser validado e testado.
   5. Remova as lâminas do corador automático e coloque-as em PBS.
   6. Monte as lâminas com mídia de montagem aquosa (o mesmo que para uma rodada IBEX) e uma lamínula #1.5 para obter imagens ideais.
   7. Use um microscópio de epifluorescência para obter imagens da lâmina de 1 ciclo para o corante TSA e DAPI, anotando o tempo de exposição necessário para visualizar o sinal.
   8. Repita isso para as lâminas de 3 e 6 ciclos, observando o tempo de exposição necessário para visualizar o corante TSA.
   9. Compare os tempos de exposição entre os diferentes números de ciclo. Veja a Figura 1 para exemplos. Certifique-se de três ciclos de lavagem entre todas as etapas.
      1. Se o tempo de exposição diminuir com o aumento dos ciclos, coloque esse anticorpo e core em uma etapa posterior.
      2. Se o tempo de exposição aumentar com o aumento dos ciclos, coloque este anticorpo em uma etapa anterior.
      3. Se não houver grande mudança no tempo de exposição, coloque este anticorpo em qualquer etapa.
      4. Anticorpos de grupo com base nos requisitos do ciclo para a passagem inicial nos painéis IBEX.
         NOTA: Para obter os melhores resultados, execute esta validação em todos os marcadores desejados para um determinado painel IBEX. Realize essa validação sempre que os tipos de tecido forem alterados ou ao trabalhar com anticorpos primários policlonais com números de lote exclusivos.
2. Aborde o sangramento do sinal do corante espectralmente próximo por avaliação da intensidade do sinal.
   1. Agrupe os anticorpos em potenciais painéis IBEX com base no número ideal de ciclos de recuperação, conforme determinado acima em grupos de 1, 3 ou 6 ciclos.
   2. Preparação de slides
      1. Use um micrótomo para criar seções seriais a partir de uma amostra FFPE, uma para cada anticorpo a ser usado em um único painel IBEX.
      2. Rotule cada lâmina com um dos anticorpos a serem usados no painel IBEX.
      3. Deixe as lâminas secarem durante a noite em temperatura ambiente. Se trabalhar apenas com marcadores de superfície, deixe as lâminas assar a 60 ^oC por pelo menos 20 min para amolecer a cera. Se estiver trabalhando com marcadores nucleares, deixe as lâminas assarem a 60 ^oC durante a noite.
   3. Para o grupo de 1, 3 e 6 ciclos, use a configuração de um ciclo da Tabela 1. Garanta três lavagens entre todas as etapas
      1. Modifique o protocolo para cada anticorpo a ser usado com o tempo de coloração ideal.
      2. Use o mesmo tempo de TSA para todos os anticorpos.
   4. Manchar as amostras no corador automático.
   5. Remova as amostras e coloque as lâminas no PBS.
   6. Monte as lâminas com mídia de montagem aquosa (o mesmo que para uma rodada IBEX) e uma lamínula #1.5 para obter imagens ideais.
   7. Visualize as lâminas em um microscópio de epifluorescência usando o tempo de exposição ideal para cada imagem.
   8. Determine a intensidade do sinal. Slides com tempos de exposição curtos têm uma intensidade de sinal muito alta, enquanto slides com um longo tempo de exposição têm uma intensidade de sinal baixa.
   9. Use a intensidade do sinal junto com o número do ciclo para desenvolver painéis IBEX.
      1. Anticorpos de grupo com base no número do ciclo.
      2. Para um determinado grupo de anticorpos com um número de ciclo específico, certifique-se de que um sinal forte não esteja opticamente próximo a um sinal fraco para minimizar o transbordamento do sinal.
3. Valide os painéis IBEX individuais para garantir que cada painel possa gerar o resultado desejado.
   1. Prepare os slides.
      1. Use um micrótomo para criar seções seriais, uma para cada painel IBEX multiplex, e rotule com a ordem do painel IBEX a ser usada.
      2. Deixe as lâminas secarem durante a noite em temperatura ambiente. Se trabalhar apenas com marcadores de superfície, deixe as lâminas assar a 60 ^oC por pelo menos 20 min para amolecer a cera. Se estiver trabalhando com marcadores nucleares, deixe as lâminas assarem a 60 ^oC durante a noite.
   2. Configure o corador automático.
      1. Para o primeiro painel, configure o programa de coloração automática sem etapas adicionais de recuperação de antígeno.
      2. Para o segundo painel, introduza etapas de desnaturação adicionais antes do primeiro anticorpo igual ao número de etapas de desnaturação no primeiro painel. Consulte a Tabela 2 para obter um exemplo de painel 1 com cinco anticorpos e a Tabela 3 para um exemplo de painel 2 com quatro anticorpos. Certifique-se de três etapas de lavagem entre todas as etapas.
      3. Repita conforme necessário para painéis IBEX adicionais, adicionando mais etapas de desnaturação.
   3. Remova as lâminas do corador automático e coloque-as no PBS até que estejam prontas para montar.
   4. Monte as lâminas com mídia de montagem aquosa (o mesmo que para uma rodada IBEX) e uma lamínula #1.5 para obter imagens ideais.
   5. Visualize as lâminas em um microscópio de epifluorescência usando o tempo de exposição ideal para cada imagem e cada corante TSA.
   6. Avalie se todos os painéis estão sendo exibidos corretamente. Em caso afirmativo, passe para a imagem IBEX. Caso contrário, reendereçar os ciclos de balanceamento e recuperação de sinal.
      NOTA: Alguns ajustes podem ser feitos em um único painel para otimizar o sinal e evitar o "efeito guarda-chuva". Alguns sinais altamente abundantes podem bloquear a coloração dos sinais a jusante. Olhe dentro de um determinado painel para usar manchas mais esparsamente presentes primeiro (veja a Figura 2).

2. Adaptação do IBEX com coradores automáticos usando reagentes TSA e plataformas de imagem de lâminas inteiras (Figura 3)

NOTA: Para comparação dos dois coradores automáticos validados usados e discutidos neste protocolo, consulte a Tabela 4.

1. Prepare todos os slides para a execução do IBEX.
   1. Use um micrótomo para criar seções FFPE em um slide carregado positivamente. Certifique-se de incluir uma lâmina para cada amostra experimental, lâminas de controle positivo de seções de tecido conhecidas por conter os antígenos a serem fotografados e uma lâmina de controle negativo na qual o PBS é usado no lugar de todos os anticorpos primários.
      NOTA: Se estiver trabalhando em lotes, inclua uma amostra de controle de lote. Uma amostra de controle de lote é um único bloco de tecido FFPE que é seccionado e incluído em cada lote de amostras experimentais para uso na normalização e controle da variação experimental entre lotes de amostras de coloração. Isso só é necessário se nem todas as amostras forem processadas juntas.
   2. Deixe as lâminas secarem durante a noite em temperatura ambiente. Se trabalhar apenas com marcadores de superfície, deixe as lâminas assar a 60 ^oC por pelo menos 20 min para amolecer a cera. Se estiver trabalhando com marcadores nucleares, deixe as lâminas assarem a 60 ^oC durante a noite.
2. Prepare anticorpos e corantes para o primeiro painel IBEX a ser visualizado.
3. Configure o programa de coloração automática. Consulte a Tabela 2 para obter um exemplo de um painel de 5 marcadores. Garanta três lavagens entre cada etapa.
4. Carregue amostras e anticorpos no corador automático e execute o programa para corar as amostras.
5. Remova as lâminas do corador automático e aplique uma lamínula usando um meio de montagem aquoso apropriado para imagens multiespectrais e uma lamínula # 1,5.
6. Visualize as lâminas dentro de 2 dias após a coloração
7. Imagem de fluorescência em epifluorescência ou scanner de lâminas de fluorescência
   1. Começando com a amostra de controle positivo bem controlada, carregue a amostra de controle positivo no microscópio.
      1. Localize um sinal positivo na amostra para cada um dos diferentes antígenos a serem visualizados.
      2. Defina o tempo de exposição para garantir a captura da faixa dinâmica da mancha, minimizando o fundo, começando com uma exposição baixa e aumentando gradualmente o tempo de exposição até que o sinal esteja presente. Faça isso para cada corante individualmente.
         NOTA: Teste a presença de alta e baixa expressão dos marcadores para garantir a captura de toda a faixa dinâmica.
   2. Salve as configurações usadas para a amostra de controle positivo e use-as para todas as outras etapas de imagem.
   3. Carregar e obter imagens da amostra de controlo negativo e de todas as amostras experimentais utilizando as configurações determinadas pela amostra de controlo positivo.
   4. Verifique se as imagens são de qualidade ideal antes de prosseguir para as etapas subsequentes.
8. Remoção de lamínula
   1. Mergulhe as lâminas em uma jarra Coplin com água DI. Coloque o frasco Coplin em banho-maria regulado para 65 °C durante 15-20 minutos para facilitar a remoção natural da lamínula. Alternativamente, se um meio de montagem à base de água for usado ou o meio de montagem tiver endurecido completamente, remova as lamínulas embebendo em solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou água DI durante a noite para permitir que as lamínulas caiam naturalmente.
9. Branqueamento com LiBH₄
   1. Em uma hotte, prepare uma nova solução de LiBH₄ na concentração de 1mg/mL em água DI. Faça o suficiente para cobrir cada amostra 3x.
      NOTA: Não prepare mais de 10 mL de cada vez devido à reação do LiBH₄ com água. Use água DI e não Millipore/água nanopura para uma atividade de branqueamento ideal.
   2. Deixe a solução descansar por 20 min. Bolhas se formarão.
   3. Pipetar 1 ml de solução de LiBH₄ em cada lâmina numa câmara de coloração numa hotte. Deixe a solução descansar na lâmina por 10-15 min.
   4. Remova o LiBH₄ pipetando a lâmina e substitua por 1 mL de LiBH_4. Deixe a solução descansar por 10-15 min.
   5. Remova o LiBH₄ pipetando a lâmina e substitua por 1 mL de LiBH_4. Deixe a solução descansar por 10-15 min.
   6. Remova o LiBH₄ das lâminas pipetando e mergulhe as lâminas em água DI ou PBS para armazenamento de curto prazo (não mais que 1 dia).
   7. Dentro de um dia, passe para a próxima rodada de coloração IBEX.
   8. Opcional: lâminas de montagem úmida e realizar uma visualização rápida em um escopo de epifluorescência para verificar o sucesso do branqueamento.
10. Montagem úmida da corrediça no corador automático e segunda execução de coloração IBEX
    1. Prepare todos os anticorpos e soluções de corante TSA para o corante automático.
    2. Para o corador automático Ventana:
       1. Quando estiver pronto para iniciar a coloração automática, pipete aproximadamente 1 mL de tampão de lavagem do corador automático na lâmina para evitar o ressecamento do suporte úmido.
       2. Carregue as lâminas montadas em banho de água no corador automático.
    3. Para o Bond Rx:
       1. Coloque os ladrilhos de cobertura nos slides.
       2. Na parte superior da telha de cobertura, pipete 300 μL de tampão de lavagem para permitir que a solução flua para o espaço entre a amostra e a telha de cobertura.
       3. Coloque as amostras no corador automático.
    4. Configure o programa de coloração automática seguindo o exemplo na Tabela 2 com N definido para o número de anticorpos no painel.
    5. Remova as lâminas do corador automático e aplique uma lamínula usando um meio de montagem aquoso apropriado para imagens multiespectrais e uma lamínula # 1,5.
    6. Fotografe as lâminas dentro de 2 dias após a coloração seguindo o procedimento de amostra descrito na etapa 2.7 para configurar a sessão de imagem e coletar imagens.
    7. Após a imagem, alvejar amostras conforme descrito nas etapas 2.8-2.9.
11. Repita para todos os painéis IBEX desejados.

3. Análise de amostras com software disponível comercialmente

1. Conclua digitalizações de lâminas inteiras das lâminas manchadas antes de prosseguir para o alinhamento.
2. Se o software permitir, execute a separação espectral por meio da função de separação automatizada incorporada às funções de varredura, incluindo a remoção dos espectros de autofluorescência. Se esta for uma função do software que está sendo usado, selecione a opção de separação e execute usando configurações padrão e corantes predefinidos
   NOTA: A desmistura personalizada pode ser gerada na maioria dos softwares que permitem a desmistura. Para criar uma biblioteca, seções de tecido individuais coradas com um único fluoróforo são adicionadas às medições do software. Uma região de tecido não corado ou autofluorescente também é escaneada para caracterizar o espectro de autofluorescência, e isso é selecionado com a ferramenta de autofluorescência. Esses espectros são compilados dentro do programa clicando em "preparar imagem" e, em seguida, exportados para uma biblioteca de desmistura específica do projeto. Essa biblioteca é então selecionada como a biblioteca de desmixagem na opção de desmixagem.
3. Importe as lâminas digitalizadas para um software de análise de imagem disponível comercialmente para alinhamento.
4. Registro de slides de várias rodadas IBEX
   1. Selecione duas iterações de rodadas IBEX a serem registradas.
   2. Clique com o botão direito do mouse nos dois e selecione a opção Registrar .
   3. Selecione o Registro Padrão com Registro de Alta Resolução para uma tentativa inicial de registro.
   4. Como alternativa, selecione Registro de canal único nas opções e selecione um único canal que seja consistente em todas as execuções do IBEX.
      NOTA: Esta opção é útil para corantes resistentes ao branqueamento (consulte os materiais para os quais os corantes não branqueiam).
5. Alinhamento de imagem
   1. Abra uma das imagens cadastradas.
   2. Na guia Ferramentas , em Registro de imagem, selecione Ferramentas de registro para abrir todas as imagens registradas.
   3. Na guia Ferramentas de registro , selecione a função de ponto de referência.
   4. Use a função de ponto de referência para ajustar o alinhamento de slides inteiros.
      1. Marque pontos de referência em uma imagem de slide manualmente.
      2. Nas outras imagens IBEX, marque o mesmo ponto de referência. O programa refinará o alinhamento usando o ponto de referência identificado. Repita para ajustar o alinhamento.
   5. Quando estiver satisfeito com o alinhamento, funda as corrediças usando o fusível | Função Serial Stain.
   6. Repita esse processo com qualquer rodada de imagem IBEX adicional até que uma composição final de todas as imagens seja concluída.
6. Análise de imagem
   1. Segmentação de células
      1. Na guia Análise , selecione e abra o módulo HighPlex e, em seguida, selecione o módulo de fenotipagem para identificação da célula.
         1. Carregue todos os marcadores e comece encontrando todos os núcleos usando a guia Detecção Nuclear no módulo Highplex . Carregue marcadores na guia Seleção de corante . Identifique as células usando a coloração DAPI.
         2. Na guia Analisar , ative a ferramenta Ajuste em tempo real usando os seguintes parâmetros-chave: Intensidade nuclear mínima definida para filtrar o sinal de fundo; Brilho máximo da imagem definido para controlar a visibilidade geral do sinal; Segmentação Nuclear Agressividade definida para refinar os limites dos núcleos detectados.
         3. Ajuste cada parâmetro com cuidado para garantir uma segmentação precisa.
   2. Detecte os marcadores de citoplasma e membrana.
      1. Navegue até a guia Detecção de membrana e citoplasma .
      2. Defina o Raio mínimo do citoplasma para um valor apropriado para a amostra para o tamanho esperado das células.
      3. Na opção Corantes de membrana , especifique quais canais são marcadores de membrana.
         NOTA: Isso deve resultar em uma melhor segmentação de células individuais para análise posterior.
   3. Limiar de marcador e atribuição de fenótipo
      1. Para cada marcador, defina os limites para sinais positivos versus negativos. Faça isso nas guias geradas para cada marcador.
      2. Faça o limite manual para cada marcador para identificar populações.
      3. Como alternativa, use uma abordagem automatizada baseada em bioinformática para limiar. Na interface Avançado | Armazenar dados do objeto (célula), alterne a opção para Verdadeiro. Em Exportação | Dados do objeto, exporte o conjunto de dados para obter informações de expressão de marcador para cada célula identificada.
      4. Importe esses dados para um software adicional para uma análise adicional e personalizada. As opções de software para análise posterior encontram-se na Tabela 5.

Resultados

Fornecemos um exemplo de um painel IBEX usando reagentes baseados em TSA no Autostainer 2 (Figura 4). Cada marcador pode ser claramente delineado e há um sangramento mínimo entre os marcadores. A imagem foi coletada em duas rodadas de coloração. A amostra é tecido pulmonar após infecção por Mycobacterium tuberculosis. Os dois painéis de coloração IBEX foram alinhados usando exemplos de software disponível comercialmente. Usando a abordagem IBEX com reagentes TSA otimizados (como descrito aqui), a organização espacial de células imunes, marcadores inflamatórios e células pulmonares especializadas pode ser vista e apreciada. A otimização adequada permite que os marcadores apareçam facilmente com o mínimo de fundo.

Figura 1: Teste de recuperação de antígenos com um fluoróforo com uma emissão de 520 nm de dois antígenos diferentes. RAGE e CD3e foram fotografados utilizando tempos de exposição conservados. O epítopo deste anticorpo RAGE é altamente sensível e suscetível à recuperação repetitiva de antígenos com rápida queda da sensibilidade do ensaio com recuperações de antígenos subsequentes. Por outro lado, a sensibilidade do ensaio de CD3e melhora com várias rodadas de recuperação de antígeno. Barras de escala = 50 μm. Abreviatura: RAGE = Receptor para Produtos Finais de Glicação Avançada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Exemplo da importância do desenvolvimento da sequência em relação ao efeito guarda-chuva. O RAGE é um marcador altamente expresso em células AT1 e, em combinação com CD31, está bloqueando efetivamente a imunorreatividade do SARS-CoV-2. No entanto, quando o SARS-CoV-2 IHC é realizado primeiro, todos os sinais podem ser visualizados. Barras de escala = 25 μm. Abreviaturas: RAGE = Receptor para Produtos Finais de Glicação Avançada; AT1 = Tipo Alveolar 1; SARS-CoV-2 = Síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2; IHQ = imuno-histoquímica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Visão geral do processo usando equipamento de coloração automatizado para o protocolo IBEX. Montagem úmida para a rodada 2 ou superior do processo de coloração para evitar que o tecido seque. Abreviatura: IBEX = branqueamento iterativo estende a multiplicidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Exemplo de IBEX com corantes à base de TSA do corante automático 2 em um pulmão infectado com Mycobacterium tuberculosis. O painel 1 contém todos os corantes e o painel 2 contém corantes que eram passíveis de branqueamento. Uma imagem mesclada de todos os canais em todo o IBEX da imagem pulmonar é apresentada. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: IBEX = branqueamento iterativo estende a multiplicidade; TSA = amplificação do sinal de tiramida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Um exemplo de protocolo para validar os efeitos do número do ciclo em anticorpos para testes de ciclo 1, 3 e 6. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Um exemplo de painel 1 com cinco anticorpos para o autocorante IBEX para validação do painel. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Um exemplo de painel 2 com quatro anticorpos para o autocorante IBEX para validação do painel. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 4: Comparação de dois coradores automáticos. Tabela resumindo os prós e contras do Ventana Autostainer e do Bond Rx. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 5: Resumo do software para análise de imagens. Tabela resumindo algumas das abordagens de análise e ferramentas de software disponíveis para a análise de imagens pós-segmentação. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

Aqui, fornecemos considerações para adaptar o protocolo IBEX em instalações de patologia central com a aplicação de equipamentos de coloração automatizados e otimização de reagentes baseados em TSA no protocolo IBEX. Demonstramos a melhor forma de otimizar as rodadas repetidas de recuperação de antígenos e o carregamento adequado na rodada 2 ou superior no equipamento automatizado. Além disso, demonstramos um método adicional de realizar o alinhamento usando o software Halo que pode estar disponível nas instalações principais. Essas abordagens demonstraram ser úteis na determinação das diferenças nos ambientes pulmonares em tecidos de primatas não humanos após infecções por SARS-CoV-2⁵.

Um componente-chave deste trabalho é destacar a necessidade de otimização extensiva do design do painel IBEX antes da coloração dos tecidos experimentais. Em particular, com o uso de reagentes à base de TSA, algumas considerações não vistas nos métodos IBEX básicos devem ser levadas em consideração. O primeiro é o impacto de várias rodadas de recuperação de antígenos na sensibilidade dos anticorpos. Com reagentes à base de TSA, cada novo desenvolvimento de anticorpos é precedido pela desnaturação de anticorpos. Alguns pares de anticorpos/antígenos serão suscetíveis a rodadas adicionais de recuperação de antígenos e diminuirão a sensibilidade do ensaio, enquanto alguns obterão sensibilidade aprimorada com desnaturação/recuperação de antígenos repetitivos. O teste cuidadoso de cada anticorpo no tecido-alvo antes de projetar os painéis é importante para garantir as melhores práticas de coloração e informar a ordem da sequência dos anticorpos e dos corantes fluorescentes. Os tampões, incluindo à base de citrato (pH 6,0) e à base de Tris-EDTA (pH 9,0), são testados para todos os anticorpos para determinar as condições ideais de recuperação de antígenos. Isso envolve avaliar sistematicamente cada tampão para identificar qual deles maximiza a exposição ao antígeno para um determinado anticorpo. Além disso, a temperatura (por exemplo, 20-37 °C), o tempo de incubação (normalmente 30-60 min) e as condições de bloqueio são otimizados para reduzir a coloração de fundo inespecífica e garantir a ligação específica dos anticorpos primários e secundários, se necessário. O bloqueio antes dos anticorpos primários e secundários pode incluir o uso de reagentes de bloqueio disponíveis comercialmente para levar em conta a autofluorescência específica do tecido ou interações não específicas. Outras considerações importantes que devem ser otimizadas antes de finalizar os painéis IBEX incluem o efeito guarda-chuva, onde a blindagem dos epítopos pode ocorrer se a ordem não for atendida à pergunta de pesquisa específica que está sendo feita⁶. Para evitar o sangramento fluorescente, é típico colocar alvos de antígenos de maior expressão em canais vermelhos distantes que têm o menor sangramento e marcadores mais fracos na faixa de 480-520 nm, que terão a melhor relação sinal-ruído, uma vez que esses corantes fluorescentes são os mais brilhantes⁷. No entanto, deve-se ter cuidado com amostras de tecido altamente autofluorescentes que podem ser mais brilhantes nessa faixa; Recomendamos abordar esse problema por meio de imagens de tecido sem corantes para abordar os níveis potenciais de autofluorescência. Juntas, essas etapas de otimização, tomadas com todas as otimizações e controles normais normalmente feitos com IBEX, podem informar o design adequado do painel para IBEX com reagentes TSA.

Neste método, demonstramos o uso de dois corantes automáticos comuns. No entanto, essas abordagens também podem ser aplicadas a outros métodos de coloração automática. A parte principal aqui é a remoção ideal de lamínulas e a carga úmida para rodadas de coloração adicionais. Além disso, não especificamos nenhuma configuração específica do microscópio. Embora os kits possam recomendar o uso com certos sistemas de imagem para uma varredura ideal de lâminas, qualquer configuração de microscópio, particularmente um microscópio de epifluorescência com cubos de filtro compatíveis e uma fonte de luz LED de amplo espectro, deve funcionar. Alguns corantes requerem detectores multiespectrais ou cubos de filtro especializados, que podem não estar disponíveis em todos os laboratórios e podem apresentar desafios quando usados com cubos de filtro padrão devido à sua sobreposição espectral. Esses corantes são melhor separados usando sistemas de imagem multiespectral ou filtros altamente específicos. Alguns fluoróforos estão fora da faixa de filtros convencionais de vermelho distante (normalmente ~ 700 nm) e requerem um cubo de filtro ou detector especializado capaz de capturar sinais infravermelhos próximos. Microscópios especializados são construídos com esses filtros, mas alternativas estão disponíveis. Isso exigirá otimização adicional para determinar como os corantes funcionam em uma determinada configuração de microscópio.

A separação multiespectral é altamente recomendada para IHC fluorescente multiplex, particularmente ao trabalhar com tecidos propensos à autofluorescência, pois separa efetivamente o sinal verdadeiro do ruído de fundo. A autofluorescência, que muitas vezes se sobrepõe aos espectros de emissão de fluoróforos comumente usados (particularmente em canais de comprimento de onda de energia mais alta), pode obscurecer ou interferir em sinais específicos, reduzindo a precisão. A separação espectral desembaraça matematicamente os espectros de emissão sobrepostos, isolando sinais fluorescentes reais enquanto "limpa" a autofluorescência indesejada. A separação espectral é particularmente valiosa em fluxos de trabalho IBEX, onde obter os sinais mais limpos possíveis é fundamental devido à natureza iterativa do processo de coloração e imagem. No IBEX, os sinais de várias rodadas de coloração são visualizados, branqueados e empilhados uns sobre os outros para criar uma imagem composta. Qualquer autofluorescência ou sangramento que permaneça não resolvido em uma rodada pode se propagar pelas imagens empilhadas, complicando a análise a jusante e reduzindo a confiança na localização do marcador. A separação espectral isola efetivamente os sinais de fluorescência verdadeiros da autofluorescência de fundo, garantindo uma detecção de sinal mais limpa e precisa em cada rodada individual. Essa clareza de sinal é essencial para gerar imagens compostas confiáveis, onde vários marcadores são analisados juntos em rodadas, permitindo fenotipagem confiável e análise espacial. A plataforma de imagem usada para este protocolo possui recursos de separação integrados, mas são necessárias mais opções de separação para compatibilidade com outras plataformas de imagem fluorescente de lâmina inteira.

Além disso, uma limitação deste trabalho é a natureza proprietária dos corantes automáticos, pois seus reagentes associados e tampões de lavagem são otimizados para esses sistemas, mas as formulações específicas permanecem não divulgadas. Além disso, nos concentramos exclusivamente em um software de análise de imagem disponível comercialmente para análise de imagem de lâmina inteira e reconhecemos que o custo das licenças de software pode representar uma barreira financeira para alguns laboratórios. Software de análise adicional ^8,9 e opções em R parecem promissores; em particular, o Bodenmiller Group¹⁰, que criou um conjunto de pacotes que parece ideal para núcleos, em que o IMCDataAnalysis¹¹ se destina ao fluxo de trabalho reproduzível na análise downstream de imagem multiplexada em R. No entanto, são necessários esforços futuros para desenvolver e caracterizar alternativas acessíveis e econômicas para a análise IBEX de lâmina inteira para garantir uma adoção mais ampla em ambientes com recursos limitados. Além disso, esta abordagem com o uso de corantes automáticos para IBEX pode ser adaptada para coloração mais tradicional em IBEX, inclusive com anticorpos primários conjugados fluorescentes, ou com anticorpos secundários padrão sem os corantes à base de TSA, se o tecido for de qualidade alta o suficiente e tempo de fixação ideal para permitir um bom sinal.

No geral, esperamos que este trabalho ajude na aplicação de IHC fluorescente multiplex baseado em TSA usando equipamentos de instalações de núcleo de patologia rotineiramente utilizados para adaptar mais amplamente o IBEX a esses ambientes. Este tipo de aplicação realmente destaca a versatilidade do protocolo IBEX e demonstra sua utilidade até mesmo em amostras de tecido difíceis ou em abordagens de grandes lotes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kits TSA da Alexa reagentes para manchas	ThermoFisher		Corantes alternativos da TSA se não houver filtros de microscopia de opala disponíveis. Incluem Alexa Fluor 488 (canal azul/verde), Alexa Fluor 555 ou 568 (canal vermelho), Alexa Fluor 647 (canal vermelho distante), Alexa Fluor 750 (infravermelho próximo, se equipada com filtros apropriados).
Anticorpo Arg1	Sinalização de Celular	93668	Usado na Figura 4 em 1:100
Material Blades	Leica Biosystems		Ou similar, o perfil alto ou baixo depende do tipo de tecido
Anticorpo CD11b	Abcam	ab133357	Usado na Figura 4 em 1:2000
Anticorpo CD163	Abcam	ab182422	Usado na Figura 4 em 1:500
Anticorpo CD31	Sinalização de Celular	77699S	Usado na Figura 2 em 1:100
Anticorpo CD3e	Dako	A045201-2	Usado na Figura 1 em 1:100
Tool Coplin Jar	Fischer Scientific	01-816-21	Ou algo semelhante
Cobertores Materialbr/	VWR	v48393-026	Ou algo semelhante
Anticorpo CX3CR1	Abcam	ab308613	Usado na Figura 4 em 1:450
Stain DAPI	Akoya	FP1490
Software FIJI			Usado para medir a intensidade do sinal
Slide Fisher Superfront Slides	Fisher Scientific	22-037-246	Ou algo parecido
Software HALO	Indica Labs		Exemplo de software de análise de imagem comercialmente disponível. Usado para alinhar e analisar imagens.
Anticorpo Iba1	Sinalização de Celular	17191	Usado na Figura 4 em 1:800
Software inForm	Akoya		Usado para medir a intensidade do sinal
Anticorpo iNOS	Abcam	ab283655	Usado na Figura 4 em 1:400
Instrument Leica Bond Rx (ou RXm)	Leica Biosystems	21.2201	Referido como "Autostainer 1" no texto. Certifique-se de que todos os reagentes associados também estejam disponíveis, incluindo caixas de coloração e soluções a granel.
Reagent LiBH4	Sigma-Aldrich	62460-5G-F	Manter em um ambiente anidro
Estalido de Mantra Instrument	Akoya		É necessário um microscópio multiespectral de fluorescência para identificar os corantes. Exemplo de microscópio que pode ser usado para detectar corantes de opala.
Microtomo Tool	Leica Biosystems		Ou semelhante com acessórios preferidos, como pincéis
Reagente de coloração Kit Opal IHC 480	Akoya	FP1500001KT	Usado na Figura 4
Reagente de coloração Kit Opal IHC 6-plex Plex	Akoya	NEL821001KT	Os 520 e 620 não descolorem, usados nas Figuras 1, 2 e 4
Reagente de coloração Kit Opal IHC 780	Akoya	FP1501001KT	Usado na Figura 4
Forno Tool	Millipore Sigma	Z683329	Ou algo semelhante, também pode ser feito no autostainer
Anticorpo Pancitoqueratina	Abcam	ab9377	Usado na Figura 4 em 1:50
Reagente PBS (opcional)	Fisher Scientific	AAJ61196AP
Instrument PhenoImager	Akoya		Imagem multiespectral de slide inteiro com desmistura espectral integrada incluída no software
Reagente ProLong Gold Antifade	Fisher Scientific	P36961	Ou meios de montagem aquosos semelhantes
Anticorpo ProSP-C n-terminal (ProSPC)	Biorreagentes das Sete Colinas	WRAB-9337	Usado na Figura 4 em 1:250
RAIVA < anticorpos/>	R& D	MAB1179	Usado nas Figuras 1 e 2 em 1:50
Reagente Buffer de reação	Roche	NC1895692	Para uso com o autostainer Ventana
Anticorpo SARS-CoV-2-N	Sinalização de Celular	68344	Usado na Figura 2 em 1:1000
Lâminas CC de Microscópio de Adesão TOMO - WH	Avantik	SKUSL6519-1	Se a adesão do tecido for motivo de preocupação
Instrument Ventana Discovery Ultra	Roche		Referido como "Autostainer 2" no texto. Certifique-se de que todos os reagentes associados também estejam disponíveis, incluindo caixas de coloração e soluções a granel.
Buffer de lavagem Reagente	Leica Biosystems	AR9590	Para uso com Leica Bond autostainer
Reagente Água	Fisher Scientific	15-230-147	DI é o melhor, não o millipore
Banho-maria Tool	Leica Biosystems	140607020C1	Ou algo semelhante