Artigo de método

Separação e Caracterização Diferencial de Vesículas Microbianas Extracelulares Intestinais em Ratos Sensíveis ao Sal sob Condições de Dieta Rica em Sal

DOI:

10.3791/68279

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6 de junho de 2025

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1School of Medical Technology, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Pathology Department, Suining Central Hospital, 3School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Department of Pharmacy, Affiliated Sport Hospital of CDSU, 5Department of Neck, Shoulder, Waist, and Leg Pain, Sichuan Province Orthopedic Hospital, 6Neijiang Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo descreve o isolamento de EVs microbianos intestinais de ratos sensíveis ao sal alimentados com HSD usando centrifugação por gradiente de densidade. Os EVs foram caracterizados por rastreamento de nanopartículas, ensaios TEM, LPS/BCA e sequenciamento de rRNA 16S para analisar o tamanho, morfologia, composição e origem da microbiota.

Resumo

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A alta ingestão de sal é um importante fator de risco para hipertensão, e seu mecanismo subjacente pode estar intimamente ligado às vesículas extracelulares (EVs) secretadas pela microbiota intestinal. Esses EVs, produzidos pela microbiota intestinal, carregam vários componentes bioativos que podem desempenhar um papel crucial no desenvolvimento da hipertensão induzida por uma dieta rica em sal (HSD). Para investigar esse mecanismo, desenvolvemos um método de extração eficiente baseado na centrifugação por gradiente de densidade para isolar EVs da microbiota intestinal de ratos sensíveis ao sal alimentados com HSD. Por meio da análise do tamanho das partículas, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e detecção de lipopolissacarídeo (LPS), identificamos a distribuição do gradiente dos EVs da microbiota intestinal e obtivemos uma extração precisa. Além disso, o sequenciamento do gene 16S rRNA foi empregado para analisar a origem e as diferenças de composição dos EVs entre os grupos normal e HSD, revelando o impacto da alta ingestão de sal nas características genéticas dos EVs da microbiota intestinal. Este estudo fornece ferramentas valiosas e insights científicos sobre os mecanismos da microbiota intestinal subjacentes à hipertensão induzida pelo sal e oferece novas perspectivas para a prevenção e tratamento de doenças relacionadas.

Introdução

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A microbiota intestinal, também conhecida como microbiota intestinal ou microecologia intestinal, é um complexo de dezenas de milhares de microrganismos localizados no trato gastrointestinal biológico e desempenha um papel crucial na manutenção da saúde humana1. Nos últimos anos, com mais pesquisas, descobriu-se que a microbiota intestinal pode produzir vesículas extracelulares (EVs)2. As EVs são pequenas vesículas liberadas pelas células, que carregam várias moléculas na célula, como proteínas, ácidos nucléicos e lipídios 3,4. Eles podem interagir com outros micróbios5, células epiteliais intestinais e até tecidos e órgãos distantes6, afetando assim a saúde do corpo humano 7,8. Existe uma estreita ligação entre os EVs produzidos por essa microbiota intestinal e a dieta9.

Os EVs produzidos pela microbiota intestinal podem ser agentes significativos através dos quais uma dieta rica em sal (HSD) afeta a saúde do corpo. A HSD não apenas perturba diretamente o equilíbrio da microbiota intestinal10, levando a uma redução significativa no número de bactérias benéficas (como Lactobacillus) 11, mas também promove a proliferação de bactérias nocivas (como Bacteroides, etc.)12. Esse desequilíbrio reduz a função da barreira intestinal e aumenta o risco de inflamação intestinal. Além disso, uma HSD também afeta ainda mais o equilíbrio ácido-base e a absorção de nutrientes no intestino, alterando as atividades metabólicas13 da microbiota intestinal, como a redução da produção de ácidos graxos de cadeia curta14,15 com múltiplas funções fisiológicas.

Essas mudanças não apenas afetam a saúde intestinal, mas também podem regular indiretamente a produção e liberação de EVs e alterar a composição e a função do EV. O ambiente com alto teor de sal pode afetar as funções fisiológicas normais das células intestinais, incluindo a liberação e o transporte de EVs, perturbando assim o papel dos EVs na transmissão de informações intercelulares e na regulação imunológica. Ao mesmo tempo, a inflamação intestinal pode promover uma variedade de EVs com funções especiais16 e se espalhar para todo o corpo através do eixo do órgão intestinal e de outras formas17,18, o que está intimamente relacionado à ocorrência e desenvolvimento de hipertensão19,20, doenças cardiovasculares21 e cerebrovasculares22,23, obesidade24,25, diabetes26 e outras doenças crônicas.

Portanto, o objetivo geral deste estudo foi desenvolver um método eficiente e confiável para extrair EVs da microbiota intestinal de ratos sensíveis ao sal alimentados com HSD e estudar sistematicamente suas propriedades físicas, composição e funções. Devido às características do aumento significativo da pressão arterial após uma dieta rica em sal, ratos sensíveis ao sal foram selecionados e revelaram o efeito do HSD na microbiota intestinal EV através da construção de um método de extração eficiente. O método foi baseado na centrifugação do gradiente de densidade e combinou várias técnicas de identificação dinâmica, como detecção de tamanho de partícula, medição de LPS/BCA, microscopia eletrônica de transmissão e análise proteômica. O protocolo visa revelar os efeitos da HSD na microbiota intestinal EV e seus mecanismos nas doenças cardiovasculares. Com sua alta eficiência, reprodutibilidade e ampla aplicabilidade, essa abordagem não apenas fornece uma ferramenta importante para explorar o mecanismo das VEs da microbiota intestinal na hipertensão induzida por sal, mas também estabelece a base teórica para o desenvolvimento de estratégias de intervenção em doenças baseadas em EVs. Por meio deste estudo, espera-se abrir novos caminhos para a prevenção e tratamento de doenças cardiovasculares, como a hipertensãoarterial sistêmica 27,28.

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Protocolo

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Este estudo experimental em animais está em conformidade com as diretrizes éticas relevantes e os padrões internacionais. Os estudos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar de Animais de Laboratório da Universidade de Medicina Chinesa de Chengdu (instituição: Universidade de Medicina Chinesa de Chengdu; número do protocolo: 2018-21).

1. Preparação animal e regime alimentar

  1. Aclimatar ratos Dahl machos sensíveis ao sal com 6 semanas de idade, peso corporal 180-200 g, criando a 50% ± 10% de umidade; Ciclo de luz de 12 h / 12 h; 20,0 ± 2,0 °C por 1 semana em condições específicas livres de patógenos.
  2. Posteriormente, dividir os ratos igualmente em dois grupos (n = 6). Fornecer a cada grupo uma dieta diferente com duração de 6 semanas: uma dieta normal de sal (NSD) com cloreto de sódio a 0,5% e uma HSD com cloreto de sódio a 8%, que é comumente usada em estudos publicados 29,30,31. Os ratos tiveram acesso ilimitado a comida e água durante todo o estudo.

2. Monitoramento da pressão arterial

NOTA: A pletismografia do manguito da cauda foi usada como um método não invasivo para medição da pressão arterial, e o registro da pressão volumétrica (VPR) foi usado quando a pressão arterial foi medida a partir do volume sanguíneo da cauda.

  1. Colocar os ratos individualmente em pequenas gaiolas com serradura, aquecidas durante 10 minutos a cerca de 37 °C e colocar numa contenção personalizada para roedores com nariz e porta ajustáveis para a entrada dos animais. Coloque os ratos em uma almofada de aquecimento em decúbito ventral para manter a temperatura corporal em 37 °C.
  2. Conecte o sensor VPR na parte inferior da cauda e defina pelo menos 10 ciclos de adaptação para estabilizar o BP28.
    1. Encha o manguito inflável na raiz da cauda e coloque o sensor pletismográfico (ou sensor fotoelétrico) abaixo. Encha lentamente acima da pressão sistólica (geralmente 200 mmHg) e, em seguida, solte lentamente. O instrumento detecta automaticamente o valor da pressão do desaparecimento da onda de pulso (pressão arterial sistólica) e recuperação (pressão arterial diastólica). Meça 3-5 vezes consecutivas e pegue o valor médio.
  3. Treine todos os ratos para acomodar o procedimento de contenção e realize este estudo em um laboratório silencioso por volta das 9h para minimizar os efeitos da variação circadiana.
  4. Meça a pressão arterial sistólica (PAS) e a pressão arterial diastólica (PAD) em dias alternados antes do sacrifício. Estimar a pressão arterial média (PAM) a partir da PAS e PAD
    PAM = (PAS + 2 PAD)/3

3. Extração de EVs

  1. Coleta de amostras
    1. Mergulhe um cotonete estéril em álcool 75% e use-o para estimular o ânus do rato. A estimulação tinha como objetivo promover o peristaltismo intestinal e relaxar o esfíncter anal, promovendo assim a defecação. Depois que as fezes forem expelidas, colete-as usando uma pinça estéril em recipientes estéreis de tamanho apropriado e armazene-as imediatamente a -80 °C.
  2. Preparação da amostra
    1. Usando uma colher, transfira 5 g de fezes para um tubo de centrífuga pré-pesado de 50 mL. Adicione 50 mL de PBS livre de endotoxinas a 37 °C pré-aquecido (concentração máxima de amostra de 10%) ao tubo e gire por 30 min. Arrefecer a centrífuga de alta velocidade a 4 °C.
    2. Centrifugue a 8.000 x g por 15 min após colocar as amostras simetricamente para permitir que a centrífuga se equilibre. Após centrifugação, aspirar o sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo de centrifugação estéril.
    3. Centrifugue novamente a 8.000 x g por 15 min. Aspirar o sobrenadante e utilizá-lo para uma análise mais aprofundada.
  3. Preparação de extrato bruto
    1. Use uma unidade de filtro estéril de 0,22 μm. Coloque a unidade de filtro no gelo e segure a bomba de vácuo com firmeza. Transferir o sobrenadante obtido para a parte superior do filtro. Ligue a bomba de vácuo para coletar as amostras filtradas.
    2. Transferir o filtrado para um filtro centrífugo (10 kDa, 15 ml), centrifugar a 4 °C, 3.000 x g durante 30 min e concentrar a amostra a pelo menos 1400 μl.
    3. Coletar a amostra concentrada e, se necessário, diluí-la a 1400 μL usando PBS livre de endotoxinas pré-resfriado. Manter a amostra congelada imediatamente após a diluição.
      NOTA: O extracto bruto pode ser utilizado imediatamente ou conservado a -80 °C durante vários meses.
  4. Separação de EVs
    1. Prepare o buffer de gradiente A e o buffer de gradiente B conforme descrito abaixo. Prepare o tampão com um dia de antecedência, pois leva várias horas para o composto se dissolver completamente. O tampão preparado pode ser armazenado a 4 °C durante 6 meses.
      1. Preparação do tampão gradiente A: Dissolva 0,25 M de sacarose, 6 mM de EDTA e 60 mM de Tris em 800 mL de água livre de endotoxinas por agitação do misturador magnético, com o pH ajustado para 7,4 usando ácido clorídrico. Diluir para 1 L com água sem endotoxinas. Use um filtro de topo de garrafa de 0.22 μm para filtrar o tampão.
      2. Preparação do tampão gradiente B: Dissolva 0,25 M de sacarose, 1 mM de EDTA e 10 mM de Tris em 800 mL de água livre de endotoxinas por agitação do misturador magnético, com pH ajustado para 7,4 com ácido clorídrico. Diluído a 1 L com água livre de endotoxinas. Use um filtro superior de garrafa de 0.22 μm para filtrar o tampão.
    2. Misture 1 volume de tampão de gradiente A e 5 volumes de meio de gradiente de densidade (o meio é solução de iodixanol a 60%) para preparar a solução de trabalho.
    3. Preparação da solução de iodixanol (10%, 20%, 40%): Para preparar uma solução de iodixanol a 10%, misture 1 unidade de solução de trabalho e 4 unidades de tampão B; para solução de iodixanol a 20%, misture 2 unidades de solução de trabalho e 3 unidades de tampão B; para solução de iodixanol a 40%, misture 4 unidades de solução de trabalho e 1 unidade de tampão B. Prepare cada solução fresca e guarde no gelo.
      NOTA: Novas soluções de trabalho devem ser preparadas para cada experimento, e um volume adicional de 10% de soluções pode ser preparado para contabilizar o erro experimental.
    4. Misture a solução preparada na etapa 3.3.3 com 7 mL de meio de gradiente de densidade para fazer uma solução de iodixanol a 50%.
    5. Para preparar um gradiente de densidade, adicione solução de azul de tripano à solução a 40% e à solução de iodixanol a 10% (peso / volume) para fornecer um contorno claro entre as camadas distintas.
    6. Transfira 8 mL de solução de iodixanol a 50% para o fundo do tubo de centrífuga de polipropileno de parede fina. Incline o tubo a 70° e transfira 8 mL de solução de iodixanol a 40% para a superfície do líquido. Adicione 8 mL de solução de iodixanol a 20%, depois 7 mL de solução de iodixanol a 10% e, finalmente, 2 mL de PBS livre de endotoxina.
      NOTA: Preparar um gradiente de densidade requer prática. A qualidade do gradiente de densidade tem um grande impacto nos resultados experimentais. Não coloque o tubo na vertical entre as diferentes etapas do processo de adição, pois isso afeta negativamente a qualidade do gradiente de densidade.
    7. Pré-resfrie a centrífuga com antecedência e coloque o gradiente de densidade preparado na ultracentrífuga. Parâmetros de entrada para iniciar, valores dos parâmetros: 100.000 x g, 20 h, 10 °C.
    8. Para separação manual da densidade do gradiente, retire lentamente 2 mL da solução do centro da superfície do sistema contendo um total de 34 mL de líquido. Cada 2mL é um gradiente, dividindo assim a solução de gradiente de densidade em 17 gradientes.
    9. Transferir as fracções de densidade para um tubo de amostra estéril utilizando uma pipeta e colocá-las imediatamente sobre gelo. Prenda o tubo da centrífuga entre o polegar e o indicador para garantir que ele permaneça na posição vertical.
  5. Recuperação de EVs
    1. Usando um sistema de extração de EVs totalmente automatizado que aplica oscilação de pressão negativa por meio de um sistema de oscilação ultrassônica de acoplamento duplo no chip de ultrafiltração, remova as impurezas de ácidos nucléicos e proteínas da amostra através dos nanoporos e intercepte EVs, levando ao enriquecimento e purificação de EVs.
      1. Remova o filtrado na etapa 3.4.7 e adicione-o ao chip de ultrafiltração.
      2. Operar o instrumento de acordo com as instruções do instrumento e recolher o filtrado filtrado, ou seja, a solução enriquecida com exossomas. O processo principal é mostrado na Figura 1.

4. Identificação de EVs

  1. Detecção de tamanho de partícula e concentração
    1. Avalie a distribuição de tamanho e o potencial zeta usando um contador de nanocoulômetro baseado em sensor de pulso resistivo (RPS). Selecione chips de nanoporos com uma faixa de medição de 60-200 nm para este experimento. Além disso, avalie a distribuição do tamanho das partículas e o potencial zeta dos EVs usando um contador de nanobiblioteca.
      1. Pegue uma quantidade adequada de solução de EVs e dilua-a em (1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000).
      2. Diferentes diluições de soluções de EVs foram colocadas no instrumento para teste.
      3. O múltiplo de diluição com melhor estabilidade foi selecionado e testado novamente para obter dados mais precisos.
  2. Ensaio LPS e BCA
    1. Ensaio de BCA: Lise EVs usando tampão RIPA e depois separe as proteínas. Determine o teor de proteína dos EVs usando o kit de determinação da concentração de proteína BCA.
    2. Ensaio LPS: Usando o kit de detecção de endotoxinas, adicione amostras, um detector de endotoxinas e cromogênico de acordo com as etapas do kit. Medir a absorvância a 545 nm e calcular a expressão LPS das vesículas externas de acordo com a curva-padrão.
  3. Avaliação TEM: Para coloração negativa e análise TEM, aplique amostras em uma grade de cobre luminescente revestida com filme de carbono contínuo e manche com formato de uranila a 0,75%. Para crio-EM, absorva os EVs em uma grade de carbono EM de 300 malhas com uma superfície hidrofílica e congele em nitrogênio líquido. Observe e analise as grades usando o Cryo-TEM e registre as imagens em 22.000 ampliações32.
  4. Caracterização de proteínas: Lise EVs usando tampão RIPA e depois separe as proteínas. Determine a concentração de proteína usando o kit de ensaio de proteína BCA, separe quantidades iguais de proteína de cada amostra por SDS-PAGE e coe com solução de corante azul de Coomassie após eletroforese para visualizar os perfis de proteína33,34.
  5. Sequenciamento e análise S: Extraia o DNA genômico das amostras fecais usando um kit de extração de DNA fecal. Avaliar a integridade e a concentração do ADN por electroforese em gel de agarose e espectrofotómetro. Amplificar a região V3 - V4 do gene 16S rRNA com primers universais, purificar os produtos de PCR, quantificá-los e sequenciá-los na plataforma Illumina. Realize a análise de dados usando o pipeline QIIME235.
    1. Classifique as variantes de sequência de amplicon (ASVs) usando DADA2 e compare com o banco de dados Silva usando o algoritmo VSEARCH. Use a análise de α-Diversidade para avaliar a riqueza e diversidade de espécies dentro das amostras, principalmente usando índices como o índice de Shannon e o índice de Chao1. β-A análise de diversidade compara a composição da comunidade microbiana entre as amostras e geralmente é visualizada pela análise de coordenadas principais (PCoA). Use métodos de análise diferencial, como tamanho de efeito de análise discriminante linear (LEfSe) e análise de gráfico de vulcão, para identificar táxons microbianos com condições significativamente diferentes ou entre grupos.

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Resultados

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As concentrações de EVs foram determinadas em diferentes frações (Figura 2A). Os resultados experimentais mostraram que a concentração dos EVs exibiu um padrão típico de distribuição normal em uma série de soluções de gradiente de densidade (Figura 2B). Especificamente, na fração 9, a concentração de EVs atingiu seu ponto mais alto (3,85 x 109), sugerindo que a principal fração de distribuição de EVs pode ser 936.

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Discussão

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Neste estudo, nos concentramos nos EVs da microbiota intestinal em ratos sensíveis ao sal em um HSD e alcançamos uma série de conquistas importantes. Primeiro, um método de extração eficiente baseado na centrifugação de gradiente de densidade foi construído com sucesso para isolar EVs da microbiota intestinal de ratos sensível ao sal em HSD, e a maioria dos componentes não EV foram isolados por meio de um processo meticuloso e padronizado de manipulação experimental em animais e processa...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82205240), pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Sichuan (2025ZNSFSC1836) e pelo Projeto Básico Clínico do Hospital Ortopédico Provincial de Sichuan (PY202414).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Suprimentos essenciais
Filtro centrífugo (10nkDa 2 mL)CentrífugaUFC903096
Tude(50 mL)Centrífuga 20220404
TudesBECKMAN COULTERZ30815SCA
Biosharp24902581
fortes
Cromogênico LAL Kitensaio Beyotime
Coomassie Blue Solução de coloração rápidaBeyotimeZ972241010
EDTADamas-betaP3117308
Kit de ensaio de proteína BCA aprimoradoBeyotimeA006241112
EtanolBeyotime KESH
HCl
OptiPrep (60% em peso/vol, iodixanol)Serumwerk00124
PBSLabshark130114005
ácido fosfotúngsticoRUIXIN
SacaroseDamas-betaP1917057
Tris (VWR)Damas-betaP3061764
Solução de coloração azul de tripano (0,4%)BeyotimeBD07242904
< forte > Equipamento< / forte >
microplacasSpectraMaxABP01690
BiomicroscópioMoticBA210 Centrífuga de mesa digital
CenceCHT210R
Micro centrífuga de mesaDLABD3024
Rotor de alumínio de ângulo fixo + 500 mL Centrífuga CopoCence
Balança eletrônica de alta precisãoSKRBN-200
Gabinete de fluxo laminarNantong Hunan Scientific Instrument Co., Ltd.SW-CJ-2FDS
SW 32.1 Ti Giro da caçamba giratória+ SW 32.1 Ti Balde do rotorBECKMAN COULTER
Microscópio eletrônico de transmissãoJEOLJEM-1400FLASH
Rotador
UltracentrífugaBECKMAN COULTEROptima XE-100
Sistema de água ultrapuraULPHWUPR-II-15TNZ
Bomba de vácuo multifuncional de Água-CieculaçãoQiang QiangSHZ-D (III)
MilliporeBKMAN Sistema de Filtração a Vácuo de 022124240705 Absorbância Leitor de de tubo

Referências

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