Avaliação da hiperalgesia do joelho em camundongos usando medição de aplicação de pressão

Resumo

O protocolo descreve como medir a hiperalgesia do joelho em camundongos. Mostramos exemplos em modelos de camundongos de dor aguda no joelho, bem como em modelos de osteoartrite (OA).

Resumo

A avaliação da hiperalgesia do joelho fornece um ensaio robusto para medir a sensibilização periférica no joelho e representa um comportamento dependente da dor clinicamente relevante que pode ser usado em modelos de artrite em roedores. Vários métodos foram relatados para determinar o limiar de respostas à compressão do joelho em roedores. Aqui, nosso objetivo foi adaptar os métodos existentes para desenvolver um método padronizado para avaliar a hiperalgesia do joelho em camundongos adultos, usando um dispositivo de Medição de Aplicação de Pressão (PAM). O protocolo inclui etapas detalhadas, recomendações de treinamento para novos experimentadores e dicas para alcançar resultados consistentes. Fornecemos sugestões para o treinamento ideal de um novo experimentador. Finalmente, resultados representativos são fornecidos para modelos agudos de hiperalgesia transitória e modelos experimentais de osteoartrite (OA), que são caracterizados por dor crônica. Este método é altamente sensível a intervenções farmacológicas, tornando-o adequado para avaliar os efeitos de mediadores como citocinas e para ensaios de triagem de medicamentos de médio rendimento. Em resumo, a abordagem descrita fornece um método robusto e clinicamente relevante para quantificar a hiperalgesia do joelho.

Introdução

A osteoartrite (OA), a forma mais comum de artrite, é caracterizada por degradação progressiva da cartilagem, sinovite, remodelação óssea e crescimento de osteófitos¹, e apresenta-se clinicamente como dor e perda da função articular. A OA é uma das principais fontes de dor crônica no mundo, impactando profundamente a vida dos pacientes devido à mobilidade reduzida e problemas de saúde associados, como ansiedade e depressão ^2,3. Os medicamentos comumente prescritos para dor da OA incluem anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), viscossuplementação, corticosteróides e opioides, mas sua eficácia é limitada e seu uso prolongado está associado a efeitos adversos graves ou risco de dependência ^1,4.

Nos últimos anos, grandes estudos de coorte tentaram descrever cuidadosamente a dor experimentada durante a OA progressiva⁵. Como parte desse esforço, vários estudos realizaram testes sensoriais quantitativos (QST) em indivíduos com OA, com o objetivo geral de identificar sensibilização e determinar associações entre medidas de QST e sintomas e gravidade da OA, bem como resposta ao tratamento (revisado em⁶). A Associação Internacional para o Estudo da Dor define sensibilização como um aumento da capacidade de resposta dos neurônios nociceptivos à sua entrada normal e / ou recrutamento de uma resposta a entradas normalmente subliminares⁷. Está se tornando cada vez mais claro que a sensibilização é um processo fundamental subjacente à dor crônica na OA. Um achado específico do QST que distingue de forma robusta os indivíduos com OA sintomática dos controles é uma redução no limiar de pressão de dor (PPT). Uma meta-análise dos valores de PPT (tanto no joelho quanto em locais distantes do joelho) de 1.003 participantes com e sem OA de joelho relatou uma diferença média padrão significativa (SMD, diferença nas médias dividida pelo desvio padrão) no PPT entre pessoas com OA e controles⁸.

A observação de que pacientes com OA apresentam sensibilização a estímulos mecânicos, que se manifesta como limiares de pressão de dor reduzidos quando uma força é aplicada à articulação, sugere mecanismos subjacentes de sensibilização periférica e central que resultam de mudanças na via da dor⁶. Os fundamentos moleculares e celulares dessas mudanças podem ser estudados em modelos de OA em roedores. Nos últimos anos, modelos sofisticados de camundongos foram desenvolvidos para modelar a natureza lentamente progressiva da OA do joelho, e essa abordagem revelou que mecanismos distintos de dor operam de maneira dependente do tempo, o que pode ter um importante significado translacional⁹. Por exemplo, no curso da OA experimental do joelho induzida cirurgicamente, os camundongos desenvolvem alodinia mecânica na pata traseira operada no início do curso da doença, enquanto os déficits de sustentação de peso só se tornam aparentes na doença em estágio avançado⁹.

Como em pacientes com OA, camundongos com OA experimental desenvolvem um limiar de dor reduzido para dor aplicada ao joelho no início do curso da OA experimental do joelho¹⁰. Isso é indicativo de sensibilização dos nociceptores que inervam o joelho, que pode de fato ser visualizada e quantificada por imagens de cálcio in vivo dos gânglios da raiz dorsal lombar¹¹. A avaliação da hiperalgesia do joelho fornece um ensaio robusto e relativamente simples para medir a sensibilização periférica, representando assim um comportamento dependente da dor clinicamente relevante que pode ser usado em modelos de artrite em roedores. Vários métodos foram relatados para determinar o limiar de respostas à compressão do joelho em roedores. Estudos mais antigos relatam apertar o joelho entre o polegar e o indicador e registrar uma resposta subjetiva de retirada ou uma resposta de vocalização no animal 12,13,14 Em 2007, Barton et al. relataram a medição da aplicação de pressão (PAM) como uma nova técnica comportamental para registrar a hipersensibilidade mecânica no joelho de rato na artrite inflamatória¹⁵. O método foi posteriormente validado em camundongos com artrite do joelho induzida por antígeno ¹⁶. A PAM é uma técnica que utiliza um transdutor de força para colocar uma força crescente no joelho afetado ao mesmo tempo em que fornece feedback visual, permitindo assim a compressão do joelho de forma reprodutível, o que aumenta sua sensibilidade e reprodutibilidade. Esses dois estudos publicados anteriormente se concentraram em modelos de artrite inflamatória, onde o inchaço do joelho é proeminente. Portanto, nosso objetivo foi adaptar esses métodos ^15,16 para desenvolver um método padronizado para avaliar a hiperalgesia do joelho em camundongos, que possa ser prontamente aplicado a modelos de OA e seja altamente responsivo à intervenção farmacológica, conforme descrito aqui.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Rush University. O protocolo descrito é avaliar a hiperalgesia do joelho direito em resposta a um estímulo mecânico em camundongos C57BL/6 adultos (10 semanas a 2 anos de idade) de ambos os sexos. Para medir a hiperalgesia do joelho esquerdo, troque de mãos.

1. Configurando o dispositivo de Medição de Aplicação de Pressão (PAM)

1. Conecte um cabo do dispositivo PAM ao computador e o segundo cabo do dispositivo PAM ao transdutor de força.
2. Ligue o computador e inicie o software PAM. Ajuste a pressão máxima para 450 g.
   NOTA: O software e o pequeno transdutor podem medir até 500 g. Portanto, o experimentador pode escolher um platô entre 450 g e 500 g, mas o limite máximo não deve mudar dentro de um experimento.
3. Deixe os ratos na sala de testes por 15 a 30 minutos até que estejam aclimatados e se acalmem. Certifique-se de que a sala de testes seja uma sala separada de onde os ratos estão alojados e que a sala esteja silenciosa. Use a mesma sala de teste durante todo o estudo.
4. Realize a pré-aclimatação, se necessário, para acalmar os camundongos antes do início do estudo - neste caso, contenha os animais segurando o camundongo com a mão esquerda, restringindo as costas e segurando firmemente a cauda com o^4º e^5º dedos (como seriam para o teste), 2 dias antes do primeiro dia de teste para aclimatar os camundongos ao ensaio. Dentro de um determinado experimento, aclimatar todos os ratos da mesma maneira.
5. Após a aclimatação, certifique-se de que o mouse esteja calmo e não se contorça quando contido. Se o camundongo não estiver calmo, devolva-o à gaiola e adie o teste por alguns dias.

2. Treinamento para mensuração da hiperalgesia do joelho

1. Comece com animais ingênuos e aprenda a reconhecer as respostas quando os animais estão calmos. Isso informará o experimentador a reconhecer qual é a resposta normal para esse ensaio.
2. Use um modelo experimental em que a hiperalgesia do joelho tenha sido caracterizada por um testador experiente para saber o que esperar. Reconheça que, na OA experimental, as respostas podem ser menos óbvias do que em modelos agudos ou modelos inflamatórios.
3. Use lidocaína ou um opiáceo para reverter o comportamento da dor - isso ajudará a avaliar como saber a diferença entre uma resposta ao estresse e uma resposta real relacionada à dor.
4. Realize todos os testes de maneira cega para a alocação de grupo. Realize um experimento de modelo OA com analgésicos conhecidos em um experimento controlado por veículo. Confirme se o testador pode distinguir esses grupos e obter medições reprodutíveis.
5. Espere que a conclusão do treinamento possa levar várias semanas.

3. Medição basal da hiperalgesia do joelho usando PAM

NOTA: Muitos modelos experimentais de artrite inflamatória ou osteoartrite são unilaterais (por exemplo, OA de joelho induzida cirurgicamente). Para avaliar a hiperalgesia do joelho nesses modelos, sempre medimos o limiar de retirada do joelho primeiro no joelho contralateral de todos os camundongos a serem testados. Em seguida, testamos o joelho ipsilateral. Como exemplo, este protocolo pode ser aplicado para medir a hiperalgesia do joelho na OA experimental induzida por DMM. Nesse modelo, o dano articular é acompanhado por hiperalgesia do joelho, desenvolvendo-se na semana 2 após a cirurgia e mantido até a semana 16¹⁷.

1. Embale o mouse com a mão esquerda, prendendo as costas e segurando firmemente a cauda com o^4º e o^5º dedos.
2. Passe o dedo indicador da outra mão (mão direita) através da amarração do transdutor (Figura 1A). Em seguida, coloque o dedo indicador com o transdutor em um saco plástico transparente (por exemplo, um saco de sanduíche). Isso evitará que o transdutor fique sujo, por exemplo, pela urina do rato.
   NOTA: O transdutor é frágil e quebra facilmente se não estiver protegido de líquidos ou quando uma força muito alta for aplicada.
3. Usando o polegar direito e o dedo médio, segure a perna direita e use o dedo médio para prender suavemente a pata no tenar da mão esquerda (Figura 1B). A posição correta do joelho no início do teste é em torno de 90° de flexão.
4. Com o joelho em flexão de 90°, o polegar direito toca a lateral do joelho. Com o dedo indicador tocando o lado medial do transdutor, aplique pressão lentamente contra o joelho. Conforme indicado pelo software de computador (linha azul no gráfico), aplique força crescente a uma taxa constante (30 g/s), até 450 g ou até que o mouse mostre comportamentos relacionados à dor, como vocalização, espasmos musculares, contorções corporais ou movimento do bigode.
5. Assim que o mouse mostrar comportamento relacionado à dor, retraia o dedo com o transdutor do joelho e registre a pressão exibida na tela (Figura 1C). Se o camundongo não apresentar comportamento relacionado à dor quando 450 g for atingido, ainda solte o transdutor e atribua um valor de 450 g como limite de retirada para esse teste.
   NOTA: Cada camundongo individual expressa uma resposta à dor à sua maneira. Portanto, o testador deve determinar quais comportamentos relacionados à dor os camundongos individuais expressam. No entanto, alguns camundongos não expressam comportamentos relacionados à dor e, neste caso, o testador pode testar novamente o joelho contralateral para determinar a resposta individual à dor do camundongo alguns dias depois ou continuar a medir o lado ipsilateral e determinar o padrão de comportamento. A última opção requer muitas horas de experiência, portanto, a primeira opção é recomendada para iniciantes.
6. Retorne o mouse para a gaiola e prossiga para testar o próximo mouse. Quando um joelho tiver sido testado em todos os camundongos, volte para o primeiro camundongo e repita o teste. Teste cada joelho 2x e faça uma média dos dois resultados do teste como resultado final. Esse número é denominado limite de retirada.
   1. Se houver uma diferença de ≥ 60 g entre a^1ª e a^2ª medições, faça uma^3ª medição e use a média das três medições como resultado final. Tente não estressar os ratos e evite várias medições consecutivas no mesmo mouse. É por isso que deve haver algum tempo entre cada medição consecutiva.
7. Teste a hiperalgesia do joelho em condições cegas para evitar viés. Use brincos individuais para facilitar a cegueira. Determinar se o comportamento do camundongo é indicativo de dor requer prática, experiência e confiança, porque o testador precisa usar seu julgamento. É por isso que cegar os grupos experimentais é importante.

4. Medindo a hiperalgesia do joelho em um modelo de dor aguda no joelho

1. Após a medição basal da hiperalgesia do joelho, raspe o pelo ao redor do joelho.
2. Anestesie o animal com isoflurano e verifique a anestesia adequada usando o reflexo de pinça do dedo do pé. Use pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento durante a anestesia. Injete 5 μL de Pam3CSK4 (1 μg ou 3 μg dissolvido em água estéril) ou controle do veículo (5 μL) através do tendão patelar no espaço intra-articular do joelho direito ou esquerdo, usando uma seringa Hamilton com uma agulha 30G.
3. Avalie a hiperalgesia do joelho 1 h, 2 h, 4 h, 6 h e 24 h após a injeção em condições cegas.
4. Para avaliar o efeito da lidocaína, injete lidocaína (20 mg / kg em solução salina) ou solução salina intra-articular 4 h após a injeção de Pam3CSK4. Em seguida, avalie a hiperalgesia do joelho após 0,5 h, 2 h e 20 h.

5. Avaliação longitudinal da hiperalgesia do joelho em um modelo prolongado de OA

1. Avalie a hiperalgesia basal do joelho em camundongos C57BL/6 machos de 12 semanas de idade.
2. Realizar desestabilização do menisco medial (DMM) ou cirurgia simulada em um joelho, conforme descrito em¹⁸.
3. Avalie a hiperalgesia do joelho em 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas, 12 semanas e 16 semanas após a cirurgia.
4. Para avaliar o efeito da lidocaína intra-articular, avalie a hiperalgesia do joelho 4 semanas após o DMM e, em seguida, injete lidocaína (20 mg/kg em 5 μL) ou solução salina sob anestesia com isoflurano, conforme descrito na etapa 4.
5. Avalie a hiperalgesia do joelho 20 min, 120 min e 240 min após a injeção de lidocaína.

Resultados

Evolução temporal da hiperalgesia do joelho em um modelo de dor aguda no joelho
Todos os resultados apresentados foram previamente relatados pelo nosso grupo, e nos referimos a¹⁰para uma descrição detalhada. O primeiro exemplo mostra um modelo para induzir hiperalgesia aguda e transitória do joelho. Neste experimento, injetamos Pam3CSK4, um ligante sintético do receptor toll-like 2 (TLR2) (1 μg ou 3 μg, dissolvido em água estéril) a 5 μL, na ca...

Discussão

A medição da hiperalgesia do joelho em camundongos oferece um meio relativamente rápido e direto de avaliar a hiperalgesia do joelho associada à artrite experimental. Como pode ser observado a partir dos resultados representativos mostrados, o ensaio pode detectar hiperalgesia de início agudo e transitória (Figura 2A). Relatamos esse comportamento em resposta a vários mediadores injetados na articulação do joelho, incluindo um fragmento de agrecan

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Antagonista do receptor de quimioquina C-C 2 (CCR2RA)	Tocris	RS 504393
Computador (de qualquer tipo)			Windows 7 mínimo
Lidocaína	Sigma	L5647
Medição de Aplicação de Pressão (P.A.M)	Ugo Basile	38500	incluía transdutor, computador e cabos
Saco de sanduíches	Mercado Integral de Alimentos	6-1/2 x 5-7/8	Cobrir o transdutor
ligando do receptor tipo toll 2 Pam3CSK4	invitrogen	TLRL-PMS