Rastreamento de proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência

Summary

Este artigo fornece uma descrição detalhada de como criar amostras para rastreamento de proteína única em bicamadas lipídicas suportadas por sólidos. Também explica um microscópio de fluorescência simples, com sensibilidade a molécula única e taxa de quadros rápida. Por fim, descrevemos o procedimento para extrair trajetórias de proteína única.

Abstract

A observação direta é um método fundamental para a descoberta e compreensão científica. A imagem de fluorescência de molécula única em time-lapse permite a observação de proteínas individuais enquanto elas se movem e interagem com o ambiente, tornando visíveis estados que normalmente estariam ocultos em medições de conjunto. O rastreamento de proteína única é especialmente adequado para o estudo de proteínas de membrana, onde sua natureza bidimensional permite imagens rápidas e de campo amplo com sensibilidade a um único fluoróforo. O uso de bicamadas lipídicas artificiais que imitam membranas onde proteínas transmembranas ou periféricas são encontradas (como membranas plasmáticas ou membranas de organelos intracelulares de vários tipos celulares) permite a medição de interações específicas em ambientes quase nativos. Também permite a adição gradual de complexidade, um componente de cada vez, enquanto suprime a interferência de fundo causada pela fluorescência e espalhamento Raman. Ao adicionar controle de temperatura, torna-se possível determinar também as propriedades termodinâmicas das interações de partícula única. Neste trabalho, descrevemos um protocolo para preparação de amostras, coleta de dados, rastreamento de fluorescência de molécula única e análise das trajetórias de proteínas de membrana em bicamadas lipídicas usando Aquaporina-4. Este trabalho serve como um exemplo fundamental e pode ser adaptado a diferentes proteínas e composições de bicamadas.

Introduction

Em condições biológicas naturais, as proteínas de membrana são cercadas por uma extensa rede de interações, que inclui outras proteínas de membrana, proteínas nos fluidos intracelulares e extracelulares, vários tipos de lipídios e colesterol, substratos ou ligandos, interações com soluções e interações entre matrizes extracelulares e intracelulares. Uma abordagem clássica biofísica para entender melhor interações específicas e coletivas começa com um único componente, introduzindo gradualmente componentes adicionais um de cada vez até que a complexidade reflicta o ambiente nativo — uma abordagem de "Dividir para Conquistar" da biofísica. Um método moderno em escala molecular para estudar essas interações é por meio da observação direta, utilizando imagens de fluorescência de molécula única em time-lapse para acompanhar proteínas individuais enquanto elas se movem e interagem com seu ambiente. Neste artigo, descrevemos as etapas fundamentais dessa abordagem, incluindo a formação de bicamadas lipídicas em cobertores de quartzo e a inserção de uma grande proteína de membrana nessas bicamadas pré-fabricadas de maneira adequada para imagem de proteína única. Isso será seguido por um protocolo 'work-horse' para rastrear proteínas individuais em bicamadas suportadas.

Este artigo descreve como criar bicamadas lipídicas com suporte sólido usando pequenas vesículas unilamelares (SUVs) que rompem em coberturas de quartzo hidrofílico. As superfícies de quartzo são preparadas por lavagem ácida ou limpeza com ozônio com ultravioleta (UV). Os lipídios usados para criar os SUVs devem, quando possível, corresponder à composição química principal da membrana biológica de interesse (por exemplo, aquaporina-4 (AQP4) é encontrada na membrana plasmática dos astrócitos e os principais componentes são POPC (46,4%), POPE (8,5%), PS (5,6%), colesterol (30%), PI (2,5%) e SM (5,6%)^1,2). Para evitar a interação com o substrato sólido, aditivos como polietilenoglicol (PEG) enxertados em um lipídio levantam a bicamada^{da superfície 3,4}. A quantidade de cada aditivo deve ser cuidadosamente ajustada para garantir que a difusão da proteína não seja obstruída, além de fornecer suporte suficiente para levantar a membrana da superfície do substrato. Aditivos como os lipídios PEGilados normalmente apresentam duas fases: uma 'fase de escova' e uma 'fase cogumelo'. A fase de escova ocorre quando o PEG está em alta concentração, fazendo com que o polímero fique em pé para reduzir a obstrução estérica. A fase cogumelo ocorre em concentrações baixas, quando os polímeros estão suficientemente separados para existir como bobinas aleatórias. Em geral, a fase de escova dificulta a difusão, mas a fase de cogumelo oferece pouco suporte. A concentração entre as fases de escova e cogumelo é ótima, proporcionando suporte com impacto mínimo na difusão ^3,4.

Algumas proteínas de membrana se inserem espontaneamente em membranas lipídicas suportadas por sólidos, como P450s e citocromo P450 redutase⁵, enquanto outras precisam ser inseridas usando detergentes, o que é um processo delicado. Uma lavagem cuidadosa é necessária para remover esses detergentes, assim como quaisquer proteínas não incorporadas que possam interferir no rastreamento de uma única proteína – um processo que será descrito em detalhes. O foco principal deste artigo é a preparação de uma amostra para rastreamento de molécula única (SMT) usando imagem de fluorescência em time-lapse. Isso requer um objetivo com alta ampliação e abertura numérica (NA) — tipicamente um objetivo de imersão em óleo de 100x e 1,45 NA ^6,7. Também requer uma câmera rápida e altamente sensível (EMCCD, CMOS ou ICCD) e excitação a laser. A excitação a laser precisa cobrir um campo de visão grande o suficiente para medir trajetórias proteicas longas, o que é frequentemente realizado usando reflexão interna total para criar um campo evanescente de cerca de 50 μm x 100 μm ou epi-iluminação com óptica de modelagem de feixe (Gaussiana a cartola) de cerca de 80 μm x 80^{μm 8} ou uma folha óptica altamente inclinada e laminada (HILO) com campo semelhante ao TIRF. A microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) tem a vantagem de reduzir o sinal de fundo. Um projeto simples e relativamente barato de microscópio TIRF é apresentado abaixo. Ao adicionar controles de temperatura, é possível medir várias propriedades termodinâmicas, como entalpia, entropia e energia livre de^{Gibbs 9}. A técnica também requer marcação por fluorescência da proteína de membrana em um grau de marcação que garante que a maioria das proteínas de membrana carregue uma etiqueta fluorescente.

A proteína transmembrana de interesse neste artigo é a AQP4. AQP4 é um canal de água polarizado nas extremidades dos astrócitos e em outras áreas da vasculatura do sistema nervoso^{central 10}. Ela pode transportar até 3 bilhões de moléculas de água por segundo e está envolvida na homeostase da água, migração celular, edema cerebral, aprendizado e formação de memória por meio da plasticidade^{sináptica 11}. A desregulação da função do AQP4 tem sido associada a várias condições neurológicas, incluindo edema cerebral, neuromielite óptica e epilepsia 12,13,14,15. AQP4 é uma proteína de 32-37 kD, dependendo de sua isoforma, e possui uma estrutura quaternária tetramérica com oito domínios de membrana hidrofóbicos conectados por alças de união, um domínio intracelular N-terminal e um grande domínio intracelular^{C-terminal 16}. Existem duas isoformas principais do AQP4, M1 e M23; A diferença surge da iniciação no resíduo de metionina 1 ou no resíduo de metionina 23. Pesquisas mostraram que a isoforma M1 pode formar díades ou tríades consigo mesma, dependendo de seu estado de^{palmitoilação 9}. A isoforma M23 se forma em grandes agregados proteicos conhecidos como Arrays Ortogonais de Partículas (OAPs). Quando coexpressa, a isoforma M1 limita o crescimento da OAP formando um revestimento proteico periférico ao redor de seu exterior 17,18,19. A dinâmica da agregação da PO pode ser um fator chave na modulação da permeabilidade à água e da homeostase no cérebro. Neste artigo, descrevemos os passos necessários para rastrear AQP4s individuais em uma membrana e observar interações individuais proteína-proteína.

Protocol

1. Preparação de pequenas vesículas unilamelares

1. Tire as soluções de caldo lipídico do freezer e deixe que cheguem à temperatura ambiente.
2. Tire um frasco limpo de 10 mL do forno e deixe esfriar até a temperatura ambiente.
3. Adicione 900 μL de clorofórmio de grau espectroscópico e 100 μL de metanol de grau espectroscópico ao frasco frio de fundo redondo, depois adicione as quantidades apropriadas de cada lipídio na mistura. Gire o frasco para garantir que os lipídios estejam bem misturados.
   NOTA: Outros autores usam diferentes proporções de clorofórmio:metanol, mas descobrimos que a melhor proporção para formar bolos lipídicos uniformes foi 9:1.
   Uma planilha para calcular as quantidades corretas de lipídios é fornecida no Arquivo Suplementar 1. Se preparar lipídios para verificar a formação da bicamada lipídica na superfície do substrato, utilize um lipídio marcado fluorescente.
4. Coloque um conector de destilação a vácuo sobre o frasco de fundo arredondado, como mostrado na Figura 1, e conecte-o à linha de nitrogênio (aparelho de secagem).
   NOTA: Use N₂(g) purificado e passe por um filtro de 0,22 μm antes de conectar ao aparelho de secagem.
5. Ligue o N₂(g) e ajuste a pressão para que o fluxo seja tão leve que mal seja sentido no dorso da mão.
   NOTA: Molhar o dorso da mão pode ajudar a perceber a evaporação.
6. Deixe a amostra secar sob um fluxo de N₂(g) por 2,5 a 3 horas, verificando periodicamente para garantir que o nitrogênio continue fluindo. A amostra provavelmente parecerá seca dentro da primeira meia hora; No entanto, continue fluindo nitrogênio por mais 2 a 2,5 horas para remover qualquer solvente restante.
   NOTA: A amostra também pode ser seca durante a noite.
7. Adicione 1 mL de tampão para cada 5,0 μmol de lipídios totais no cantil de fundo arredondado.
   NOTA: O tampão utilizado neste estudo consistia em 100 mM HEPES, 5 mM_{CaCl 2} e 140 mM NaCl; Esse é o mesmo tampão usado durante toda a preparação da amostra.
8. Coloque uma rolha de vidro no frasco e envolva com filme de parafina.
9. Coloque o cantil em uma gramposa em um suporte de anel e submerga a parte inferior do cantil em um banho de um sonicador ajustado a 60 °C. Deixe o frasco incubar por 1 hora, girando suavemente a cada 15 minutos para criar lipossomos multilamelares, aparecendo como uma solução opaca sem lipídios ligados ao frasco.
10. Após a incubação de 1 hora, ligue o sonicador (~35 kHz) e ajuste a amplitude para a configuração máxima. Depois, mova o cantil na banheira para encontrar a posição onde ocorre a maior agitação, de modo que a solução bata e espirre dentro do cantil. Sonice por 30 minutos, buscando uma mudança do opaco para o transparente e levemente opalescente.
11. Remova a solução lipídica do frasco e coloque-a em um tubo de microcentrífuga, depois centrifuge a 100.000 × g por 1 hora a 4 °C. Remova o sobrenadante do tubo da microcentrífuga.
    NOTA: Pode se formar um pequeno pellet no fundo do tubo. Se o pellet for grande, descarte-o e repita o processo.
12. Use os SUVs após a centrifugação, armazene-os a 4 °C por uma semana ou mantenha a -80 °C com um pouco de trehalose.
    NOTA: A quantidade recomendada de trehalose é 1 mg por mL de solução lipídica. Para resultados ideais, novos SUVs podem ser fabricados semanalmente e armazenados na geladeira.
    NOTA: Este é apenas um dos métodos para preparar SUVs. Além dos SUVs, vesículas unilamelares pequenas, médias e grandes podem ser produzidas usando extrusão ou lipossomos unilamelares gigantes por eletroformação 20,21,22,23.

2. Marcagem de proteínas

NOTA: A marcação de proteínas com sondas fluorescentes usando vários conjugados, como ésteres e maleímidas do NHS, é bem documentada e compreendida. No entanto, o grau de marcação (DOL) é especialmente importante no rastreamento de proteína única. Neste estudo, foi essencial determinar qual porcentagem de proteínas transmembranas foram marcadas e a distribuição dos fluoróforos em cada tetramero AQP4.

1. Coloque um tubo de diálise em um béquer contendo 0,1 M de tampão de fosfato a pH 8,3 que tenha sido passado por um filtro de 0,22 μm. Depois, deixe-o no buffer durante a noite em posição invertida, permitindo que a membrana se condicione.
2. No dia seguinte, substitua o tampão dentro do tubo de diálise pela solução proteica.
   NOTA: O volume da solução proteica deve estar entre 20 e 250 μL. Deve haver ~1-5 mg de proteína dissolvida na solução.
3. Uma vez que a proteína seja colocada no tubo de diálise, deixe-a repousar durante a noite no tampão fosfato de 0,1 M.
4. Após a diálise, transfira a proteína para um tubo de microcentrífuga.
5. Prepare um novo tubo de diálise repetindo o passo 2.1.
6. Prepare o corante NHS colocando alguns grãos (3-4) em um pequeno pedaço de papel de pesagem, depois transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e dissolva 100 μL de DSMO. Em seguida, duas diluições 1 mL de 10 vezes em DMSO, usando a diluição final para determinar as concentrações de cada amostra por espectroscopia UV-vis. Para alcançar um DOL médio de 2-3, adicione um excesso molar de corante reativo em três molares à solução proteica enquanto agita suavemente.
   NOTA: Um espectrômetro UV-vis padrão será suficiente para esse propósito, embora um espectrômetro de pequeno volume seja vantajoso devido ao tamanho da amostra.
7. Adicione o corante reativo ao tubo da microcentrífuga contendo a proteína em volumes iguais. Depois que o corante reativo e a proteína forem adicionados, nute por pelo menos 8 horas.
8. Após a nutação, transfira a proteína marcada para o tubo de diálise preparado no passo 2.5 e coloque-a em um béquer contendo tampão de fosfato fresco. Coloque uma barra de agitação no buffer e deixe girar suavemente por 6 horas, seguida de uma troca de buffer e mais 6 horas de diálise.
9. Após as duas trocas de tampão, coloque o tubo de diálise contendo a proteína marcada em um béquer limpo contendo o tampão final em funcionamento.
   NOTA: O tampão final de trabalho utilizado neste estudo consistiu em 100 mM de HEPES, 5 mM de_{CaCl 2} e 140 mM de NaCl a pH 7,4.
10. Após a diálise, meça o DOL usando um espectrômetro UV-vis.
    NOTA: É importante seguir métodos padrão para medir o DOL. Abaixo está uma equação para o cálculo.
    (1)
    Onde a absorvância medida no pico do corante é e o pico da proteína em 280 nm é . O coeficiente de extinção da proteína é (calculado a partir do peso molecular da proteína), enquanto e são fornecidos pelo fabricante do corante.

3. Preparação de coberturas de quartzo de 25 mm de diâmetro

NOTA: Abaixo estão dois métodos diferentes:

1. Lavagem ácida
   NOTA: Existem vários procedimentos publicados de lavagem ácida, incluindo piranha e base etch. Descobrimos que o procedimento abaixo proporciona uma superfície extremamente limpa e hidrofílica, sem gravação, o que é preferível para estudos de molécula única usando imagem de fluorescência.
   1. O método Acid Wash requer uma exaustão enquanto aquece a solução e EPI (óculos de proteção, jaleco, luvas). Um frasco de bicarbonato de sódio deve estar disponível no capô em caso de derramamento.
   2. Coloque as coberturas em um béquer e encha com água nanopura, 30% de água oxigenada e ácido nítrico concentrado em partes iguais em volume (solução 1:1:1).
   3. Aqueça as coberturas nessa solução por 30 minutos até a solução começar a borbulhar.
   4. Verifique a solução e misture girando suavemente a cada 10 minutos para evitar que as coberturas grudem juntas. Ao girar a solução, observe os deslizes deslizando para se separar. Depois de separarem, vá gradualmente desacelerando para mantê-los separados, permitindo que a solução borbulhante envolva as gotas.
      NOTA: A solução não deve ser aquecida com muita intensidade, pois a reação produz calor. Ajuste a placa elétrica para um borbulho suave, geralmente na configuração mais baixa. Nessas configurações, a solução permanece a ~70 °C. Peróxido de hidrogênio fresco também é recomendado.
   5. Quando 30 minutos se passarem ou a solução parar de borbulhar, deixe a solução 1:1:1 esfriar até a temperatura ambiente, depois enxágue bem as coberturas com água purificada usando um movimento suave.
2. Ozônio UV
   1. Limpe as coberturas de quartzo com n-hexano e depois metanol, usando lenços de lente.
   2. Coloque as coberturas em um limpador UV de ozônio com a superfície a ser tratada voltada para a lâmpada.
   3. Fluxo de oxigênio para a câmara a 5 psi por 5 minutos; Depois, desligue o fluxo de oxigênio.
   4. Em seguida, ligue as luzes UV por 15 minutos e deixe as coberturas descansarem por pelo menos 10 minutos para deixar o ozônio escapar.
   5. Após usar qualquer um dos métodos de limpeza, certifique-se de usar imediatamente as coberturas limpas. Se usar lâminas previamente limpas, repita o processo para regenerar a superfície.
      NOTA: A ozonação UV requer circulação constante para remover o ozônio do ar. O sistema deve ser colocado sob um snorkel de manuseio de ar ou em uma exaustão de fumaça.

4. Formação de bicamadas e incorporação de AQP4 em uma membrana de duas camadas

NOTA: O tampão utilizado neste estudo consistiu em 100 mM de HEPES, 5 mM de_{CaCl 2} e 140 mM de NaCl a pH 7,4.

1. Coloque a capa recém-limpa em um suporte de amostra de 25 mm usando um tubo de lente SM1 de 1/4 de polegada. Depois, corte uma junta de parafilme de dupla camada de 8 mm de diâmetro e posicione-a no centro do suporte da amostra (veja a Figura 3).
2. Apresente uma gota de 50 μL dos SUVs no centro da junta de 8 mm, vede-a e depois incube a 37 °C por 1 hora.
   NOTA: Isso permite que os lipossomos se fundam com a superfície do quartzo hidrofílico e se rompam, formando uma bicamada contínua.
   É muito provável que a quantidade de lipossomos adicionados à área da junta possa variar, e uma junta maior pode exigir mais lipossomos para formar uma bicamada contínua. No entanto, as quantidades especificadas no passo 4.2 quase sempre promovem a formação de uma bicamada contínua.
3. Após a incubação, enxágue a amostra usando uma pipeta para remover a solução. Depois, adicione 50 μL de novo tampão à bicamada. Depois, repita o processo um total de 10 vezes.
   NOTA: É fundamental que a ponta da pipeta não toque na bicamada lipídica e que reste alguma solução para manter a bicamada hidratada. Ao levar a ponta para o topo da gota, você verá que ela faz contato. Você pode remover a solução sem danificar a bicamada mantendo o contato mínimo com a superfície da gotícula. Eventualmente, a gota se inverte e se desloca em direção à junta; Este é o momento ideal para parar de remover a solução. A luz refletida deve mudar nesse ponto e pode servir como um sinal para parar. Se você está preocupado em remover muita solução, diminua a configuração da pipeta durante a lavagem para deixar uma quantidade confortável de tampão acima da bicamada lipídica.
   A integridade da formação da bicamada lipídica nessas condições pode ser avaliada antecipadamente usando a recuperação por fluorescência após o fotobranqueamento (FRAP). Isso requer que tenha um componente na mistura lipídica marcado^{fluorescentemente como} 6,7,24,25.
4. Após concluir a lavagem final, remova novamente o tampão e adicione uma alíquota de 50 μL da proteína desejada em detergente igual ou abaixo da sua concentração micelar crítica. Deixe pelo menos 1 hora para incorporação de proteína a 37 °C.
   NOTA: O detergente amolece suavemente a bicamada e ajuda a incorporação da proteína à membrana. Neste protocolo, o detergente utilizado foi de 50 μM n-Dodecil-beta-D-tiomalaltoside (DOTM), um detergente não iônico, e a concentração de proteína foi de 2 nM.
5. Após uma hora, enxágue a amostra com um tampão para remover qualquer proteína e detergente não incorporados.
6. Adicione 5 mg de contas de poliestireno condicionado (Bio-esferas) à amostra, deixe agir por pelo menos 1 hora antes de remover. A amostra então está pronta para imagem (veja abaixo).

5. Aditivo antifade

1. Dissolva 5 mg de Trolox e 80 mg de glicose D em 10 mL de tampão (veja acima). Sacode e faça vórtice até não restar mais sólidos. Nutate durante a noite no escuro, depois filtre a solução através de um filtro de 0,22 μm. Prepare fresco toda semana.
2. Dissolver 6,5 mg de glicose oxidase (1650 U) e 8 μL de Catalase (29.200 U/mL em tampão) em 92 μL de tampão. Misture a solução suavemente sem que faça vórtice, depois centrifuge e transfira o sobrenadante para um novo tubo. Armazene a 4 °C e proteja da luz.
   NOTA: Esta solução pode ser armazenada na geladeira por vários meses; No entanto, se aparecer qualquer turvação, descarte-a e prepare uma solução nova.
3. Misture 99 μL de solução do 5,1 com 1 μL do passo 5,2 em um novo tubo. Após o enxágue final da amostra, adicione a solução antidescolorante sobre a amostra (chamada de solução de imagem).
   NOTA: Soluções antifade podem alterar as funções das proteínas transmembranares; É importante verificar a compatibilidade com o sistema.

6. Configuração e configurações do microscópio

NOTA: Um microscópio TIRF personalizado foi utilizado para este estudo de molécula única. Esta seção descreve os principais componentes e técnicas de alinhamento de chaves para um microscópio de fluorescência básico adequado para imagens rápidas em time-lapse (Figura 4), que é um instrumento confiável.

1. Use um laser He:Ne de 633 nm para excitar as amostras. O laser passa por um filtro passa-banda e uma placa de onda de 1/4 para refinar a linha do laser e converter a excitação da luz polarizada linearmente para a luz polarizada circularmente.
   NOTA: A polarização circular reduz o efeito da orientação da sonda.
2. O feixe passa por uma lente de 300 mm e um filtro de linha a laser de 633 nm, reflete em um espelho dicróico passa-longos de 633 nm e é focado na parte traseira de um objetivo de microscópio de óleo de 100x e 1,45 N/A. Alinhe a viga para garantir que ela passe suavemente pelo centro do objetivo e permaneça reta ao sair do objetivo.
   NOTA: Neste ponto, o microscópio está configurado para epifluorescência (epi). Uma pequena quantidade de leite em pó pode ser adicionada a uma cuvette com fundo transparente. A cubeta é então colocada sobre o objetivo do microscópio com uma gota de óleo de imersão entre eles. Isso permite que você observe que o feixe está passando diretamente pelo objetivo.
3. A emissão das proteínas marcadas fluorescente passa pelo espelho objetivo, dicróico, filtro passa-longas e uma lente de 300 mm, depois é imagada em uma câmera EMCCD. Use lentes tubulares de maior distância focal para ampliar imagens na câmera e melhorar a precisão da superlocalização, o que é benéfico para proteínas e agregados transmembranares de movimento lento. Certifique-se de calibrar os pixels da câmera em nanômetros.
   NOTA: No entanto, a ampliação 1x é alcançada com a lente tubular especificada pelo fabricante do objetivo, o que aumenta a relação sinal-ruído ao focar a fluorescência em menos pixels. Distâncias focais comuns incluem lentes de 200 mm, 180 mm, 165 mm e 164,5 mm. Recomendamos o uso de um alvo de ampliação da USAF de 1951. Usando uma lente de 300 mm nesse setup, uma calibração de pixels de 74 nm foi medida com uma ampliação total de 170x.
4. Controle a temperatura da amostra usando um colar de objetivo e um suporte de amostra equipado com aquecedor/resfriador^{Peltier 26}.
   NOTA: Manter uma temperatura estável é crucial para garantir a estabilidade térmica do microscópio e permitir medições precisas dependentes da temperatura e foco do instrumento.
5. Atuadores piezo movem a amostra nas direções XYZ. Uma vez que uma amostra esteja em foco, ajuste o feixe para a borda do objetivo do microscópio (veja a Figura 4) usando o estágio acoplado ao espelho giratório final até que um ângulo crítico seja alcançado. Isso gera um campo de excitação evanescente. O microscópio agora está ajustado em TIRF.
   NOTA: Você pode determinar que o microscópio está em TIRF quando a reflexão retro do laser é uma linha (não uma mancha), e o fundo da amostra diminui em intensidade e se alonga.

7. Coleta de dados

NOTA: A câmera deve ser configurada para coleta rápida de dados.

1. Ajuste a velocidade vertical de deslocamento de pixels para aproximadamente 600 ns e faça overclock na tensão de clock vertical (tipicamente +4). Depois, ajuste a leitura horizontal de pixels para sua configuração máxima (30 MHz a 16 bits neste exemplo). Ajuste o ganho do pré-amplificador para 2 e configure a saída do amplificador para multiplicação de elétrons. Por fim, ajuste o ganho do multiplicador de elétrons ao seu nível mais alto.
2. Ajuste a exposição para 25 ms. Com 25 ms de exposição, certifique-se de que a taxa de quadros seja um pouco maior (25,802 ms na câmera usada aqui).
3. Ajuste a potência do laser para que o sinal fique claramente acima do fundo.
   NOTA: Ajustar a potência do laser pode ser desafiador. Se for muito alto, a sonda descolora rápido demais; muito baixa, e a relação sinal-ruído dificulta o acompanhamento. Recomendamos ajustar a potência para que o sinal exceda o fundo em 3-5x para as partículas com o sinal mais fraco. A Seção 2 explica por que o brilho molecular apresenta uma distribuição.
4. Colete dados suficientes para fornecer pelo menos 1.000 trilhas por amostra.

8. Análise de rastreamento

NOTA: Em nossos laboratórios, a análise de rastreamento de partícula única é tipicamente realizada usando scripts personalizados no MATLAB baseados no trabalho de Crocker e Grier e modificada pelos^{autores 3,26,27}. Abaixo está uma descrição usando o ImageJ, um software disponível gratuitamente para a comunidade de pesquisa. Ambos os métodos produzem resultados idênticos.

1. Ajuste os conjuntos de dados de corte para um tamanho consistente e depois corrija o fundo usando o ImageJ.
   NOTA: Se os dados coletados forem os mesmos entre conjuntos, não há necessidade de recortar. Isso geralmente é feito apenas se a região de interesse tiver mudado no sensor da câmera entre as coletas de dados. As capacidades do ImageJ podem ser significativamente ampliadas com plugins. Uma opção é instalar e usar o FIJI, que é o ImageJ incluído em um conjunto de plugins padrão. Entre esses plugins está o TrackMate, que será usado para o protocolo^{aqui 28,29}.
   O site ImageJ Wiki oferece guias e exemplos para muitos plugins. Também inclui tutoriais em vídeo.
2. Dentro do FIJI, arraste e solte o arquivo do filme ou do arquivo empilhado *.tif a ser analisado (veja Arquivo Suplementar 2).
3. Aí entra os detalhes de calibração dos pixels. Na aba Analisar , selecione Definir Escala e aplique a calibração pixel-para-distância do instrumento.
4. Salve uma cópia para acompanhar quaisquer mudanças em relação ao original.
5. Subtraia o fundo da janela escolhida e aplique à cópia salva dos dados originais. Na aba Processo , escolha Subtrair Antecedentes.
   NOTA: Isso será otimizado com base nos dados. Um bom ponto de partida é usar uma "bola rolante" maior do que as partículas que estão sendo fotografadas.
6. Na aba Plugins , selecione Tracking | TrackMate. Isso abre a janela de diálogo TrackMate , que guia o usuário pelo processo de rastreamento.
   NOTA: Uma vez concluído o Tracking, é possível exportar as faixas para análise adicional fora do ImageJ.

9. Processamento de dados

NOTA: Aqui é discutido como processar os dados representativos e como calcular distribuições de tamanho de passo para obter uma constante média de difusão.

1. Arraste e solte a pilha de imagens no FIJI; Depois, aplique a calibração (74 nm/pixel).
2. Subtraia o fundo usando a subtração de bola rolante com largura de 5 pixels. Recorte o campo em quatro seções separadas de 11 μm x 11 μm e analise separadamente.
   NOTA: Isso serve para minimizar qualquer variância de limiar devido ao campo de excitação ao rastrear proteínas de membrana.
3. Inicie o plugin TrackMate . Verifique se a calibração foi aplicada aos pixels (veja Arquivo Suplementar 3) e que o tempo cobre a faixa desejada.
   1. No TrackMate, selecione o Laplaciano de Gaussiano (LoG) como método de detecção para as partículas, com diâmetro estimado de 350 nm usando o filtro mediano pré-processo. Clique no botão Pré-visualização para verificar se as partículas detectadas são razoáveis.
      NOTA: Algumas partículas podem estar claramente no fundo; Não se preocupe com isso — eles serão eliminados na próxima etapa.
   2. Quando estiver satisfeito com as configurações de contagem, processe o restante da pilha, seguido pelo threshold. Use o limite automático ou arraste a caixa de seleção para ajustar o limiar.
   3. Após escolher como visualizar as partículas detectadas, selecione o método de rastreamento: Advanced Kalman Tracker para este conjunto de dados, com as seguintes configurações: 350 nm para os raios de busca e uma lacuna máxima de 2 quadros.
      NOTA: Também é possível adicionar penalidades, divisão de trilhos e fusão de trilhos. Para este conjunto de dados, apenas o rastreamento foi realizado.
   4. Decida como filtrar e visualizar as faixas.
      NOTA: Neste conjunto de dados, apenas os pontos detectados são exibidos (veja Arquivo Suplementar 4).
   5. Após processar as faixas individuais, exporte os dados de rastreamento como um arquivo XML para uso em um software de edição de planilha (veja Arquivo Suplementar 5).

Results

Como descrito na seção 2 do protocolo, as lisinas foram marcadas usando ésteres do NHS conjugados a uma molécula de corante fluorescente (corante NHS). Após a conjugação com a proteína, meça o DOL com um espectrômetro UV-Vis. Para este experimento, o DOL dos tetrameros AQP4 foi de 4,12. Em seguida, determine a probabilidade de que cada tetramero AQP4 tenha pelo menos uma molécula de corante usando a distribuição de Poisson fornecida abaixo.

(2)

Onde P é a probabilidade de que cada AQP4 seja rotulado, usando a equação 2, a probabilidade de que cada tetramero AQP4 tenha uma marca fluorescente ligada a si é de 98%. A distribuição de rótulos por tetramero é mostrada na Figura 2 e reflete a distribuição de brilho observada na amostra.

A relação sinal-ruído alcançada nesses dados de exemplo foi 8-9x acima do fundo para um único fluoróforo e acima de 15-20 para as partículas mais brilhantes. Essa variação vem da posição no feixe de excitação e do DOL descrito no passo 2 do protocolo.

Dentro do arquivo XML gerado, as colunas de interesse são J, K, L e M, que correspondem ao ID do número de partículas, ao referencial em que a partícula foi detectada, à posição X da partícula e à posição Y da partícula, respectivamente (veja Arquivo Suplementar 6). Na segunda folha do arquivo, a distribuição do tamanho do passo e o coeficiente médio de difusão são calculados, onde os tamanhos do passo são as distâncias que uma partícula percorre entre os quadros, e a difusão média é dada pela equação 3:

(3)

Onde D_média é o coeficiente médio de difusão, e Δt é a taxa de quadros. Essa equação assume movimento browniano, que geralmente é válido para pequenos deslocamentos e pode ser confirmado analisando a etiqueta média quadrática deslocada versus tempo a partir de uma amostra de trilhas^{individuais 3,30,31}.

Um histograma de tamanhos de degraus mostra uma distribuição de partículas difundindo, que pode ser atribuída a OAPs de diferentes tamanhos (Figura 5).

Figura 1: Aparelho de secagem de lipídios. O aparelho consiste em um frasco de fundo arredondado de 10 mL com um conector de destilação a vácuo. O nitrogênio entra em baixa pressão através de um filtro de seringa de 0,2 μm com uma agulha presa a uma tampa de síntese amarela, que é conectada a um conector de destilação a vácuo. A pressão é liberada por um tubo de Tygon preso a uma seringa com uma agulha de corte. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Distribuição esperada de rótulos fluorescentes em cada unidade AQP4 usando a equação 2. O número mais provável de fluoróforos é 4, e 98% de todos os AQP4 terão marcador fluorescente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Montagem do suporte da amostra. O conjunto é feito de um tubo de lente SM1 de 1" com as roscas macho removidas e chanfradas para evitar interferência com a objetiva do microscópio. Inclui um cobertor de quartzo e uma junta de parafilme. Todo o conjunto é fixado com um anel de retenção SM1. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Microscópio. No lado direito há um diagrama simplificado do microscópio; A linha verde mostra a luz de excitação vinda do laser. Começando pela direita, a luz do laser passa por uma placa de onda de 1/4, depois é focada por uma lente de 300 mm. A luz é refletida por um espelho dicróico de passagem longa sobre o objetivo, onde é focada na abertura traseira. Ao usar um espelho de translação para deslocar o feixe de excitação, o feixe é posicionado na borda da abertura do objetivo, criando um campo evanescente na amostra. A luz emitida em foco é coletada pelo objetivo e representada pela linha vermelha. A luz emitida então passa pelo dicroico, depois por um filtro passa-longo, e é focada por uma lente de 300 mm na câmera, fornecendo uma ampliação óptica de 1,7x (170x ampliação total da objetiva e da lente do tubo). No lado esquerdo, há uma imagem do microscópio. Note que espelhos giratórios adicionais são usados para posicionar corretamente o laser. Simultaneamente, o braço de detecção é organizado para maximizar a coleta de fótons das proteínas transmembranar marcadas fluorescente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Histograma dos tamanhos dos passos. A linha azul com círculos vermelhos é um histograma de todos os tamanhos de passos. A linha preta é adequada para múltiplos coeficientes de difusão. A distribuição de probabilidade do tamanho do passo é dada por: onde f_i é a população fracionária de cada tipo de partícula difusora, assumindo que cada uma sofre movimento browniano. O histograma e o ajuste mostram uma distribuição heterogênea de partículas que se movem mais lentamente e mais rápido, atribuída a uma distribuição de múltiplos tamanhos de CAO. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Calculadora de planilha usada para determinar composições em mol%, quantidades totais de lipídios e componentes opcionais fluorescentes/FRAP para preparação de SUVs. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Pilha bruta de imagens de microscopia de fluorescência de molécula única usada no rastreamento de trajetória (arquivo fonte do tutorial TrackMate). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 3: Prévia animada dos dados brutos de fluorescência de molécula única mostrando intensidade e fundo antes do processamento. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4: Animação dos caminhos filtrados das partículas (pós-thresholding) mostrando trajetórias representativas do AQP4 ao longo do tempo. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 5: Sobreposição animada mostrando rastreamento de partículas de campo completo das moléculas AQP4 usando saída TrackMate. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 6: Planilha mostrando coordenadas de trajetória extraídas e distribuições de tamanho de passo calculadas usadas para análise de difusão. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Neste artigo, apresentamos um método de rastreamento de partícula única para observar diretamente proteínas individuais da membrana enquanto elas se movem por uma membrana de bicamada lipídica suportada por sólidos e interagem entre si. O AQP4 foi escolhido como exemplo representativo devido à sua capacidade de formar auto-montagens dinâmicas reguladas por suas diferentes isoformas 32,33,34. Acima, descrevemos um método confiável para preparação de amostras e parâmetros-chave para rastrear proteínas de membrana única em escalas de milissegundos. As etapas incluem: (1) preparação de SUVs, (2) determinação do nível adequado de marcação fluorescente, (3) preparação de suportes sólidos, (4) criação de amostras de proteínas transmembranas dentro de uma bicamada lipídica suportada por sólidos, (5) preparação de agentes antidesfaçantes, (6) construção de um microscópio simples de molécula única, (7) coleta de dados de rastreamento de molécula única e (8) análise dos dados de rastreamento usando ImageJ.

O método passo a passo descrito é conceitualmente simples; No entanto, cada passo crítico tem suas próprias armadilhas e limitações. Entre eles, a preparação da amostra é a mais desafiadora (etapas 1-5). Portanto, vários detalhes devem ser levados em consideração. A primeira é como criar uma bicamada lipídica com suporte sólido. Existem três métodos principais: (1) Langmuir-Blodgett (LB), (2) fusão e ruptura de SUVs, e (3) revestimento de^rotação 35,36,37,38,39. Cada método tem suas vantagens e desvantagens. Por exemplo, o método de Langmuir-Blodgett oferece maior controle sobre as propriedades e composição química das bicamadas, incluindo composições assimétricas entre as duas folíolas, e permite a formação de múltiplas camadas de forma controlada. No entanto, usar um canadeiro LB é tecnicamente demandante, demorado e caro para conseguir³⁵. O spin-coating é uma técnica relativamente simples para criar bicamadas lipídicas; no entanto, tende a produzir multicamadas e requer um grande excesso de material, muitas vezes uma quantidade impraticável^{de 39}. Fusão e ruptura de vesículas são processos diretos que requerem apenas uma pequena quantidade de material. No entanto, criar uma superfície hidrofílica é crucial, e algumas composições lipídicas formam bicamadas por fusão de vesículas mais facilmente do que outras (por exemplo, em nosso laboratório, descobrimos que vesículas com carga líquida negativa formam bicamadas por fusão de vesículas apenas com a adição de cátions divalentes e tempos de incubação estendidos)⁴⁰. Além de estabelecer uma superfície hidrofílica (passo 3), outras considerações importantes ao formar uma bicamada sustentada por sólido por meio da fusão de vesículas incluem lavar a bicamada recém-formada antes e depois de incorporar a proteína de membrana. A lavagem pré-inserção remove o excesso de SUV e as vesículas multilamelares maiores (MLVs), enquanto a lavagem final após a inserção da membrana elimina a proteína não incorporada. Lavagem insuficiente pode introduzir sinais de fundo durante estudos de rastreamento.

Selecionamos diversos detergentes para determinar se são adequados para inserção de proteínas transmembranas em bicamadas lipídicas suportadas por sólidos, incluindo C12E9, Tween-20, TritonX-100 e muitos outros. Nosso detergente preferido é o DOTM porque é fácil de remover e é o mais suave para a membrana (menos propenso a prejudicar a integridade da membrana). A quantidade de proteína adicionada é fundamental. Se for demais, será impossível observar trilhos únicos. Ao adaptar esse procedimento a outras proteínas transmembranares, a quantidade terá que ser ajustada por tentativa e erro. No entanto, as quantidades fornecidas nesse procedimento são um excelente ponto de partida. A quantidade de detergente deve ser mantida igual ou abaixo da concentração micelar crítica; caso contrário, a bicamada será solubilizada e removida do substrato de quartzo.

A inserção de proteínas de membrana na bicamada lipídica suportada precisa ser otimizada para cada conjunto de condições experimentais. No entanto, existem alguns métodos comuns para alcançar isso, incluindo o uso de proteolipossomos e a incorporação direta de proteínas de membrana em uma bicamada⁴¹ pré-formada. Um proteolipossomo é um lipossomo, como um SUV, com uma proteína embutida nele. Esses proteolipossomos podem fundir-se com uma bicamada lipídica pré-formada e sólida ou ser incorporados simultaneamente aos SUVs durante a formação da bicamada⁴². A fusão causa ruptura, liberando a proteína na membrana. É simples de implementar, mas resulta em uma orientação aleatória das proteínas de membrana. Isso pode levar a fortes interações com o suporte sólido, resultando em propriedades de difusão diferentes dependendo da orientação da^{proteína 3}. Este protocolo descreve um método que utiliza a incorporação direta, resultando em uma preferência orientacional para AQP4 e outras proteínas de membrana com grandes domínios hidrofílicos em um dos lados da proteína 2,5,43,44.

A observação direta é uma ferramenta poderosa usada na descoberta científica. A imagem dinâmica de molécula única é especialmente importante na biofísica de proteínas de membrana, onde observar o movimento e as interações de proteínas individuais é usado para testar hipóteses ou gerar novas que descrevam melhor como uma proteína se comporta. O protocolo e os métodos descritos aqui são ideais para bicamadas lipídicas bidimensionais suportadas por sólidos, mas podem ser estendidos para ambientes mais complexos com múltiplos componentes², células vivas 34,45,46,47 e três dimensões⁴⁸. O rastreamento de molécula única abre a porta para muitos outros experimentos, incluindo rastreamento de molécula única de duas cores⁴⁹, FRET de molécula única^50,51 e imagens dinâmicas de super-resolução, como Microscopia de Reconstrução Óptica Estocástica (STORM) e Topografia em Nanoescala por Acúmulo de Pontos (PAINT). Ao expandir o instrumento para incluir controle de temperatura, as propriedades termodinâmicas das proteínas de membrana também podem ser^exploradas 26,43,52.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de onda 1/4	Thorlabs	WPQ05M-633	Certifique-se de combinar o laser
Objetivo 100X do Petróleo	Olympus	12-563-659	1,45 N/A apocromático
16:0-18:1 PC	Lípidos polares Avanti	850457	POPC Fosfolipídios
18:0 PEG2000 Educação Física	Lípidos polares Avanti	880210	Sal de Amônio
Lente 300mm	Thorlabs	AC254-300-A-ML
Laser He:Ne de 633 nm	Melles Griot	05-LHP-927	Pode ser alterado para outras fontes e para outros comprimentos de onda
Filtro passa-banda de 633nm	Chroma Tech	633/10X	Correspondência com o laser usado
Filtro passa-longa de 655nm	Chroma Tech	ET655lp	Altere para corresponder aos comprimentos de onda do corante/laser
Andor Solis I	Andor	Andor Solis I	Software para captura de imagem
ATTO 655	ATTO-TEC	655 d.C.	Modificação NHS-Ester, qualquer corante com uma modificação adequada para trabalho com molécula única pode ser utilizada. ATTO é recomendado, mas Cy5/7 pode ser usado
Bioesferas SM-2 Resina	BioRad	1523922
Cloreto de cálcio	Millipore Sigma	C4901
Catalase	Sigma-Aldrich	C3155-50MG	de fígado bovino, soltion aquoso e GE; 30.000 unidades/mg
Clorofórmio	Fisher Scientific & nbsp;	C547-1	HPLC ou grau espectroscópico
Colesterol	Sigma-Aldrich	C8667-500MG
Coberturas	Óptica ESCO	R525000	Quartzo 25mm
Divisor de Feixe Dicroico	Semrock	FF545/650-Di01-25x36	Altere para corresponder aos comprimentos de onda do corante/laser
Câmera EMCCD	Andor	iXon Ultra 888
Falcon Tubes 15mL	Greiner Bio-one	188261	Tubos de cultura celular Cellestar
Glucose Oxidase	Sigma-Aldrich	G2133-50KU	de Aspergillus niger, typer VII, ≥ 100000 unidades/g sólido (sem oxigênio adicionado)
Pistola de Calor	Carga do Porto	56434	Usado no aquecimento do parafilme, geralmente qualquer pistola de calor podia ser usada
HEPES	Biorreagentes Fisher	BP310-500
Óleo de imersão de baixa autofluorescência	Thorlabs	MOIL-30
Methonal	Fisher Scientific & nbsp;	A452-1	HPLC ou grau espectroscópico
Tubo Microcentrífuga	VMR	525-1126	1,5 mL
Micro Pipetters	Ependorf		Vários; 1000 & micro; L, 100 & micro; L e 10 & micro; L são sugeridos
& Oslash; Tubos de lente de 1,5"	Thorlabs	SM1.5L10	A rosca externa é raspada para preparação da amostra
Tabela Óptica	Newport	Dependência RPR	O tamanho da tabela depende do espaço disponível
Tecidos ópticos	Thorlabs	MC-50E	Limpeza de vários componentes
Parafilm	Millipore Sigma	P7669	Verifique não haver gases fluorescentes durante o processo
Atuador piezo	Newport	PZA12
Isoladores pneumáticos de vibração	Newport	Série I-2000	usado para estabilizar a tabela óptica para qualquer irregularidade
Banho Refrigerado	Fisher Scientific & nbsp;	Isotemp 3016
Controlador de obturador	Thorlabs	SC10	Vinculado ao software de imagem
Cloreto de sódio	Millipore Sigma	S988
Filtro Steritop	Millipore Sigma	S2GPT05RE
Driver e Controlador de Switchbox	Newport	PZC200	Controlador de estágio
Filtro de Seringa	J.T. Baker	SF01-98	PES 25mm 0.2 & micro; M
Elemento TEC	Thorlabs	TEC3-2.5	Usado para conectar a bomba de calor Peltirer ao suporte da amostra e ao colar objetivo
Controlador de temperatura	Engenharia Meerstetter	TEC-1091
Detector de Temperatura	Thorlabs	TH100PT
Termistor	Thorlabs	TH10K
Diálisador Tube-O-Diálisador	G Biosciences	786-611	4K MWCO
Limpador UV de Ozônio	Novascan	PSDP_UV	Pro Series - Digital & nbsp;
Zoom Optics	Thorlabs	SM1NR1